CN1254548C - 核酸扩增方法 - Google Patents

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Abstract

在样品中，利用在3′末端或3′末端侧具有核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、内切核糖核酸酶及具有链置换活性的DNA聚合酶扩增靶核酸的高灵敏度和高特异性方法，也即等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)方法；通过上述方法获得的扩增片段的检测方法；利用上述扩增方法制备靶核酸的方法；以及用于这些方法中的嵌合寡核苷酸引物。

Description

核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及在临床医学领域中有用的靶核酸的检测方法及在遗传工程中有用的DNA的合成方法。本发明涉及以核酸为模板的扩增方法及利用该方法得到的靶核酸的检测方法。
背景技术
DNA合成可用于遗传工程领域中的多种研究用途。除短链DNA如寡核苷酸外，绝大多数DNA的合成是通过其中应用有DNA聚合酶的酶促法合成的。这些方法的一个示例是聚合酶链式反应(PCR)，其在美国专利NO.4,683,195、4,683,202及4,800,159中有详细描述。另一个示例是结合了PCR和逆转录酶反应的逆转录-PCR(RT-PCR)法，在Trends in Biotechnology，10：146-152(1992)中有描述。
上述提到的方法的开发使得能够对感兴趣的DNA或RNA的区域进行扩增。
上文提及的DNA合成法是如通过包括3个步骤的反应进行的。为了对感兴趣的DNA区域进行扩增，此三个步骤为双链DNA解离(变性)为单链DNA、将引物退火到单链DNA上及从引物开始合成互补链(延伸)。另外，可利用命名为“穿梭PCR”的反应来进行PCR合成(″PCRhou saizensen″(Recent advances in PCR methodology)，Tanpakushitsu Kakusan Kouso，Bessatsu，(Protein，Nucleic Acidand Enzyme，Supplement)，41(5)：425-428(1996))，其中的3个步骤中的2个步骤，也即退火和延伸步骤是在同一温度下进行的。
另外，可利用1989年6月14日公开的EP 320,308中描述的连接酶链式反应(LCR)法或PCR Protocols，Academic Press Inc.，1990，pp.245-252中描述的基于转录的扩增体系(TAS)法来进行DNA合成。在上述4个方法中，为了为下一个扩增循环再生单链靶分子，这就需要在高温和低温下进行多次重复反应。由于反应为上述温度所限制，所以反应体系应利用不连续相或循环来进行。
因此，这些方法要求利用一台昂贵的热循环仪随着时间变化在宽温度范围内对温度进行严格调节。此外，反应需要时间来将温度调节到2或3个预先确定的值。时间损失随循环数目成比例增加。
为了解决这些问题，所以我们开发了可在等温条件下进行的核酸扩增方法。其示例包括JPB-B7-114718中描述的链置换扩增(SDA)法、自我维持的序列复制(3SR)法、日本专利No.2650159中描述的基于核酸序列的扩增(NASBA)法、转录介导的扩增(TMA)方法、法日本专利No.2710159中描述的Qβ复制酶法、及美国专利No.5,824,517、WO99/09211、WO95/25180和WO99/49081中描述的多种修饰SDA法。寡核苷酸的等温酶合成法在美国专利NO.5,916,777中有描述。在这些等温核酸扩增或寡核苷酸合成法的反应中，从引物开始的延伸步骤和/或引物退火到单链延伸产物(或退火到起始靶序列上)上的步骤是在等温反应混合物中同时进行的，而其后紧随的是从引物开始的延伸步骤。
在这些等温核酸扩增方法中，SDA法是DNA最终扩增成功的体系的示例。SDA法是在样品中、通过利用DNA聚合酶和限制性内切核酸酶对双链进行置换的靶核酸序列(及其互补链)扩增方法。此方法要求有4种引物用于扩增，其中两个应该设计含有限制性内切核酸酶的识别位点。对于DNA的大量合成来讲，此方法要求利用修饰的脱氧核糖核苷三磷酸作为底物。修饰的脱氧核糖核苷三磷酸的一个示例是(α-S)脱氧核糖核苷三磷酸，其中α-位磷酸基的氧原子为硫原子(S)所替代。如果在如遗传检验中进行常规的反应，那与修饰的脱氧核糖核苷三磷酸相关的成本问题就变的严重了。此外，在此方法中，将修饰的核苷酸如(α-S)脱氧核糖核苷酸结合到扩增后的DNA片段中可能会使具有限制性酶的扩增后DNA片段的可切割性丧失，例如，当用于限制性酶片段长度多态性(RFLP)分析时。
美国专利NO.5,824,517中描述的修饰的SDA法是一种利用嵌合引物进行的DNA扩增方法，此嵌合引物由RNA和DNA组成，并且其含有至少在3′末端定位有DNA的必需结构元件。在WO99/09211中描述的修饰的SDA法要求利用限制性酶来产生突出的末端。WO95/25180中描述的修饰的SDA法要求利用至少两对引物。WO99/49081中描述的修饰的SDA法要求利用至少两对引物和至少一个修饰的脱氧核糖核苷三磷酸。另一方面，美国专利NO.5,916,777中描述的寡核苷酸合成法包括利用在3′末端含有核糖核苷酸的引物合成DNA、利用引物完成反应、用可将其分离开来的内切核酸酶在引物延伸链的引物和延伸链之间导入切口、消化模板并回收引物进行重复利用。此寡核苷酸合成方法要求从反应体系中分离引物并随后将其退火到模板上以便在本方法中重复利用引物。另外，WO00/28082中描述的环介导的等温扩增(LAMP)法要求有4种引物用于扩增并且利用此方法合成扩增后的产物是不同大小的DNA，而对这些DNA中用于扩增的靶定区域进行了重复。
如上所述，传统的等温核酸扩增方法仍然具有多种问题。因此，我们想要的是低运转成本的核酸扩增方法，通过此方法我们可获得进一步进行了遗传工程操作的DNA片段。
发明目的
本发明的主要目的是提供靶核酸扩增方法，而此扩增方法是在样品中利用嵌合寡核苷酸引物，通过DNA合成反应而以高敏感度特异性扩增靶核酸，提供利用该方法获得的扩增片段的检测方法，提供利用该扩增方法和这些方法中应用的嵌合寡核苷酸来制备靶核酸的方法。
发明概述
作为深入研究的结果，本发明的发明者们构建了优良的基因扩增反应体系。通过开发了一个方法来完成了此构建工作，其中此方法包括在具有3′末端或3′末端侧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、内切核酸酶和DNA聚合酶存在的条件下对感兴趣的DNA区域进行扩增。从而，完成本发明。此方法是利用嵌合寡核苷酸引物进行的核酸扩增方法，在此处称为ICAN(等温和嵌合引物起始的核酸扩增)法。
本发明的第一方面涉及靶核酸的扩增方法，此方法包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合来制备反应混合物，其中，此引物是基本上与作为模板的核酸的核苷酸序列互补的嵌合寡核苷酸引物，并且此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；及
(b)对反应混合物孵育足够时间以产生反应产物。
在本发明的第一个方面中，选用了进一步含有嵌合寡核苷酸引物的反应混合物，而此嵌合寡核苷酸引物含有与作为模板的核苷酸序列基本同源的序列。
本发明的第二方面涉及核酸扩增方法，此方法包括：
(a)用至少一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补的引物及DNA聚合酶处理作为模板的核酸，以合成与模板互补的引物延伸链并合成双链核酸，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)在RNA酶H存在下，用具有链置换活性的DNA聚合酶对互补于在前面的步骤中获得的、作为模板的双链核酸的核苷酸序列进行延伸，以引起链置换并合成置换后的链及双链核酸；及
(c)在步骤(b)中重新利用步骤(b)中获得的双链核酸作为模板。
本发明的第三方面涉及利用至少两种引物进行核酸扩增的方法，此方法包括：
a)用至少一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补的引物及DNA聚合酶处理作为模板的核酸，以合成与模板互补的引物延伸链，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)在RNA酶H存在下，用具有链置换活性的DNA聚合酶对互补于在前面的步骤中获得的、作为模板的双链核酸的核苷酸序列进行延伸，以引起链置换并合成置换后的链及双链核酸；
(c)在步骤(b)中重新利用步骤(b)中获得的双链核酸作为模板；
(d)利用至少一种与步骤(a)中所用的引物不同的引物及DNA聚合酶处理步骤(b)中获得的、作为模板的置换后的链，以合成与置换后的链互补的引物延伸链，其中与步骤(a)中所用的引物不同的此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物基本上与置换后链的核苷酸序列互补，并且含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(e)在RNA酶H存在下，用具有链置换活性的DNA聚合酶对互补于在前面的步骤中获得的、作为模板的双链核酸的核苷酸序列进行延伸，以引起链置换并合成置换后的链及双链核酸；及
(f)在步骤(e)中重新利用步骤(e)中获得的双链核酸作为模板。
在本发明的第二或第三个方面中，具有链置换活性的DNA聚合酶可用作DNA聚合酶。
本发明的第四方面涉及核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列基本互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；及
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由模板和引物延伸链组成的双链核酸。
本发明的第五方面涉及核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列基本互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；及
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸。
本发明的第六方面涉及核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列基本互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸和由相互退火的模板组成的、与步骤(a)中的两种引物退火的双链核酸；
(d)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(c)中获得的、与两种引物退火的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸和由相互退火的模板组成的、与步骤(a)中的两种引物退火的双链核酸；和
(e)在步骤(d)中，重新利用步骤(d)中获得的、与两引物退火的双链核酸。
本发明的第七方面涉及核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列基本互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸和由相互退火的模板组成的、与步骤(a)中的两种引物退火的双链核酸；
(d)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(c)中获得的、与两种引物退火的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由模板和引物延伸链组成的双链核酸；
(e)利用内切核酸酶，切割步骤(d)中获得的、由模板和引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；和
(f)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(e)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以合成置换后的链。
在第4-7方面，内切核糖核酸酶，如RNA酶H可用作内切核酸酶。
在其中应用了RNA酶H的第1-7方面中，可以选用来自于大肠杆菌、栖热袍菌属细菌、栖热菌属细菌、火球菌属细菌、古生球菌属细菌、芽胞杆菌属细菌等的RNA酶H。
在本发明的第1-7方面，在靶核酸的核酸序列中，进行特异性扩增的区域的合适长度的示例为200bp或更小。
对于本发明的第1-7方面，可以选用下列通式所表示的嵌合寡核苷酸引物：
通式：5′-dNa-Nb-dNc-3′
(a：等于或大于11的整数；b：等于或大于1的整数；c：0或等于或大于1的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可为Ns所替换，并且可对3′末端的核苷酸进行修饰，这样不会发生通过DNA聚合酶的作用而进行的从3′末端开始的延伸)。
这些嵌合寡核苷酸引物的范例是c为0的引物以及其中的核苷酸类似物是脱氧肌苷核糖(deoxyriboinosine)核苷酸或脱氧尿嘧啶核糖(deoxyribouracil)核苷酸、而修饰的核糖核苷酸为(α-S)核糖核苷酸的引物。此外，当应用这样的嵌合寡核苷酸引物时，DNA延伸反应是在适合于引物的DNA延伸反应温度下进行的。
第1-7方面的扩增方法包括在含有可促进核酸退火到引物上的物质的退火溶液中，将作为模板的核酸分子退火到嵌合寡核苷酸引物上，而这些引物基本上是与作为模板的核酸的核苷酸序列互补的。例如，退火溶液可含有亚精胺和/或丙二胺。等于或大于90℃下，对含有作为模板的核酸及与作为模板的核酸序列基本互补的嵌合寡核苷酸引物的退火溶液进行孵育，随后将溶液冷却到进行扩增反应的温度或低于此温度，从而来进行退火。
可在缓冲溶液中进行本发明1-7方面的扩增反应，而此缓冲溶液中含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分。
在本发明的1-7方面中，例如，选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的BstDNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶可用作具有链置换活性的DNA聚合酶。
在本发明1-7方面的一个实施方案中，来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶被用作具有链置换活性的DNA聚合酶，而来自于大肠杆菌、火球菌属细菌或古生球菌属细菌的RNA酶H用作内切核酸酶。RNA酶H的范例是来自于大肠杆菌的I型RNA酶H或来自于火球菌属细菌或古生球菌属细菌的II型RNA酶H。
在本发明的第1-7方面中，可以利用具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶可用作这样的DNA聚合酶，并且在允许DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质存在下进行扩增反应。允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质的范例是锰离子。
在抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质存在下，可利用本发明第1-7方面中的扩增方法对靶核酸进行扩增。抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质的范例为乙膦甲酸。
可利用单链DNA或双链DNA作为模板来实施本发明的第1-7方面。如果作为模板的核酸是双链DNA，那可在将其转化为单链DNA后再进行扩增反应。
作为模板的核酸可以是以RNA为模板通过逆转录反应得到的cDNA。一方面，扩增反应是在以RNA为模板通过逆转录反应合成cDNA后进行的。具有逆转录酶活性的DNA聚合酶可用于逆转录反应。例如，可利用具有逆转录酶活性和链置换活性的DNA聚合酶来进行逆转录反应并合成与模板互补的延伸链。这样的DNA聚合酶的范例是来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶或来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
在本发明的第1-7方面中，可在等温条件下进行扩增反应。可在脱氧核糖核苷三磷酸类似物如脱氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物存在下进行扩增反应。
本发明的第8方面涉及用于核酸扩增的组合物，其包含：
(a)至少一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)内切核酸酶；及
(c)具有链置换活性的DNA聚合酶。
本发明的第9方面涉及用于核酸扩增的组合物，其包含有：
(a)至少两种基本上与作为模板的双链核酸的各条链的核苷酸序列分别互补的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)内切核酸酶；及
(c)具有链置换活性的DNA聚合酶。
本发明的第10方面涉及用于核酸扩增的组合物，其是通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和内切核酸酶混合而获得的，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个。
本发明的第11方面涉及用于核酸扩增的组合物，其是通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种引物和内切核酸酶混合而制得的，其中每种引物都是嵌合寡核苷酸引物，此引物与作为模板的双链核酸的每条链的核苷酸序列基本互补，并且此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个。
本发明第8-11方面的组合物中包含的引物的范例为下面通式表示的嵌合寡核苷酸引物：
通式：5′-dNa-Nb-dNc-3′
(a：等于或大于11的整数；b：等于或大于1的整数；c：0或等于或大于1的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可为Ns所替换，并且可对3′末端的核苷酸进行修饰，这样不会发生通过DNA聚合酶的作用而进行的从3′末端开始的延伸)。
这些嵌合寡核苷酸引物的范例是c为0的引物以及其中的核苷酸类似物是脱氧肌苷核糖核苷酸或脱氧尿嘧啶核糖核苷酸、而修饰的核糖核苷酸为(α-S)核糖核苷酸的引物。
本发明的第8-11方面的组合物含有适于核酸扩增反应的缓冲成分。例如，其可含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分。
通过含有选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶作为具有链置换活性的DNA聚合酶的组合物来例示本发明的第8-11方面。内切核糖核酸酶如RNA酶H可用作内切核酸酶。RNA酶H的范例是来自于大肠杆菌的、来自于栖热袍菌属细菌的、来自于栖热菌属细菌的、来自于火球菌属细菌的、来自于古生球菌属细菌的或来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H。
在一个实施方案中，本发明的第8-11方面的组合物中包含有来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶作为具有链置换活性的DNA聚合酶，来自于大肠杆菌、火球菌属细菌或古生球菌属细菌的RNA酶H作为内切核酸酶。RNA酶H的范例是来自于大肠杆菌的I型RNA酶H或来自于火球菌属细菌或古生球菌属细菌的II型RNA酶H。
本发明的第8-11方面的组合物包含有具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶可用作这样的DNA聚合酶，其可在允许DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质存在下进行应用。允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质的范例是锰离子。
本发明的第8-11方面的组合物包含有可抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质。可抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质的范例为乙膦甲酸。此外，此组合物可含有脱氧核糖核苷三磷酸类似物，如脱氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
本发明的第12方面涉及用于本发明第1-3方面的核酸扩增方法的核酸扩增组合物，此组合物包含：
(a)RNA酶H；及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
本发明的第13方面涉及用于本发明第4-7方面的核酸扩增方法的核酸扩增组合物，此组合物包含：
(a)RNA酶H；及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
内切核糖核酸酶，如RNA酶H可用作本发明第13方面的组合物中所包含的内切核酸酶。
选自来自于大肠杆菌的、来自于栖热袍菌属细菌的、来自于栖热菌属细菌的、来自于火球菌属细菌的、来自于古生球菌属细菌的或来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H的RNA酶H可用作本发明第12或13方面的组合物中所包含的RNA酶H，而本发明的第12或第13方面的组合物是包含有RNA酶H的。
本发明第12或13方面的组合物可进一步包含适于核酸扩增反应的缓冲成分。例如，此组合物含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分。
通过含有选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶作为具有链置换活性的DNA聚合酶的组合物来例示本发明的第12或13方面。内切核糖核酸酶如RNA酶H可用作内切核酸酶。RNA酶H的范例是来自于大肠杆菌的、来自于栖热袍菌属细菌的、来自于栖热菌属细菌的、来自于火球菌属细菌的、来自于古生球菌属细菌的或来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H。
在一个实施方案中，本发明的第12或13方面的组合物中包含有来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶作为具有链置换活性的DNA聚合酶，来自于大肠杆菌、火球菌属细菌或古生球菌属细菌的RNA酶H作为内切核酸酶。RNA酶H的范例是来自于大肠杆菌的I型RNA酶H或来自于火球菌属细菌或古生球菌属细菌的II型RNA酶H。
本发明的第12或13方面的组合物包含有具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的BcaDNA聚合酶可用作这样的DNA聚合酶，其可在允许DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质存在下进行应用。允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质的范例是锰离子。
本发明的第12或13方面的组合物包含有可抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质。可抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质的范例为乙膦甲酸。此外，此组合物可含有脱氧核糖核苷三磷酸类似物，如脱氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
本发明第14方面涉及用于本发明第1-3方面的核酸扩增方法的核酸扩增试剂盒，此试剂盒含有：
(a)RNA酶H；及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
本发明第15方面涉及用于本发明第4-7方面的核酸扩增方法的核酸扩增试剂盒，此试剂盒含有：
(a)内切核酸酶；及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
内切核糖核酸酶，如RNA酶H可用作本发明第15方面的试剂盒中所包含的内切核酸酶。
通过含有选自来自于大肠杆菌的、来自于栖热袍菌属细菌的、来自于栖热菌属细菌的、来自于火球菌属细菌的、来自于古生球菌属细菌的或来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H的RNA酶H的试剂盒例示了本发明第14或15方面包含有RNA酶H的试剂盒。
本发明第14或15方面的试剂盒可进一步包含有适于核酸扩增反应的缓冲成分。例如，此组合物含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分。此试剂盒可含有退火溶液，而此退火溶液含有可促进作为模板的核酸退火到与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补的引物上的物质。例如，退火溶液可含有亚精胺和/或丙二胺。
通过含有选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶来例示本发明第14或15方面的试剂盒中包含的、并具有链置换活性的DNA聚合酶。
在一个实施方案中，本发明第14或15方面中的试剂盒含有来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，也含有来自于大肠杆菌、火球菌属细菌或古生球菌属细菌的RNA酶H。RNA酶H的范例是来自于大肠杆菌的I型RNA酶H或来自于火球菌属细菌或古生球菌属细菌的II型RNA酶H。
本发明的第14或15方面的试剂盒可以含有具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶可用作这样的DNA聚合酶。此试剂盒可含有允许DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质。允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质的范例是锰离子。
本发明的第14或15方面的试剂盒含有可抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质。可抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质的范例为乙膦甲酸。此外，此试剂盒可含有脱氧核糖核苷三磷酸类似物，如脱氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
本发明第16方面涉及用于本发明第1-3方面的核酸扩增方法的核酸扩增试剂盒，此试剂盒以包装形式存在，并且含有说明以指导具有链置换活性的DNA聚合酶及RNA酶H的应用。
本发明第17方面涉及用于本发明第4-7方面的核酸扩增方法的核酸扩增试剂盒，此试剂盒以包装形式存在，并且含有说明以指导具有链置换活性的DNA聚合酶及内切核酸酶的应用。
本发明第18方面涉及用于核酸扩增的试剂产品，由包装材料和用于对包裹在包装材料中的核酸进行扩增的试剂组成，其中用于扩增核酸的试剂包括具有链置换活性的DNA聚合酶和/或RNA酶H，并且在粘贴到包装材料的标签中或粘贴到包装材料的说明书中说明了所述用于扩增核酸的试剂可以用于在等温条件下进行核酸扩增。
本发明的第19方面涉及用于核酸扩增的试剂产品，由包装材料和用于对包裹在包装材料中的核酸进行扩增的试剂组成，其中用于扩增核酸的试剂包括具有链置换活性的DNA聚合酶和/或内切核酸酶，并且在粘贴到包装材料的标签中或粘贴到包装材料的说明书中说明了所述用于扩增核酸的试剂可以用于在等温条件下进行核酸扩增。
本发明第20方面涉及样品中靶核酸的检测方法，此方法包括：
(a)利用本发明第1-7方面中的核酸扩增方法进行核酸扩增；及
(b)对步骤(a)中扩增的核酸进行检测。
本发明第20方面中的检测方法可包括利用探针对扩增后的核酸进行检测。此探针可以是已标记有标记物质的探针。例如，可选用用间隔了导致淬灭状态的距离的两种或多种荧光物质标记的RNA探针。
本发明第21方面涉及用于第20方面的嵌合寡核苷酸引物。可通过下列通式所表示的嵌合寡核苷酸引物来例示嵌合寡核苷酸引物：
通式：5′-dNa-Nb-dNc-3′
(a：等于或大于11的整数；b：等于或大于1的整数；c：0或等于或大于1的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可为Ns所替换，并且可对3′末端的核苷酸进行修饰，这样不会发生通过DNA聚合酶的作用而进行的从3′末端开始的延伸)。
这些嵌合寡核苷酸引物的范例是c为0的引物以及其中的核苷酸类似物是脱氧肌苷核糖核苷酸或脱氧尿嘧啶核糖核苷酸、而修饰的核糖核苷酸为(α-S)核糖核苷酸的引物。
本发明第21方面的引物的范例是用于检测病原微生物或与疾病相关的基因的引物。用于检测病原微生物，如肠出血性大肠杆菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、结核分支杆菌、衣原体、乳头状瘤病毒、丙型肝炎病毒或类病毒的嵌合寡核苷酸引物也包括在本发明之中。
本发明第22方面涉及用于检测肠出血性大肠杆菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有选自SEQ ID NO：31-34、47、48、51-53、64-72、84、85、113、114、130和131的核苷酸序列。
本发明第23方面涉及用于检测类病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有选自SEQ ID NO：59、60、119、120、122和123的核苷酸序列。
本发明第24方面涉及用于检测肉毒梭菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO：116或117所表示的核苷酸序列。
本发明第25方面涉及用于检测乳头状瘤病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO：96或97所表示的核苷酸序列。
本发明第26方面涉及用于检测丙型肝炎病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有选自SEQ ID NO：101、102、138、139、200、201、205和206的核苷酸序列。
本发明第27方面涉及用于检测金黄色葡萄球菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO：136或137所表示的核苷酸序列。
本发明第28方面涉及用于检测结核分支杆菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有选自SEQ ID NO：155、156、159-162、194和195的核苷酸序列。
本发明第29方面涉及用于检测衣原体的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有选自SEQ ID NO：157、158、203和204的核苷酸序列。
本发明第30方面涉及用于本发明第1-5方面中的核酸扩增方法的核酸扩增试剂盒，此试剂盒含有第20-29方面的嵌合寡核苷酸引物。
本发明第31方面涉及用于本发明第20方面的靶核酸检测方法的靶核酸检测试剂盒，此试剂盒含有本发明第21-29方面的嵌合寡核苷酸引物。
本发明第32方面涉及用于本发明第20方面的方法中的探针。
本发明第33方面涉及与通过本发明第1-7方面的方法扩增得到的核酸进行杂交的探针。
本发明第34方面涉及与利用本发明第21-29方面的嵌合寡核苷酸引物扩增得到的区域进行杂交的探针。
本发明第32-34方面中的探针可为已标记有标记物质，如用间隔了导致淬灭状态的距离的两种或多种荧光物质标记的RNA探针。
本发明第35方面涉及用于本发明第20方面的核酸检测方法中的试剂盒，此试剂盒含有本发明第32-34方面的探针。
本发明第36方面涉及核酸扩增方法，此方法包括利用具有链置换活性的DNA聚合酶来实现模板交换反应。
本发明第36方面所用的具有链置换活性的DNA聚合酶的示例为来自于大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
本发明第37方面涉及含有固定化核酸的物质的制备方法，而此物质中的核酸是排列在预定的区域中的，此方法包括：
(a)利用本发明第1-7方面的核酸扩增方法来扩增待固定化的核酸；及
(b)将步骤(a)中扩增得到的核酸排列并固定在预定的区域中。
本发明第38方面涉及含有固定化核酸的物质，而此物质中的核酸是利用本发明第37方面的方法制备并排列在预定的区域中的。
本发明第39方面涉及大量制备核酸的方法，此方法包括：
(a)利用本发明第1-7方面的核酸扩增方法扩增核酸；及
(b)收集步骤(a)中扩增得到的核酸。
本发明第40方面涉及核酸扩增方法，此方法包括：
(a)复制含有待扩增序列的DNA或RNA以制备作为模板的核酸；及
(b)利用本发明第1-7方面的核酸扩增方法来对步骤(a)中获得的作为模板的核酸进行扩增。
本发明第41方面涉及对核酸中的核苷酸序列进行确定的方法，此方法包括按照本发明第1-7、第39或40方面的方法来进行核酸扩增。
附图简述
图1图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图2图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图3图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图4图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图5图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图6图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图7图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图8图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图9图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图10图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。A：ICAN；B：PCR。
图11图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图12图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图13图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图14图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图15图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图16图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图17图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图18图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图19图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图20图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图21图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图22图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图23图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图24图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图25图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图26图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图27图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图28图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱和斑点印迹图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图29图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图30为一图表，其对比了按照本发明的方法和PCR法扩增得到的产物的量。
图31图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图32图解了扩增后DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图33图解了本发明中的核酸扩增方法的一个方面。
图34图解了本发明中的核酸扩增方法的一个方面。
图35图解了本发明中的核酸扩增方法的一个方面。
图36图解了本发明中的核酸扩增方法的一个方面。
图37图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图38图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
图39图解了扩增后DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，而此DNA片段是按照本发明中的核酸扩增方法扩增得到的。
发明详述
正如此处所用的，脱氧核糖核苷酸(也称作dN)指糖部分由D-2-脱氧核糖组成的核苷酸。此脱氧核糖核苷酸包括，如以腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶做碱基部分的脱氧核糖核苷酸。此外，此脱氧核糖核苷酸也包括具有修饰的碱基如7-脱氮鸟苷和脱氧核糖核苷酸类似物如脱氧肌苷核苷酸的脱氧核糖核苷酸。
正如此处所用的，核糖核苷酸(也称作N)指糖部分由D-核糖组成的核苷酸。此核糖核苷酸包括，如以腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶做碱基部分的核糖核苷酸。核糖核苷酸也包括修饰的核糖核苷酸，如α-位磷酸基团的氧原子为硫原子所取代(也称作(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)的修饰核苷酸或其衍生物。
正如此处所用的，嵌合寡核苷酸引物指含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的引物。此引物可含有核苷酸类似物和/或修饰的核糖核苷酸。
本发明中所用的嵌合寡核苷酸引物包括任何具有定位于引物的3′-末端或3′-末端侧的核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物可在本发明的方法中用于核酸链的延伸，可利用内切核酸酶对其进行切割，并且其可用来实现链置换反应。
正如此处所用的，3′-末端侧指从核酸，如引物的中心到核酸的3′-末端的部分。同样的，5′-末端侧指从核酸的中心到核酸的5′-末端的部分。
正如此处所用的，内切核酸酶可为任何作用于从嵌合寡核苷酸引物开始延伸DNA而生成的双链DNA并在含有核糖核苷酸的引物部分对其进行特异性切割的内切核酸酶，此处的嵌合寡核苷酸引物是已退火到作为模板的核酸上的嵌合寡核苷酸引物。
正如此处所用的，DNA聚合酶指可利用DNA链作模板从头合成DNA链的酶。DNA聚合酶包括天然DNA聚合酶和具有上述活性的变体酶。例如，这样的酶包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5′→3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶、及具有逆转录酶活性或内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
正如此处所用的，“链置换活性”指可实现链置换的活性，也即，其可在作为模板的核酸序列基础上开始DNA复制并置换DNA链以释放退火到模板链上的互补链。此外，由于链置换作用而从作为模板的核酸中释放出的DNA链在此处可称为“置换后的链”。
在下文中，对本发明作详细的描述。
(1)用于本发明中的嵌合寡核苷酸引物
本发明的方法中选用的引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一个。这样的引物也包括寡核苷酸引物，此引物具有未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸。
本发明的方法中选用的嵌合寡核苷酸引物是具有与作为模板的核酸的部分核苷酸序列基本互补的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。其有助于在选用的条件下延伸DNA链。此外，核糖核苷酸定位于嵌合寡核苷酸引物的3′-末端或3′-末端侧。一般将引物设计为可与待扩增区域的上游部分相互补，也即相应于作为模板的核酸中待扩增区域的核苷酸序列的3′部分。正如此处所用的，“基本互补的核苷酸序列”只在所用的反应条件下，可与模板DNA退火的核苷酸序列。
本发明中的方法中所用的嵌合寡核苷酸引物可含有一或多个修饰的核糖核苷酸。正如此处所用的，核糖核苷酸可为定位于嵌合寡核苷酸引物的3′-末端或3′-末端侧的未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其可为内切核酸酶所识别或切割。此核糖核苷酸包括上述未修饰的核糖核苷酸和修饰的核糖核苷酸。只要其不使引物的功能丧失，未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、或其结合可用作本发明中的嵌合寡核苷酸引物。修饰的核糖核苷酸的示例包括，但并不局限于结合到磷酸基团上的氧原子为硫原子所替代的(α-S)核糖核苷酸、以及核糖第2位的羟基为甲氧基所替代的核糖核苷酸。这些含有修饰的核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物可利用如(α-S)核糖核苷三磷酸或2-OMe-RNA-CE亚磷酰胺试剂(Glen Research)来制备，而(α-S)核糖核苷三磷酸可利用美国专利NO.5,003,097中描述的通过硫化反应试剂(Glen Research)进行的方法来制备。
本发明的扩增方法中选用的嵌合寡核苷酸引物可设计为含有修饰的核糖核苷酸，而此核糖核苷酸可给予其对内切核酸酶切割的抗性。这样的引物是有用的，因为我们在扩增反应步骤中可通过内切核酸酶控制切割位点。
在本发明的方法中可选用一或两种嵌合寡核苷酸引物，这要依赖于所需的扩增后DNA片段的形式(单链或双链)。特别的，当所需的为单链DNA时，选用一种嵌合寡核苷酸引物，而当所需的为双链DNA时，就要选用两种引物。
对本发明的方法中选用的嵌合寡核苷酸引物的长度没有特别的限制，但其优选的为约12-100个核苷酸，更优选的为约15-40个核苷酸，对此没有任何限制。优选的，嵌合寡核苷酸的核苷酸序列与作为模板的核酸基本互补，这样其在选用的反应条件下就可与作为模板的核酸退火。在引物的3′-末端或3′-末端侧含有可为内切核酸酶所识别的序列，而内切核酸酶在下文描述的步骤中有应用。
例如，虽然没有限制本发明的意图，但具有下列通式所表示的结构的寡核苷酸可在本发明的DNA合成方法中用作引物：
通式：5′-dNa-Nb-dNc-3′
(a：等于或大于11的整数；b：等于或大于1的整数；c：0或等于或大于1的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可为Ns所替换，并且可对3′末端的核苷酸进行修饰，这样不会发生通过DNA聚合酶的作用而进行的从3′末端开始的延伸)。
例如，通式所表示的嵌合寡核苷酸引物可优选的用于本发明中，其中通式中的a＝等于或大于11的整数、b＝1且c＝0、b＝2且c＝0、b＝3-5且c＝0、或b＝2且c＝0-5。本发明中的方法中选用的嵌合寡核苷酸引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸的长度优选为1-15聚体，更优选的为1-10聚体，最优选的为1-5聚体。对通式中C的值没有特别限制，在本发明的方法中可选用任何值。一般来讲，优选5或更小的值。在反应中，C的值选2而不是4、2而不是3、选1而不是2时获得了较好的结果。特别的，在c＝0的情况下的反应最有效。
本发明中选用的嵌合寡核苷酸引物具有一种结构，而在此结构中，内切核酸酶可在含有核糖核苷酸的位点处识别或切割利用DNA聚合酶从引物开始延伸的DNA链(引物延伸链)，而此核糖核苷酸定位于嵌合寡核苷酸引物的3′末端或3′末端侧。虽然没有限制本发明的意图，但例如，当RNA酶H作用于从通式所表示的、已与作为模板的核酸退火的嵌合寡核苷酸引物开始延伸形成的双链DNA时，可在核糖核苷酸部分对嵌合寡核苷酸引物进行切割。随后，产生了在寡核苷酸引物和通过延伸合成的DNA链间导入了切口的双链DNA。然后，利用DNA聚合酶从切口位点开始进行链置换反应。因此，任何可用于从引物的3′末端开始延伸核酸链的嵌合寡核苷酸引物、可利用内切核酸酶进行切割的嵌合寡核苷酸引物、以及DNA聚合酶利用其可实现链置换反应的嵌合寡核苷酸引物可用于本发明的方法中。此外，本发明的嵌合寡核苷酸引物包括一嵌合寡核苷酸引物，对其3′末端进行了修饰这样就可避免利用DNA聚合酶的作用进行DNA延伸，但利用内切核酸酶对其切割后就可立即从3′末端进行DNA延伸。
此外，用于RNA聚合酶的启动子序列可包含在嵌合寡核苷酸引物的5′末端侧。这些RNA聚合酶的示例为T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
此外，本发明的方法中选用的嵌合寡核苷酸引物可含有核苷酸类似物和其他物质。说的更精确一些，只要引物实现通过DNA聚合酶的作用而从3′末端开始的聚合延伸反应的功能不丧失，本发明的一或多种嵌合寡核苷酸引物中就可包含一或多种核苷酸类似物。核苷酸类似物的多种类型可结合使用。核苷酸类似物的示例包括，但并不局限于脱氧肌苷核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、具有修饰碱基如7-脱氮鸟嘌呤的核苷酸类似物、具有核糖衍生物的核苷酸类似物等。此外，只要它们保留上述功能，本发明中选用的嵌合寡核苷酸引物可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或具有多种修饰如添加已标记的化合物的核苷酸类似物。
在引物中掺入核苷酸类似物可有效的抑制引物高级结构的形成并可有效抑制其与模板形成的退火结构的稳定化。为了同样的目的，可将核糖核苷酸掺入引物中。虽然没有对本发明进行限制的意图，但可优选选用修饰的核糖核苷酸如(α-S)核糖核苷酸来防止引物为非特异性内切核酸酶所消化(RNA酶)。
按照亚磷酰胺法，利用如Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成仪就可合成含有所需核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。另外，包括磷酸三酯法、H-磷酸酯法和硫代膦酸酯法在内的任何方法都可用于合成嵌合寡核苷酸引物。
(2)本发明中应用的内切核酸酶
任何能够作用于从上文(1)中描述的嵌合寡核苷酸引物开始的、通过DNA延伸作用产生的双链DNA并切割延伸链以实现链置换反应的内切核酸酶都可选用在本发明之中，而嵌合寡核苷酸引物是已与作为模板的核酸退火的。说的更精确些，内切核酸酶是在双链DNA的嵌合寡核苷酸引物部分中产生切口的酶。可用于本发明中的内切核酸酶的示例包括，但并不局限于核糖核酸酶。在核糖核酸酶中，优选的选用可作用于由DNA和RNA组成的双链核酸的RNA部分的内切核糖核酸酶H(RNA酶H)。包括嗜中温和抗热核酸酶在内的、具有上述活性的内切核酸酶可优选的应用于本发明之中。例如，源自大肠杆菌的RNA酶H可用于本发明的方法中在约50-70℃下进行的反应中，而此反应在下文实施例中有所描述。优选用于本发明中的抗热核酸酶的实例包括，但并不局限于商业购买的核糖核酸酶、HybridaseTM耐热RNA酶H(Epicenter Technologies)及源自芽胞杆菌属嗜热细菌的、源自栖热菌属细菌的、源自火球菌属细菌的、源自栖热袍菌属细菌的、源自古生球菌属细菌的RNA酶H等。此外，天然内切核酸酶及变体内切核酸酶都是优先选用的。按照参考实施例中所描述的酶单位测定法，此处的RNA酶H的酶单位为表达值。
只要可用于本发明的方法中，RNA酶H并不局限于特定的RNA酶H。例如，RNA酶H可为来源于多种病毒、噬菌体、原核或真核生物的RNA酶H。RNA酶H可为细胞RNA酶H或病毒RNA酶H。细胞RNA酶H的示例为大肠杆菌RNA酶HI，而病毒RNA酶H的示例为HIV-1。I型、II型或III型RNA酶H可选用在本发明的方法中。例如，优选选用源自大肠杆菌的RNA酶HI、或源自火球菌属细菌或古生球菌属细菌的RNA酶HII，对此没有任何限制。
利用本发明的方法中选用的RNA酶H进行的切割反应的效率依引物3′末端附近的核苷酸序列不同而变动，并可影响所需DNA的扩增效率。因此，为所选用的RNA酶H设计最佳的引物是很自然的事情。
正如此处所用的，术语“导入切口”或“切口”指对双链核酸的两条链中的一条进行内部切割。例如，RNA酶H作用于由DNA和含有核糖核苷酸的DNA组成的杂交双链核酸，从而在两链中的核糖核苷酸部分选择性切割含有核糖核苷酸的链，这样就在杂交双链核酸中导入了一个切口。
(3)本发明中的DNA聚合酶
具有可作用于DNA的链置换活性的DNA聚合酶可用于本发明中。特别的，优选基本缺乏5′→3′内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
正如此处所用的，“链置换活性”指可实现链置换的活性，说的更确切些，其可在作为模板的核酸序列基础上进行DNA复制并置换DNA链以释放退火到模板链上的互补链。此外，由于链置换作用而从作为模板的核酸中释放出的DNA链在此处称为“置换后的链”。
任何具有链置换活性的DNA聚合酶可用于本发明中。其示例包括源自芽胞杆菌属嗜热细菌如热坚芽孢杆菌(下文称为B.ca)和嗜热脂肪芽胞杆菌(下文称为B.st)并缺乏5′→3′内切核酸酶活性的DNA聚合酶变体、以及大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段(克列诺片段)。本发明优选的选用嗜中温和抗热DNA聚合酶。
B.ca为嗜热细菌，其最佳生长温度约为70℃。已知源自此细菌的Bca DNA聚合酶具有DNA依赖型DNA聚合酶活性、RNA依赖型聚合酶活性(逆转录活性)、5′→3′外切核酸酶活性和3′→5′外切核酸酶活性。此酶可为从其最初来源纯化的酶或可为利用遗传工程技术制备得到的重组体蛋白。可利用遗传工程技术或其他方法对此酶进行修饰，如取代、缺失、添加或插入。这些酶的示例包括BcaBEST DNA聚合酶(TakaraShuzo)，而此酶为缺乏5′→3′外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。
已知某些DNA聚合酶在特定条件下具有内切核酸酶活性，如RNA酶H活性。这样的DNA聚合酶可用于本发明的方法中。在一个方面中，可在允许RNA酶H活性表达的条件，如Mn2+存在的条件下选用DNA聚合酶。在这种情况下，可在不添加RNA酶H的情况下实施本发明的方法。本发明的发明者们第一次证明了Bca DNA聚合酶可在含有Mn2+的缓冲液中展示RNA酶活性，并且证明可在不含有除Bca DNA聚合酶以外的任何酶的反应混合物中实施本发明中的核酸扩增方法。上述提及的方法不限于Bca DNA聚合酶的应用。已知具有RNA酶H活性的DNA聚合酶，如源自嗜热栖热菌的Tth DNA聚合酶可用于本发明中。
(4)本发明中选用的缓冲溶液的组成
本发明中选用的是含有缓冲成分、镁盐或另一种金属盐、及dNTP的反应缓冲液。可想而知，需要根据对选用的金属的要求和对选用的酶的要求来优化盐的类型和浓度。优选选用的缓冲成分的示例包括，但并不局限于N-二[羟乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、tris及磷酸盐(如磷酸钠和磷酸钾)。在这些缓冲成分中，本发明优选的选用含有N-二[羟乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、tris及磷酸盐作缓冲成分的缓冲液。虽然没有对本发明进行限制的意图，但如，当反应温度较高时，优先选用温度变化可导致很小的pH变化的N-二[羟乙基]甘氨酸缓冲液。依赖于选用的RNA酶H的类型，优先的选用HEPES缓冲液。因此，要根据选用的反应温度、内切核酸酶或DNA聚合酶等来选择最佳的缓冲液。缓冲成分的最终浓度为5-100mM，优选20-50mM。pH为6.0-9.5，优选7.0-9.2。例如，优先选用pH7.5-9.2、含有22-46mMTricine的缓冲液或pH7.0-8.0、含有25-50mM磷酸钾的缓冲液。优先选用的镁盐的示例包括，但并不局限于氯化镁、醋酸镁或硫酸镁。镁盐的终浓度为1-20mM，优选2-10mM。作为DNA延伸反应底物的混合物中dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物)的终浓度为0.1-3.0mM，优选0.2-1.2mM。50μl反应溶液中选用的引物的量为1-1000pmol，优选10-150pmol。此外，例如为了稳定扩增反应，反应混合物中可含有添加剂。混合物中可添加终浓度为≤0.1％的牛血清白蛋白、终浓度为≤10％的二甲亚砜(DMSO)、终浓度为≤4mM的二盐酸腐胺或终浓度为≤0.01％的丙二胺。此外，反应混合物中也可含有NMP(1-甲基-2-吡咯酮)、甘油、聚乙二醇、二甲亚砜和/或甲酰胺。我们预期这些有机溶剂的添加将会减少寡核苷酸引物的非特异性退火。
可通过添加抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质如乙膦甲酸(PFA)来施行本发明中的方法。如果添加了可抑制逆转录活性的物质，就可减少除靶核酸之外的非特异性产物的扩增。
在另一方面中，在扩增反应前，作为模板的核酸与本发明选用的嵌合寡核苷酸引物的退火可在本发明的检测、扩增或制备方法中有效的减少寡核苷酸引物的非特异性退火。优选利用含有可促进退火的物质如多胺(如精胺或亚精胺)或丙二胺的退火溶液来进行退火。优选的，含有多胺的退火溶液也含有盐。例如，退火溶液可含有氯化钠、氯化钾、醋酸钾、醋酸钠等及多胺，而没有任何限制。
一般通过在双链核酸变性温度(如90℃或更高温度)下孵育含有引物和作为模板的核酸的退火溶液，然后将退火溶液冷却到本发明的方法中的反应温度或更低温度下来进行退火。
退火后，通过向反应混合物中进一步添加其他必需组分，如DNA聚合酶、RNA酶H及dNTP来起始本发明中的核酸扩增反应。
在50μl反应体积中，作为内切核酸酶范例的、源自大肠杆菌的RNA酶H的含量优选为3-200U，更优选为15-60U。类似的，在50μl反应混合物中，作为内切核酸酶范例的、源自火球菌属细菌或源自古生球菌属细菌的RNA酶H的含量优选为3-200U，更优选为4-40U。在50μl反应混合物中，作为DNA聚合酶范例的BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的含量优选为0.5-100U，更优选为1-22U。
当内切核酸酶和DNA聚合酶组合用于本发明的方法中时，如，优先选用的是源自大肠杆菌的RNA酶H、源自火球菌属细菌的RNA酶H、或源自古生球菌属细菌的RNA酶H与BcaBEST DNA聚合酶的组合，而没有任何限制。我们认为，内切核酸酶和DNA聚合酶的优选单位可依酶的类型而变化。在这样的情况下，可以检测灵敏度或扩增产物量的提高为指标对添加的酶量和选用的缓冲溶液的组成进行调节。在任一情况下，很自然的要依赖选用的酶的类型来对反应缓冲溶液的组成等进行优化。
(5)本发明中的核酸扩增方法
通过利用上文(1)中所述的至少一种寡核苷酸引物结合上文(2)中所述的内切核酸酶和上文(3)中所述的DNA聚合酶来实施本发明中的方法。另外，在上述允许RNA酶H活性表达的条件下可选用具有RNA酶H活性的DNA聚合酶。
用于PCR等的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物)可优选的用作核苷三磷酸底物，而这些核苷三磷酸在本发明的方法中的延伸反应中可作为底物。只要其可作为选用的DNA聚合酶的底物，dNTP就可含有dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)类似物如7-脱氮-dGTP、dITP的三磷酸盐等。也可选用dNTP或dNTP类似物的衍生物。也可含有具有功能基团的衍生物，如具有氨基的dUTP。嵌合寡核苷酸引物也可用于本方法中。按照传统的合成方法，可利用如DNA合成仪来制备引物。嵌合寡核苷酸引物与正常寡核苷酸引物可结合用于本发明的方法中。
如果选用的酶的活性在反应过程中可能降低，那就要在本发明的方法中的反应过程中进一步添加酶。虽然没有对本发明进行限制的意图，但如，在选用了RNA酶H的反应中可进一步添加源自大肠杆菌的RNA酶H。添加的酶可与反应开始时的反应混合物中含有的酶相同，或其可为展示相同活性的不同的酶。因此，只要反应过程中酶的添加提供了效用，如提高了检测灵敏度或增加了扩增产物量，待添加的酶的类型和性质并非是特定的。
可从含有作为模板的核酸的任何样品中制备或分离可用作本发明中的模板的核酸(DNA或RNA)。另外，按照本发明，样品可直接用于核酸扩增反应中。含有核酸的样品的示例包括，但并不局限于取自生物体的样品如全血、血清、血块黄层、尿、粪便、脑脊液、精液、唾液、组织(如癌组织或淋巴结)及细胞培养物(如哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物)、含有核酸如类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母菌、植物和动物的样品、怀疑被污染或已感染有微生物如病毒或细菌(如食品或生物制剂)的样品、以及含有有机体如土壤和废水的样品。样品可为含有核酸的制剂，而此制剂是按照已知的方法对上述样品进行加工制得的。可用于本发明的制剂的示例包括细胞破坏产物或通过对产物进行分级分离得到的样品、样品中的核酸、或对其中的特异性核酸分子如mRNA进行了富集的样品。此外，优先选用核酸，如利用已知方法、对样品中含有的核酸进行扩增而得到的DNA或RNA。
通过如利用去污剂溶解、超声、利用玻璃珠振荡或搅拌、或弗氏压碎器来处理上述的物质，从而制备含有核酸的制剂，对此没有任何限制。在某些情况下，对制剂进行进一步加工以对核酸进行纯化是有利的(如在内源核酸酶存在的情况下)。在这样的情况下，核酸是通过已知的方法如苯酚提取、色谱法、离子交换法、凝胶电泳法或密度梯度离心法进行纯化的。
当需要对含有源自RNA的序列的核酸进行扩增时，可利用cDNA作模板来实施本发明中的方法，而此cDNA是以RNA为模板、通过逆转录反应合成的。任何可使引物用于逆转录反应中的RNA都可用于本发明的方法中，这样的RNA包括样品中的总RNA、RNA分子如mRNA、tRNA和rRNA及特异性RNA分子。
在选用的反应条件下，任何可退火到模板RNA上的引物可用于逆转录反应中。此引物可为含有与作为模板的特异性RNA互补的核苷酸序列的引物(特异性引物)、寡-dT(脱氧胸腺嘧啶)引物、以及具有随机序列的引物(随机引物)。鉴于特异性退火，用于逆转录的引物的长度优选为6个核苷酸或更多，更优选为9个核苷酸或更多。考虑到寡核苷酸合成，优选的引物长度为100个核苷酸或少于100个核苷酸，更优选为30个核苷酸或少于30个核苷酸。嵌合寡核苷酸引物可用作逆转录反应的引物。嵌合寡核苷酸引物也可用作本发明的核酸扩增方法中的链置换反应引物，而此核酸扩增方法是以通过逆转录反应获得的cDNA为模板进行的。这样的引物可为具有上文(1)中所描述的特性并可用于利用RNA进行的逆转录反应中的任何引物。
任何具有以RNA为模板合成cDNA的活性的酶都可用于逆转录反应中。其示例包括源自多种来源的逆转录酶，如源自禽类成髓细胞瘤病毒的逆转录酶(AMV RTase)、源自Molony鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RTase)及Rous-伴随病毒2逆转录酶(RAV-2 RTase)。此外，也可选用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。本发明优选在高温下具有逆转录活性的酶，如源自栖热菌属细菌的DNA聚合酶(如Tth DNA聚合酶)及源自芽胞杆菌属嗜热细菌的DNA聚合酶。例如，虽然没有限制本发明的意图，但优选源自芽胞杆菌属嗜热细菌的DNA聚合酶如源自B.st的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)及Bca DNA聚合酶。例如，Bca DNA聚合酶的逆转录反应不要求锰离子。此外，在高温条件下，在抑制模板RNA的二级结构形成的同时可以合成cDNA。只要它们具有活性，具有逆转录酶活性的天然酶和变体酶都可选用。
在另一方面，在含有待扩增的核苷酸序列的DNA或RNA复制完成后，复制产物可用作本发明的方法中的作为模板的核酸。复制方法的示例包括，但并不局限于一方法，此方法包括利用载体对适当的宿主进行转化，而此载体中已经插入了含有待扩增的核苷酸序列的核酸片段，培养生成的转化体、从中提取载体并对其进行利用，而此载体中已经插入了含有待扩增的核苷酸序列的核酸片段。可选用任何可在宿主中稳定复制的载体。例如，优选pUC系列载体、pBluescript系列载体、pGEM系列载体、粘粒载体及噬菌体载体。可选用任何能供养所选用的质粒的载体。例如，极易培养的大肠杆菌就是一范例。
在复制方法的另一方面中，在利用RNA聚合酶和含有作为模板的核苷酸序列的核酸片段对含有待扩增核苷酸片段的RNA进行转录后，此RNA可直接用作本发明的方法中的模板或在通过逆转录反应将其转化为cDNA后用作本发明的方法中的模板。只要其含有RNA聚合酶的启动子序列，含有待扩增核苷酸序列的核酸片段并不局限于特定的核酸片段。可将其插入到具有RNA聚合酶启动子序列的载体中，可将其与连接物或在其末端含有RNA聚合酶启动子序列的盒相连，或利用含有RNA聚合酶启动子序列的引物和适当的模板对其进行酶促合成。因此，利用含有如上所述定位的RNA聚合酶启动子序列，可以RNA形式、对含有待扩增核苷酸序列的核酸片段进行复制或扩增。可选用含有RNA聚合酶启动子序列的任何载体。例如，优选pUC系列载体、pBluescript系列载体、pGEM系列载体、粘粒型载体及噬菌体型载体。优选以环形形式或线性化后的形式存在的载体。任何RNA聚合酶可用于复制或扩增方法中。例如，优选SP6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶等。
在本发明中，双链DNA如上述分离的基因组DNA或PCR片段及单链DNA如利用逆转录反应从总RNA或mRNA开始制备得到的cDNA可优选用作模板DNA。优选已变性为单链DNA的或没有进行这样的变性的双链DNA作模板。
如果利用线性双链DNA如PCR扩增产物作模板，本发明的核酸扩增方法中的变性步骤就可省略。通过将本发明的方法中所选用引物的退火位点定位在DNA末端以内约50个碱基，这样就可省掉变性步骤。如果对具有源自RNA的序列的核酸进行扩增，可通过向本发明的、含有RNA酶H的扩增反应混合物中添加RNA-cDNA双链核酸来起始此扩增反应，而此RNA-cDNA双链核酸是以RNA为模板、通过逆转录反应来获得的，而扩增反应混合物中的RNA酶H是用来消化RNA链并将核酸链转化为单链cDNA的。此外，在本发明的DNA合成方法中，可利用一种DNA聚合酶实施以RNA为模板的逆转录反应和以通过逆转录反应产生的cDNA为模板而进行的DNA扩增反应。这样的DNA聚合酶具有逆转录酶活性和链置换活性。
由于存在整个靶序列或至少在核酸片段中存在足够长的靶序列部分，所以模板的合适长度就是可为引物序列提供充分结合的长度。
如果作为模板的DNA是双链核酸，则可将此DNA变性为单链DNA以使引物结合到在本发明的方法中的模板DNA链上，对此没有任何限制。对于变性来讲，优选在变性温度下(如约95℃)来孵育双链DNA。其他变性方法包括利用升高的pH来进行变性的方法。在这种情况下，为了使寡核苷酸引物与靶核酸结合，所以在进行扩增反应时就要将pH降低。将双链DNA变性为单链DNA后，或如以RNA作为模板、通过逆转录反应制备cDNA(单链DNA)后，在等温条件下就可对核酸进行连续扩增。
“连续”指在反应温度没有任何变化或反应混合物的组成没有任何变化的情况下进行反应。正如此处所用的，“等温”指温度基本不变的反应条件，这样酶和核酸链就能在每步中发挥其作用。
可在正常温度(如37℃)下，利用嗜中温DNA聚合酶如克列诺片段来施行本发明中的核酸扩增反应。也可在高温(如，50℃或更高温度，或60℃或更高温度)下，利用抗热的酶类(如内切核酸酶和DNA聚合酶)来进行。在这样的情况下，引物的非特异性退火受到抑制，从而造成DNA扩增的特异性提高。此外，解决了利用DNA作模板来形成二级结构的问题，从而提高了DNA聚合酶的延伸能力。在此方法中可连续进行逆转录反应和核酸扩增。在这种情况下，将逆转录酶与上述反应结合或利用具有逆转录活性的DNA聚合酶来对具有衍生自RNA的序列的DNA进行扩增。
在本发明的每个方面中，虽然没有限制本发明的意图，但优选的，与作为模板的单链DNA互补的嵌合寡核苷酸引物首先退火到DNA上。随后，在DNA聚合酶作用下，与模板DNA互补的DNA(引物延伸链)从引物的3′末端沿模板DNA剩余的序列进行延伸来合成双链DNA。内切核酸酶作用于双链DNA并从头开始从引物延伸链的引物部分重新延伸DNA。在本发明的一个方面中，虽然本发明没有受理论的限制，但内切核酸酶作为切口酶来进行作用，而此切口酶可在双链DNA中导入切口或可改变由嵌合寡核苷酸引物和模板DNA组成的双链DNA的结构。具有链置换活性的DNA聚合酶从双链DNA中导入的切口的3′端开始重新延伸DNA链，这样就在从切口的3′端开始释放下游DNA的同时生成了新的引物延伸链。因此，新生成的引物延伸链替代了以前合成的引物延伸链。
可利用两种引物，也即一个与作为模板的核酸互补的嵌合寡核苷酸引物及另一个与置换后的链互补的嵌合寡核苷酸引物来施行本发明中的核酸扩增方法。在这种情况下，一种引物结合到模板DNA链上以引起链置换反应，而另一种引物结合到链置换反应释放出的置换后的链上以起始另一个链置换反应。非常明白，如果选用了本发明的这一方面，含有一种引物的反应产物可用作另一引物的模板。因此，随着模板数量的增加，扩增产物的量以非线性方式增加。
当以双链DNA为模板、利用分别退火到两条链上的嵌合寡核苷酸引物来施行本发明的核酸扩增方法时，这两条链都可作为扩增反应的模板。如果反应是在双链DNA变性后起始的，那就要在双链DNA变性前或后将嵌合寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶和内切核酸酶添加到反应混合物中。如果利用热处理来使双链DNA变性且没有应用抗热酶，那优选在变性后向反应混合物中添加此酶。
在本发明的以双链DNA为模板且选用了两种嵌合寡核苷酸引物的核酸扩增方法中，虽然依赖于反应条件等因素，但在从引物开始的延伸反应过程中，在模板延伸链中间物间可发生模板交换，这样就可产生由合成的引物延伸链相互退火而组成的双链核酸。在双链核酸的两端含有嵌合寡核苷酸引物。随后，可从两端重新起始包含有链置换作用的互补链延伸反应。结果，产生了在一端具有引物序列的扩增产物。此外，如果在反应过程中发生了模板交换，那就再一次产生了与上述双链核酸相似的双链核酸。
本发明提供了核酸扩增方法，其包括利用具有链置换活性的DNA聚合酶来实现模板交换反应。在存在双链核酸模板的模板交换反应中，合成了两个分别与两条链的核苷酸序列基本互补的嵌合寡核苷酸引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、两条与模板互补的引物延伸链。在引物延伸链的合成过程中，发生了每条引物延伸链从模板到另一引物延伸链的模板交换。
正如此处所用的，模板交换反应指一个反应，其包括当通过链置换反应从双链核酸的两端合成互补链时，DNA聚合酶使模板进行了交换，其后以另一新合成的互补链为模板、利用DNA聚合酶合成了互补链。换言之，模板交换反应指一反应，其包括利用引物和具有链置换活性的DNA聚合酶处理双链核酸模板以产生与模板互补的延伸链，其中在延伸链合成过程中，合成了引物延伸链的DNA聚合酶主动将原始模板与其他的引物延伸链进行了交换。虽然没有限制本发明的意图，但如按照下文实施例32中所描述的方法就可确定实现模板交换反应的DNA聚合酶的能力。
本发明优选利用能够在链置换反应中实现模板交换反应的DNA聚合酶。例如，尤其优选缺乏5′→3′外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶的变体酶。这样的酶，如BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)可通过商业渠道购得。按照日本专利NO.2978001中描述的方法，也可从含有这些酶的基因的大肠杆菌HB101/pU1205(FERM BP-3720)来制备这些酶。从1991年5月10日(原始保藏日期)始，大肠杆菌HB101/pU1205(FERM BP-3720)已经保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本。
虽然没有限制本发明的意图，但例如，我们认为本发明中核酸扩增方法的反应方式如下所述。
在本发明的核酸扩增方法中，在RNA酶H存在下，利用两个分别与作为模板的核酸的两条链的核苷酸序列互补的嵌合寡核苷酸引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸，这样就合成了与模板互补的引物延伸链。可获得由合成的引物延伸链相互退火而组成的双链核酸及由模板相互退火而组成的双链核酸，而作为模板交换反应的结果，两种引物是退火到模板上的。将后者的双链核酸重新用作模板。
利用RNA酶H在含有核糖核苷酸的位点切割由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸。利用具有链置换活性的DNA聚合酶，分别从双链核酸引物部分的3′端开始对互补于模板的核酸进行延伸以实现链置换。可获得由引物延伸链相互退火而组成的双链核酸及由模板相互退火而组成的双链核酸，而作为模板交换反应的结果，两种引物是退火到模板上的。
如果没有发生模板交换反应，可获得分别由模板和引物延伸链组成的两种双链核酸。
利用具有链置换活性的DNA聚合酶，分别从双链核酸引物部分的3′端开始对与模板互补的核酸进行延伸以实现链置换作用，而此双链核酸是与两引物退火的。作为模板交换反应的结果，可获得由引物延伸链相互退火而组成的双链核酸及由模板相互退火而组成的双链核酸，而作为模板交换反应的结果，两种引物是退火到模板上的。将与两引物退火的双链核酸重新用作模板。
如果没有发生模板交换反应，可获得分别由模板和引物延伸链组成的两种双链核酸。
利用RNA酶H在含有核糖核苷酸的位点切割这两种双链核酸。利用具有链置换活性的DNA聚合酶，分别从双链核酸引物部分的3′端开始对与模板互补的核酸进行延伸以实现链置换。
在本发明的核酸扩增方法中，在RNA酶H存在下，利用两种分别与作为模板的核酸的两条链的核苷酸序列互补的嵌合寡核苷酸引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理双链核酸模板，这样就合成了与模板互补的引物延伸链。如果没有发生模板交换反应，可获得分别由模板和引物延伸链组成的两种双链核酸。
在本发明的扩增方法中，可在含有核糖核苷酸的位点对嵌合寡核苷酸引物延伸链进行切割，这样就从不含有核糖核苷酸的切割中产生了5′片段(引物部分)。因此，内切核酸酶不再对从产生的引物部分开始延伸的引物延伸链进行切割。结果，生成了末端含有引物序列的扩增产物。
如上所述，在本发明的核酸扩增中可产生不含引物序列的扩增产物和在一或两端含有引物序列的扩增产物。这些产物包括在本文的扩增产物之内。
图33-36例示了本发明的核酸扩增方法的实施例。换言之，图33-36例示了本发明的核酸扩增方法中的典型的核酸扩增。
图33-36例示了典型的核酸扩增，此核酸扩增是在作为双链核酸模板的DNA、在模板DNA核苷酸序列信息基础上合成的一对嵌合寡核苷酸引物(图中，嵌合寡核苷酸引物在它们的3′端具有3个核糖核苷酸；图中的空心圆表示核糖核苷酸)、具有链置换活性的链置换型DNA合成酶(DNA聚合酶)、可在DNA-RNA杂交位点进行切割的核糖核酸酶RNA酶H、以及掺入延伸链中的底物dNTP存在下进行的。
如图33中所展示的，在模板DNA核苷酸序列信息基础上合成的一对嵌合寡核苷酸引物退火到模板DNA的特定部分。如步骤1所示，作为链置换反应的结果，分别从两个嵌合寡核苷酸引物的3′端开始对DNA链进行延伸。
其次，如图34中所示，如步骤2所示，作为模板交换反应的结果，从上游和下游开始延伸的某些引物延伸链从最初的模板中释放出来。这些引物延伸链在其3′部分相互退火。互补链从退火后的延伸链开始延伸，从而形成由相互退火的引物延伸链组成的双链DNA。此外，产生了由与上述嵌合寡核苷酸引物对退火的、由相互退火的置换后的链组成的双链DNA。此双链DNA在图34中用作起始物质。
如图35中的步骤3所示，在双链DNA的DNA-RNA杂交位点，利用RNA酶H作用仅对含有源自图34中的双链DNA的嵌合寡核苷酸引物的RNA的一条链进行切割，从而在双链DNA中导入切口，而此处的双链DNA是由引物延伸链相互退火组成的。
随后，从双链DNA的切口开始发生了链置换反应，并如图35的步骤4所示对DNA进行延伸。其后，在某种程度上，或以图35的步骤5所示的某一比率发生了与图34的步骤2类似的模板交换反应，产生了由扩增产物组成的双链DNA，也即相互退火的引物延伸链。
此外，产生了由相互退火的置换后的链组成的双链DNA，它与上述嵌合寡核苷酸引物对退火。
其次，如图36所展示的，作为链置换反应的结果，分别从图35中双链DNA的嵌合寡核苷酸引物的3′端开始对DNA链进行延伸，而图35中的双链DNA是由相互退火的置换后的链组成的，而置换后的链是与嵌合寡核苷酸引物对退火的。在某种程度上发生了与步骤2和步骤5中的模板交换反应相类似的模板交换反应，产生了由相互退火的引物延伸链组成的双链DNA。对此双链DNA进行图35中的步骤3。反应从步骤3重新开始。产生了由相互退火的置换后的链组成的双链DNA，并将此双链DNA用作图36的起始物质，而此处的置换后的链是与嵌合寡核苷酸引物对退火的。结果，发生了可重复产生这些双链核酸的链反应，这样就可特异性扩增和制备与嵌合寡核苷酸引物对相结合的区域。
在本发明中的利用嵌合寡核苷酸进行的核酸扩增方法中产生了多聚体，而这些多聚体中的待扩增区域是相互连接在一起的。多聚体具有一结构，而此结构中的多个待扩增区域是在同一方向上进行重复扩增的。对扩增产物进行电泳分析观察到的多聚体是梯状条带。我们认为，这些多聚体的产生是受待扩增区域、待扩增区域的大小、侧翼区、选用的嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列、反应条件等的影响。
上述多聚体含有多个待扩增区域。例如，当计划对含有待扩增区的核酸进行检测时，多聚体是很有用的，因为在利用合适的探针进行杂交时，其可与多种探针杂交并产生强信号。利用结合使用的限制性酶等进行消化，可从多聚体中获得单体形式的待扩增区域或其部分。
在置换以前延伸的DNA链的同时，本发明中选用的DNA聚合酶应会使链从引物部分的3′端向下游延伸。重要的是DNA聚合酶不应展示出可消化置换后的链的5′→3′外切核酸酶活性。例如，源自大肠杆菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷变体克列诺片段、源自Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)的类似片段、及源自B.ca(Takara Shuzo)的BcaBEST DNA聚合酶用作这样的DNA聚合酶是有益的。也可选用Gene，97：13-19(1991)中描述的测序酶1.0和测序酶2.0(UnitedStates Biochemical)、T5 DNA聚合酶和29 DNA聚合酶。如果添加适当的抑制剂可抑制其5′→3′外切核酸酶活性，那在本发明的DNA合成法中可选用正常具有5′→3′外切核酸酶活性的聚合酶。
可在变化的温度条件下或在等温条件下实施本发明的核酸扩增方法。变化的温度指改变每步的反应温度，这样温度的改变不会影响各步的反应。特别的，变化的温度指将温度改变为适于，如引物的每个退火、互补链的合成反应、互补链的切口及置换反应等的温度。
另一方面，等温指每个步骤的反应温度是不变的，每步都是在基本恒定的温度下进行。在这两种情况下，很自然要对温度进行选择以优化反应条件。
本发明的核酸扩增方法的一个特点是在核酸合成过程中不需要对温度进行上下调节。因此，本发明提供了等温合成核酸的方法。多种传统的核酸扩增方法要求对温度进行上下调节以使靶核酸从合成的链中解离出来。这些方法要求特殊的反应设备，如热循环仪来达到其目的。然而，本发明的方法仅仅利用可保持恒定温度的设备就可得以施行。如上所述，可在单一温度下施行本发明的方法。优选的，通过选择反应温度严格水平来施行本发明的方法，这样，引物的非特异性退火减少，并且引物可特异性退火到作为模板的核酸上。虽然没有限制本发明的意图，但可利用上述的热抗性酶，在高温条件下实施本发明的方法。此外，优选在可充分保留选用的酶的活性的适当温度下施行本发明的方法，这样就可将反应效率维持在高水平。因此，虽然依赖选用的酶来变化反应温度，但反应温度优选的约为20℃-80℃，更优选的约为30℃-75℃，最优选的约为50℃-70℃。当在特定的高温条件下进行反应时，优选的利用较正常温度下进行反应时选用的引物长的引物。可通过如，参照其Tm值来确定适于反应温度的引物的序列和长度。此外，可选用商业渠道可购得的、用来设计引物的软件如OLIGOTM引物分析软件(Takara Shuzo)。例如，当选用的反应温度为55℃-60℃或65℃时，本发明的方法中选用的引物的长度可为，如12-100个核苷酸，优选14-50个核苷酸，更优选15-40个核苷酸。升高温度所带来的影响的示例为存在模板DNA二级结构形成问题的溶液。即使以高GC含量的核酸作为模板，升高的反应温度也可使其进行扩增。此外，在对长链区域进行扩增中也有类似的效果。在对链长约为60bp-20kbp，特别的是约为110bp-4.3kbp，更特别的是约为130bp-1500bp的核酸进行扩增时可观察到这样的效应。
按照核酸模板的GC含量来调整反应温度，这样就可提高扩增反应的效率。例如，如果选用具有低GC含量的核酸作为模板，虽然反应温度依赖于待扩增核酸的链长及引物的Tm值，但本发明的扩增反应可在50-55℃下进行。
在本发明的方法中，选用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(如BcaBEST DNA聚合酶)可很容易的施行从RNA开始的核酸扩增，其包括从RNA制备cDNA这一步(逆转录反应)。此外，独立施行从RNA制备cDNA这一步得到的产物，也即cDNA可在本发明的方法中用作DNA模板。
在每种情况下，重复本发明的方法中的反应，直至以适当的方式，如酶失活或降低反应温度使其中止，或直至反应缺乏一种底物为止。
本发明的核酸扩增方法可用于多种利用核酸扩增的操作中，包括对核酸进行检测、标记和序列分析。
此外，本发明中的核酸扩增方法可用作原位核酸扩增法、在固体基质如DNA芯片上进行的核酸扩增法、或对多个区域同时扩增的多重核酸扩增法。
本发明的核酸扩增法的一个特征为其制备单链DNA的能力。在制备单链核酸的方法中可选用一或两种嵌合寡核苷酸引物。例如，如果选用两种寡核苷酸引物，就可利用与所谓的不对称PCR类似的引物比例来施行本发明的方法，而不对称PCR是利用一种相对于另一种引物远远超量的寡核苷酸引物来进行扩增反应的。引物比例优选1∶10-1∶500，更优选1∶10-1∶100，对此没有任何限制。结果，从一条链得到的替代产物的量远超过从另一条链得到的替代产物的量。
按照本发明的核酸扩增方法，可制备基本不含互补链的单链DNA。例如，在短时间内，可很容易的制备用于制备具有固定化核酸的物质如DNA芯片的单链DNA、用于靶核酸检测的单链DNA探针、或用于长链PCR的大引物。利用本发明的方法仅可选择性扩增有义序列或反义序列。因此，作为具有有义序列或反义序列的核酸的制备方法，本发明也是有益的。
通过在N-二[羟乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris缓冲溶液中施行本发明的方法，我们甚至可以痕量核酸为模板对所需的核酸区域进行扩增。
此外，本发明的核酸扩增方法不需要可随时间变化而对温度进行调节的特殊反应设备。因此，可在大体积反应混合物中进行扩增反应。从而，可在工业上大量制备核酸(如，用于医药应用)。
本发明的核酸扩增方法中的引物利用率约为100％，其较传统方法如PCR中的利用率高5-10倍。
利用本发明的核酸扩增方法可制得对作为模板的核酸的核苷酸链有高精确度的扩增产物。当对产生的扩增产物的核苷酸序列进行分析从而确定了本发明的DNA合成方法中的错误频率时，利用本发明的方法获得的扩增产物中的错误频率与利用LA-PCR制得的扩增产物中的错误频率相当，而已知LA-PCR可以高精确度对核酸进行扩增。换言之，本发明的方法具有与LA-PCR相当的精确度。
(6)本发明的靶核酸检测方法及用于此方法的试剂盒
可利用本发明中的核酸扩增方法来对样品中的靶核酸进行检测。检测方法包括：
(a)利用上述的、本发明中的核酸扩增方法对靶核酸进行扩增；及
(b)对上步骤扩增的靶核酸进行检测。
在上述步骤(a)中，如果以RNA为模板，逆转录反应和核酸扩增反应可以一步完成。虽然没有限制本发明的意图，但例如，AMV RTase、MMLV RTase或RAV-2 RTase与Bca DNA聚合酶的结合可优选的用作逆转录酶和链置换型DNA聚合酶的结合。
本发明中的方法可用于对样品的特定基因进行检测和定量。换言之，可对怀疑含有核酸，如DNA或RNA的所有样品中的特定基因进行检测和定量。含有待检测和定量的特定基因的样品的示例包括，但并不局限于取自生物体的样品如全血、血清、血块黄层、尿、粪便、脑脊液、精液、唾液、组织(如癌组织或淋巴结)及细胞培养物(如哺乳动物细胞培养物或细菌培养物)、含有核酸如类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母菌、植物和动物的样品、怀疑污染或已感染有微生物如病毒或细菌(如食品或生物制剂)的样品、以及含有有机体样品如土壤和废水。例如，在存在源自这些靶微生物的特定基因的基础上或在源自这些靶微生物的特定基因含量的基础上，可对样品中的类病毒、病毒、真菌、细菌或其他微生物进行检测或定量。特别的，在卫生和环境领域中，病原微生物的检测方法是有益的。此外，本发明中的方法可用于区分生物体的基因型或确定基因的表达水平。特别的，在医药领域中，检测或确定与疾病相关的基因，如与细胞癌化相关的基因的表达状态是有益的。在检测应用中，RNA和DNA都可优选的用作作为模板的核酸。
本发明中的靶核酸检测方法可用于区分靶核酸的核苷酸序列中的差异。在此方面中，对选用的嵌合寡核苷酸引物进行设计，这样引物的3′端部分的定位就靠近待区分的靶核苷酸序列的特定碱基。例如，对嵌合寡核苷酸引物进行设计，这样在碱基和引物的3′末端碱基间形成了氢键。如果在引物3′末端部分的核苷酸序列与模板核苷酸序列间存在误配，那利用上述扩增反应的嵌合寡核苷酸引物对靶核酸进行的扩增就不会发生，也就没有扩增产物生成。利用本发明的方法可获得与基因中特定碱基相关的信息，如点突变或单链多态性(SNP)。
通过从含有核酸的样品直接进行靶核酸扩增可对本发明的靶核酸检测方法进行实施。在这种情况下，对待扩增的靶核酸的链长没有限制。例如，200bp或更短的区域，优选150bp或更短的区域对于靶核酸的灵敏检测来讲是有效的。通过对本发明的嵌合寡核苷酸引物进行设计以获得上述待扩增的链长，可对样品中的靶核酸进行高灵敏度检测。
此外，利用含有N-二[羟乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris作缓冲成分的反应缓冲液及含如上文(4)示范的、含有亚精胺或丙二胺的退火溶液，本发明中的检测方法甚至可对痕量核酸样品中的靶核酸进行高灵敏度检测。在这种情况下，对选用的内切核酸酶和DNA聚合酶没有特别的限制。例如，优选源自大肠杆菌、火球菌属细菌及古生球菌属细菌的RNA酶H与BcaBEST DNA聚合酶的结合。我们认为，优选的内切核酸酶和DNA聚合酶单位可依选用的酶类型的不同而变化。在这种情况下，利用检测灵敏度的升高或扩增产物量为指标，可对缓冲溶液的组成和添加的酶量进行调整。
在本发明的检测方法中，dUTP在靶核酸扩增过程中可作为底物而掺入。因此，如果dUTP作为底物，通过利用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解扩增产物可防止扩增产物的存留感染。
已知的核酸检测方法可用于步骤(b)中。这些方法的示例包括通过电泳法对特定大小的反应产物进行检测及通过与探针进行杂交来进行检测。此外，结合利用磁珠的检测方法是优选的。在利用电泳进行的检测中，经常利用荧光物质如溴乙啶。利用探针进行的杂交可与利用电泳进行的检测进行结合。可利用放射性同位素或非放射性物质如生物素或荧光物质对探针进行标记。此外，利用步骤(a)中标记的核苷酸可促进对掺入标记核苷酸的扩增产物进行的检测，或可增强利用标记物进行检测的信号。荧光偏振法、荧光能量交换等也可用于检测。通过构建合适的检测体系就可对靶核酸进行自动检测或定量。此外，优选利用杂交层析法通过肉眼进行检测。
在本发明的检测方法中可选用利用两或多种荧光物质标记的核糖核苷酸(RNA)探针，荧光物质间隔导致淬灭状态的距离。此探针不发射荧光。当探针退火到对与探针互补的靶核酸进行扩增得到的DNA上时，RNA酶H消化了此探针。随后探针上荧光物质间的距离增加，从而使得荧光物质发射荧光。因此，荧光发射表明有靶核酸存在。如果RNA酶H用于本发明的核酸扩增方法中，那仅通过向反应混合物中添加探针就可对靶核酸进行检测。例如，荧光物质6-羧基荧光素(6-FAM)和N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)的结合可优选用于探针标记。
本发明进一步提供了可用于上述靶核酸检测法的探针。只要在正常杂交条件下，其可与通过本发明的核酸扩增方法扩增得到的靶核酸进行杂交，那对本发明中的探针就没有特别的限制。由对扩增产物进行的特异性检测来看，优选可在正常条件，如本领域中的熟练技术人员已知的严格条件下进行杂交的探针。严格的杂交条件在，如T.Maniatis et al.(eds.)，Molecular Cloning；A LaboratoryManual 2nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中有描述。特别的，严格的杂交条件的示例如下：在含有0.5％SDS的6x SSC(1x SSC；0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、5x Denhardt′s(0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％Ficoll400)和100μg/ml鲑鱼精子DNA中，在低于选用的探针的Tm约25℃的温度下孵育4小时到过夜。含有上述标记的探针可用作探针来促进对靶核酸的检测。
本发明中在等温条件下进行的核酸扩增方法不要求利用设备如热循环仪。在本发明的扩增方法中可利用一或两种引物，而这种引物数要小于传统方法中所用的引物数。既然试剂，如用于PCR的dNTP等可用于本发明的方法中，那相对于传统方法来讲，运转成本就降低了。因此，本发明的方法可优选的用于，如进行常规检测的遗传检验领域中。本发明的方法可在更短的时间内较PCR提供了更大量的扩增产物。因此，本发明的方法可用作方便、快捷、灵敏的基因检测方法。
在基因组水平的遗传分析中，为了对大量核苷酸序列进行分析，我们试图开发更小的反应体系并提高整合程度。为了这一目的，我们利用最新的超精细处理技术开发了此体系，而超精细处理技术可将基本的基因组分析方法(如从细胞中提取DNA、DNA扩增反应、电泳、杂交、对感兴趣的DNA进行检测等)整合到几平方厘米到指尖大小的微芯片上。
我们目前考虑将PCR应用到此基因扩增反应体系中。然而，由于PCR要求有随时间重复控制温度上下变化的方法，所以此体系将会很复杂。与此相比，由于利用本发明中在等温条件下进行核酸扩增的方法可简化此体系，那将此方法用于上述整合体系会很合适。利用本发明的技术可以构建高度整合的体系。
(7)本发明的试剂盒
本发明提供了可用于上述的、本发明的核酸扩增和检测法中的试剂盒。在一个实施方案中，此试剂盒以包装形式存在，并且含有与DNA聚合酶和内切核酸酶在链置换反应中的应用有关的说明书。另外，含有具有链置换活性的DNA聚合酶、内切核酸酶、以及用于链置换反应的缓冲溶液的试剂盒优选用于本发明的方法中。另外，按照说明书，也可选择并应用可通过商业渠道购买的、具有链置换活性和/或内切核酸酶活性的DNA聚合酶。此外，此试剂盒可含有用于逆转录反应的试剂，而此试剂是在以RNA为模板的逆转录反应中选用的。DNA聚合酶可选自上文(3)中描述的、本发明中选用的DNA聚合酶。内切核酸酶可选自在上文(2)中描述的内切核酸酶。含有上文(4)中描述的反应缓冲组合物的缓冲溶液可优选的用作链置换反应的缓冲溶液。
“说明书”是描述试剂盒使用方法如链置换反应试剂溶液的制备方法、推荐反应条件等的打印材料。说明书包括小册子或传单、或粘贴到试剂盒上的标签形式的使用说明手册，及在含有试剂盒的包装的表面上的说明。说明书也包括通过电子媒介如互联网公开的或提供的信息。
本发明的试剂盒可进一步含有缓冲溶液和上文(4)中所示范的退火溶液，而这些缓冲溶液是以N-二[羟乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris作缓冲成分的。此外，其可含有具有链置换活性的DNA聚合酶及RNA酶H。此外，此试剂盒可含有修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷三磷酸类似物。
在上述的说明书和扩增反应试剂之外，应用于核酸检测方法的试剂盒可进一步含有可用于靶核酸扩增的、适当的嵌合寡核苷酸引物及可用于扩增后的靶核酸检测的试剂，如探针。
此外，本发明中的试剂盒包括含有本发明中选用的嵌合寡核苷酸引物的试剂盒和/或上述的、本发明中的探针。
(8)本发明的组合物
本发明提供了用于上述的、本发明的核酸扩增方法或本发明的核酸检测方法中的组合物。例如，此组合物可含有上文(2)所描述的内切核酸酶和上文(3)所描述的DNA聚合酶。组合物可进一步含有可用于扩增反应的缓冲成分、镁盐、dNTP等。此外，其可含有修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷三磷酸类似物。上文(4)中的那些物质可用作缓冲成分和其他的添加剂。
在一尤其优选的方面中，组合物可含有适量的、上文列出的、可用于本发明的核酸扩增方法的多种组分。仅向组合物中添加适当的模板和嵌合寡核苷酸引物就可进行扩增反应。如果待扩增的对象是事先已知的，则组合物优选的含有适于扩增该扩增对象的嵌合寡核苷酸引物。
(9)含有排列在本发明的预定区域中的固定化核酸的物质及制备该物质的方法
DNA芯片(也叫做DNA微阵列或DNA阵列)是含有固定化核酸的物质，其中多种基因片段或DNA排列并固定化在固体基质如玻璃上的预定的区域内或预定的位置上。DNA芯片可用于检测核酸样品中存在的核酸，而这些核酸与在DNA芯片上的预定区域中排列和固定化的DNA是互补的。通过将DNA芯片与从样品中制备的核酸样品，优选已标记的核酸样品接触以进行杂交，这样来进行实施检验。由于DNA芯片可用于对一个操作样品中的多种核酸进行检测或定量，所以其是可显著促进基因表达分析和突变或多态性分析的非常有用的工具。在对其进行适当的变性后，可将在其预定区域中排列并固定化有双链核酸的DNA芯片用于杂交。可将在其预定区域中排列并固定化有与待检测靶核酸互补的双链核酸的DNA芯片优选的用于靶核酸检测。
如上所述，利用本发明的方法可对所需的DNA以单链形式进行扩增。虽然可选用扩增产物的任何纯化方法，但优选的是利用异丙醇沉淀来进行纯化。这样得到的DNA，优选基本不含其互补链的单链DNA，可优选的用作固定化到DNA芯片上的DNA片段。因此，本发明的方法优选的用作那些排列并固定化在预定区域的DNA芯片的DNA的制备方法。任何不溶基质可用作基质，而这些基质上的预定的区域中可排列并固定化制得的DNA，但优选的是利用玻璃或塑料制得的盘状基质及利用硝酸纤维素或尼龙制得的膜状基质。已知的核酸固定化方法可用于核酸固定化。可将DNA直接固定化到基质上。另外，可通过适当的连接体对DNA进行固定化或在与多个DNA分子连接后对其进行固定化。此外，由于通过本发明的制备方法可将修饰的脱氧核糖核苷酸掺入扩增后的核酸中，所以利用修饰基团就可制备具有固定化核酸的物质。
可对与含有固定化核酸的物质上的核酸进行杂交的靶核酸进行检测或定量，而在此物质中，利用本发明的方法扩增的DNA排列并固定化在预定的区域中(如DNA芯片)。将从怀疑含有用于杂交的靶核酸的样品中制备的核酸样品与该物质接触就可完成这样的检测或定量，而此样品是从怀疑含有用于杂交的靶核酸的样品中制备的。在这些物质中，相对于传统的物质，DNA芯片可以更方便的操作、更高的灵敏度及更高的重复性对靶核酸进行检测。
(9)本发明的大量核酸制备方法
如上所述，本发明的一方面提供了可在等温条件下进行的核酸扩增方法。在一方法中，将用作待扩增核酸的模板的核酸与反应所需的多种成分混合，反应混合物在等温条件下进行反应，这样制备了所需的核酸。因为PCR要求随着时间变化来改变反应混合物的温度，所以反应体积就限制在可对温度进行控制的程度上(一般为200μl或更少)。因此，很难对体积进行扩大。另一方面，在本发明的方法中没有这样的限制。通过增加反应混合物的体积可制备得到大量的核酸。在本发明的方法中，虽然没有限制本发明的意图，但此体积，例如，优选大于200μl，更优选300μl或更大体积，最优选500μl或更大体积。在本发明的方法中，从一个模板分子合成了大量的互补链分子。此外，可以这些互补链分子作模板合成核酸。因此，通过选择合适的模板和引物，就可对所需的核酸进行大量的、高效的制备。此外，从设备和能量方面来看，与PCR不同，本发明的方法不要求特殊的设备或复杂的温度变化这个事实对其来说是有利的。因此，此方法是工业上大量制备核酸的优良方法。
利用如上文(4)中示范的反应缓冲液和退火溶液，甚至可以从本发明的制备方法中的痕量核酸模板扩增或制备感兴趣的核酸。在这种情况下，对选用的内切核酸酶和DNA聚合酶没有特别的限制。例如，优选结合应用源自大肠杆菌的RNA酶H与BcaBEST DNA聚合酶。我们认为，内切核酸酶和DNA聚合酶的优选单位可依选用的酶的类型而变化。在这样的情况下，可利用应用产物的最大量为指标，对缓冲溶液的组成和添加的酶量进行调整。
此外，本发明的方法作为大量供应多种DNA片段，如固定化到DNA芯片上的那些片段的方法是有用的。特别的，在一实施方案中，在一个简单反应步骤中就可获得大量的DNA片段。在另一实施方案中，少量的引物可用于获取多种DNA片段。一个核酸扩增步骤可结合到后者的实施方案中，而通过已知的核酸扩增方法如PCR，此核酸事先可在本发明的方法中作为模板。利用少量引物可对所有作为模板的核酸进行扩增，例如，在利用含有标记序列的随机引物进行的核酸扩增方法(Nucleic Acids Research，24(19)：3778-3783(1996))或在利用简并引物进行简并寡核苷酸引导的PCR(DOP-PCR；Genomics，13：718-725(1992))基础上进行扩增。可利用一或几种引物施行本发明中的核酸扩增方法来对上述提及的步骤中的所有作为模板的核酸进行扩增。通过对用于本发明的核酸扩增方法中的引物进行设计，使其与添加到随机引物或简并引物中的标记序列相对应，从而来完成此核酸扩增。因此，相对于传统方法，将制备作为模板的核酸的合适步骤与本发明的方法结合可以较低成本来大量提供多种DNA片段。
包含有核酸的药物组合物可含有用于在细胞中表达有用多肽的双链DNA或用于抑制感兴趣的基因表达的单链反义DNA。利用适当的方式，例如，基因转移载体如脂质体，对生物体给予这样的核酸。本发明中的核酸制备方法优选的用于大量制备用于医药用途的单链或双链核酸。此外，利用本发明的方法可迅速的制备含有，如可抑制体内核酸降解的dNTP类似物的核酸。
由于本发明中的DNA扩增片段由正常的核苷酸组成，所以可利用DNA中的限制性酶位点将扩增后的DNA，如亚克隆到载体中。此外，例如，可利用限制性酶对DNA进行处理以进行限制性片段长度多态性分析而没有发现任何问题。因此，此DNA可广泛用于遗传检验领域中。此外，可将RNA聚合酶的启动子序列整合到扩增后的片段中。例如，扩增后的片段可用作模板来合成RNA，而此RNA可用作探针。当然，利用荧光标记的dNTP而不是正常dNTP施行本发明的核酸扩增方法，这样就可制备荧光标记的DNA探针。
本发明的核酸扩增方法的特征如下所列：
1.其可从少量模板扩增大量核酸。当使用两种引物时，扩增产物以二次方的比率增加。
2.其可在等温条件下进行。在这种情况下，其不要求利用设备如热循环仪。因此，反应体积可很容易的增加。
3.一般来说，扩增反应是利用一或两种嵌合寡核苷酸引物及两种酶(DNA聚合酶和内切核酸酶)来进行的。
4.由于大量的DNA链是从一种引物分子合成的，所以引物量不会限制扩增产物的量。此外，引物的利用率约为100％，这远高于PCR中的引物利用率。
5.依目的不同，可对单链或双链DNA进行选择性扩增。
6.因为扩增反应不要求有dNTP类似物如(α-S)dNTP，所以试剂成本很低。此外，可获得不含有dNTP类似物的天然形式的核酸。
7.通过结合利用本发明的方法和另一种核酸扩增方法，其可以低成本大量供应扩增后的DNA片段。
8.相对于传统检测方法，本发明的检测法具有相同或更高的检测灵敏度。本发明的检测法可在较具有相同灵敏度的传统方法短的时间内完成。
9.此方法适于核酸扩增、自动检测、在微芯片或纳米芯片上的少量且高度整合的检测方法中进行检测。
如上所述，本发明的方法适于基因检测和工业上的核酸制备。
实施例
下列实施例更详细的例示了本发明，但没有限制其范围的意图。
参考实施例1：从嗜热热坚芽孢杆菌中制备RNA酶H
将热坚芽孢杆菌YT-G(购自Deutsche Sammlung vonMikroorganismen；DSM406)接种到100ml含有0.2％胰蛋白胨(DifcoLaboratories)和1.5％酵母提取物(Difco Laboratories)(pH6.5)的培养基中，60℃下振荡培养140分钟并将其用作预培养物。将30ml预培养物接种到组成相同的3L培养基中，60℃下，以2.5L/min的速度通气并在转速为250rpm下搅拌培养5小时。
在5000xg下对培养物离心15min，收集细胞。将402g(湿重)细胞悬浮在1000ml含有10mM巯基乙醇、0.5M NaCl、1mM EDTA和20μMPAPMSF的50mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，并利用MINI-Lab(ApVGAULIN/RANNIE)使其裂解。通过离心去除细胞碎片以收集上清液。
将聚乙烯亚胺溶液添加到上清液中至其浓度为0.1％。搅拌后，混合物静置1小时。随后离心收集上清液。将硫酸铵添加到上清液中至50％的饱和度。离心收集沉淀，并将沉淀物溶解在含有10mM巯基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中。在相同缓冲液中对此溶液进行透析。将透析后的样品加入到已用相同的缓冲液平衡过的280ml DE52柱(Whatman)中，收集非吸附的部分。
进一步利用420ml缓冲液冲洗柱子进行平衡，并收集冲洗级分。将从DE52柱层析收集的非吸附级分和冲洗级分混合在一起，并将其添加到已利用含有10mM巯基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的240ml P-11柱(Whatman)上。随后利用含有0-0.5M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱。
将得到的活性级分置于透析管中。4℃下，将此管置于固体聚乙二醇中脱水浓缩。随后将酶浓缩物添加到已利用含有5mM巯基乙醇、0.5mM EDTA、30mM NaCl和50％甘油的25mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的300ml Superdex G-200柱(Amersham Pharmacia Biotech)中。利用平衡缓冲液进行洗脱以获得活性级分。将活性级分添加到已利用含有10mM巯基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mMtris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的15ml肝素琼脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech)中。利用含有0-0.5M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱。
将得到的活性级分添加到已用含有10mM巯基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的5mlHitrap-SP柱(Amersham Pharmacia Biotech)中。利用含有0-0.5M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱。将得到的活性级分添加到已用含有5mM巯基乙醇、0.5mM EDTA、30mM NaCl和50％甘油的25mMtris-HCl缓冲液(pH7.5)重新平衡过的300ml Superdex G-200柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。得到的活性成分可用作RNA酶H制剂(一种酶溶液)。
抗热RNA酶H的活性测定如下：
将1mg聚(rA)或聚(dT)(购自Amersham Pharmacia Biotech)溶解在1ml含有1mM EDTA的40mM tris-HCl(pH7.7)中来制备聚(rA)溶液和聚(dT)溶液。
随后将聚(rA)溶液(终浓度为20μg/ml)和聚(dT)溶液(终浓度为30μg/ml)添加到含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。此混合物在37℃下反应10分钟，随后将其冷却到4℃以制备聚(rA)-聚(dT)溶液。
将1μl酶溶液添加到100μl聚(rA)-聚(dT)溶液中。混合物在40℃下反应10min。向其中添加10μl 0.5M EDTA以中止反应。随后测定其在260nm下的吸光度。作为对照，将10μl 0.5M EDTA添加到反应混合物中，得到的混合物在40℃下反应10分钟，随后测定其吸光度。从不含EDTA的反应混合物的吸光度中扣除对照吸光度就得到了一个值(在吸光度上有差别)。从而，在吸光度差异的基础上，利用酶反应确定了从聚(rA)-聚(dT)杂种中释放出的核苷酸的浓度。按照下列方程式，一个单位的RNA酶H定义为在10分钟内释放1nmol核糖核苷酸相对应的A260升高值。如果选用稀释后的酶溶液，在稀释率基础上利用下列方程得到的值是正确的：
单位＝[吸光度差异×反应容积(ml)]/0.0152
参考实施例2：热坚芽孢杆菌RNA酶HII基因的克隆
(1)从热坚芽孢杆菌中制备基因组DNA
将热坚芽孢杆菌YT-G(DSM406)接种到60ml LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％NaCl，pH7.2)中，并在65℃下培养20小时。培养后，对培养物离心收集细胞。将细胞悬浮在2ml 25％蔗糖和50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中添加已溶于水中的0.2ml10mg/ml氯化溶菌酶制剂(Nacalai Tesque)。混合物在20℃下反应1小时。反应完成后，向反应混合物中添加12ml含有150mM NaCl、1mMEDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的混合物、0.1ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及1ml 10％十二烷基硫酸钠。混合物在37℃下孵育1小时。
随后将2.1ml 5M NaCl和2ml CTAB-NaCl溶液[10％溴棕三甲铵(Nacalai Tesque)和0.7M NaCl]添加到混合物中，将产生的混合物混合完全，并在65℃下孵育10min。向其中添加等体积的氯仿/异戊醇(24；1，v/v)混合物。将生成的混合物轻轻混合10min，随后在10000xg下离心10min。离心完成后，向得到的上清液中添加等体积的苯酚饱和溶液与100mM tris-HCl(pH8.0)/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v)的混合物。将生成的混合物轻轻混合10min，随后在10000xg下离心10min。离心完成后，向得到的上清液中添加0.6体积的2-丙醇。利用玻璃棒盘绕生成的纤维状沉淀物，利用70％乙醇水溶液进行冲洗，风干，随后溶解在0.5ml TE缓冲液中以获得基因组DNA溶液。
(2)克隆RNA酶HII基因的中间部分
在源自多种生物体的RNA酶HII的氨基酸序列中的保守部分MotifI和Motif III的基础之上，合成SEQ ID NO：1和2所表示的寡核苷酸(Biochemistry，38：605-608(1999))。
利用参考实施例2-(1)中制备的1μl热坚芽孢杆菌基因组溶液为模板、以100pmol BsuII-3和100pmol BsuII-6为引物，在100μl容器中进行PCR。按照粘贴的使用指导，利用TaKaRa Taq聚合酶(Takara Shuzo)作为PCR反应的DNA聚合酶进行反应。PCR操作如下：94℃反应30秒，45℃下反应30秒及72℃下反应1min，持续50个循环。反应完成后，利用苯酚处理反应混合物，随后进行乙醇沉淀来纯化DNA。得到的DNA是利用T4DNA聚合酶(Takara Shuzo)形成的钝末端DNA，随后对其进行琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约0.4kb的扩增后DNA片段。利用T4DNA连接酶(Takara Shuzo)将长约0.4kb的DNA片段与已用Sma I(Takara Shuzo)消化过的pUC119(Takara Shuzo)连接。利用连接混合物转化大肠杆菌JM109。培养生成的转化体以获得其中已插入有长约0.4kb DNA的质粒21-12。
(3)克隆RNA酶II基因的上游部分
确定了在参考实施例2-(2)中获得的质粒21-12中长约0.4kb的插入片段的核苷酸序列。在此确定的核苷酸序列的基础之上，合成了SEQ ID NO：3和4所代表的寡核苷酸RNII-S1和RNII-S2。
利用BamHI(Takara Shuzo)消化参考实施例2-(1)中制备的热坚芽孢杆菌基因组DNA并利用T4 DNA连接酶将其与Sau3AI盒(Takara Shuzo)相连。按照粘贴到TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)上的指导说明，以连接混合物为模板、以RNII-S2为第一次PCR的引物而以RNII-S1为第二次PCR引物进行PCR。首先利用苯酚提取，然后利用乙醇沉淀从第二次PCR后的溶液中纯化DNA.此DNA是利用T4 DNA聚合酶扩增的钝末端DNA。随后对其进行琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约1.5kb的扩增后DNA片段。利用T4 DNA连接酶将此长约1.5kb的DNA片段连接到已用Sma I消化过的pUC119上。利用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
对获得的转化体进行培养以获取其中已插入有长约1.5kb的DNA的质粒B25N16。
(4)克隆整个RNA酶II基因
在参考实施例2-(3)中确定的质粒21-12中长约0.4kb的插入片段的核苷酸序列基础上，合成了SEQ ID NO：5和6所代表的寡核苷酸RNII-S5和RNII-S6。
以参考实施例2-(2)中制备的质粒21-12为模板进行PCR、以RNII-S5和RNII-S6为引物进行PCR。按照试剂盒上粘贴的操作指导，以TaKaRa Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)为DNA聚合酶进行PCR。此PCR执行如下：94℃下反应30秒、55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，循环25次。PCR完成后，对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中回收长约0.3kb的扩增后DNA片段。利用DIG High-prime(Roche Diagnostics)、通过洋地黄毒甙配基对长约0.3kb的DNA片段进行标记。
以洋地黄毒甙配基标记的DNA为探针，利用HindIII(TakaraShuzo)、Sac I(Takara Shuzo)或HindIII及SacI进行Southern杂交以消化参考实施例2-(1)中制备的热坚芽孢杆菌基因组DNA。按照粘贴到其上的操作指导，利用DIG荧光检测试剂盒(RocheDiagnostics)来进行杂交和检测。结果，长约4.5kb、5.8kb和1.3kb的DNA片段分别与探针进行了杂交以利用HindIII、SacI、HindIII及Sac进行消化。
在这些结果基础上，利用HindIII对热坚芽孢杆菌基因组DNA进行消化，并对其进行琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约4.5kb的DNA。利用SacI对获得的DNA片段进行消化，并对其进行琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约1.3kb的DNA。利用T4DNA连接酶将获得的DNA与已利用HindIII及SacI消化过的pUC19(Takara Shuzo)连接。利用连接混合物转化大肠杆菌HB101。
将获得的转化体复制平铺到Hybond-NTM(Amersham PharmaciaBiotech)上。随后，按照传统方法，利用上述提及的洋地黄毒甙配基标记的探针进行菌落杂交。从而，从获得的正克隆中制备得到了质粒pRHB1。
随后确定了插入到pRHB1的DNA的核苷酸序列。对比由此核苷酸序列得到的氨基酸序列和枯草芽胞杆菌RNA酶HII的氨基酸序列，表明pRHB1中的DNA缺失从起始密码子开始的长约40bp的区域。随后，如下构建了完全长度的RNA酶H基因。
利用HindIII消化参考实施例2-(3)中制备的B25N16，并对其进行琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约160bp的DNA片段。利用T4DNA连接酶将长约160bp的DNA片段与已用HindIII消化过的pRHB1连接在一起。利用连接混合物转化大肠杆菌HB101。从得到的转化体中制备质粒。
然后，在起始密码子附近推测的核苷酸序列基础上，合成了SEQ IDNO：7所代表的寡核苷酸RNII-Nde。以从转化体制备的质粒为模板、以RNII-Nde及RNII-S6为引物进行PCR。选取可从中扩增长约0.7kb的DNA片段的质粒，并将其命名为pRHB11。
对插入到获得的pRHB11质粒中的DNA片段的核苷酸序列进行确定。分析结果显示存在可能编码RNA酶HII的开放阅读框架。此核苷酸序列在SEQ ID NO：8有展示。SEQ ID NO：9展示了源自此核苷酸列的RNA酶HII的氨基酸序列。
质粒pRHB11转化过的大肠杆菌大肠杆菌HB101命名为大肠杆菌JM109/pRHB11，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-7655。
(5)热坚芽孢杆菌RNA酶II基因的表达
将利用pRHB11或pRHB1转化过的大肠杆菌HB101接种到5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下振荡培养过夜。培养结束后，将离心收集后的细胞悬浮在0.5ml TE缓冲溶液中并进行超声处理。离心得到的上清液用作粗细胞提取物。
将10mM tris-HCl(pH8.0)、1mM二硫苏糖醇(Nacalai Tesque)、0.003％牛血清白蛋白(fraction V，Sigma)、4％甘油、20μg/ml聚(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)及30μg/ml聚(rA)(AmershamPharmacia Biotech)混合在一起。混合物在37℃下孵育10min并用作RNA酶H活性测定的底物溶液。
将1μl 1M MnCl2添加到100μl底物溶液中。40℃下孵育混合物。将10μl粗细胞提取物的10倍稀释液添加到混合物中以起始反应。40℃下反应30min后，向其中加入10μl 0.5M EDTA中止反应。随后测定其在260nm下的吸光度。结果，从含有pRHB11的大肠杆菌HB101制备得到的粗细胞提取物的反应混合物在260nm下的吸光度要明显高于从含有pRHB1的大肠杆菌HB101制备得到的粗细胞提取物的反应混合物在260nm下的吸光度。因此，这证明pRHB11含有RNA酶H基因并且含有pRHB11的大肠杆菌表达了RNA酶H活性。
(6)制备纯化的RNA酶HII制剂
将参考实施例2-(4)中利用pRHB11转化获得的大肠杆菌HB101接种到1L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下振荡培养16小时。培养完成后，将离心收集的细胞悬浮在52.3ml超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)，2mM2-巯基乙醇、10％甘油、2mM苯甲基磺酰氟]中并进行超声处理。在12000rpm下对超声后的悬浮液离心10min，将得到的上清液在60℃下加热15min。随后重新在12000rpm下对其离心10min以收集上清液。从而，得到了50.0ml加热后的上清液。
将溶液添加到已用缓冲溶液C[50mM tris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巯基乙醇、10％甘油]平衡过的RESOURSE Q柱(Ametsham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC体系(Amersham Pharmacia Biotech)进行层析。结果，RNA酶HII从RESOURSE Q柱中流下。将51ml RNA酶HII级分添加到已用缓冲液C平衡过的RESOURSE S柱(AmershamPharmacia Biotech)上，通过FPLC体系进行0-500mM NaCl线性梯度洗脱。约在240mM NaCl处洗脱得到含有RNA酶II的级分。将3.0mlRNA酶II级分分两部分添加到已用含有50mM NaCl的缓冲液C平衡过的PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。就得到的7.0ml洗脱液添加到已用含有50mM NaCl的缓冲液C平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用FPLC体系进行50-550mM NaCl的线性梯度洗脱。约在310mM NaCl处洗脱得到了含有RNA酶II的级分。利用Centricon-10(Amicon)进行超滤浓缩得到了4.4mlRNA酶II级分。将280μl浓缩物添加到已用含有100mM NaCl和0.1mMEDTA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用相同的缓冲液进行洗脱。结果，RNA酶HII在相应于35KD分子量的位置洗脱出来。此分子量与RNA酶HII的单体形式相对应。将洗脱得到的RNA酶HII用作BcaRNA酶HII制剂。
对获得的Bca RNA酶HII制剂的酶活性进行如下测定。
将100μl已在40℃下孵育过的反应混合物[20mM HEPES-氢氧化钾(pH7.8)、0.01％牛血清白蛋白(Takara Shuzo)、1％二甲亚砜、10mM二氯化锰、20μg/ml聚(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)、30μg/ml聚(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)]添加到1μl Bca RNA酶HII制剂中。将混合物在40℃下反应10min。随后向其中添加10μl 0.5MEDTA(pH8.0)中止反应。随后测定其在260nm下的吸光度。
结果，在Bca RNA酶HII制剂中观察到RNA酶H活性。
参考实施例3：克隆热坚芽孢杆菌RNA酶HIII基因
(1)克隆RNA酶HIII基因片段
在枯草芽胞杆菌和其他生物体中保存完好的区域的氨基酸序列基础之上，合成了用于筛选编码RNA酶HIII基因的、SEQ ID NO：10-13所表示的引物BsuIII-1、BsuIII-3、BsuIII-6和BsuIII-8，而上述氨基酸序列是在枯草芽胞杆菌和其他生物体RNA酶HIII的氨基酸序列同源性的基础上确定的[Biochemistry，38：605-608(1999)]。
在50μl容器中，以参考实施例2-(1)中制备的200ng热坚芽孢杆菌基因组DNA为模板、以100pmol BsuIII-1和100pmol BsuIII-8为引物进行第一次PCR。随后，在100μl容器中，以1μl此反应混合物为模板、以100pmol BsuIII-3和100pmol BsuIII-6为引物进行第二次PCR。按照附加的操作指导，在此两PCR中选用TaKaRa Taq聚合酶(Takara Shuzo)为DNA聚合酶。PCR操作如下：94℃下反应30秒，45℃下反应30秒及72℃下反应1min，持续25(第一次PCR)或30(第二次PCR)个循环。
长约450bp的扩增后DNA片段是利用T4 DNA聚合酶(TakaraShuzo)得到的钝末端DNA片段，随后对其进行琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约450bp的扩增后DNA片段。利用T4 DNA连接酶(TakaraShuzo)将此长约450bp的DNA片段连接到已用SmaI(Takara Shuzo)消化过的pUC119(Takara Shuzo)上。利用连接混合物转化大肠杆菌JM109。培养生成的转化体以获取其中已插入有长约450bp DNA片段的质粒pBCA3204。
(2)利用Southern杂交法克隆RNA酶HIII基因
对参考实施例3-(1)中得到的pBCA3204的插入DNA片段的核苷酸序列进行确定。在对此核苷酸序列确定的基础上，合成了SEQ IDNO：14和15所表示的引物RNIII-S3和BcaRNIII-3。在100μl容器中，以RNIII-S3和BcaRNIII-3为引物、以pBCA3204为模板，进行PCR。按照附加的指导说明，选用TaKaRa Z-Taq(Takara Shuzo)做为DNA聚合酶进行PCR。PCR操作如下：98℃下反应0秒，55℃下反应反应0秒及72℃下反应20秒，重复30个循环。反应完成后，对反应混合物进行苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀和琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约0.4kb的DNA片段。利用DIG DNA标记试剂盒(BoehringerMannheim)对长约0.4kb的DNA片段进行标记以制备探针。
利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI或XbaI(购自Takara Shuzo)将参考实施例2-(1)制备的20μg热坚芽孢杆菌基因组DNA完全消化。随后，取每种消化后DNA的一半量进行琼脂糖凝胶电泳。利用0.4N氢氧化钠将这些DNA从琼脂糖凝胶上转移到尼龙膜上，并在120℃下固定30分钟。60℃下，在含有30ml杂交缓冲液[43.4g/L氯化钠、17.6g/L柠檬酸钠、1％封闭剂(Boehringer Mannheim)、0.1％N-lauroyl肌氨酸、0.02％十二烷基硫酸钠(SDS)]的密封袋中对此膜进行4小时的预孵育，随后，60℃下，在含有包含有探针的5ml杂交缓冲液的密封袋中对其孵育16小时。
室温下，将此膜在含有0.1％SDS的50ml 2x SSC(17.5g/L NaCl，8.8g/L柠檬酸钠)中冲洗两次，45℃下，在含有0.1％SDS的50ml 0.5x SSC(4.3g/L氯化钠，1.9g/L柠檬酸钠)中冲洗两次。随后，利用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)检测到具有与探针互补的序列的长约8kb的EcoRI片段、长约4.5kb的PstI片段及长约1kb的HindIII片段。
对利用PstI完全消化的、剩余的一半热坚芽孢杆菌基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中收集长约4.5kb的PstI片段。随后，将此DNA片段连接到已利用PstI消化的、且已利用碱性磷酸酶(TakaraShuzo)去磷酸化的质粒载体pTV119N上。利用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
在50μl容器中，以RNIII-S3和BcaRNIII-3为引物、以一个菌落为模板进行PCR以筛选可能含有RNA酶HIII基因的菌落。按照附加的使用指导，选用TaKaRa-Z Taq(Takara Shuzo)进行PCR。PCR操作如下：98℃下反应0秒，55℃下反应0秒及72℃下反应20秒，持续30个循环。结果，我们发现，在菌落No.88中含有我们感兴趣的基因。
以从菌落No.88制备的质粒为模板，利用引物对RN-N(TakaraShuzo)和BcaRNIII-3或引物对M4(Takara Shuzo)和RNIII-S3进行PCR以检验是否整个RNA酶HIII基因都包含在质粒中。结果，我们发现，整个RNA酶HIII基因都包含在命名为pBCA3P88的质粒中。
(3)确定含有RNA酶HIII基因的DNA片段的核苷酸序列
利用双脱氧法，确定参考实施例3-(2)中质粒pBCA3P88的插入DNA片段的核苷酸序列。
对确定的核苷酸序列进行的分析表明，其中存在编码包括RNA酶HIII N-末端氨基酸序列在内的氨基酸序列的开放阅读框架。开放阅读框架的核苷酸序列及由此核苷酸序列得到的RNA酶HIII的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示。
(4)构建RNA酶HIII的表达质粒
在体积为100μl的容器中，以参考实施例3-(2)中描述的质粒pBCA 3P88为模板、以SEQ ID NO：18所代表的BcaRNIIINde和M13引物M4(Takara Shuzo)为引物进行PCR，而BcaRNIIINde是对上文提及的、RNA酶HIII的开放阅读框架周围的序列进行设计得到的。按照附加的使用指导，选用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)进行PCR反应。PCR操作如下：94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应3min，重复30个循环。利用NdeI(Takara Shuzo)对长约4kb的扩增后DNA片段进行消化，并对其进行琼脂糖凝胶电泳以从凝胶中回收长约1.4kb的NdeI片段。将此长约1.4kb的DNA片段连接到已利用NdeI消化过且已利用碱性磷酸酶(Takara Shuzo)去磷酸化后的pTV119Nd(一种质粒，其中，pTV119N中的NcoI位点转化为NdeI位点)上。利用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
然后，在体积为50μl的容器中，以一个克隆为模板，以RN-N(Takara Shuzo)和BcaRNIII-3为引物，进行PCR以筛选质粒，而此质粒中NdeI片段的RNA酶HIII的下游是与载体pTV119Nd中的1ac启动子相连的。随后筛选可能含有RNA酶HIII的菌落。按照附加的指导说明，利用TaKaRa-Z Taq(Takara Shuzo)进行PCR。PCR操作如下：98℃下反应0秒，55℃下反应0秒及72℃下反应20秒，持续30个循环。结果，我们发现，菌落No.2含有质粒，而此质粒的NdeI片段中的RNA酶HIII基因的下游是与载体pTV119Nd中的lac启动子相连的。将此质粒命名为pBCA3Nd2。
利用双脱氧法对插入到质粒中的DNA片段的核苷酸序列进行确定，结果表明除起始密码子GTG变为ATG之外，PCR没有引起任何突变。
将利用质粒pBCA3Nd2转化过的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/pBCA3Nd2，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-7653。
(5)制备纯化的RNA酶HIII制剂
将利用参考实施例3-(4)中得到的pBCA3Nd2转化过的大肠杆菌JM109接种到2L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下振荡培养16小时。培养完成后，将离心收集的细胞悬浮在39.6ml超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并进行超声处理。在转速为12000rpm下，对超声处理后的悬浮液离心10分钟，60℃下，将得到的上清液加热处理15分钟。随后，在12000rpm下对其再次离心10分钟并收集上清液。从而得到了39.8ml加热处理后的上清液。
将加热处理后的上清液添加到已用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)上，并利用FPLC体系(Amersham Pharmacia Biotech)进行层析。结果，RNA酶HIII从RESOURSE Q柱中流下。
将45ml RNA酶HIII级分在2L缓冲液B[50mM tris-HCl(pH7.0)，1mM EDTA]中透析2小时。在相同条件下重复此透析2或多次。将55.8ml透析后的酶液添加到已用缓冲液B平衡过的RESOURSE S柱(AmershamPharmacia Biotech)上，利用FPLC体系进行0-500mM NaCl线性梯度洗脱。在105mM NaCl处收集到含有RNA酶HIII的级分。
向7.0ml级分中添加含有1M NaCl的缓冲液B使NaCl浓度达到150mM。将混合物添加到已用含有150mM NaCl的缓冲液B平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。结果，RNA酶HIII从HiTrap-肝素柱中流下。
利用Centricon-10(Amicon)对7.5ml RNA酶HIII级分进行超滤浓缩。将190μl浓缩液添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用同种缓冲液进行洗脱。结果，RNA酶HIII在相当于分子量为33KD的位置洗脱下来。此分子量与单体形式的RNA酶HIII的分子量相对应。
将洗脱得到的RNA酶HIII用作Bca RNA酶HIII制剂。
获得的Bca RNA酶HIII制剂的酶活性测定如下：
将在40℃孵育的100μl反应混合物[20mM HEPES-氢氧化钾(pH7.8)，0.01％牛血清白蛋白(Takara Shuzo)，1％二甲亚砜4mM醋酸镁，20μg/ml聚(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)，30μg/ml聚(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)]添加到1μl Bca RNA酶HIII制剂中。混合物在40℃下反应10分钟。向其中添加10μl 0.5MEDTA(pH8.0)中止反应。随后在260nm下测定其吸光度。结果，我们在Bca RNA酶HIII制剂中观察到RNA酶H活性。
参考实施例4；克隆激烈热球菌RNA酶HII基因
(1)从激烈热球菌中制备基因组DNA
将2L含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母提取物(Difco Laboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppmCuSO4·5H2O、0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O及0.25ppm NiCl2·6H2O的培养基置于2L培养基容器中，120℃下灭菌20min，通氮气以驱除其中的溶解氧，随后将激烈热球菌(购自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen；DSM3638)接种到培养基中，并在95℃下静置培养16小时。培养完成后，离心收集细胞。
随后悬浮在将收集的细胞4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中添加0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶制剂(Nacalai Tesque)水溶液。此混合物在20℃下反应1小时。反应完成后，向其中添加24ml含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及2ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液的混合物。将此混合物在37℃下孵育1小时。反应完成后，对此混合物进行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀以制备约1mg基因组DNA。
(2)克隆RNA酶HII基因
Pyrococcus horikoshii的整个基因组序列已公开[DNAResearch，5：55-76(1998)]。已知存在编码基因组中的RNA酶HII(PH1650)的同系物的基因(SEQ ID NO：19，National Institute ofTechnology and Evaluation的主页： http：//www.nite.go.jp/)。
对PH1650基因和激烈热球菌部分公开的基因组序列(the homepage of University of Utah，Utah Genome Center；http：//www.genome.utah.edu/sequence.html)间的同源性进行搜索。结果发现了高度同源的序列。在此同源序列基础上合成了引物1650Nde(SEQ ID NO：20)和1650Bam(SEQ ID NO：21)。
在100μl容器中，以参考实施例4-(1)中获得的200ng激烈热球菌基因组DNA为模板，以20pmol 1650Nde和20pmol 1650Bam为引物，进行PCR。按照附加的操作指导，利用TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo)做DNA聚合酶来进行PCR。PCR操作如下：94℃下反应30秒，55℃下反应30秒，及72℃下反应1min，持续30个循环。利用NdeI和BamHI(购自Takara Shuzo)消化长约0.7kb的扩增后DNA片段。将得到的DNA片段插入到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点与BamHI位点间以获得质粒pPFU220。
(3)确定含有RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列
按照双脱氧法，对参考实施例4-(2)中获得的pPFU220的DNA插入片段的核苷酸序列进行确定。
对确定后的核苷酸序列进行的分析表明，其中存在可能编码RNA酶HII的开放阅读框架。开放阅读框架的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示。从此核苷酸序列得到的RNA酶HII氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
将利用质粒pPFU220转化过的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/pPFU220，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-7654。
(4)制备纯化的RNA酶HII制剂
利用参考实施例4-(2)中获得的pPFU220转化大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen)。将转化后的含有pPFU220的HMS174(DE3)接种到2L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下振荡培养16小时。培养完成后，将离心收集的细胞悬浮在66.0ml超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并进行超声处理。在12000rpm下对超声后的悬浮液离心10min，将得到的上清液在60℃下加热15min。随后重新在12000rpm下对其离心10min以收集上清液。从而，得到了61.5ml加热后的上清液。
将加热处理后的溶液添加到已用缓冲溶液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC体系(Amersham Pharmacia Biotech)进行层析。结果，RNA酶HII从RESOURSE Q柱中流下。
将60ml RNA酶HII级分添加到已用缓冲液A平衡过的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，通过FPLC体系进行0-500mMNaCl线性梯度洗脱。约在150mM NaCl处洗脱得到含有RNA酶II的级分。利用Centricon-10(Amicon)对2.0ml RNA酶II级分进行超滤浓缩。将250μl浓缩物添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用相同的缓冲液进行洗脱。结果，RNA酶HII在相应于17KD分子量的位置洗脱出来。此分子量与RNA酶HII的单体形式相对应。
将洗脱得到的RNA酶HII用作Pfu RNA酶HII制剂。
如参考实施例3-(5)中所述，对获得的Pfu RNA酶HII制剂进行酶活性测定。结果，在Pfu RNA酶HII制剂中观察到RNA酶H活性。
参考实施例5：克隆海栖热袍菌RNA酶HII基因
(1)从海栖热袍菌中制备基因组DNA
将2L含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％可溶性淀粉、3.5％Jamarine S Solid、0.5％ Jamarine S Liquid、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppm H3BO3、0.1ppm Na2MoO4·2H2O及0.25ppm NiCl2·6H2O的培养基置于2L培养基容器中，120℃下灭菌20min，通氮气以驱除其中的溶解氧，随后将海栖热袍菌(购自Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSM3109)接种到培养基中，并在85℃下静置培养16小时。
从300ml培养物中离心收集细胞，随后将其悬浮在3ml TE缓冲液[10mM tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA]中。向其中添加150μl 10％十二烷基硫酸钠水溶液(Nacalai Tesque)和15μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)。混合物在37℃下孵育1小时。反应完成后，向混合物中添加0.5ml 5M NaCl。完全混合后，向混合物中添加0.4mlCTAB-NaCl溶液[10％溴棕三甲铵(Nacalai Tesque)，0.7M NaCl]。完全混合后，混合物在65℃下孵育10分钟。向其中添加1.5ml氯仿/异戊醇混合物(24∶1，v/v)。将混合物轻轻混匀10min，并在20000xg下离心5分钟。离心完成后，向得到的上清液中添加等体积的、饱和苯酚与100mM tris-HCl(pH8.0)/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v)的混合物。将混合物轻轻混匀10min，并在20000xg下离心5分钟。离心完成后，向上清液中添加0.6体积的2-丙醇。利用70％乙醇水溶液冲洗在10000xg下离心5min后得到的沉淀物，风干，随后溶解在200μl TE中以形成基因组DNA溶液。
(2)克隆RNA酶HII基因
为了以海栖热袍菌基因组DNA为模板进行PCR，从而得到含有RNA酶H基因的扩增后DNA片段，所以在部分核苷酸序列基础之上(http：//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)，合成了SEQ ID NO：24-27所表示的寡核苷酸915-F1、915-F2、915-R1和915-R2，而此部分核苷酸序列已鉴定为海栖热袍菌基因组DNA的核苷酸序列中的RNA酶HII基因。
以参考实施例5-(1)中制备的海栖热袍菌基因组DNA为模板，以915-F1和915-R1、915-F1和915-R2、915-F2和915-R1或915-F2和915-R2为引物对，进行PCR。按照附加的操作指导，选用TaKaRa ExTaq为DNA聚合酶来进行PCR。PCR操作如下：95℃下反应0.5min，55℃下反应0.5min及72℃下反应1.5min，持续25个循环。反应完成后，对各个PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以提取和纯化长约0.7kb的扩增后DNA片段。利用HindIII和XbaI(购自Takara Shuzo)消化通过引物对915-F1和915-R1或915-F1和915-R2扩增得到的DNA，并利用T4 DNA连接酶将其与已经HindIII和xbaI消化后的pUC19连接。利用连接混合物转化大肠杆菌JM109。对得到的转化体进行培养以制备其中插入有长约0.7kbDNA的质粒DNA。结果，获得了含有利用915-F1和915-R1扩增得到的DNA的质粒No.1和No.2，及含有利用915-F1和915-R2扩增得到的DNA的质粒No.3和No.4。
此外，利用NcoI(Takara Shuzo)和XbaI双重消化通过引物对915-F2和915-R1或915-F2和915-R2扩增得到的DNA，并利用T4 DNA连接酶将其与经由NcoI和xbaI双重消化的pTV119N(Takara Shuzo)连接。利用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
对获得的转化体进行培养以制备其中插入有长约0.7kbDNA的质粒DNA。结果，得到了含有利用915-F2和915-R1扩增得到的DNA的质粒No.5和No.6，及含有利用915-F2和915-R2扩增得到的DNA的质粒No.7。
将利用质粒No.7转化过的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/pTM-RNH，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-7652。
(3)表达海栖热袍菌RNA酶HII基因
将利用质粒No.1-7中的一种质粒或pUC19转化过的大肠杆菌JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，pH7.2)中，并在37℃下振荡培养。当在660nm下的吸光度达到0.5时，向其中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷直至其浓度为1mM，并将细胞培养过夜。培养完成后，将离心收集的细胞悬浮在1ml TE缓冲液中并进行超声处理。80℃下，对超声处理后悬浮液进行10分钟加热处理。离心得到的上清液用作粗细胞提取物。如参考实施例2-(5)中所述，对粗细胞提取物进行吸光度测定。结果，当在MnCl2存在下进行反应时，从含有质粒No.3、5、6或7的大肠杆菌JM109制备的粗细胞提取物在260nm处的吸光度要明显高于从含有pUC19的大肠杆菌JM109制备的粗细胞提取物在260nm处的吸光度。因此，这证明质粒No.3、5、6和7含有RNA酶H基因，并且含有这些质粒中的一种质粒的大肠杆菌表达了此RNA酶H活性。
对质粒中的DNA插入片段的部分核苷酸序列进行了确定，而已证明此质粒可在大肠杆菌中表达RNA酶活性。对已进行确定的核苷酸序列进行的分析表明，其中含有可能编码RNA酶HII的开放阅读框架。开放阅读框架的核苷酸序列在SEQ ID NO：143中有示。衍生自此核苷酸序列的RNA酶HII的氨基酸序列在SEQ ID NO：144中有示。随后，我们发现，在质粒No.7的DNA插入片段的部分核苷酸序列中可观察到可能由PCR引起的碱基替代，而此替代造成了其编码的氨基酸残基发生变化。
(4)制备纯化的RNA酶HII制剂
利用参考实施例5-(2)中获得的pTM-RNH转化大肠杆菌JM109。将含有pTM-RNH的转化后大肠杆菌JM109接种到1L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下振荡培养16小时。培养完成后，将离心收集的细胞悬浮在31.0ml超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)，2mM 2-巯基乙醇、10％甘油、2mM苯甲基磺酰氟]中并进行超声处理。在12000rpm下对超声后的悬浮液离心10min，将得到的上清液在70℃下加热15min。随后重新在12000rpm下对其离心10min以收集上清液。从而，得到了32.0mi加热处理后的上清液。
将加热处理后的上清液添加到已用缓冲溶液C[50mM tris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巯基乙醇、10％甘油]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)中，并利用FPLC体系(AmershamPharmacia Biotech)进行层析。结果，RNA酶HII从RESOURSE Q柱中流下。将32.5ml RNA酶HII级分添加到已用缓冲液C平衡过的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，通过FPLC体系进行0-500mM NaCl线性梯度洗脱。约在240mM NaCl处洗脱得到含有RNA酶II的级分。将2.0ml RNA酶II级分添加到已用含有50mMNaCl的缓冲液C平衡过的PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。将得到的3.5ml洗脱液添加到已用含有50mM NaCl的缓冲液C平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用FPLC体系进行50-550mM NaCl的线性梯度洗脱。结果，约在295mM NaCl处洗脱得到了含有RNA酶II的级分。利用Centricon-10(Amicon)进行超滤浓缩得到了4.4ml RNA酶II级分。将RNA酶HII洗脱液用作Tma RNA酶HII制剂。
如参考实施例2-(6)所述，对制得的Tma RNA酶HII制剂进行酶活性测定。结果，在Tma RNA酶HII制剂中观察到RNA酶H活性。参考实施例6：从Pyrococcus horikoshii中克隆RNA酶HII基因
(1)从Pyrococcus horikoshii中制备基因组DNA
将2L含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母提取物(Difco Laboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppmCuSO4·5H2O、0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O及0.25ppm NiCl2·6H2O的培养基置于2L培养基容器中，120℃下灭菌20min，通氮气以驱除其中的溶解氧，随后将Pyrococcus horikoshii OT3(购自the Institute of Physical andChemical Research(RIKEN)；JCM9974)接种到培养基中，并在95℃下静置培养16小时。培养完成后，离心收集细胞。
随后将收集的细胞悬浮在4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中添加0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶制剂(Nacalai Tesque)水溶液。此混合物在20℃下反应1小时。反应完成后，向其中添加24ml含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及2ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液的混合物。此混合物在37℃下孵育1小时。
反应完成后，对此混合物进行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀以制备约1mg基因组DNA。
(2)克隆RNA酶HII基因
Pyrococcus horikoshii的整个基因组序列已公开[DNAResearch，5；55-76(1998)]。已知存在编码基因组中的RNA酶HII(PH1650)的同系物的基因(SEQ ID NO：145，National Institute ofTechnology and Evaluation的主页： http：//www.nite.go.jp/)。
在此PH1650基因(SEQ ID NO：145)的序列的基础上合成了引物PhoNde(SEQ ID NO：146)和PhoBam(SEQ ID NO：147)。
在100μl容器中，以参考实施例6-(1)中获得的100ng Pyrococcushorikoshii基因组DNA为模板，以20pmol PhoNde和20pmol PhoBam为引物，进行PCR。按照附加的操作指导，利用TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo)做DNA聚合酶来进行PCR。PCR操作如下：94℃下反应30秒，55℃下反应30秒，及72℃下反应1min，持续40个循环。利用NdeI和BamHI(购自Takara Shuzo)消化长约0.7kb的扩增后DNA片段。随后，将得到的DNA片段结合到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点与BamHI位点间以获得质粒pPHO238。
(3)确定含有RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列
按照双脱氧法，对参考实施例6-(2)中获得的pPHO238的DNA插入片段的核苷酸序列进行确定。
对经确定后的核苷酸序列进行的分析表明，其中存在可能编码RNA酶HII的开放阅读框架。开放阅读框架的核苷酸序列在SEQ ID NO：148中有示。由此核苷酸序列得到的RNA酶HII氨基酸序列在SEQ IDNO：149中有示。
将利用质粒pPHO238转化过的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/pPH0238，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-7692。
(4)制备纯化的RNA酶HII制剂
利用参考实施例6-(2)中获得的pPHO238转化的大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen)。将转化后的含有pPH0238的HMS174(DE3)接种到1L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下振荡培养16小时。培养完成后，将离心收集的细胞悬浮在34.3ml超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并进行超声处理。在12000rpm下对超声后的悬浮液离心10min，将得到的上清液在80℃下加热15min。随后重新在12000rpm下对其离心10min以收集上清液。从而，得到了33.5ml加热后的上清液。
将加热处理后的溶液添加到已用缓冲溶液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC体系(Amersham Pharmacia Biotech)进行层析。结果，RNA酶HII从RESOURSE Q柱中流下。
在2L缓冲液B(50mM tris-HCl(pH7.0)，1mM EDTA)中对35.0mlRNA酶HII级分进行2小时的透析。将34.5ml透析后的酶液添加到已用缓冲液B平衡过的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上并利用FPLC体系进行0-500mM NaCl的线性梯度洗脱。约在150mMNaCl处洗脱得到含有RNA酶II的级分。
向4.0ml级分中添加缓冲液B直至NaCl浓度达到50mM。将混合物添加到已用含有50mM NaCl的缓冲液B平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用FPLC体系进行50-550mMNaCl线性梯度洗脱。结果，约在160mM NaCl收集到含有RNA酶HII的级分。
利用Centricon-10(Amicon)对6.9ml RNA酶II级分进行超滤浓缩。将250μl浓缩物分为两部分，并添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡过的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用相同的缓冲液进行洗脱。结果，RNA酶HII在相应于24.5KD分子量的位置洗脱出来。此分子量与RNA酶HII的单体形式相对应。
将洗脱得到的RNA酶HII用作Pho RNA酶HII制剂。
如参考实施例3-(5)中所述，对获得的Pho RNA酶HII制剂进行酶活性测定。结果，在Pho RNA酶HII制剂中观察到RNA酶H活性。参考实施例7：从闪烁古生球菌中克隆RNA酶HII基因
(1)从闪烁古生球菌中制备基因组DNA
将从8ml细胞培养物中收集的闪烁古生球菌(购自DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSM4139)细胞悬浮在100μl 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中添加20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml氯化溶菌酶制剂(NacalaiTesque)水溶液。此混合物在20℃下反应1小时。反应完成后，向其中添加800μl含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及50μl 10％十二烷基硫酸钠水溶液的混合物。此混合物在37℃下孵育1小时。反应完成后，对此混合物进行苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀并风干，随后将其溶解在50μl TE中以获得基因组DNA溶液。
(2)克隆RNA酶HII基因
闪烁古生球菌的整个基因组序列已公开[Nature，390：364-370(1997)]。已知存在编码基因组中的RNA酶HII(AF0621)的同系物的基因(SEQ ID NO：150，http：//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。
在AF0621基因(SEQ ID NO：150)的序列的基础上合成了引物AfuNde(SEQ ID NO：151)和AfuBam(SEQ ID NO：152)。
在100μl容器中，以参考实施例7-(1)中获得的100ng闪烁古生球菌基因组DNA为模板，以20pmol AfuNde和20pmol AfuBam为引物，进行PCR。按照附加的操作指导，利用Pyrobest DNA聚合酶(TakaraShuzo)做DNA聚合酶来进行PCR。PCR操作如下：94℃下反应30秒，55℃下反应30秒，及72℃下反应1min，持续40个循环。利用NdeI和BamHI(购自Takara Shuzo)消化长约0.6kb的扩增后DNA片段。随后，将得到的DNA片段结合到质粒载体pTV119Nd(一种质粒，其中，pTV119N中的NcoI位点转化为NdeI位点)的NdeI位点与BamHI位点间以构建质粒pAFU204。
(3)确定含有RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列
按照双脱氧法，对参考序列7-(2)中获得的pAFU204的DNA插入片段的核苷酸序列进行确定。
对经确定后的核苷酸序列进行的分析表明，其中存在可能编码RNA酶HII的开放阅读框架。开放阅读框架的核苷酸序列在SEQ ID NO：153中有示。从此核苷酸序列得到的RNA酶HII氨基酸序列在SEQ IDNO：154中有示。
将利用质粒pAFU204转化过的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/pAFU204，并于2001年2月22日(原始保藏日期)保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-7691。
(4)制备纯化的RNA酶HII制剂
利用参考实施例7-(2)中获得的pAFU204转化的大肠杆菌JM109。将转化后的含有pAFU204的JM109接种到2L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下振荡培养16小时。培养完成后，将离心收集的细胞悬浮在37.1ml超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并进行超声处理。在12000rpm下对超声后的悬浮液离心10min，将得到的上清液在70℃下加热15min。随后重新在12000rpm下对其离心10min以收集上清液。从而，得到了40.3ml加热后的上清液。
将加热处理后的溶液添加到已用缓冲溶液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC体系(Amersham Pharmacia Biotech)进行层析。结果，RNA酶HII从RESOURSE Q柱中流下。
将RNA酶HII级分添加到已用缓冲液A平衡过的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用FPLC体系(AmershamPharmacia Biotech)进行层析。结果，RNA酶HII从RESOURSE Q柱中流下。
在2L含有50mM NaCl缓冲液B(50mM tris-HCl(pH7.0)，1mMEDTA)中对40.0ml RNA酶HII级分进行2小时的透析。重复两次这样的透析。将40.2ml透析后的酶液添加到已用含有50mM NaCl的缓冲液B平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用FPLC体系进行50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果，约在240mM NaCl处收集到含有RNA酶HII的级分。
利用Centricon-10(Amicon)对7.8ml RNA酶II级分进行超滤浓缩。将600μl浓缩物分为四部分，将每一部分分别添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡过的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用相同的缓冲液进行洗脱。结果，RNA酶HII在相应于30.0KD分子量的位置洗脱出来。此分子量与RNA酶HII的单体形式相对应。
将上述洗脱得到的RNA酶HII用作Afu RNA酶HII制剂。
如参考实施例3-(5)中所述，对获得的Afu RNA酶HII制剂进行酶活性测定。结果，在Afu RNA酶HII制剂中观察到RNA酶H活性。
参考实施例8：按照下列方法对源自本发明的方法中选用的大肠杆菌的RNA酶H进行酶活力单位测定
(1)制备选用的试剂溶液
用于活性确定的反应混合物：下列物质以指定的终浓度溶解在无菌水中：40mM tris-盐酸盐(37℃下，pH7.7)、4mM氯化镁、1mM DTT、0.003％BSA、4％甘油和24μM聚(dT)。
聚[8-3H]腺苷酸溶液；将370kBq聚[8-3H]腺苷酸溶液溶解在200μl无菌水中
多聚腺苷酸溶液；将多聚腺苷酸溶解在无菌超纯水中，浓度为3mM。
酶稀释液；下列物质以指定的终浓度溶解在无菌水中；25mM tris-盐酸盐(37℃下，pH7.5)、5mM 2-巯基乙醇、0.5mM EDTA(37℃下，pH7.5)、30mM氯化钠和50％甘油。
制备热变性的小牛胸腺DNA：将200mg小牛胸腺DNA悬浮并溶胀在100ml TE缓冲液中。在UV260nm的吸光度测定的基础上，利用无菌超纯水将其稀释到浓度为1mg/ml。将稀释液在100℃下加热10min，随后在冰浴中迅速冷却。
(2)活性测定方法
将7μl聚[8-3H]腺苷酸溶液添加到985μl反应混合物中以确定上文(1)中制备的酶液的活性。将此混合物在37℃下孵育10分钟。向混合物中添加8μl腺苷酸使其浓度达到24μM。将混合物进一步在37℃下孵育5分钟。从而，制备了1000μl聚[8-3H]rA-聚-dT反应混合物。随后去200μl反应混合物在30℃下孵育5分钟。向其中添加1μl的适当系列稀释后的酶液。每隔一定时间从反应混合物中取出50μl样品以用于随后的测定。从添加酶液到采样的时间定义为Y，以分钟表示。通过添加1μl酶稀释液而不是酶溶液，制备了用于总CPM测定或用做空白的50μl反应混合物。向样品中添加100μl 100mM焦磷酸钠、50μl热变性的小牛胸腺DNA溶液及300μl 10％三氯乙酸(300μl超纯水用于总CPM测定)。将混合物在0℃下孵育5分钟，随后在10000rpm下离心10min。离心完成后，将得到的250μl上清液置于小玻璃瓶中。向其中添加10ml水溶胶-2(NEN Life Science Products)。在液体闪烁计数器中测定CPM。
(3)酶活力单位计算
按下列方程式计算每种酶的酶活力单位：
酶活力单位/ml＝{(测定的CPM-空白CPM)×1.2*×20×1000×稀释率)200(μl)/(总CPM×Y(min.)×50(μl)×9**)
1.2*；每50μl酶液的总CPM中含有的聚[8-3H]rA-聚-dT量，以nmol表示。
9**；纠正系数
实施例1
利用本发明中的方法检测肠出血性大肠杆菌O-157
本实施例中选用的引物的序列在序列表SEQ ID NO：31-34中有示。利用每个都含有SEQ ID NO：31或32的引物构建其引物结合体以用于检测编码O-157 vero毒素(VT)1的序列，以及利用每个都含有SEQ ID NO：33或34的引物构建其引物结合体以用于检测编码O-157vero毒素(VT)2的序列。培养肠出血性大肠杆菌O-157(ATCC编号43895)，收集细胞，将细胞以适当的细胞密度悬浮在无菌水中，在98℃下对其加热处理10min，这样制备得到了热水提取物，以此热水提取物为模板。反应混合物的组成如下。
在48μl反应体积中含有27mM磷酸缓冲液(pH7.3)、0.01％牛血清白蛋白(BSA)、5％二甲亚砜(DMSO)、每种dNTP各1mM、8mM醋酸镁、每种引物各60pmol、相当于104-106个细胞的DNA的模板DNA(热水提取物)及无菌蒸馏水。在98℃下将反应混合物加热1min使其热变性，随后冷却到55℃。向其中添加5.5U BcaBEST DNA聚合酶和60U大肠杆菌RNA酶H。反应混合物在55℃下孵育60min。其后，在90℃加热此混合物2min以使酶变性。每种反应混合物各取3μl并在4％NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)上进行电泳。结果，利用一种引物对和相当于104个细胞DNA的模板DNA就可对O-157 vero毒素1和2进行检测，这进一步确定了本发明的方法可用做毒性细菌检测方法。
实施例2
(1)对本发明的方法中选用的缓冲液类型的效应进行检验。在本实施例中，选用可对含有SEQ ID NO：39和40所表示的序列的λDNA进行扩增的引物。反应操作如下。简单来讲，在98℃下，将10μl含有每种引物各120pmol、0.01％丙二胺水溶液、10ng或1ng模板DNA的混合物加热变性2分钟，随后在冰上冷却以使引物退火到模板DNA上。将在扩增后随后就利用Suprec02(Takara Shuzo)进行纯化的扩增后产物(1005bp)作为模板，而此扩增后产物是利用λDNA(TakaraShuzo)为模板及以SEQ ID NO：41和42所表示的序列为引物进行PCR得到的。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸镁、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亚砜(DMSO)、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三种反应缓冲液(42.5mM Tricine-氢氧化钾(pH8.5)、42.5mM N-二[羟乙基]甘氨酸-氢氧化钾缓冲液(pH8.3)及42.5mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8))中的一种，使终体积达到50μl。将反应混合物在60℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳以进行进一步的证明。随后，观察到以多种模板进行扩增后得到的感兴趣的片段。特别的，从含有N-二[羟乙基]甘氨酸-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)的反应体系中可获得更大量的扩增产物。
(2)对利用HEPES-氢氧化钾缓冲液取得的活性提高进行检验。以含有插入到多克隆位点中的长约150bp的DNA片段的pUC19质粒DNA为模板。此模板的制备如下。
利用含有SEQ ID NO：134和135所表示的序列的pUC19upper150PCR引物和pUC19 lower PCR引物、以100pg pUC19质粒DNA为模板进行PCR。利用Microcon-100对扩增后的片段进行纯化，利用DNA钝化试剂盒(Takara Shuzo)进行钝末端化，并将其亚克隆到质粒pUC19的HincII位点中。利用含有插入的扩增片段的质粒转化大肠杆菌JM109。培养转化体。利用QIAGEN质粒微型试剂盒(Qiagen)从细胞中纯化具有插入DNA的质粒，并将其作为模板。
将PCR扩增后的DNA片段用做模板，而此扩增后片段是通过以上述制备的pUC19-150质粒DNA为模板、利用含有SEQ ID NO：35和36所表示的核苷酸序列的引物MCS-F和MCS-R进行PCR扩增得到的。将含有SEQ ID NOS：37和38所表示的核苷酸序列的引物MF2N3(24)和MR1N3(24)作为嵌合寡核苷酸引物。结合利用这些引物而获得的扩增后片段的大小约为350bp。
选择HEPES-氢氧化钾缓冲液体系作为待测缓冲液。磷酸钾缓冲液体系和Tricine缓冲液体系作为对照。反应缓和物组成如下所示。
反应混合物A：10ng PCR扩增后片段，引物MF2N3(24)和MR1N3(24)各50pmol，0.01％丙二胺水溶液及无菌水，反应体积为10μl。
反应混合物B：制备下列三种类型缓冲液体系。
磷酸钾缓冲液体系：制备40μl含有终浓度为35mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、1.25％DMSO、0.0125％BSA、5mM醋酸镁、每种dNTP各0.625mM、60U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的反应混合物。
Tricine缓冲液体系；制备40μl含有终浓度为42.5mM Tricine缓冲液(pH8.7)、12.5mM氯化钾、12.5mM硫酸铵、1.25％DMSO、0.0125％BSA、5mM醋酸镁、每种dNTP各0.625mM、30U大肠杆菌RNA酶H及5.5U BcaBEST DNA聚合酶的反应混合物。
HEPES-氢氧化钾缓冲液体系；制备40μl含有终浓度为25mMHEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、125mM醋酸钾、1.25％DMSO、0.0125％BSA、5mM醋酸镁、每种dNTP各0.625mM、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的反应混合物。
将反应混合物A在98℃下加热变性2min，冷却到60℃或65℃，随后在冰上静置。将一份反应缓和物B添加到置于冰上的反应混合物A中，将其混合并使体积达到50μl。在60℃或65℃下孵育反应混合物1小时。反应完成后，将其冷却到4℃，并向每种反应缓冲液中添加1/10体积0.5M EDTA中止反应。每种反应混合物各取3μl，在3％NuSieve3∶1琼脂糖凝胶上对其进行电泳。结果，不管反应温度如何，在此三种缓冲液体系中都观察到感兴趣的扩增后片段。特别的，在此实施例中，在HEPES-氢氧化钾缓冲液体系中观察到最大量的扩增产物和最高的活性。
实施例3
(1)对本发明的方法中引物与模板退火的条件进行检验
在WO97/32010中描述的黄杆菌亚种SA-0082(1995年3月29日已经保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM P-14872，并保藏于国际专利生物保藏机构：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-5402(要求转移到国际托管权威机构的日期为；1996年2月15日))的部分核苷酸序列基础上，选用含有SEQ ID NO：43和44所表示的序列的引物。在本实施例中，选用扩增后的且随后利用Suprec02(TakaraShuzo)进行纯化的扩增产物(573bp)做为DNA模板，而此扩增后产物是以黄杆菌亚种SA-0082的基因组DNA为模板、结合利用SEQ IDNO：45和46所表示的引物进行PCR得到的。反应操作如下。简单来讲，将2μl两种退火溶液(500mM氢氧化钾和8μM亚精胺，或0.05％丙二胺)中的一种添加到每种引物浓度均为120pmol的溶液中。每种终体积均为10μl的混合物中进一步含有10ng或1ng PCR扩增片段，在98℃下使其加热变性2min。变性后，混合物在冰上迅速冷却以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸镁、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亚砜(DMSO)、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三种反应缓冲液(42.5mM Tricine-氢氧化钾(pH8.5)、42.5mM N-二[羟乙基]甘氨酸-氢氧化钾缓冲液(pH8.3)及42.5mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8))中的一种，使终体积达到50μl。将反应混合物在52℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图1所示。图1例示了结合利用退火溶液和缓冲液进行反应的电泳结果。泳道1；分子量标记(100bp梯，TakaraShuzo)；泳道2；丙二胺/Tricine(模板；10ng)；泳道3；丙二胺/HEPES(模板；10ng)；泳道4；丙二胺/HEPES(模板；1ng)；泳道5；丙二胺/N-二[羟乙基]甘氨酸(模板；10ng)；泳道6；丙二胺/N-二[羟乙基]甘氨酸(模板；1ng)；泳道7；500mM氢氧化钾和8μM亚精胺/N-二[羟乙基]甘氨酸(模板；10ng)；泳道8；500mM氢氧化钾和8μM亚精胺/N-二[羟乙基]甘氨酸(模板；1ng)；泳道9；分子量标记(100bp梯)；泳道10；丙二胺/Tricine(模板；1ng)；泳道11；500mM氢氧化钾和8μM亚精胺/Tricine(模板；1ng)；泳道12；丙二胺/HEPES(模板；1ng)；泳道13；500mM氢氧化钾和8μM亚精胺/HEPES(模板；1ng)；泳道14；丙二胺/N-二[羟乙基]甘氨酸(模板；1ng)；及泳道15；500mM氢氧化钾和8μM亚精胺/N-二[羟乙基]甘氨酸(模板；1ng)
如图1所示，不管模板DNA的量，当含有500mM氢氧化钾+8μM亚精胺的退火溶液用于此三种缓冲溶液中的引物与DNA模板退火时，我们可获得更大量的感兴趣的扩增产物。特别的，在本实施例中，结合使用含有500mM氢氧化钾+8μM亚精胺的退火溶液与N-二[羟乙基]甘氨酸-氢氧化钾缓冲溶液会收到好的效果。
(2)如果源自λDNA的PCR扩增片段作为模板时，对退火溶液的效用进行检测。本实施例中选用实施例2(1)所述的嵌合寡核苷酸引物。以实施例2(1)中制备的PCR扩增片段或λDNA为模板DNA。反应操作如下。简单来讲，将2μl三种退火溶液(500mM氢氧化钾和8μM亚精胺，0.05％丙二胺，或无菌水)中的一种添加到120pmol引物中。制备10μl进一步含有10ng或1ng PCR扩增片段的混合物。在98℃下对此混合物加热变性2min，随后在冰上迅速冷却以使引物与模板退火。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸镁、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亚砜(DMSO)、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三种反应缓冲液(42.5mM Tricine-氢氧化钾(pH8.5)、42.5mM N-二[羟乙基]甘氨酸-氢氧化钾缓冲液(pH8.3)及42.5mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8))中的一种，使终体积达到50μl。将反应混合物在60℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图2所示。图2例示了结合利用模板、反应溶液和退火溶液进行反应的电泳结果。泳道1；标记物(100bp梯)；泳道2；10ng模板，结合利用Tricine/500mM氢氧化钾和8μM亚精胺；泳道3；1ng模板，结合利用Tricine/500mM氢氧化钾和8μM亚精胺；泳道4；10ng模板，结合利用N-二[羟乙基]甘氨酸/500mM氢氧化钾和8μM亚精胺；泳道5；1ng模板，结合利用N-二[羟乙基]甘氨酸/500mM氢氧化钾和8μM亚精胺；泳道6；10ng模板，结合利用HEPES/500mM氢氧化钾和8μM亚精胺；泳道7；1ng模板，结合利用HEPES/500mM氢氧化钾和8μM亚精胺；泳道8；分子量标记(100bp梯)；泳道9；10ng模板，结合利用Tricine/丙二胺；泳道10；1ng模板，结合利用Tricine/丙二胺；泳道11；10ng模板，结合利用N-二[羟乙基]甘氨酸/丙二胺；泳道12；1ng模板，结合利用N-二[羟乙基]甘氨酸/丙二胺；泳道13；10ng模板，结合利用HEPES/丙二胺；泳道14；1ng模板，结合利用HEPES/丙二胺；泳道15；分子量标记(100bp梯)；泳道16；10ng模板，结合利用Tricine/水；泳道17；1ng模板，结合利用Tricine/水；泳道18；10ng模板，结合利用N-二[羟乙基]甘氨酸/水；泳道19；1ng模板，结合利用N-二[羟乙基]甘氨酸/水；泳道20；10ng模板，结合利用HEPES/水；及泳道21；1ng模板，结合利用HEPES/水。
如图2所示，不管模板DNA的使用量，我们在结合利用三种缓冲液和三种退火溶液进行退火时观察到了我们感兴趣的扩增片段。特别的，在进一步证明了结合利用N-二[羟乙基]甘氨酸缓冲液和含有500mM氢氧化钾+8μM亚精胺的退火溶液时可获得更大量的扩增片段。
实施例4
检验了逆转录酶(RTase)抑制剂的存在对本发明的方法的影响。乙膦甲酸(PFA)可用做RTase的抑制剂。本实施例选用了SEQ ID NO：47和48所表示的引物。在本实施例中，选用扩增后的并随后利用Suprec02(Takara Shuzo)进行纯化的扩增产物(576bp)做为DNA模板，而此扩增后产物是以肠出血性大肠杆菌O-157的基因组DNA为模板、利用SEQ ID NO：49和50所表示的引物进行PCR得到的。反应操作如下。简单来讲，向每种引物浓度均为120pmol的溶液和含有500mM氢氧化钾及8μM亚精胺的2μl退火溶液中添加1ng PCR扩增片段，制备得到10μl混合物。将此混合物在98℃下其加热变性2min。随后，混合物在冰上迅速冷却以使引物退火到模板上。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)5.0mM醋酸镁、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亚砜(DMSO)、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的混合物及500μg/ml或50μg/ml的PFA，使其终体积达到50μl。将反应混合物在55℃下孵育1小时。另外也制备一不添加有PFA的体系作为对照。反应完成后，每种反应混合物各取9μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图3所示。图3例示了可展示逆转录酶活性抑制剂的效用的电泳结果。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；不添加PFA；泳道3；添加500μg/ml PFA；泳道4；添加50μg/ml PFA。
如图3所示，当添加有PFA时，非特异性扩增受到抑制并观察到感兴趣的扩增片段。特别的，其进一步证明，没有观察到在未添加PFA的体系中可观察到的非特异性扩增产物，在添加有500μg/ml PFA的体系中明显的扩增了感兴趣的扩增片段。
实施例5
对本发明的方法中的待扩增片段长度与检测灵敏度间的关系进行检验。
(1)合成了用于扩增SEQ ID NO：51-53所表示的大肠杆菌O-157vero毒素的引物。也选用了实施例4中选用的嵌合寡核苷酸引物。利用每种引物组合进行扩增的片段的长度如下：247bp(SEQ ID NO：51和48)；168bp(SEQ ID NOS：52和53)；206bp(SEQ ID NOS：52和48)；135bp(SEQ ID NOS：47和53)；及173bp(SEQ ID NOS：47和48)。在本实施例中，以实施例4中制备的长约576bp的、纯化的、PCR扩增片段作为模板DNA。反应操作如下：简单来讲，将10μl含有每种引物各60pmol、2μl 0.05％丙二胺水溶液和10fg-10ng PCR扩增片段的混合物在98℃下加热变性2min，随后在热循环仪Personal(Takara Shuzo)中将其冷却到55℃以使引物退火到模板上。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亚砜(DMSO)、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶及无菌水的混合物，使其终体积达到50μl。将反应混合物在55℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。作为对照，对利用SEQ ID NO：54和55所表示的引物扩增得到的10fg-1pg PCR扩增片段进行检测。结合利用这些引物扩增得到了长为135bp的片段。制备了每种引物各含60pmol的50μl PCR溶液、5μl 10x Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo)、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及浓度为0.2mM的各种dNTP。PCR操作如下：94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，持续25或30个循环(2分38秒/循环)。反应结束后，从每种反应混合物中各取1μl(ICAN)或5μl(PCR)混合物，在3.0％琼脂糖凝胶上对它们进行电泳。结果如图4和表1所示。
表1
  扩增长度(bp)   检测限
  ICAN(总时间：70分钟)247168206135173 100pg100fg100pg10fg100fg
  PCR(25个循环，总时间：约66分钟)135 100fg
  PCR(30个循环，总时间：约80分钟)135 10fg
图4例示了可展示通过ICAN(添加1/50反应混合物)和PCR(添加1/10反应混合物)扩增的135bp片段的检测限的电泳结果。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；ICAN，以1pg扩增片段为模板；泳道3；ICAN，以100fg扩增片段为模板；泳道4；ICAN，以10fg扩增片段为模板；泳道5；PCR(25个循环)，以1pg扩增片段为模板；泳道6；PCR(25个循环)，以100fg扩增片段为模板；泳道7；PCR(25个循环)以10fg扩增片段为模板；泳道8；PCR(30个循环)以1pg扩增片段为模板；泳道9；PCR(30个循环)以100fg扩增片段为模板；及泳道10；PCR(30个循环)以10fg扩增片段为模板。
如表1所示，其进一步确定了ICAN具有几乎与PCR相同的检测灵敏度。此外，PCR的总反应时间为80分钟，而利用本发明中的方法达到相同的检测灵敏度需要的的时间为70分钟，这进一步证明了利用本发明中的方法可缩短反应时间。
(2)合成了用于扩增含有SEQ ID NO：39、40和56所表示的核苷酸序列的λDNA的引物。利用每种引物组合进行扩增的片段的长度如下：151bp(SEQ ID NO：39和40)；及125bp(SEQ ID NO：56和40)。在本实施例中，以实施例2(1)中制备的模板DNA为模板。反应操作如下：简单来讲，将2μl退火溶液(500mM氢氧化钾和8μM亚精胺)、1fg-1ng模板添加到每种引物均为120pmol的溶液中，添加蒸馏水使其体积达到10μl。将此混合物在98℃下加热变性2min，随后在冰上迅速冷却以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氢氧化钾(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亚砜(DMSO)、30U大肠杆菌RNA酶H和11UBcaBEST DNA聚合酶的的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物在60℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如表2所示。
表2
  扩增长度(bp)   检测限
  125151   10fg100fg
如表2所示，其进一步证明，当λDNA为模板时，通过对最理想的区域进行检测可获得10fg的检测限。
(3)通过在质粒T7Blue T-载体(Takara Shuzo)中插入一扩增片段(长；340bp)制备得到一质粒。此扩增片段的制备在JP-A9-140383中有描述，其是以用于扩增含有SEQ ID NO：57和58所表示的核苷酸序列的菊花类病毒基因的合成引物为引物，以源自感染了类病毒的菊花的RNA为模板扩增得到的。利用此质粒转化大肠杆菌JM109活性细胞(Takara Shuzo)。37℃下，将转化体在5ml LB培养基中培养16小时。按照使用指南，利用QIAGEN质粒微型试剂盒(Qiagen)从收集的细胞中纯化此质粒。在利用Beckman DU-600(Beckman)对质粒浓度进行测定的基础上，制备在1μl无菌水中含有0fg、1fg、10fg、100fg、1pg、10pg、100pg或1ng此种质粒的稀释液。从制得的质粒稀释液中各取1μl用做每个50μl ICAN反应体系的模板。本实施例中选用含有SEQ ID NO：59和60所表示的核苷酸序列的引物CSVD-F2和CSVD-R6。反应操作如下。简单来讲，制备10μl含有浓度均为50pmol的各种引物、1μl已制备的质粒溶液及终浓度为0.01％的丙二胺的混合物。将此混合物在98℃下加热2分钟，冷却到60℃，在此温度下的热循环仪Personal(Takara Shuzo)中孵育1分钟，随后将其置于冰上。
退火完成后，向混合物中添加终浓度为20mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BS A、4mM醋酸镁、500μM的每种dNTP、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物置于60℃下的热循环仪Personal中并反应1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果，在利用10fg模板进行扩增的扩增产物中观察到感兴趣的扩增产物(长约90bp，长约70bp及长约50bp)。
实施例6
对本发明的方法中选用的引物进行检验。
(1)对引物的Tm值和反应温度进行检验。合成了用于扩增含有SEQ ID NO：43和61-63所表示的核苷酸序列的黄杆菌菌种SA-0082的引物。构建这些引物以对GC含量约为20％、长为160bp或更短的区域进行扩增。利用每种引物组合来扩增的片段的长度如下：126bp(SEQID NO：43和62)；158bp(SEQ ID NO：43和63)；91bp(SEQ ID NO：61和62)；及123bp(SEQ ID NOS：61和63)。本实施例中，选用实施例3(1)中制备的PCR扩增产物做模板DNA。反应如下进行。简单来讲，制备了10μl含有浓度均为120pmol的各种引物、2μl三种退火溶液(500mM氢氧化钾和8μM亚精胺，0.05％丙二胺，或水)中的一种及1fg-10ng模板的混合物。将此混合物在98℃加热变性2分钟，随后在冰上冷却以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸镁、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)、1.25％二甲亚砜(DMSO)、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三种反应缓冲液(17mM Tricine-氢氧化钾(pH8.5)、17mM N-二[羟乙基]甘氨酸-氢氧化钾缓冲液(pH8.3)及20mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8))中的一种，使其终体积达到50μl。将反应混合物在52、55或60℃下孵育1小时。反应完成后，从每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果，在反应温度为52℃的反应混合物中观察到了感兴趣的扩增片段。特别的，在结合利用含有500mM氢氧化钾和8μM亚精胺的退火溶液及Tricine或N-二[羟乙基]甘氨酸缓冲液的反应混合物中观察到更大量的感兴趣的扩增片段。图2和表3中展示了反应温度为52℃时的引物对、扩增片段长度及检测灵敏度。
表3
  扩增长度(bp)   检测限
  12615891123   100fg1pg1fg100fg
图5例示了电泳结果，而此电泳结果展示了当对富含AT区域进行扩增时扩增片段长度与模板DNA量之间的关系。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；长为91bp的扩增片段，1pg模板；泳道3；长为91bp的扩增片段，100fg模板；泳道4；长为91bp的扩增片段，10fg模板；泳道5；长为91bp的扩增片段，1fg模板；泳道6；长为123bp的扩增片段，1pg模板；泳道7；长为123bp的扩增片段，100fg模板；泳道8；长为123bp的扩增片段，10fg模板；泳道9；长为126bp的扩增片段，1pg模板；泳道10；长为126bp的扩增片段，100fg模板；泳道11；长为126bp的扩增片段，10fg模板；泳道12；长为158bp的扩增片段，1pg模板；泳道13；长为158bp的扩增片段，100fg模板；及泳道14；长为158bp的扩增片段，10fg模板。
如图5和表3所示，其证明了当利用富含AT的模板和一组富含AT的引物施行本发明的方法时，依赖于引物的Tm值而利用较低的反应温度会取得好的结果。
(2)引物的高级结构可能影响本发明的方法中的反应性。随后，检查了对引物进行的修饰，而这些修饰是为了避免引物的高级结构形成并使引物迅速退火到目标模板上。选用了SEQ ID NO：47、48和64-69所表示的引物。特别的，选用含有SEQ ID NO：47所表示的核苷酸序列的引物、含有SEQ ID NOS：64-66所表示的核苷酸序列并在其从3′末端始第4、5或6位碱基上含有肌苷脱氧核糖核酸的引物120I4、121I5和122I6、含有SEQ ID NO：104所表示的核苷酸序列的引物、及含有SEQ ID NOS：67-69所表示的序列并在其从3′末端始第4、5或6位碱基上含有肌苷脱氧核糖核酸的引物123I4、124I5和125I6。在本实施例中，选用在实施例4中制备的DNA模板。反应操作如下。简单来讲，将10μl含有50pmol各种引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、1ng-10ng模板DNA及无菌蒸馏水的混合物在98℃下加热2分钟，冷却到55℃，并利用此温度下的热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，Applied Biosystems)中孵育1分钟。
退火完成后，向退火混合物中添加浓度均为0.625mM的多种dNTP、42.5mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、30U大肠杆菌RNA酶H或5U源自嗜热栖热菌(Tth)的抗热性RNA酶H(Toyobo，下文中称为Tth RNA酶H)及5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加蒸馏水使其终体积达到50μl。将反应混合物在55℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图6所示。
图6例示了电泳结果，而此电泳结果展示了当选用大肠杆菌RNA酶H和Tth RNA酶H时，含有肌苷脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物的效用。泳道2-9表示利用大肠杆菌RNA酶H获得的结果。泳道10-17表示利用Tth RNA酶H获得的结果。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；SEQ ID NO：47和48所代表的引物对，1ng模板；泳道3；引物对120I4和123I4，1ng模板；泳道4；引物对121I5和124I5，1ng模板；泳道5；引物对122I6和125I6，1ng模板；泳道6：SEQ IDNO：47和48所代表的引物对，10ng模板；泳道7；引物对120I4和123I4，10ng模板；泳道8；引物对121I5和124I5，10ng模板；泳道9；引物对122I6和125I6，1ng模板；泳道10；SEQ ID NO：47和48所代表的引物对，1ng模板；泳道11；引物对120I4和123I4，1ng模板；泳道12；引物对121I 5和124I5，1ng模板；泳道13；引物对122I6和125I6，1ng模板；泳道14；SEQ ID NO：47和48所代表的引物对，10ng模板；泳道15；引物对120I4和123I4，10ng模板；泳道16；引物对121I5和124I5，10ng模板；及泳道17；引物对122I6和125I6，10ng模板
如图6所示，当选用含有在从引物3′末端始第4或5位碱基上结合有肌苷的引物时，不管模板的使用量，在使用大肠杆菌RNA酶H或嗜热栖热菌抗热性RNA酶H时都观察到感兴趣的扩增产物增加。这些结果证明，通过在适当位点结合肌苷可提高ICAN的反应性。
(3)鉴于与(2)相同的目的，对选用的引物进行检验。合成了含有SEQ ID NO：84和85所表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物1S和4S，而这两种引物3′末端的3个碱基为α-S(或α-硫)核糖核苷酸，也即，在RNA中含有5′-硫代磷酸酯键。此外，合成了含有SEQ ID NO：70和71所表示的核苷酸序列并在从3’末端开始的3个碱基中和脱氧核糖核苷酸的部分序列中含有核糖核苷酸，也即从引物3′末端始的11-13位上的核糖核苷酸的寡核苷酸引物1N3N3和4N3N3。选用实施例4中制备的模板DNA。扩增反应操作如下。简单来讲，利用热循环仪将10μl含有浓度均为50pmol的多种引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、10ng模板DNA和无菌水的混合物在98℃下加热2min，随后置于冰上冷却。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有浓度均为0.625mM的多种dNTP、42.5mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA，1.25％DMSO、30U大肠杆菌RNA酶H或5U Tth RNA酶H及5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加蒸馏水使其终体积达到50μl。55℃下，将反应混合物在热循环仪中孵育1小时。
反应完成后，每种反应混合物各5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果，不管选用的RNA酶H的类型，在结合利用引物1S和4S或1N3N3和4N3N3时在预期的位置清晰观察到扩增产物。这些结果进一步证实，在本发明的方法中利用5′-phophothioate对引物3′-末端进行的修饰是有效的。此外，其也进一步证明，在除引物3′-末端外的适当的内部位点利用核糖核苷酸进行替代对提高本发明的方法的反应性是有效的。
实施例7
在特殊金属离子存在下，对本发明的方法中的具有大肠杆菌RNA酶H活性的DNA聚合酶的利用进行检测。对10μl含有120pmol实施例2(1)选用的每种嵌合寡核苷酸引物、2μl含有500mM氢氧化钾和8μM亚精胺的退火溶液、1ng实施例2(1)中选用的模板DNA及无菌水的混合物在98℃下加热变性2分钟，随后在冰上迅速冷却以使引物与模板退火。退火完成后，向混合物中添加40μl含有浓度均为0.625mM的多种dNTP、42.5mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、11U BcaBEST DNA聚合酶及终浓度分别为0.5、2.5、5.0或10mM的二氯化锰(Nacalai Tesque)的混合物，添加蒸馏水使其终体积达到50μl。60℃下，将反应混合物在热循环仪中孵育1小时。此外，以不添加二氯化锰的混合物和添加有30U大肠杆菌RNA酶H而不添加二氯化锰的混合物做对照。反应完成后，从每种混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图7所示。
图7例示了电泳结果，而此电泳结果展示了利用BcaBEST DNA聚合酶的RNA酶H活性进行ICAN的结果。泳道1：分子量标记(100bp梯)；泳道2；不添加氯化锰/添加大肠杆菌RNA酶H；1泳道3；不添加氯化锰/不添加大肠杆菌RNA酶H；泳道4；添加0.5mM氯化锰/不添加大肠杆菌RNA酶H；泳道5；添加2.5mM氯化锰/不添加大肠杆菌RNA酶H；泳道6；添加5.0mM氯化锰/不添加大肠杆菌RNA酶H；及泳道7；添加10.0mM氯化锰/不添加大肠杆菌RNA酶H。
如图7所示，在添加有2.5mM氯化锰而不存在大肠杆菌RNA酶H的反应体系中观察到感兴趣的扩增产物。
实施例8
利用实际的生物样品对本发明中的方法进行了检验。
(1)以从肠出血性 大肠杆菌O-157(ATCC编号43895)的培养物中制得的热水提取物为模板进行检测。42℃下，将肠出血性大肠杆菌O-157在含有新生霉素的mEC培养基中培养18小时，随后在95℃下加热10min。通过利用无菌水对提取物进行稀释，制得相当于0、1、10、102、103、104或105个细胞的O-157热水提取物。在与实施例5(1)相同的条件下，利用一种O-157热水提取物对Vero毒素2(VT2)基因进行扩增。此外，在与实施例5(1)中所描述的相同的条件下，利用相同的模板进行PCR，作为对照。反应完成后，从每种混合物中取1μl(ICAN)或5μl(PCR)，在3.0％琼脂糖凝胶上对其进行电泳。结果如表4和图8所示。
表4
  扩增长度(bp)   检测限(细胞)
  ICAN(总时间：70分钟)135173 102103
  PCR(25个循环；总时间：约66分钟)135 103
  PCR(30个循环；总时间：约80分钟)135 102
图8例示了电泳结果，而此电泳结果展示了利用ICAN或PCR对大肠杆菌O157进行的检测。待扩增片段的链长为135bp。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；ICAN，104个细胞；泳道3；ICAN，103个细胞；泳道4；ICAN，102个细胞；泳道5；PCR，25个循环，104个细胞；泳道6；PCR，25个循环，103个细胞；泳道7；PCR，25个循环，102个细胞；泳道8；PCR，30个循环，104个细胞；泳道9；PCR，30个循环，103个细胞；及泳道10；PCR，30个循环，102个细胞。
如表4和图8所示，其进一步本发明中的检测方法的检测灵敏度与PCR的检测灵敏度相当，并且本发明中的检测法所需的检测时间较PCR少。
(2)利用实施例2和4中选用的、SEQ ID NO：40和56所表示的引物对λDNA进行检测。反应操作如下。简单来讲，制备了10μl含有浓度均为120pmol的多种引物、2μl含有500mM氢氧化钾和8μM亚精胺的退火溶液、10fg-1ngλDNA(Takara Shuzo)及无菌水的混合物。将混合物在98℃加热变性2分钟。随后在冰上迅速冷却以使引物与模板退火。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有浓度均为0.625mM的多种dNTP、42.5mM Tricine-氢氧化钾(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA，1.25％DMSO、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物在60℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如表5所示。
表5
  扩增长度(bp)   检测限
  125   1pg
如表5所示，其进一步证明本发明中的方法在λDNA检测方面是有效的。
(3)以黄杆菌亚种SA-0082基因组DNA为模板，以实施例6(1)中选用的、SEQ ID NO：61和62所代表的引物进行检测。按照传统方法，从WO97/32010中描述的黄杆菌属物种培养物中制备基因组DNA模板。反应进行如下。简单来讲，制备了10μl含有浓度均为120pmol的多种引物、2μl含有500mM氢氧化钾和8μM亚精胺的退火溶液、10fg-1ng基因组DNA及无菌水的混合物。将混合物在98℃加热变性2分钟。随后在冰上迅速冷却以使引物与模板退火。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有浓度均为0.625mM的多种dNTP、42.5mM Tricine-氢氧化钾(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA，1.25％DMSO、30U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物在52℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如表6和图9所示。
表6
  扩增长度(bp)   检测限
  91   100fg
图9例示了电泳结果，而此电泳结果展示了黄杆菌属物种进行的检测。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；1ng模板；泳道3；10pg模板；泳道4；1pg模板；泳道5；100fg模板；及泳道6；10fg模板。
如表6和图9所示，其进一步证明了本发明中的方法在细菌检测方面是有效的。
实施例9
对结合利用了本发明中的扩增方法和杂交方法的靶核酸检测方法进行检验。选取肠出血性大肠杆菌O-157为靶。如实施例8(1)中所述制备模板DNA。GC含量约为40％、长约100bp的区域选作待扩增片段。选取含有SEQ ID NO：51和72所表示的核苷酸序列的引物VT2-IF20和VT2-IR20-2为引物。反应进行如下。简单来讲，制备了10μl含有50pmol引物VT2-IF20和VT2-IR20-2、含有0.01％propylenediamin的退火溶液、相当于0-104个细胞的热水提取物及无菌水的混合物。将此混合物在98℃下加热变性2分钟，冷却到55℃，并在相同温度的热循环仪Personal(Takara Shuzo)中孵育1分钟，随后在冰上冷却以进行退火。
退火完成后，向混合物中添加终浓度20mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、浓度均为0.625mM的多种dNTP、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物置于温度已设定为55℃的热循环仪Personal中并在此温度下孵育60分钟。作为对照，按照操作指南，利用O-157 Typing Set(Takara Shuzo)在热循环仪Personal中进行了PCR。PCR操作如下：94℃下反应1min，55℃下反应1min，及72℃下反应1min，持续35个循环。此反应的每个循环需要约4分钟，而总时间约需145分钟。预期的扩增产物大小为404bp。反应完成后，从每种反应混合物各取3μl，在3％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图28A所示。图28A展示了利用ICAN或PCR对肠出血性大肠杆菌O157 vero毒素II基因进行检测的电泳结果。泳道M1；分子量标记(50-2000bp)；泳道M2；分子量标记(100bp梯)；泳道N；阴性对照；泳道1：相当于1个细胞的模板；泳道2；相当于10个细胞的模板；泳道3；相当于102个细胞的模板；泳道4；相当于103个细胞的模板；及泳道5；相当于104个细胞的模板。另外，表7展示了利用ICAN和PCR对相当于1或10个细胞的DNA进行扩增的扩增水平比较结果。
表7
  大肠杆菌O-157细胞的数目
  0   1   10
  ICANPCR   --   ++   +++++
-；没有进行扩增；+至+++表示三个等级的扩增程度
如图28A和表7所示，在利用本发明的检测法及PCR检测法中的利用相当于1个细胞的热水提取物进行的反应体系中都观察到感兴趣的扩增产物。以含有SEQ ID NO：73表示的核苷酸序列并在5′-末端用生物素标记的寡核苷酸VT2为探针，对利用ICAN获得的扩增产物进一步进行斑点印迹杂交。斑点印迹杂交操作如下。简单来讲，将1μl反应混合物在98℃下加热变性5min，在冰上迅速冷却，并将其印记到Hybond-NTM(Amersham PHarmacia Biotech)上。UV照射后，将膜置于杂交袋中。向其中添加10μl含有0.5M磷酸氢二钠(pH7.2)、1mM乙烯二胺四乙酸和7％十二烷基硫酸钠的杂交溶液。随后在42℃下进行30min预杂交。将10μl 100ng/μl VT2探针溶液热变性并添加到预杂交反应体系中。在42℃杂交60min后，室温下，在含有66.6mM氯化钠、66.6mM柠檬酸钠和0.1％氯化钠的溶液中冲洗膜两次，42℃下，在6ml添加有2μl 5mg/ml辣根过氧化物酶s treptoavidin共轭物(PIERCE)的冲洗缓冲液(0.3M氯化钠，17.3mM二水合磷酸氢二钠，2.5mM EDTA，0.1％十二烷基硫酸钠)中孵育12min，随后在室温下利用冲洗缓冲液冲洗两次。随后，室温下，在10ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)对膜进行冲洗，并在含有5ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液、5μl3％过氧化氢和250μl 2mg/ml四甲基联苯胺(TMB，Nacalai Tesque)乙醇溶液的混合物中避光反应10min。变色后，利用去离子水中止反应。结果如图28B所示。图28B展示了利用ICAN对肠出血性大肠杆菌O-157 vero毒素II基因进行检测的斑点印迹杂交结果。这些结果与上述电泳结果一致。因此，本发明中的方法的检测灵敏度与PCR的相当。相对于PCR，利用本发明的ICAN可将需要的反应总时间缩短1/2或更短的时间。进一步证明了本发明的ICAN作为病原等的检测方法是有效的。
实施例10
(1)以从培养物细胞中获得的RNA为模板，对逆转录反应和本发明中的方法的结合利用进行检验。反应操作如下。简单来讲，将1.5×105个细胞/ml的TRAW264.7细胞(ATCC TIB71)悬浮在含有10％胎牛血清(Gibco)的Dulbecco′s修饰后Eagle′s培养基(Bio Whittaker，12-604F)中。向6孔微量滴定板的每个孔中添加5ml悬浮液，并在5％CO2存在下，在37℃下孵育过夜。向每孔中添加50μl 100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma)水溶液和50μ11000U/μl干扰素-γ(IFN-γ，GenzymeTechne)水溶液。对滴定板额外孵育4小时。随后按照粘贴到试剂盒上的使用指导，利用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)从细胞中制备RNA。提供一组不添加LPS或IFN-γ内应混合物以作为阴性对照。
将60μl含有3μg制备的RNA、10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.3)、50mM KCl、5mM MgCl2、浓度均为1mM的多种dNTP、150pmol随机6聚体引物、60U核糖核酸酶抑制剂(Takara Shuzo)和15U逆转录酶xL(AMV)(Takara Shuzo，2620A)的混合物在30℃孵育10min、在42℃下孵育1小时，随后利用热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，Applied Biosystems)在99℃下对其孵育5min，这样制得了cDNA。
在鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(GeneBank标号NM-010927)的mRNA核苷酸序列基础上，合成了含有SEQ ID NO：74和75所表示的核苷酸序列的引物。
制备了10μl含有浓度均为50pmol的多种引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、1μl模板cDNA(相当于50ng RNA)和无菌水的混合物。在98℃下使混合物热变性2分钟，冷却到55℃，并在此温度下的热循环仪中孵育1分钟以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、15U大肠杆菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物在55℃的热循环仪中孵育1小时。将反应后样品在-20℃下冷冻保存至对其进行分析。作为对照的PCR操作如下。简单来讲，在热循环仪中使50μl含有每种引物各50pmol、1μl cDNA(相当于50ng RNA)、5μl 10x ExTaq缓冲液(Takara Shuzo)、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo)及每种dNTP各0.2mM的反应混合物进行反应。反应程序如下；94℃下反应2min，1个循环；94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，持续30个循环；以及72℃下反应5min，1个循环。将反应后样品在-20℃下冷冻保存直至对其进行分析。反应完成后，每种反应混合物各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图10所示。
图10例示了电泳结果，而此电泳结果展示了对RT-ICAN(A)和RT-PCR(B)进行的对比。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2：阴性对照组；及泳道3；LPS和IFN-γ处理组。
如图10所展示的，当以从细胞培养物中制备的、利用LPS和IFN-γ处理过的cDNA为模板时，在本发明的方法和PCR中都观察到了扩增产物。因此，其进一步证明，由于本发明的方法相对于PCR法需要较短的反应时间，所以本发明的方法作为逆转录后DNA扩增方法是更有效的。
实施例11
在本发明的扩增反应中可能使最适反应温度为37℃的大肠杆菌RNA酶H失活。随后，向反应混合物中添加大肠杆菌RNA酶H，检测其效用。选用一扩增片段(1071bp)为模板DNA，而此扩增片段是通过以SEQ ID NO：78和79所表示的引物GMO-PCR-F和GMO-PCR-R为引物、以从其中已导入菜花样花叶病毒35S启动子和EPSPS基因的重组体大豆中提取的基因组DNA为模板进行PCR得到的。此外，也选用了含有SEQ ID NO：80-83所表示的核苷酸序列的引物GMO-S1、S2、A1和A2。反应进行如下。简单来讲，制备了10μl含有浓度均为50pmol的多种引物、0.01％丙二胺、1pg-10ng模板DNA和无菌水的混合物。在98℃使混合物热变性2分钟，并冷却到55℃以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有终浓度均为0.625mM的多种dNTP、34mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.7)、4.0mM醋酸镁、0.01％BSA、1％DMSO、30U大肠杆菌RNA酶H和505U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物在55℃的热循环仪中孵育25分钟。反应起始25min后，向其中进一步添加30U大肠杆菌RNA酶H。将反应混合物在55℃下孵育30分钟。将反应混合物在55℃下孵育55分钟来作为对照。反应完成后，从每种混合物中取出3μl混合物，在3％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果，其进一步证明，不管与任一种引物S1/A1、S1/A2、S2/A1和S2/A2结合使用的模板DNA的浓度，在反应中添加大肠杆菌RNA酶H提高了扩增效率。
实施例12
对本发明中作为模板的核酸的扩增或复制方法与本发明的方法的结合利用进行了检验。反应进行如下。简单来讲，利用含有实施例5(3)中制备的菊花类病毒基因和T7RNA聚合酶(Takara Shuzo)进行体外转录获得RNA复制片段，而此质粒是在大肠杆菌中作为模板进行复制的。利用含有SEQ ID NO：57和58所表示的核苷酸序列的引物和cDNA合成试剂盒(Takara Shuzo)合成cDNA。如实施例5(3)中所述，cDNA片段或复制的质粒为模板进行扩增反应。结果，其进一步证明，以质粒形式复制的核酸及利用RNA聚合酶、cDNA形式从RNARNA复制的核酸都可用做本发明的方法中的模板。
实施例13
(1)合成引物
在鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的核苷酸序列的基础上，合成了SEQ ID NO：86和87所表示的寡核苷酸引物NS1和NS2。
(2)以PCR产物为模板，利用ICAN进行DNA片段扩增
在98℃下，将l0μl含有浓度均为50pmol的合成寡核苷酸引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、10fg-10pg模板DNA的混合物加热2分钟，随后利用热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，Applied Biosystems)在60℃下对其加热2min以使引物退火到模板上。选用iNOS cDNA(741bp)作模板，而此模板是利用SEQ ID NO：132和133所代表的引物NS-PCR1和NS-PCR2扩增得到并随后利用Suprec02(TakaraShuzo)进行纯化的。将40μl含有0.625mM的每种dNTP、40mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、125mM醋酸钾、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和0.66μg BcaBEST DNA聚合酶的反应混合物添加到加热后的溶液中。将反应混合物置于60℃下的热循环仪中孵育1小时。每种反应混合物各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图11所示。图11表示利用Pfu RNA酶H进行ICAN的结果。泳道1；分子量标记(100bp)；泳道2；10fg模板；泳道3；100fg模板；泳道4；1pg模板；及泳道5；10pg模板。
如图11所示，在利用100fg模板的情况下观察到感兴趣的扩增产物。
实施例14
(1)制备RNA
将浓度为1.5×105个细胞/ml的TRAW264.7细胞(ATCC TIB 71)悬浮在含有10％胎儿牛血清(Gibco)的Dulbecco′s修饰后Eagle′s培养基(Bio Whittakef)中。向6孔微量滴定板的每个孔中添加5ml悬浮液，并在5％CO2存在下，在37℃下孵育过夜。向每孔中添加50μl100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma)水溶液和50μl 1000U/μl干扰素-γ(IFN-γ，Genzyme Techne)水溶液。对滴定板额外孵育4小时。随后按照粘贴到试剂盒上的使用指导，利用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)从细胞中制备RNA。提供一组不添加LPS或IFN-γ的混合物以作为阴性对照。
将60μl含有3μg已制备的RNA、10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.3)、50mM KCl、5mM MgCl2、浓度均为1mM的多种dNTP、150pmol随机6聚体引物、60U核糖核酸酶抑制剂(Takara Shuzo)和15U逆转录酶XL(AMV)(Takara Shuzo，2620A)的混合物在30℃孵育10min、在42℃下孵育1hr，随后利用热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，Applied Biosystems)在99℃下对其孵育5min以使酶失活，这样制得了cDNA。
在鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的核苷酸序列基础上，合成了含有SEQ ID NO：92和93所表示的核苷酸序列的引物NS5和NS6。此外，也合成了SEQ ID NO：88和89所代表的PCR引物NS3和NS4。
将50μl含有50pmol引物NS5和NS6、1μl上述合成的cDNA溶液(相当于50ng RNA)或模板溶液的10、100、1000或10000倍水稀释液、每种dNTP各0.5mM、32mM HEPES--氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、4.0mM醋酸镁、0.01％BSA、1％DMSO、0.0156μg PfuRNA酶H和0.66U BcaBEST DNA聚合酶的混合物在60℃下的热循环仪中孵育1小时。将反应后样品在-20℃下冷冻保存直至对其进行分析。
另一方面，利用一PCR作为对照。在热循环仪中使50μl含有50pmol引物NS3和NS4、1μl cDNA溶液(相当于50ng RNA)或其10、100、1000或10000倍水稀释液、5μl 10x Ex Taq缓冲液(TakaraShuzo)、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及每种dNTP各0.2mM的反应体系进行反应。反应程序如下；94℃下反应2min，1个循环；94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，持续35个循环；以及72℃下反应5min，1个循环。将反应后样品在-20℃下冷冻保存直至对其进行分析。
从每种反应混合物(ICAN或PCR)中各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图12所示。图12展示了iNOS基因的检测结果，而此检测是利用Pfu RNA酶H通过ICAN或通过PCR进行的。泳道1；100bp DNA梯标记；泳道2：阴性对照cDNA的10000倍稀释；泳道3；阴性对照cDNA的1000倍稀释；泳道4；阴性对照cDNA的100倍稀释；泳道5；阴性对照cDNA的10倍稀释；泳道6；阴性对照cDNA的原始溶液；泳道7；添加LPS和IFN-γ的cDNA组的10000稀释溶液；泳道8；添加LPS和IFN-γ的cDNA组的1000稀释溶液；泳道9；添加LPS和IFN-γ的cDNA组的100稀释溶液；泳道10；添加LPS和IFN-γ的cDNA组的10稀释溶液；及泳道11；添加LPS和IFN-γ的cDNA组的原始溶液。
如图12所展示的，只有当以从细胞培养物中制备的、利用LPS和IFN-γ处理过的cDNA为模板时，在ICAN和PCR反应混合物中都观察到扩增产物。对于ICAN来说，在利用cDNA的1000倍稀释的情况下观察到扩增产物增加。对于PCR来讲，在利用cDNA的100倍稀释液的情况下观察到扩增产物增加。
实施例15
(1)在DNA的核苷酸序列基础上合成了SEQ ID NOS：90和91所表示的寡核苷酸引物4和5。寡核苷酸引物4是GC含量为75％的有义引物。寡核苷酸引物5是GC含量为80％的反义引物。
将10μl含有120pmol引物4和5、2μl 0.05％丙二胺溶液和10ng模板的反应体系在98℃加热变性2分钟，随后在并上迅速冷却以使引物与模板退火。选用实施例2中描述的、利用Suprec02纯化后的PCR产物(1005bp)作模板。
(2)退火完成后，向退火混合物中添40μl含有每种dNTP各0.625mM、42.5mM Bicine-氢氧化钾缓冲液(pH8.3)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、0.5μl海栖热袍菌RNA酶HII(0.58μg/ml)和2.2U BcaBEST DNA聚合酶的混合物并在60、65或70℃下利用ICAN反应1小时。ICAN完成后，每种反应混合物各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图13所示。图3例示了利用海栖热袍菌RNA酶HII进行ICAN的电泳结果。泳道1；分子量标记(100bp)；泳道2；反应温度为60℃；泳道3；反应温度为65℃；及泳道4；反应温度为70℃
如图13所示，在各个反应温度条件下都观察到了扩增产物。
实施例16
(1)对以PCR扩增产物为模板、按照ICAN施行的DNA片段扩增进行检验。将1μl含有10fg-10pg模板的溶液与1μl 0.4N NaOH混合。将混合物在37℃下孵育5分钟以使模板变性。选用实施例13中描述的、利用Suprec02(Takara Shuzo)纯化的PCR扩增的iNOS cDNA(741bp)为模板。利用1μl 0.4N HCl对变性模板溶液进行中和。随后，向其中加入47μl含有50pmol的引物NS1和NS2、每种dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、4.0mM醋酸镁、0.01％BSA、1.0％DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和0.66UBcaBEST DNA聚合酶的反应混合物。将此混合物在60℃下的热循环仪中孵育1小时。从每种反应混合物中取5μl，并在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。结果如图14所示。图14展示了利用碱变性模板进行ICAN的结果。泳道1：分子量标记(100bp)；泳道2；10fg模板；泳道3；100fg模板；泳道4；1pg模板；及泳道5；10pg模板。
如图14所示，在选用1pg模板的情况下观察到扩增产物。
实施例17
(1)对不利用变性模板、按照ICAN施行的DNA片段扩增进行检验。选用SEQ ID NO：92和93所表示的引物NS5和NS6作为引物。选用实施例13中制备的模板作为模板DNA。
向其中加入50μl含有10fg-100pg作为阴性对照的模板或水、50pmol的引物NS5和NS6、每种dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、4.0mM醋酸镁、0.01％BSA、1.0％DMSO、0.0156μgPfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶(TakaraShuzo)的反应混合物。将此混合物在60℃下的热循环仪中孵育1小时。反应完成后，从每种反应混合物中取5μl，并在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。结果如图15所示。图15展示了不利用变性模板进行ICAN的结果。泳道1；100bp DNA梯标记；泳道2；阴性对照(水)；泳道3；10fg模板；泳道4；100fg模板；泳道5；1pg模板；泳道6；10pg模板；及泳道7；100pg模板。
如图15所示，在选用1pg模板的情况下观察到扩增产物。
实施例18
(1)在载体质粒pDON-AI DNA(Takara Shuzo)中的包装区域的核苷酸序列的基础上，合成了SEQ ID NO：94和95所表示的引物pDON-AI-1和pDON-AI-2。
(2)在不利用变性模板的情况下，利用ICAN进行DNA片段扩增
将包含有作为阴性对照的1μl 1fg-1ng pDON-AI DNA溶液或作为阴性对照的1μl水、50pmol各种引物、每种dNTP各0.5mM、32mMHEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、4.0mM醋酸镁、0.01％BSA、1.0％DMSO、0.0156μg参考实施例4中制备的Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的50μl反应混合物在60℃的热循环仪中孵育1小时。反应完成后，从每种反应混合物中取5μl混合物，并在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。结果如图16所示。图16展示了利用非变性环形双链DNA为模板实施本发明中的方法的电泳结果。泳道1；100bp DNA梯标记；泳道2；阴性对照(水)；泳道3；10fg模板；泳道4；100fg模板；泳道5；1pg模板；泳道6；10pg模板；泳道7；100pg模板；及泳道8；1ng模板。
如图16所示，其进一步证明了在选用1pg模板的情况下可获得感兴趣的扩增产物。
实施例19
检验了利用本发明的方法对人乳头状瘤病毒16基因进行的检测。选用从感染人乳头状瘤病毒16的细胞CaSki细胞(DainipponPHarmaceutical；细胞中含有人乳头状瘤病毒16的500个拷贝)中提取的DNA作为模板。含有SEQ ID NO：96和97所表示的核苷酸序列的引物HPV16 S3和HPV16 A2用做对HPV16进行检测的引物。利用引物对扩增得到的扩增产物的预期大小约为120bp。反应进行如下。
制备了10μl含有1pg、3pg、30pg、100pg、300pg、1ng、3ng或10ng模板DNA、50pmol引物HPV16 S3和HPV16 A2及终浓度为0.01％的丙二胺的混合物。在热循环仪Personal中，将混合物在98℃下孵育2分钟，并在55℃下孵育1min。随后置于冰上。向混合物中添加终浓度为20mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、500μM的每种dNTP、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物置于55℃下的热循环仪Personal中并反应1小时。作为对照，按照热循环仪Personal的操作指南，利用人肉头状瘤病毒引物HPVp16(forward，reverse)(Takara Shuzo)进行PCR。扩增产物的预期大小为140bp。
反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，在4.0％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图17A所示。图17A展示了利用ICAN和PCR对HPV16基因进行检测的结果。泳道M1；分子量标记(100bp梯)；泳道M2；分子量标记(50-2000bp)；泳道1；无模板；泳道2；1pg模板；泳道3；3pg模板；泳道4；30pg模板；泳道5；100pg模板；泳道6；300pg模板；泳道7；1ng模板；泳道8；3ng模板；及泳道9；10ng模板。
如图17A所示，其进一步证明，在分别利用3pg模板DNA进行ICAN和1pg模板DNA进行PCR的情况下观察到感兴趣的扩增片段。
此外，以含有SEQ ID NO：98所表示的核苷酸序列的寡核苷酸HPV16为探针，对反应产物进行斑点印迹杂交。如实施例9所述进行杂交。结果如图17B所示。图17B展示了通过PCR和ICAN对HPV16基因进行斑点印迹杂交检测的结果。泳道1；无模板；泳道2；1pg模板；泳道3；3pg模板；泳道4；30pg模板；泳道5；100pg模板；泳道6；300pg模板；泳道7；1ng模板；泳道8；3ng模板；及泳道9；10ng模板。
如图17B所示，ICAN和PCR的检测灵敏度几乎相同。因此，其进一步证明，这些方法可有效的对病毒等进行检测。
实施例20
检验了对临床标本DNA样品中的人乳头状瘤病毒16基因进行的检测。在得到哈许可的情况下，选用通过传统方法从6个临床标本中制得的DNA作为模板。利用PCR对从这些临床标本制得的样品中含有的感染性HPV的类型进行了检验。选取实施例19中描述的引物HPV16 S3和HPV16 A2作为引物来进行检测。利用TE缓冲液调节从临床标本制得的模板DNA样品的浓度为100ng/μl。除模板用量外，反应混合物组成和反应条件与实施例19中的相同。此外，利用反应混合物进行类似的反应，以不含模板DNA的反应混合物为阴性对照，而以含有500pg制备自感染HPV16的CaSki细胞的DNA的反应混合物为阳性对照。反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，利用4％NuSieve 3∶1琼脂糖进行电泳。结果如图18A所示。图18A展示了对临床标本中的HPV16基因进行检测的结果。泳道M；分子量标记；泳道1-6；临床标本；泳道7；阴性对照；及泳道8；阳性对照。
如图18A中所示，在利用ICAN对样品进行检测的情况下观察到长约120bp的扩增产物，而此样品已经通过传统的PCR证明感染有HPV16。在感染有其他类型HPV的样品中和未感染的样品中没有观察到扩增现象。
此外，如实施例9中所描述的，对扩增产物进行斑点印迹杂交。结果如图18B和表8所示。图18B展示了对临床标本中的HPV16基因进行斑点印迹杂交检测的结果。泳道1-6；临床标本；泳道7；阴性对照；及泳道8；阳性对照。
如图18所示，这些结果与通过电泳获得的结果一致，这进一步证明，利用电泳及斑点印迹杂交可获得与利用PCR得到的结果相类似的结果。因此，其进一步证明，利用本发明的方法可对实际临床标本中的HPV16进行检测，并可有效的对病毒等进行检测。
表8
  样品   PCR分型   利用HPV16检测引物进行的ICAN扩增
  NO.3NO.4NO.6NO.7NO.8NO.9无模板阳性对照   未感染的未感染的18型16型67型16型**   ---+-+-+
-；无扩增；+：观察到扩增
实施例21
检验了对临床标本中的HCV进行的检测。在获得患者许可的情况下，按照粘贴到试剂上的指导，利用TRIzol试剂(LifeTechnologies)从感染HCV的5个患者血清标本的每个标本中获取300μl标本样品，最后将其溶解在6μl可注射水(OtsukaPHarmaceutical)中以获取RNA样品。将以类似方法从健康个体的300μl血清中提取的RNA作为阴性对照。首先，利用RNA PCR试剂盒(AMW)ver 2.1(Takara Shuzo)，制备了4μl含有1x RNA PCR缓冲液、5mM MgCl2、1mM各种dNTP、1U AMV逆转录病毒XL、10pmol SEQ ID NO：99和100所代表的引物HCV-F和HCV-R及2μl RNA样品的逆转录反应混合物。将此混合物在30℃下温热10min，随后在50℃反应30min。逆转录反应完成后，进行ICAN。选用含有SEQ ID NO：101和102所表示的核苷酸序列的引物HCV-F2和HCV-R1作为ICAN引物。反应进行如下。
制备了10μl含有每种引物各50pmol、3μl逆转录反应混合物和终浓度为0.01％的丙二胺。利用3μl无菌水作空白。将混合物在98℃下加热2min，迅速冷却到60℃，并在同样温度的热循环仪Personal中孵育1分钟，在冰上贮存。
退火完成后，向混合物中添加终浓度为20mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMS0、0.01％BSA、4mM醋酸镁、500μM的每种dNTP、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物置于60℃的热循环仪MP中并反应1小时。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图19A所示。图19A展示了对临床标本中的HCV的检测结果。泳道B；以无菌水为模板；泳道1；取自健康个体的样品；泳道2-6；取自感染HCV的患者的样品；及泳道M：分子量标记(50-2000bp)。
如图19A所示，仅在取自HCV患者的RNA样品中观察到源自HCV基因组核苷酸序列的、预期长约107bp的扩增产物，但在取自正常个体血清的样品及空白中没有观察到这样的扩增片段。此外，如实施例9中所述，以SEQ ID NO：103表示的、5′-末端生物素标记的HCV为探针，对ICAN扩增产物进行斑点印迹杂交。结果如图19B所示。图19B中的电泳结果显示的泳道为样品泳道。
如图19所示，其进一步证明，电泳结果与斑点印迹杂交结果相一致。这些结果证明，本发明的方法可用于检测实际临床标本中的HCV，并可对病毒等进行有效检测。
实施例22
对腺病毒检测方法进行检验。
在腺病毒(GenBank编号JO1917)核苷酸序列的基础上，构建了SEQ ID NO：104-106所表示的、用于扩增E1A(肿瘤基因)、E1A-1(有义)、E1A-2(反义)和E1A-3(反义)的引物。选用了腺病毒(ATCC编号VR-5)。模板制备如下。在0.1％SDS和0.2mg/ml蛋白酶K存在下，在37℃下对100μl含有浓度为8.73×1010PFU/ml的腺病毒的溶液孵育1小时。通过硅胶吸附对DNA进行纯化。利用无菌水对选用的纯化DNA进行稀释以制备相当于103、104、105或106PFU的腺病毒DNA。反应进行如下。简单来讲，将10μl含有60pmol引物E1A-1和E1A-2(待扩增链长：112bp)或E1A-1和E1A-3(待扩增链长：91bp)、2μl0.05％丙二胺和模板的ofa反应体系在98℃下加热变性2分钟，随后在并上迅速冷却以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氢氧化钾缓冲液(pH8.5)、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、15U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物在60℃下孵育1hr。作为对照，利用与上述相同的模板，以含有SEQ ID NOS：107，108和142所表示的核苷酸序列的、用于PCR扩增E1A(肿瘤基因)、E1A-1(有义)、E1A-2(反义)和E1A-3(反义)的引物为引物进行PCR检测。此PCR检测操作如下。简单来讲，制备了50μl含有60pmol引物E1A-1和E1A-2(待扩增链长：112bp)或E1A-1和E1A-3(待扩增链长：91bp)、5μl 10x Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo)、1.25U TaKaRaEx Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及每种dNTP各0.2mM的反应混合物。PCR反应条件如下；94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，持续30个循环。
反应完成后，从ICAN反应混合物和PCR反应混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图20和表19所示。图20展示了对源自腺病毒颗粒的病毒E1A基因的检测结果。泳道1-10展示了结合利用引物E1A-1和E1A-2获得的结果。泳道11-20展示了结合利用引物E1A-1和E1A-3获得的结果。泳道1：分子量标记(100bp梯)；泳道2；利用与106PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道3；利用与105PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道4：利用与104PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道5；利用与103PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道6；分子量标记(100bp梯)；泳道7；利用与106PFU相当的DNA进行的PCR；泳道8；利用与105PFU相当的DNA进行的PCR；泳道9；利用与104PFU相当的DNA进行的PCR；及泳道10；利用与103PFU相当的DNA进行的PCR。此外，泳道11：分子量标记(100bp梯)；泳道12；利用与106PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道13；利用与105PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道14；利用与104PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道15；利用与103PFU相当的DNA进行的ICAN；泳道16；分子量标记(100bp梯)；泳道17；利用与106PFU相当的DNA进行的PCR；泳道18；PCR利用与105PFU相当的DNA进行的PCR；泳道19；利用与104PFU相当的DNA进行的PCR；及泳道20；利用与103PFU相当的DNA进行的PCR。
表9
  扩增长度   检测限
  ICAN   PCR
  11291   104104   104104
如图20和表9所示，其进一步证明，利用ICAN进行的腺病毒E1A基因检测的检测灵敏度与通过PCR进行的检测灵敏度相当。
实施例23
检验了对感染了逆转录病毒载体的细胞中的整合病毒基因进行的检测。如下所述制备感染了逆转录病毒的细胞和基因组DNA。简单来讲，按照磷酸钙法，将载体质粒pDON-AI(Takara Shuzo)导入包装细胞GPE+86中。从导入后细胞的培养上清液中制备了嗜亲性载体。利用嗜亲性载体感染NIH/3T3细胞并将感染后的细胞在含有G418的培养基中培养14天，这样就制得了利用病毒载体感染的细胞。按照传统方法，从4×104个感染了逆转录病毒的细胞中获得了27μg基因组DNA。选用实施例18(1)中描述的引物pDON-AI-1和pDON-AI-2作为引物。反应进行如下。简单来讲，将10μl含有60pmol每种引物、2μl 0.25％丙二胺水溶液和0.1ng-1000ng基因组模板DNA的反应体系在98℃下加热2分钟，随后在60℃的热循环仪(Takara Shuzo)中使引物与模板退火。
退火完成后，向反应混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、40mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(PH7.8)、125mM醋酸钾、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5UBcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物在60℃循环仪中孵育1小时。反应完成后，从反应混合物中各取5μl混合物，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。此外，为了比较ICAN和PCR的DNA检测灵敏度，利用SEQ ID NOS：111和112所表示的引物pDON-AI-3和pDON-AI-4进行PCR。此PCR操作如下。制备了50μl含有0.1ng-100ng模板、60pmol各种引物、5μl 10x Ex Taq缓冲液、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及每种dNTP各0.2mM的反应混合物。利用热循环仪Personal使混合物进行如下反应；94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，持续35个循环。反应完成后，从每种反应混合物中各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图21所示。图21展示了利用ICAN和PCR对感染了逆转录病毒载体的细胞的整合病毒基因的检测结果。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；1000ng模板；泳道3；100ng模板；泳道4；10ng模板；泳道5；1ng模板；及泳道6；0.1ng模板。
如图21所示，在利用1ng模板DNA进行的ICAN和利用1ng模板进行35个循环的PCR混合物中都观察到了感兴趣的扩增产物。
实施例24
对结合利用了本发明中的扩增方法和杂交方法的靶核酸检测方法进行检验，从而对大肠杆菌O-157 vero毒素基因进行检测。选取肠出血性大肠杆菌O-157的vero毒素基因作为靶。如实施例8(1)中所述制备模板DNA。GC含量约为40％、长约80bp的区域选作待扩增区域。选取含有SEQ ID NO：113和114所表示的核苷酸序列的引物VT1-IF4和VT1-IR1作为引物。反应进行如下。简单来讲，制备了5μl含有60pmol引物VT1-IF4和VT1-IR1、0.01％丙二胺溶液、相当于0-105个细胞的热水提取物及无菌水的混合物。将此混合物在98℃下加热变性2分钟，迅速冷却到55℃，并在相同温度的热循环仪Personal(Takara Shuzo)中孵育1分钟，随后置于冰上进行退火。
退火完成后，向混合物中添加终浓度20mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、浓度均为500uM的多种dNTP、15U大肠杆菌RNA酶H和2.75U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加无菌水使其体积达到25μl。将反应混合物置于温度已设定为55℃的热循环仪Personal中并在此温度下孵育60分钟。作为对照，按照操作指南，利用O-157 Typing Set(Takara Shuzo)在热循环仪Personal中对热水提取物进行PCR。此PCR操作如下：94℃下反应1min，55℃下反应1min，及72℃下反应1min，持续35个循环。此反应所需的总反应时间约为145分钟。预期的扩增产物大小为349bp。反应完成后，每种反应混合物各取3μl，在3％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。ICAN结果如图22所示。图22展示了对O-157vero毒素I基因的检测结果。泳道M；分子量标记(50-2000bp)；泳道N；以无菌水为模板；泳道1：相当于1个细胞的模板；泳道2；相当于10个细胞的模板；泳道3；相当于102个细胞的模板；及泳道4；相当于103个细胞的模板。另外，表10展示了利用ICAN和PCR进行的检测结果。
表10
  大肠杆菌O-157细胞的数目
  0   1   10
  ICANPCR   --   ++   +++++
-；没有进行扩增；+至+++表示三个等级的扩增程度
如表10所示，在ICAN和PCR检测法中，在利用相当于1个细胞的热水提取物进行的反应体系中都观察到感兴趣的扩增产物。此外，以含有SEQ ID NO：115表示的核苷酸序列并在5′-末端用生物素标记的寡核苷酸VT1为探针，对扩增产物进行斑点印迹杂交。如实施例19所述进行斑点印迹杂交。其结果与电泳结果相一致。因此，其进一步证明，ICAN的检测灵敏度与PCR相当。此外，相对于PCR，利用本发明的ICAN可将所需的反应总时间缩短至1/2或更短。因此，其进一步证明，本发明的ICAN作为病原等的检测方法是有效的。
实施例25
对肉毒A型毒素基因的检测方法进行检验。从来自于食物中毒案例的肉毒梭菌中制备DNA，选取A-190型DNA作为模板。此肉毒梭菌菌株保藏在Department of Hygiene，Kagawa NutritionUniversity。合成含有SEQ IOD NO：116和117所代表的核苷酸序列的引物BotA S2和BotA A2来作为检测引物。利用引物对扩增得到的扩增产物的大小约为150bp。制备1μl含有100fg、1pg、10pg或100pg源自产生A型毒素的肉毒梭菌的DNA的水溶液，以此作为模板。反应进行如下。
制备10μl含有浓度为50pmol引物对、0.01％丙二胺及1μl模板DNA溶液的混合物。在实施例19中所描述的反应条件下，利用反应混合物中的组合物对混合物进行ICAN。作为对照，按照使用指南，在热循环仪Personal中利用肉毒A型毒素基因检测引物组BAS-1和BAS-2(Takara Shuzo)来进行PCR。扩增产物的预期大小为284bp。
反应结束后，从各反应混合物中取3μl混合物，在4％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图23A所示。图23A展示了利用ICAN和PCR对肉毒A型毒素基因进行的检测结果。泳道Mi：分子量标记(100bp梯)；泳道M2；分子量标记(50-2000bp标记物)；泳道1：无模板；泳道2；100fg模板；泳道3；10pg模板；及泳道4；100pg模板。
如图23A所示，在利用100fg模板DNA进行ICAN时观察到感兴趣的扩增产物。另一方面，在利用100fg模板DNA进行PCR时没有观察到感兴趣的扩增产物。此外，利用含有SEQ ID NO：118所表示的核苷酸序列的BotA探针对扩增产物进行斑点印迹杂交。如实施例9中所述进行斑点印迹杂交。结果如23B所示。如图23B所示，在利用100fg模板DNA进行ICAN和在利用10pg模板DNA进行PCR时分别观察到有信号存在。这些结果与电泳结果相一致。
实施例26
对菊花类病毒检测进行了检验。制备了低分子量RNA的10倍系列稀释液，而低分子量RNA是按照JP-A9-140383的实施例1中描述的从感染菊花stunt类病毒(CSVd)的菊花中提取低分子量RNA的方法获得的。利用RNA PCR试剂盒(AMW)ver 2.1(Takara Shuzo)进行逆转录反应。特别的，制备了20μl含有1x RNA PCR缓冲液、5mMMgCl2、各种dNTP各1mM、20U RNA酶抑制剂、5U AMV逆转录酶XL、50pmol随机9聚体、1μl RNA系列稀释液中的一种稀释液的逆转录反应混合物。将反应混合物在30℃温热10分钟，在55℃下反应30分钟，随后在99℃下加热5分钟使逆转录酶失活。冷却后，进行ICAN。以1μl逆转录反应混合物作为模板来对50μl反应混合物进行ICAN。在本实施例中，选取含有SEQ ID NO：119和120所表示的核苷酸序列的引物CSVD-F4和CSVD-R3作为引物。除反应温度为60℃和使用热循环仪MP外，其他条件与实施例19所描述的相同来进行反应。反应结束后，从每种反应混合物中各取3μl并利用3％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶进行电泳。
另一方面，以1μl相同的逆转录反应混合物为模板在50μl反应体系中进行PCR扩增。选取SEQ ID NO：109和110所表示的引物F94和R264作为引物。反应进行如下。简单来讲，按照操作指导，利用TaKaRaPCR扩增试剂盒制备了反应混合物。向其中添加引物各10pmol及1μl逆转录反应混合物以使其体积达到50μ1。利用热循环仪MP进行扩增反应。反应进行如下：94℃下反应30秒，55℃下反应30秒，及72℃下反应30秒，持续30个循环。反应完成后，从每种反应混合物中各取5μl并利用3％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶进行电泳。结果如表11所示。
表11
 模板RNA的稀释比   ×102   ×103
 RT-ICANRT-PCR   +++   +-
-；无扩增；+：扩增；++：很好的扩增
如表11所示，在以103倍稀释的RNA样品为模板进行ICAN反应时观察到扩增产物存在。另一方面，在以102倍稀释的RNA样品为模板进行PCR反应时观察到扩增产物存在。
此外，利用斑点印迹杂交进一步对ICAN扩增产物和PCR扩增产物进行证实以确定其为感兴趣的产物。斑点印迹杂交是以含有SEQ IDNO：121所表示的核苷酸序列并在5′-末端标记有生物素的CSVd探针进行的。斑点印迹杂交如实施例9所述进行。其结果与电泳结果相一致。在利用103倍稀释的RNA样品进行ICAN和在利用102倍稀释发RNA样品进行PCR时分别观察到有信号存在，这证明ICAN较PCR灵敏。
实施例27
检测了利用Pfu RNA酶H对感染了菊花dwarfing类病毒(CSVd)的菊花中的类病毒基因进行的检测。将60μl含有3μl实施例26中制备的RNA10倍稀释液中的一种、10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.3)、50mMKCl、5mM MgCl2、浓度均为1mM的多种dNTP、150pmol随机6聚体引物、60U核糖核酸酶抑制剂(Takara Shuzo)和15U逆转录酶XL(AMV)(Takara Shuzo)的混合物在30℃孵育10min，在42℃下孵育1小时，随后利用热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，AppliedBiosystems)在99℃下对其孵育5min使酶失活，这样制得了cDNA。在类病毒的mRNA核苷酸序列基础上，合成了含有SEQ ID NO：122-125所表示的核苷酸序列的引物Vd1、Vd2、Vd3和Vd4。
将50μl含有50pmol引物Vd1和Vd2、1μl上述合成的cDNA溶液、其作为阴性对照模板的10倍、100倍、1000倍或10000倍水稀释液或水、每种dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、4.0mM醋酸镁、0.01％BSA、1％DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶的混合物在57℃的热循环仪中孵育1小时。将反应后样品在-20℃下冷冻保存以进行分析。
以另一PCR作为对照。简单来讲，在热循环仪中使50μl含有50pmol引物Vd3和Vd4、1μl cDNA溶液、其作为阴性对照模板的10倍、100倍、1000倍或10000倍水稀释液或水、5μl 10x Ex Taq缓冲液、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及每种dNTP各0.2mM的反应混合物进行反应。反应程序如下；94℃下反应2min，1个循环；94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，持续35个循环；以及72℃下反应5min，1个循环。将反应后样品在-20℃下冷冻保存以进行分析。
从ICAN和PCR反应混合物中各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图24所示。图24展示了类病毒的检测结果，而此检测是利用Pfu RNA酶H通过ICAN或通过PCR进行的。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2：阴性对照；泳道3；cDNA的10000倍稀释液；泳道4；cDNA的1000倍稀释液；泳道5；cDNA的100倍稀释液；泳道6；cDNA的10倍稀释液；及泳道；cDNA发原始溶液。
如图24所展示的，当cDNA的100倍稀释液为模板时，在ICAN和PCR中都观察到了感兴趣的扩增产物。
实施例28
检验了对K-ras基因进行的检测。
(1)从基因组DNA中进行检测
在c-Ki-ras的核苷酸序列基础上，构建了SEQ ID NO：126和127所代表的引物c-Ki-ras-1和c-Ki-ras-2。
制备了10μl含有每种引物各60pmol、2μl 0.25％丙二胺水溶液和10ng-100ng人基因组模板DNA(Clontech)的混合物。将此混合物在98℃下加热2min，并在53℃下的热循环仪Personal中进行反应以使引物退火到模板上。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有每种dNTP各0.625mM、40mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、125mM醋酸钾、5.0mM醋酸镁、0.0125％BSA、1.25％DMSO、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5UBcaBEST DNA聚合酶的混合物，使其终体积达到50μl。将反应混合物在53℃下孵育1小时。反应完成后，每种反应混合物各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。
另一方面，以另一PCR作为对照。选用SEQ ID NO：128和129所表示的引物c-Ki-ras-3和c-Ki-ras-4作为引物。制备了50μl含有60pmol的各种引物、0.1-100ng模板、5μl 10x Ex Taq缓冲液、1.25UTaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及每种dNTP各0.2mM的溶液。混合物在热循环仪Personal中的反应如下；94℃下反应30秒，55℃下反应30秒及72℃下反应30秒，持续30或35个循环。反应完成后，从每种反应混合物中各取5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图25所示。图25展示了通过ICAN和PCR对人基因组DNA中的c-Ki-ras基因的检测结果。对ICAN来讲，泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；100ng模板；泳道3；10ng模板；泳道4；ng模板；及泳道5：无模板。对PCR来讲，泳道1；100ng模板；泳道2；10ng模板；泳道3；1ng模板；及泳道4；无模板。
如图25所述，在利用1ng模板进行的ICAN和利用10ng模板进行的35个循环的PCR中观察到感兴趣的扩增产物。图30展示了利用1ng-100ng模板进行ICAN和PCR所获得的扩增产物量的比较结果。在图30中，阴影柱表示进行了30个循环的PCR结果，有点的柱表示进行了35个循环的PCR结果，完全闭合的柱表示ICAN结果。如图30所展示的，其进一步证明，通过ICAN获得的扩增产物量较利用PCR获得的扩增产物量大。
(2)从血样中检测
以柠檬酸钠或肝素为抗凝剂从每个健康个体中采集100μl血样，并利用Dr.GenTLETM(用于全血)(Takara Shuzo)从中制备基因组DNA。利用相应于0.04-5μl血液的DNA、按照上文(1)中所描述的通过ICAN来进行c-Ki-ras基因检测。此外，为了对比利用ICAN和PCR进行的DNA检测的灵敏度，如上文(1)所述，所以利用从0.04-5μl血样中制备的DNA来进行检测。结果如图26所示。图26展示了利用ICAN和PCR对血样中的c-Ki-ras基因进行的检测结果。对于ICAN来讲，泳道1：分子量标记；泳道2；5μl柠檬酸化的血液；泳道3；1μl柠檬酸化的血液；泳道4；0.2μl柠檬酸化的血液；泳道5；0.04μl柠檬酸化的血液；泳道6；5μl添加有肝素的血液；泳道7；1μl添加有肝素的血液；泳道8；0.2μl添加有肝素的血液；及泳道9；0.04μl添加有肝素的血液。对于PCR来讲，泳道1；分子量标记；泳道2；5μl柠檬酸化的血液，30个循环；泳道3；1μl柠檬酸化的血液，30个循环；泳道4；0.2μl柠檬酸化的血液，30个循环；泳道5；0.04μl柠檬酸化的血液，30个循环；泳道6；5μl柠檬酸化的血液，35个循环；泳道7；1μl柠檬酸化的血液，35个循环；泳道8；0.2μl柠檬酸化的血液，35个循环；泳道9；0.04μl柠檬酸化的血液，35个循环；泳道10；5μl添加有肝素的血液，30个循环；泳道11；1μl添加有肝素的血液，30个循环；泳道12；0.2μl添加有肝素的血液，30个循环；泳道13；0.04μl添加有肝素的血液，30个循环；泳道14；5μl添加有肝素的血液，35个循环；泳道15；1μl添加有肝素的血液，35个循环；泳道16；0.2μl添加有肝素的血液，35个循环；及泳道17；0.04μl添加有肝素的血液，35个循环。
如图26所展示的，在利用相应于0.2μl血样(柠檬酸化的或添加有肝素的)的基因组DNA进行ICAN和利用相应于0.2μl血样(柠檬酸化的或添加有肝素的)的基因组DNA进行30个循环的PCR时分别观察到有感兴趣的扩增产物存在。
实施例29
检验了利用Bca RNA酶HIII对大肠杆菌0-157vero毒素2(VT-2)基因进行的检测。42℃下，将肠出血性大肠杆菌0-157在含有新生霉素的mEC培养基中培养18小时，随后在95℃下加热10min。通过利用无菌水对提取物进行稀释，制得相当于0、1、10、102或103个细胞的O-157热水提取物并用做模板。选取含有SEQ ID NO：130和131所表示的核苷酸序列的引物VT2-IF4和VT2-IR3作为引物。利用引物对获得的扩增产物的大小约为146bp。反应进行如下。简单来讲，制备了10μl含有50pmol引物对、0.01％丙二胺、一种热水提取物的混合物。将此混合物在98℃下加热变性2分钟，并在55℃的热循环仪Personal(Takara Shuzo)中孵育1分钟，随后置于冰上冷却。向混合物中添34mM Tricine缓冲液(pH8.7)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、浓度均为500uM的多种dNTP、32U如参考实施例3(5)中所述制备的Bca RNA酶HIII和5.5UBcaBEST DNA聚合酶，使其体积达到50μl。将此反应混合物置于温度已设定为55℃的热循环仪中并在此温度下反应60分钟。反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，在4％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图27所示。图27展示了利用Bca RNA酶HIII对大肠杆菌O-157 vero毒素II(VT2)基因进行的检测结果。泳道M；分子量标记(100bp梯)；泳道N；阴性对照；泳道1：相当于1个细胞的模板；泳道2；相当于10个细胞的模板；泳道3；相当于102个细胞的模板；及泳道4；相当于103个细胞的模板。
如图27所示，在利用相当于1个细胞的热水提取物进行ICAN时检测到VT2基因。这些结果与实施例9中利用大肠杆菌RNA酶H进行的ICAN和PCR得到的检测结果相同。因此，其进一步证明了利用BcaRNA酶HIII这种热抗性RNA酶H进行ICAN也可对病毒、细菌等进行有效的检测。
实施例30
检验了对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因进行的检测。在金黄色葡萄球菌肠毒素A基因区域的核苷酸序列的基础之上，合成了SEQ IDNO：136和137所表示的引物SEA-1和SEA-2。58℃下，在热循环仪中对50μl含有1μl含有115pg或1.15ng金黄色葡萄球菌(ATCC编号13565)基因组DNA溶液或作为阴性对照的1μl水、50pmol的引物SEA-1和SEA-2、每种dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、4.0mM醋酸镁、0.01％BSA、1.0％DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的反应混合物孵育1小时。反应完成后，从每种反应混合物中取5μl，并在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。结果如图29所示。图29展示了金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的电泳检测结果。泳道1；分子量标记(100bp梯)；泳道2；阴性对照(无菌水)；泳道3；115pg模板；及泳道4；1.15ng模板。
如图29所示，在选用约1.15ng模板的情况下观察到感兴趣的扩增产物。
实施例31
检验了对丙型肝炎病毒(HCV)进行的检测。在HCV的核苷酸序列的基础之上，合成了含有SEQ ID NO：138和139所表示的核苷酸序列的引物HCV-F3和HCV-R1。按照如下操作制备了模板DNA。简单来讲，利用热循环仪(Gene Amp PCR System 9600，Applied Biosystems)，将4μl含有如实施例21所述的从100μl健康个体血清或感染HCV的患者的血清中制备的RNA、10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.3)、5mMMgCl2、每种dNTP各1mM、10pmol随机6聚体及10U逆转录酶XL(TakaraShuzo)的混合物在30℃下孵育10分钟，在42℃下孵育1小时，随后在99℃下加热5分钟以使酶失活，这样就制备了cDNA。
除选用1μl cDNA反应混合物和100pmol引物HCV-F3和HCV-R1外，如实施例13中所示，在55℃进行ICAN1小时。反应完成后，每种反应混合物各取2.5μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图31所示。图31展示了HCV的电泳检测结果。泳道1：分子量标记(100bp)；泳道2：从健康个体血清中制备的模板；及泳道3-6：从感染HCV的患者血清中制备的模板。
如图31所示，其进一步证明能够从感染了HCV的患者的血清样品中特异性检测HCV。
实施例32
对本发明的扩增方法进行检验。
(1)以实施例2(2)中制备的pUC19-150质粒DNA为模板、以SEQ ID NO：35和36所表示的引物MCS-F和MCS-R为引物进行PCR。利用Microcon-100(Millipore)对反应混合物进行纯化得到长约534bp的PCR扩增片段。制备了含有15ng PCR片段、30pmol含有SEQID NO：140所表示的核苷酸片段且在5′-末端利用[γ-32p]ATP进行磷酸化标记的引物MR2及5μl无菌蒸馏水的反应混合物，并制备了进一步含有30pmol含有SEQ ID NO：141所表示的核苷酸序列的引物MRl的混合物。在98℃下使反应混合物加热变性2分钟，随后冷却到55℃。向反应混合物中添加20μl含有1U BcaBEST DNA聚合酶的反应混合物(42.5mM Tricine缓冲液(pH8.7)，12.5mM氯化钾，12.5mM硫酸铵，0.0125％BSA，1.25％DMSO，5mM醋酸镁，每种dNTP各0.625mM)。将得到的混合物在55℃下反应15分钟。反应完成后，向5μl反应混合物中添加2.5μl反应中止溶液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝，0.5％二甲苯蓝)。在94℃下使此混合物热变性3分钟。从每种反应混合物中各取1.6μl，利用含有8M尿素的6％聚丙酰胺凝胶进行电泳，并利用BAS2000(Fujix)读取信号来检测从引物MR1上延伸的产物。结果如图32A所示。利用磷酸化标记有[γ-32P]ATP的引物MF2对M13mp18单链DNA(Takara Shuzo)进行序列分析来制备图32A中的序列梯，并利用其确定延伸产物的长度。泳道1：结合利用MF2和MR1；及泳道2；MR1。
如图32A所示，当通过向模板中仅添加引物MR1来进行延伸作用时，检测到了从引物MR1开始延伸到模板末端的长约448bp的条带。另一方面，通过进一步添加引物MR2，在上述条带之外，检测到了与引物MR1和MF2连接的长约373bp的条带。因此，其进一步证明，以PCR扩增片段为模板、在BcaBEST DNA聚合酶的作用下从M1引物开始的延伸进行的交换要归因于此模板交换到了以从引物MF2开始的延伸链为模板而进行的延伸中。此外，在类似的条件下，当克列诺DNA聚合酶用做具有链置换活性的嗜中温DNA聚合酶时观察到模板交换。另一方面，当选用不具有链置换活性的TaKaRa Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo)或PyroBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)时没有观察到模板交换。
(2)利用退火到引物上的模板DNA链对模板交换反应进行检验。与引物MF2和MR1退火的DNA片段的制备如下。以质粒pUC19为模板，利用引物MCSF和RV(Takara Shuzo)或引物M4(Takara Shuzo)和MCSR进行PCR。利用Microcon-100对反应混合物进行纯化以获得PCR扩增片段MSCF-RV(236bp)和M4-MCSR(271bp)。在这两个PCR扩增片段中一般存在通过引物M4和RV而结合的区域。通过如下操作使模板-引物(1)和模板-引物(2)退火到一起，而模板-引物(1)中退火到引物上的模板DNA链没有相互退火，而模板-引物(2)中退火到引物上的模板DNA链是相互退火的。
(1)将含有30ng MCSF-RV片段、40pmol在5′-末端磷酸化标记有[γ-32P]ATP的引物MF2、终浓度为0.01％的丙二胺及5μl无菌水的混合物和含有30ng M4-MCSR片段、40pmol引物MR1、终浓度为0.01％的丙二胺及5μl无菌水的混合物在98℃下分别加热变性2分钟，随后冷却到55℃。从每种反应混合物中各取2.5μl混合物并将其混合在一起以制备模板-引物。
(2)将含有15ng MCSF-RV片段、15ng M4-MCSR片段、20pmol在5′-末端磷酸化标记有[γ-32P]ATP的引物MF2、20pmol引物MR1、终浓度为0.01％的丙二胺及5μl无菌水的反应混合物在98℃下加热变性2分钟，随后冷却到55℃以制备模板-引物。
将20μl含有1U BcaBEST DNA聚合酶的反应混合物(42.5mMTricine缓冲液(pH8.7)，12.5mM氯化钾，12.5mM硫酸铵，0.0125％BSA，1.25％DMSO，5mM醋酸镁，每种dNTP各0.625mM)添加到5μl模板-引物反应混合物中。生成的混合物在55℃下反应15分钟。反应完成后，向5μl反应混合物中添加2.5μl反应中止溶液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝，0.5％二甲苯蓝)。在94℃下使此混合物热变性3分钟。从每种反应混合物中各取1.6μl，利用含有8M尿素的6％聚丙酰胺凝胶进行电泳，并利用BAS2000(Fujix)读取信号来检测从引物MR2上延伸的产物。结果如图32B所示。利用磷酸化标记有[γ-32P]ATP的引物MR1对M13mp18单链DNA(Takara Shuzo)进行序列分析，从而制备图32B中的序列梯，并利用其确定延伸产物的长度。泳道1；模板DNA链没有相互退火；及泳道2；模板DNA链相互退火到一起。
如图32B所展示的，对其中退火到引物上的模板DNA链没有相互退火的模板-引物来讲，仅观察到一从引物MF2延伸到模板末端的、长为161bp的条带。另一方面，对其中退火到引物上的模板DNA链相互退火的模板-引物来讲，在上述的条带之外还检测到一与引物MF2和MR1结合的、长为223bp的条带。因此，其进一步证明，如果退火到引物上的模板DNA链相互退火就会发生模板交换反应。
实施例33
(1)利用参考实施例7中描述的源自闪烁古生球菌(Afu)的RNA酶H检验对结核分支杆菌的检测。在GenBank注册编号为AL123456的结核分支杆菌基因组的核苷酸序列基础上合成了引物MTIS2F(SEQID NO：155)和MTIS2R(SEQ ID NO：156)。包括引物部分在内的与引物对相邻的区域长为103bp。利用传统方法，从卡介苗疫苗(Nippon BCGSeizo)中提取作为模板的结核分支杆菌基因组DNA。制备了每μl无菌水中含有100pg、10pg、1pg、100fg、10fg或1fg基因组DNA的溶液。反应进行如下。简单来讲，将32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、500μM的每种dNTP、50pmol引物MTIS2F和MTIS2R、8.75U Afu RNA酶H、8U BcaBEST DNA聚合酶及1μl模板混合在一起，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物置于60℃下的热循环仪Personal中并反应1小时。反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。
另一方面，以另一PCR为对照。选用在Rinsho Byori(theJapanese Journal of Clinical Pathology)，43(9)：941-947(1995)中描述的引物MTIS PCR-F和MTIS PCR-R作为引物。利用此引物对得到了长为276bp的扩增产物。按照在Ex Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo)外附加的使用指南，利用每种引物各10pmol制备了50μl反应混合物。将反应混合物置于热循环仪中并进行40个循环反应，每个循环包括94℃下反应30秒，50℃下反应30秒，及72℃下反应30秒。反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果，在利用100fg模板进行反应的各种情况下都观察到感兴趣的扩增产物。
(2)检验了利用Afu RNA酶H或Pyrococcus horikoshii(PHo)RNA酶H对沙眼衣原体进行的检测。在GenBank注册编号为X06707的沙眼衣原体质粒的核酸序列基础上合成了引物CT2F(SEQ ID NO：157)和CT2R(SEQ ID NO：158)。包括引物部分在内的与引物对相邻的区域长为109bp。利用传统方法，从卡介苗疫苗(Nippon BCG Seizo)中提取作为模板的结核分支杆菌基因组DNA。在事先征得患者同意的情况下，对来自于患者的临床标本进行苯酚-氯仿处理和乙醇沉淀，这样制得了模板DNA。反应进行如下。简单来讲，将32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、500μM的每种dNTP、50pmol引物CT2F和CT2R、46.4U Pho RNA酶H、8UBcaBEST DNA聚合酶及1μl模板混合在一起，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物置于55℃下的热循环仪Personal中并反应1小时。反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果，观察到了感兴趣的扩增产物。这些结果进一步证明，利用本发明的方法中的Afu或Pho RNA酶H可对沙眼衣原体进行检测。
(3)此外，检验了利用商业购买的磁珠作为检测工具进行的检测。简单来讲，如上文(1)所述，以上文(1)中选用的5′-末端进行生物素标记的引物MTIS2R为引物，以100ng结核分支杆菌基因组DNA为模板，进行基因扩增反应。将生成的扩增片段进行30倍、300倍、或3000倍稀释，并在一自动检测装置Lumipuls(Fujirebio)中利用链亲和素包被的磁珠(Pierce)进行检测。
能够结合100pmol固定化生物素的磁珠与生物素化扩增片段在小容器的第一层上反应5分钟。随后向其中添加0.1N NaOH。利用FITC标记的探针MTISBF进行5分钟的杂交。对其冲洗后，向其中添加POD标记的抗FITC抗体。反应5分钟并冲洗，向其中添加一种发光物质。结果，其证明在传统的自动化检测装置中，利用磁珠可在短时间(20分钟)内进行半定量检测。利用光计数对发光水平进行测定来进行检测。结果如表12所示。
表12
  结核分枝杆菌扩增子   光计数   S/N比
  ×30×300×30000   3.55×1071.21×1070.21×1070.12×107   29.610.01.75
表12中的结果证明，利用磁珠进行的检测与利用传统的杯碟发光法进行的检测具有相同的灵敏度。
(4)检验了利用杂种层析法对上述扩增片段进行的检测。将Streptoavidin(Nacalai Tesque)固定化到硝化纤维素膜上。将其与吸水垫连接以构建一个杂种层析条。按照杂种层析法，层析条是用来检测上文(3)中的扩增片段的。利用一步TMB-印迹(Pierce)通过颜色变化来进行检测。特别的，使含有扩增片段的反应混合物铺展在硝化纤维素膜上。随后，使0.1N NaOH溶液、FITC标记的探针、洗涤溶液、显色液依次在硝化纤维素膜上铺展。结果，从源自结核分支杆菌阳性样品的扩增片段中检测到一蓝色条带。其证明此方法可作为一种快速基因检测方法，因为，利用本发明的方法中的这种方法可在5-10分钟内利用肉眼观察到结果。
实施例34
(1)含有有规则条带的扩增产物的Southern杂交分析
在许多情况下，除感兴趣的三个条带之外，在本发明的扩增方法中可观察到多个高分子量有规则条带。对这些有规则条带进行检验。选取肠出血性大肠杆菌O-157作为靶。ICAN的模板DNA、嵌合引物及反应条件如实施例9中所述。反应完成后，从每种反应混合物中各取5μl混合物，在3％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图37所示。在图37中，各泳道代表结果如下：泳道M；100bp DNA梯标记；泳道1；阴性对照；泳道2：相当于1个细胞的热水提取物；泳道3；相当于10个细胞的热水提取物；泳道4；相当于102个细胞的热水提取物；泳道5；相当于103个细胞的热水提取物；泳道6；相当于104个细胞的热水提取物；及泳道7；相当于105个细胞的热水提取。如图37所示观察到了梯状条带。
(2)有规则的扩增产物的分析
对上文(1)中获得的有规则条带的核苷酸序列进行分析。简单来讲，将(1)中制备的50μl反应混合物在3％琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳完成后，从凝胶中切掉有规则的条带。随后利用EASYTRAP Ver.2(Takara Shuzo)从凝胶中回收扩增后的DNA片段。利用钝化试剂盒(Takara Shuzo)对回收后的扩增片段进行钝末端化。
利用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)使钝末端DNA片段与载体pGEM-3Z(Promega)连接，而此载体已为限制性酶HincII(TakaraShuzo)所消化。利用连接混合物转化JM109(Takara Shuzo)的活性细胞。转化完成后，37℃下，在含有0.1mM氨苄青霉素、1mM IPTG和0.02％X-半乳糖的LB琼脂平板上培养细胞过夜。
培养完成后，从平板上挑选几个白色菌落。利用引物M13-M4和M13-RV(Takara Shuzo)进行菌落PCR以确定插入片段存在与否。37℃下，将存在插入片段的菌落在含有0.1mM氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养过夜。培养完成后，利用QIAGEN质粒微型试剂盒(Qiagen)从细胞中纯化质粒。按照传统方法，利用引物M13-M4和M13-RV对在质粒HincII位点的克隆片段序列进行双向分析。
结果，其证明利用本发明的方法获得的有规则片段具有一结构，而此结构中的待扩增区域进行了重复。此外，其进一步证明，此重复是在从5′-3′的同一方向上。
(3)除三个感兴趣的扩增片段外，在本发明的方法中形成了有规则的扩增片段以检测结核分支杆菌、HCV或沙眼衣原体，对此进行了检验。在如实施例31中所述条件下对HCV进行检测。在如实施例33中所述条件下对结核分支杆菌和沙眼衣原体进行检测。如上文(2)所述对生成的有规则扩增片段进行亚克隆和序列分析。结果，其证明利用本发明的方法获得的梯状片段具有一结构，而此结构中的待扩增区域进行了重复。此外，其进一步证明，此重复是在从5′-3′的同一方向上。
实施例35
(1)对本发明中的结核分支杆菌检测方法进行检验。首先，合成了引物K-F-1033(60)(SEQ ID NO：159)和K-F-1133(62)(SEQ IDNO：160)以扩增结核分支杆菌中含有相对低GC含量的区域。如实施例33(1)中所述，选取含有100fg-10pg结核分支杆菌基因组DNA的系列稀释溶液作为模板。反应进行如下。简单来讲，将32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、500μM的每种dNTP、50pmol引物K-F-1033(60)和K-F-1133(62)、9.375U Pfu RNA酶HII、4.375U BcaBEST DNA聚合酶及1μl模板混合在一起，添加无菌水使其体积达到25μl。将反应混合物置于62℃下的热循环仪Personal中并反应1小时。反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果，其证明可对利用100fg-10pg模板基因组DNA和任一RNA酶H得到的扩增产物进行检测。
(2)利用具有更高Tm值的引物对上文(1)所述的方法进行检测。首先，合成了引物K-F-1033(68)(SEQ ID NO：161)和K-F-1133(68)(SEQ ID NO：162)。除反应温度为63℃外，在与上文(1)相同的反应条件下进行扩增反应。反应完成后，从混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图38所示。图38例示了利用Pfu RNA酶H和Afu RNA酶H扩增得到的结核分支杆菌基因组的电泳结果。泳道1-4表示利用Pfu RNA酶HII和下列量的模板DNA获得的扩增结果。泳道1；10pg；泳道2；1pg；泳道3；100fg；及泳道4：阴性对照。泳道5-8表示利用Afu RNA酶HII和下列量的模板DNA获得的扩增结果。泳道5；10pg；泳道6；1pg；泳道7；100fg；及泳道8：阴性对照.泳道M表示100bp DNA梯标记。
如图38所示，其证明可对利用100fg模板基因组DNA和任一RNA酶H对感兴趣的扩增片段进行检测。这说明利用Afu RNA酶H时可获得更多的扩增产物。此外，其证明选用Afu RNA酶H时可获得更稳定的检测灵敏度。
(3)检验了结合利用引物K-F-1033(68)和K-F-1133(68)及含有待扩增区域的模板质粒而进行的扩增。首先，为了制备含有待扩增区域的质粒，合成了引物F26(SEQ ID NO：163)和R1310(SEQ IDNO：164)。利用这些引物和卡介苗疫苗菌株进行PCR。随后将生成的扩增产物导入pT7-Blue-T载体(Takara Shuzo)中以制备质粒。除了选用4U Bca DNA聚合酶外，反应混合物的组分与上文(2)中所述的相同。结果，其进一步证明可利用1fg模板来进行检测。
(4)将结合利用引物MTIS2F和MTIS2R从而形成含有感兴趣的三个扩增片段的有规则扩增片段时所达到的检测灵敏度与结合利用引物K-F-1033(68)和K-F-1133(68)从而形成感兴趣的三个扩增片段时达到的检测灵敏度进行比较。选取结核分支杆菌作为靶。当结合利用引物MTIS2F和MTIS2R时，按照实施例33(2)所述进行反应，或当结合利用引物K-F-1033(68)和K-F-1133(68)时，按照上文(2)所述进行反应。结果，在每种情况下都观察到相同的检测灵敏度。
实施例36
对本发明中不包含模板基因组DNA变性的扩增方法进行检验。
(1)依据质粒pDON-AI(Takara Shuzo)中的包装区域的核苷酸序列合成了引物pDON-AI-68-1(SEQ ID NO：165)和pDON-AI-68-2(SEQ ID NO：166)。
(2)制备了50μl含有1μl含有10fg或1pg pDON-AI的溶液、1μl含有1ng、10ng或100ng源自实施例23中制备的、结合有pDON-AI的NIH/3T3细胞的基因组DNA溶液或1μl作为阴性对照的水、50pmol上文(1)所述的每种引物、dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、4mM醋酸镁、0.01％BSA、1％DMSO、18.5U Pfu RNA酶HII和4U BcaBEST DNA聚合酶的反应混合物。将此混合物置于热循环仪中并在64℃下孵育1小时。反应完成后，从反应混合物中各取5μl，利用3％琼脂糖凝胶进行电泳以对扩增产物进行观察。结果如图39所示。在图39中，这些泳道代表利用下列量的模板获得的结果：泳道M；100bp DNA梯标记；泳道1：阴性对照；泳道2；结合有pDON-AI的1ng基因DNA；泳道3；结合有pDON-AI的10ng基因组DNA；泳道4；结合有pDON-AI的100ng基因组DNA；泳道5；10fg pDNA-AI DNA；及泳道6；1pg pDON-AI DNA。
如图39所示，对利用pDON-AI或结合有pDON-AI的基因组DNA来讲都观察到了特定DNA片段的扩增。因此，其进一步证明，即使选取基因组DNA作为模板，在反应前不对模板DNA进行变性的情况下也可对感兴趣的DNA片段进行扩增。
实施例37
通过选用了TaKaRa Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)的LA技术对比了本发明与PCR的精确度。首先，模板质粒制备如下。
特别的，利用PCR从人原癌基因、Wnt-5a基因(GenBank编号为L20861)、核糖体蛋白S5基因(GenBank编号为XM_009371)、人NADH基因(GenBank编号为NM_000903)和人protocadherin43基因(GenBank编号为AU077347)中扩增了每个含有SEQ ID NO：167-170所表示的、长为300bp的片段的区域。在这种情况下，利用特别引物进行PCR，而这些引物的5′-末端含有限制性酶SfiI位点。反应完成后，利用限制性酶SfiI(Takara Shuzo)对这些扩增片段进行消化。利用限制性酶Af1III(NEB)和NdeI(Takara Shuzo)对pUC19(TakaraShuzo)进行消化并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切除长约2kbp的片段并利用EASYTRAP(Takara Shuzo)对其进行回收。利用DNA合成仪合成了含有SEQ ID NO：171所表示的序列的DNA及与其互补的DNA。将这些DNA加热变性并随后相互退火以形成双链DNA。在这些双链DNA的末端具有限制性酶Af1III和NdeI的粘性末端。利用DNA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)将此双链合成DNA插入到利用限制性酶消化pUC19得到的片段中。生成的质粒命名为pIC62。pIC62具有与引物ICAN2(SEQ ID NO：172)和ICAN6(SEQ ID NO：173)退火的序列及限制性酶SfiI位点。利用限制性酶SfiI消化质粒pIC62。利用连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)将上文提及的、利用限制性酶SfiI消化后的PCR扩增片段连接到质粒上。利用此连接混合物转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)。对交换体进行培养，获得了具有长约300bp的DNA插入片段的质粒，并对插入DNA的序列进行了确定。随后将此质粒用做本实施例中的模板。
(2)如下制备ICAN扩增产物。简单来讲，制备了10μl含有10ng模板质粒、50pmol嵌合引物ICAN2(SEQ ID NO：172)和ICAN6(SEQID NO：173)及0.01％丙二胺的溶液。将此溶液在98℃变性2分钟，并在60℃的热循环仪Personal中孵育1分钟，随后转移到冰上。然后，向其中添加20mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、dNTP各500μM、30U大肠杆菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，并利用无菌水使其体积达到50μl。60℃下，将此反应混合物置于热循环仪Personal中，并孵育60分钟。反应完成后，在2％SeaKem GTG琼脂糖凝胶(Takara Shuzo)上对反应混合物进行电泳分析。电泳结束后，通过从琼脂糖凝胶中切下感兴趣的扩增产物、利用SUPREC-01(TakaraShuzo)进行回收、进行苯酚-氯仿和处理和乙醇沉淀来回收感兴趣的扩增产物。
(3)利用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶如下制备了PCR扩增产物。简单来讲，按照TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)的附加操作指南，利用10ng上述的模板质粒和10pmol DNA引物ICAN2(SEQID NO：174)和ICAN6(SEQ ID NO：175)制备了反应混合物。将反应混合物置于热循环仪中并反应30个循环，每个循环包括在94℃下反应30秒、55℃下反应30秒及在72℃下反应30秒。反应完成后，如上文(2)所述对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。通过利用Microcon-100(Takara Shuzo)回收、苯酚-氯仿处理和乙醇沉淀而回收到了感兴趣的扩增片段。
(4)对上文(2)和(3)中的扩增产物进行如下亚克隆。简单来讲，按照操作指南，利用Perfectly Blunt克隆试剂盒(Takara Shuzo)将ICAN扩增产物和PCR扩增产物导入载体pT7Blue(Takara Shuzo)中。利用连接混合物转化NovaBlue Singles活性细胞(TakaraShuzo)。对每种克隆来讲，从生成的转化体中选择10个菌落并进行培养以获取含有长约0.4kb的插入DNA的质粒。利用T7启动子引物(Takara Shuzo)和M3启动子(Takara Shuzo)对质粒中的插入片段进行序列分析。
通过上述的序列分析对总量约16,000个碱基进行了分析。结果，在利用本发明的方法得到的扩增片段和利用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶进行PCR得到的扩增片段的约25,00个碱基中发现了一个突变。因此，其进一步证明，本发明的方法的精确度与高精确度LA-PCR的精确度相同。
实施例38
(1)利用PCR制备ICAN反应的模板
利用cDNA合成试剂盒(Takara Shuzo)从源自鼠大脑(OriGene)的polyA+RNA中制备双链cDNA。以双链cDNA为模板，结合利用含有SEQ ID NOS：176-189所表示的核苷酸序列的引物对PCR片段进行扩增。通过TA克隆获得了质粒克隆，从而将这些片段导入pT7 Blue T-载体(Takara Shuzo)中。利用TaKaRa PCR热循环仪Personal(TakaraShuzo)对50μl含有1μl(1ng)质粒克隆、10pmol引物MCS-F(SEQID NO：190)和MCS-R(SEQ ID NO：191)、1.25U Ex Taq(Takara Shuzo)、5μl 10x Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo)及每种dNTP各0.2mM的反应混合物进行如下反应：94℃下反应2分钟；94℃下反应30秒，55℃下反应30秒，及72℃下反应1分钟，持续30个循环。将得到的扩增DNA片段用做ICAN反应模板。
(2)以PCR产物为模板通过ICAN扩增DNA片段
利用Aminoallyl dUTP(Sigma)进行ICAN反应以将一氨基导入ICAN扩增产物中。通过如下改变ICAN反应中dTTP量与AminoallyldUTP量之比来对导入ICAN扩增产物中的氨基的比率进行检验：10；0、9；1、8；2、7；3和6；4。反应进行如下。
首先，在TaKaRa PCR热循环仪Personal中，使10μl含有1μl上文(1)中制备的PCR反应混合物、50pmol引物MF2N3(24)(SEQID NO：192)和MR1N3(24)(SEQ ID NO：193)及2μl 0.05％丙二胺水溶液的溶液在98℃下加热2分钟，随后在65℃下加热30秒并在冰上迅速冷却以使引物与模板退火。向加热后的溶液中添加40μl含有0.625mM dATP、dCTP和dGTP、0.625mM dTTP+Aminoallyl dUTP混合物、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、5.0mM醋酸镁、0.6U大肠杆菌RNA酶H(Takara Shuzo)及2.75U BcaBEST DNA聚合酶的混合物。65℃下，将产生的混合物在热循环仪中孵育1小时。
向50μl反应混合物中添加50μl异丙醇和5μl 3M醋酸钠溶液(pH5.2)。将产生的混合物在-80℃下冷却20分钟，随后离心提取上清液。向其中添加200μl 70％的乙醇溶液。通过离心获取上清液。风干沉淀物。将获得的DNA重新溶解在水中。测定OD260/280来确定产物量。
(3)进一步证实Aminoallyl dUTP导入了ICAN扩增产物中。
利用5-羧基荧光素succinimidil酯(分子探针)对ICAN产物中的氨基进行荧光标记来进一步证实ICAN产物中导入了氨基。对上述DNA溶液进行稀释以使其浓度为2μg/50μl。向此溶液中添加20μl 1M碳酸钠缓冲液(pH9.0)。随后，向其中进一步添加4μl 10mM FITC(Nacalai Tesque)N，N-二甲基甲酰胺溶液。将生成的混合物在20℃下反应16小时。在利用商业购买的spincolumn取出多余的FITC后，取10μl反应混合物添加到2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结束后，利用FM-BIO对荧光染料进行检测。此外，利用EtBr染色对ICAN扩增片段进行检测。结果，其进一步证明，利用Aminoallyl dUTP进行ICAN可将氨基导入ICAN扩增产物中。这也进一步证明，结合利用含有功能基团的修饰核苷酸和扩增产物的荧光标记可进一步提高检测灵敏度。
(4)利用脱氧UTP检验本发明中的扩增方法。选取结核分支杆菌作为靶。在GenBank注册编号为AL123456的结核分支杆菌基因组的核苷酸序列基础上合成了引物MTIS2F-16(SEQ ID NO：194)和MTIS2R-ACC(SEQ ID NO：195)。利用引物对扩增得到的、包括引物部分在内的区域的长度为98bp。模板制备如下。简单来讲，通过DNA连接试剂盒Ver.2将利用引物MTIS-PCR-F-2(SEQ ID NO：196)和MTIS-PCR-R-2(SEQ ID NO：197)从结核分支杆菌基因组中PCR扩增得到的产物插入到pT7 Blue T-载体(Takara Shuzo)中。利用连接质粒来转化大肠杆菌JM109。对生成的交换体进行培养并获取含有长约400bp的导入DNA的质粒。在通过OD260测定而确定的浓度的基础之上，制备了每μl含有103个质粒拷贝的溶液。
将32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、500μM的dATP、dCTP和dGTP、dTTP/dUTP混合物(500/0，400/100，300/200，200/300，100/400或0/500μM)、50pmol引物MTIS 2F-16和MTIS 2R-AAC、8.75U Afu RNA酶H、8UBcaBEST DNA聚合酶及1μl模板(103个拷贝)混合在一起，添加无菌水使其体积达到50μl。将反应混合物置于60℃下的热循环仪Personal中并反应1小时。反应完成后，从每种反应混合物中各取3μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果，在每种dTTP/dUTP比下都观察到了感兴趣的扩增产物。在这些结果基础之上，其进一步证明，修饰核苷酸在本发明的方法中可用做底物。
实施例39
对本发明的扩增方法在一步扩增方法中的应用进行检验。选取HCV作为靶。
(1)制备转录RNA
制备作为模板的转录RNA。在征得患者同意的情况下，从感染丙型肝炎病毒的患者中采集300μl血清，按照附加的操作指南，利用TRIzol试剂(Life Technologies)从血清中提取RNA并最后将其溶解在20μl可注射水(Otsuka PHarmaceutical)中，从而完成了转录RNA的制备。以上述RNA样品为模板进行RT-PCR。反应进行如下。按照一步RNA PCR试剂盒(Takara Shuzo)的附加指南，利用2μl RNA样品和20pmol引物SP6-HCV-F(SEQ ID NO：198)和T7-HCV-R(SEQ IDNO：199)制备了50μl反应混合物。将反应混合物置于热循环仪Personal中，并进行如下反应：50℃下反应15分；94℃下反应2分钟；及94℃下反应30秒，60℃下反应30秒，72℃下反应30秒，持续40个循环。反应完成后，将反应混合物在2％SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶上进行电泳分析。从凝胶中切除长约350bp的感兴趣的扩增产物。随后按照试剂盒的附加操作指南，利用EASYTRAP Ver.2回收DNA。按照试剂盒上的附加指南，利用竞争性RNA转录试剂盒(TakaraShuzo)并以回收的DNA为模板合成转录RNA。此转录RNA用做模板来对一步RT-ICAN进行检测。
(2)检验一步RT-ICAN
在OD260测定值基础之上确定了上文(1)中制备的转录RNA的浓度，并制备了每μl含有104、105、106或107个拷贝的稀释液。制备了50μl含有32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM醋酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸镁、500μM的多种dNTP、50pmol引物HCV-AS(SEQ ID NO：200)和HCV-AA(SEQ ID NO：201)、30U PfuRNA酶H、8U BcaBEST DNA聚合酶、20U RNA酶抑制剂、0、1、2.5、3或5U AMV RTase XL(Takara Shuzo)及1μl含有可变拷贝数目的转录RNA的稀释液的反应混合物。将反应混合物置于60℃下的热循环仪Personal中并孵育1小时。反应完成后，从每种反应混合物中各取2μl，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果，当不添加AMV RTase时，以各种稀释液为模板都没有观察到感兴趣的扩增产物。另一方面，在利用含有107个拷贝(添加1U AMVRTase XL)、106个拷贝(添加2.5U AMV RTase XL)、106个拷贝(添加3U AMV RTase XL)或106个拷贝(添加5U AMV RTase XL)的稀释液为模板的情况下观察到了感兴趣的扩增产物。当在57℃下进行反应时，在以含有105个拷贝的RNA并添加有2.5U AMV RTase XL的稀释液为模板时观察到了感兴趣的扩增产物。此外，当应用1U BcaBESTDNA聚合酶和10U Pfu RNA酶H时，甚至在不添加AMV RTase的情况下，以含有106个拷贝的稀释液为模板也观察到了感兴趣的扩增产物。
工业实用性
本发明提供了靶核酸扩增方法，此方法包括利用嵌合寡核苷酸引物、通过DNA合成反应来扩增靶核酸的核苷酸序列中适于特异扩增的区域。本发明也提供了对利用靶核酸扩增方法得到的靶核酸的检测方法，其包括对从靶核酸扩增得到的片段进行检测。此外，本发明的扩增方法可用做有效的核酸制备方法，而此方法是通过与另一核酸扩增方法或核酸复制方法结合而实现的。本发明也提供了对靶核酸进行特异性检测的方法和对微生物，尤其是病原微生物如病毒、细菌、真菌、酵母等进行高灵敏度定量的方法及用于这些方法中的嵌合寡核苷酸引物。本发明进一步提供了核酸的扩增和检测体系，此体系是自动化的、含量少且高度整合的。
序列表文字
SEQ ID NO：1；PCR引物BsuII-3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：2；PCR引物BsuII-6，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：3；PCR引物RNII-S1，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：4；PCR引物RNII-S2，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：5；PCR引物RNII-S5，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：6；PCR引物RNII-S6，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：7；PCR引物RNII-Nde，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：8；热坚芽孢杆菌的RNA酶HII基因中的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9；热坚芽孢杆菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10；PCR引物BsuIII-1，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：11；PCR引物BsuIII-3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：12；PCR引物BsuIII-6，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：13；PCR引物BsuIII-8，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：14；PCR引物RNIII-S3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：15；PCR引物RNIII-S3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：16；热坚芽孢杆菌的RNA酶HIII中的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17；热坚芽孢杆菌的RNA酶HIII的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18；PCR引物BcaRNIIINde，其可用于从热坚芽孢杆菌中扩增编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：19；保留在PH1650和激烈热球菌基因组序列的一部分间的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20；PCR引物1650Nde，其可用于从激烈热球菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：21；PCR引物1650Bam，其可用于从激烈热球菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：22；激烈热球菌的RNA酶HII的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23；激烈热球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24；PCR引物915-F1，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：25；PCR引物915-F2，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：26；PCR引物915-R1，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：27；PCR引物915-R2，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO：28；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为pUC19 upper150，用于扩增质粒pUC19的一部分。“核苷酸24-25是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：29；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MR1N3，用于扩增质粒pUC19的一部分。“核苷酸28-30是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：30；设计的寡核苷酸引物，命名为M13M4。
SEQ ID NO：31；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：32；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：33；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：34；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：35；设计的寡核苷酸引物，命名为MCR-F，用于扩增长DNA片段。
SEQ ID NO：36；设计的寡核苷酸引物，命名为MCR-R，用于扩增长DNA片段。
SEQ ID NO：37；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MF2N3(24)，用于扩增长DNA片段。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：38；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MR1N3(24)，用于扩增长DNA片段。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：39；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：40；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：41；设计的寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分
SEQ ID NO：42；设计的寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分
SEQ ID NO：43；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：44；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：45；设计的寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分
SEQ ID NO：46；设计的寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分
SEQ ID NO：47；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：48；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：49；设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分
SEQ ID NO：50；设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分
SEQ ID NO：51；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：52；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：53；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：54；设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。
SEQ ID NO：55；设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。
SEQ ID NO：56；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：57；设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO：58；设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO：59；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：60；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：61；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：62；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：63；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：64；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸18是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：65；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：66；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：67；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：68；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：69；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，核苷酸15是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：70；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸9-11和19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：71；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸8-10和18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：72；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：73；设计的寡核苷酸探针，用于检测从出血性大肠杆菌O-157的vero毒素2-编码序列扩增的DNA片段
SEQ ID NO：74；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：75；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：76；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
SEQ ID NO：77；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
SEQ ID NO：78；设计的寡核苷酸引物，命名为GMO-PCR-F 20聚体
SEQ ID NO：79；设计的寡核苷酸引物，命名为GMO-PCR-R 20聚体
SEQ ID NO：80；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-S1 20聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：81；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-S2 20聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：82；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-A1 20聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：83；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-A2 20聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：84；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：85；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：86；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS-编码序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：87；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：88；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
SEQ ID NO：89；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
SEQ ID NO：90；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：91；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：92；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：93；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：94；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：95；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：96；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HPV DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：97；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HPV DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：98；设计的寡核苷酸引物，用于扩增HPV DNA的一部分。
SEQ ID NO：99；设计的寡核苷酸引物，用于扩增HCV DNA的一部分。
SEQ ID NO：100；设计的寡核苷酸引物，用于扩增HCV DNA的一部分。
SEQ ID NO：101；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：102；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：103；设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增部分HCV的DNA片段。
SEQ ID NO：104；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：105；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：106；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：107；设计的寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。
SEQ ID NO：108；设计的寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。
SEQ ID NO：109；设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO：110；设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO：111；设计的寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。
SEQ ID NO：112；设计的寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。
SEQ ID NO：113；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SFQ ID NO：114；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：115；设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。
SEQ ID NO：116：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从肉毒梭菌中扩增肉毒毒素A编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：117：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从肉毒梭菌中扩增肉毒毒素A编码序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：118：设计的寡核苷酸探针，用于检测从肉毒梭菌扩增肉毒毒素A编码序列的一部分的DNA片段。
SEQ ID NO：119；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：120；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：121；设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增类病毒CSVd的一部分的DNA。
SEQ ID NO：122；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：123；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：124；设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO：125；设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO：126；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：127；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：128；设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。
SEQ ID NO：129；设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。
SEQ ID NO：130；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：131；设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：132；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
SEQ ID NO：133；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
SEQ ID NO：134；设计的寡核苷酸引物，命名为pUC19 upper 150，用于扩增质粒pUC19的一部分
SEQ ID NO：135；设计的寡核苷酸引物，命名为pUC19 lower NN，用于扩增质粒pUC19的一部分
SEQ ID NO：136；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为SEA-1，用于扩增金黄色葡萄球菌的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：137；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为SEA-2，用于扩增金黄色葡萄球菌的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：138；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-F3，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：139；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-R1，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：140；设计的寡核苷酸引物，命名为MF2，用于扩增pUC19质粒DNA的一部分
SEQ ID NO：141；设计的寡核苷酸引物，命名为MR1，用于扩增pUC19质粒DNA的一部分
SEQ ID NO：142；设计的寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。
SEQ ID NO：143；海栖热袍菌RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO：144；海栖热袍菌RNA酶HII基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO：145；Pyrococcus horikoshii PH1650的核苷酸序列。
SEQ ID NO：146；PCR引物PhoNde，可用于从Pyrococcushorikoshii中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
SEQ ID NO：147；PCR引物PhoBam，可用于从Pyrococcushorikoshii中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
SEQ ID NO：148；Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列
SEQ ID NO：149；Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII的氨基酸序列
SEQ ID NO：150；闪烁古生球菌的AF0621的核苷酸序列
SEQ ID NO：151；PCR引物AfuNde，用于从闪烁古生球菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
SEQ ID NO：152；PCR引物AfuBam，用于从闪烁古生球菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
SEQ ID NO：153；闪烁古生球菌的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO：154；闪烁古生球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
SEQ ID NO：155；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2F，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：156；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2R，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：157；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为CT2F，用于扩增沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：158；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为CT2R，用于扩增沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：159；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-F-1033(60)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：160；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-R-1133(62)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：161；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-F-1033(68)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：162；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-R-1133(68)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：163；设计的寡核苷酸引物，命名为F26，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
SEQ ID NO：164；设计的寡核苷酸引物，命名为R1310，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
SEQ ID NO：165；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为pDON-AI-68-1，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：166；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为pDON-AI-68-2，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：167；人类原癌基因Wnt-5a的核苷酸序列
SEQ ID NO：168；人类核糖体蛋白S5的核苷酸序列
SEQ ID NO：169；人类心肌黄酶的核苷酸序列
SEQ ID NO：170；人类protocadherin的核苷酸序列
SEQ ID NO：171；设计的寡核苷酸，用于制备pIC62。
SEQ ID NO：172；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为ICAN2。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：173；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为ICAN6。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：174；设计的寡核苷酸引物，命名为ICAN2 DNA。
SEQ ID NO：175；设计的寡核苷酸引物，命名为ICAN6 DNA。
SEQ ID NO：176；设计的寡核苷酸引物，用于小从小鼠中扩增核糖体蛋白S18编码序列的一部分。
SEQ ID NO：177；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增核糖体蛋白S18编码序列的一部分。
SEQ ID NO：178；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增转铁蛋白受体(TFR)编码序列的一部分。
SEQ ID NO：179；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增转铁蛋白受体(TFR)编码序列的一部分。
SEQ ID NO：180；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增基质细胞来源的因子4(Sdf4)编码序列的一部分。
SEQ ID NO：181；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增基质细胞来源的因子4(Sdf4)编码序列的一部分。
SEQ ID NO：182；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增细胞质β-肌动蛋白编码序列的一部分。
SEQ ID NO：183；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增细胞质β-肌动蛋白编码序列的一部分。
SEQ ID NO：184；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增鸟氨酸脱羧酶编码序列的一部分。
SEQ ID NO：185；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增鸟氨酸脱羧酶编码序列的一部分。
SEQ ID NO：186；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)编码序列的一部分。
SEQ ID NO：187；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)编码序列的一部分。
SEQ ID NO：188；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增酪氨酸3-单加氧酶编码序列的一部分。
SEQ ID NO：189；设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增酪氨酸3-单加氧酶编码序列的一部分。
SEQ ID NO：190；设计的寡核苷酸引物，命名为MCS-F。
SEQ ID NO：191；设计的寡核苷酸引物，命名为MCS-R。
SEQ ID NO：192；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MF2N3(24)。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：193；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MR1N3(24)。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：194；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2F-16，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：195；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2R-ACC，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：196；设计的寡核苷酸引物，命名为MTIS-PCR-F-2，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
SEQ ID NO：197；设计的寡核苷酸引物，命名为MTIS-PCR-R-2，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
SEQ ID NO：198；设计的寡核苷酸引物，命名为SP6-HCV-F，用于扩增HCV的一部分。
SEQ ID NO：199；设计的寡核苷酸引物，命名为SP6-HCV-R，用于扩增HCV的一部分。
SEQ ID NO：200；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-AS，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO：201；设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-AA，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
                             序列表
<110>宝生物工程株式会社
<120>核酸扩增方法
<130>662757
<150>JP 2000-251981
<151>2000-08-23
<150>JP 2000-284419
<151>2000-09-19
<150>JP 2000-288750
<151>2000-09-22
<150>JP 2001-104191
<151>2001-04-03
<160>201
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BsuII-3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>1
gtcgccagcg cagtnathyt  20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BsuII-6，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>2
cggtccctcg tcacyttngc  20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物RNII-S1，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>3
cgcgcttttc cggcgtcagc  20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物RNII-S2，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>4
acggcgcacg cttcaatttg  20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物RNII-S5，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>5
acgcctattt gccggggctt  20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物RNII-S6，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>6
atgaccgacg cagcggcgat  20
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物RNII-Nde，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>7
tagaagaggg agaggcatat gaagcggtat acggtgaaa  39
<210>8
<211>780
<212>DNA
<213>热坚芽孢杆菌的RNA酶HII基因中的ORF的核苷酸序列。
<400>8
atgaagcggt atacggtgaa agacattgaa gcgctgcttc cgaagcttgg cgcggacgac  60
ccgcgctggg agatgctgcg gcaggatgag cgaaaaagcg tgcaggcgct tcttgcccgt  120
tttgaaaggc agaaagcgcg ccggcacgcc atcgagcagc ggtgggaaga actaatgcgt  180
tatgagaggg aactatacgc cgctggcgtt agacggatcg ccggcattga tgaggccggg  240
cgcggcccgc tggccggccc ggtcgtcgcc gccgcggtca tcttgccgaa agacgcctat  300
ttgccggggc ttgacgactc gaagcggctg acgccggaaa agcgcgaggc attgtttgcg  360
caaattgaag cgtgcgccgt cgccatcggc atcggcatcg tcagcgcggc ggagatcgat  420
gaaaggaata tttacgaagc gacaaggcaa gcgatggcga aagcggtgaa cgccctttcc  480
ccgccgcctg aacatttgct tgttgatgcg atggcggtgc cgtgcccact gccgcaacag  540
cgcctcataa aaggagacgc caacagcgct tcaatcgccg ctgcgtcggt catcgccaaa  600
gtgacgcgcg accggtggat gaaagaactg gatcgccgct atccacaata cgggttcgcg  660
cgccatatgg gctacggaac gccggaacat ttcgaggcga tccgccgcta cggcgttacg  720
cctgagcacc gtcgttcgtt cgcaccggtg agggaggtgc tgaaggcgag cgagcagctc  780
<210>9
<211>260
<212>PRT
<213>热坚芽孢杆菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
<400>9
Met Lys Arg Tyr Thr Val Lys Asp Ile Glu Ala Leu Leu Pro Lys
  1               5                  10                  15
Leu Gly Ala Asp Asp Pro Arg Trp Glu Met Leu Arg Gln Asp Glu
                 20                  25                  30
Arg Lys Ser Val Gln Ala Leu Leu Ala Arg Phe Glu Arg Gln Lys
                 35                  40                  45
Ala Arg Arg His Ala Ile Glu Gln Arg Trp Glu Glu Leu Met Arg
                 50                  55                  60
Tyr Glu Arg Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly
                 65                  70                  75
Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Leu Ala Gly Pro Val Val Ala
                 80                  85                  90
Ala Ala Val Ile Leu Pro Lys Asp Ala Tyr Leu Pro Gly Leu Asp
                 95                 100                 105
Asp Ser Lys Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Glu Ala Leu Phe Ala
                11O                 115                 120
Gln Ile Glu Ala Cys Ala Val Ala Ile Gly Ile Gly Ile Val Ser
                125                 130                 135
Ala Ala Glu Ile Asp Glu Arg Asn Ile Tyr Glu Ala Thr Arg Gln
                140                 145                 150
Ala Met Ala Lys Ala Val Asn Ala Leu Ser Pro Pro Pro Glu His
                155                 160                 165
Leu Leu Val Asp Ala Met Ala Val Pro Cys Pro Leu Pro Gln Gln
                170                 175                 180
Arg Leu Ile Lys Gly Asp Ala Asn Ser Ala Ser Ile Ala Ala Ala
                185                 190                 195
Ser Val Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Trp Met Lys Glu Leu
                200                 205                 210
Asp Arg Arg Tyr Pro Gln Tyr Gly Phe Ala Arg His Met Gly Tyr
                215                 220                 225
Gly Thr Pro Glu His Phe Glu Ala Ile Arg Arg Tyr Gly Val Thr
                230                 235                 240
Pro Glu His Arg Arg Ser Phe Ala Pro Val Arg Glu Val Leu Lys
                245                 250                 255
Ala Ser Glu Gln Leu
                260
<210>1O
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BsuIII-1，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
<400>10
ggtaaggtct tgttycargg  20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BsuIII-3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
<400>11
ggaaccggag attayttygg  20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BsuIII-6，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
<400>12
atgattgaag cagcngcnac  20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BsuIII-8，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
<400>13
gtattggcga aatgnarytt  20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物RNIII-S3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
<400>14
cccgatcgtc gtcgccgccg  20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物RNIII-S3，其可用于从热坚芽孢杆菌中克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
<400>15
gatacgtgga cactttccgc  20
<210>16
<211>915
<212>DNA
<213>热坚芽孢杆菌的RNA酶HIII中的ORF的核苷酸序列。
<400>16
gtgattcaag ccgaccaaca gctgcttgac gccttgcgcg cccactacca agacgcctta  60
tccgaccggc ttccggctgg agcgttgttt gccgtcaagc gcccggatgt cgtcatcacc  120
gcctaccgct caggcaaagt gctgtttcaa gggaaagcgg cggagcaaga agcagcgaaa  180
tggatatcag gggcgagcgc ctcaaacgaa acagctgacc accagccgtc cgctttggca  240
gctcatcaac tcgggtctct ttccgccatc ggttccgatg aagtcggcac cggcgattat  300
ttcggcccga tcgtcgtcgc cgccgcctac gtggatcggc cgcatatcgc caaaatcgcg  360
gcgcttggcg tgaaagattc gaaacaattg aacgatgagg caatcaaacg gatcgccccc  420
gccatcatgg aaaccgtgcc gcatgcggtc accgtgttgg acaatgccga atacaaccgc  480
tggcagcgaa gcggcatgcc gcagacgaaa atgaaagcgc tccttcacaa ccggacgctc  540
gtgaaactcg ttgacgccat cgcgcccgcc gaaccagaag caatcatcat cgacgaattt  600
ttaaaacggg attcgtattt ccgttacctt tccgatgaag atcgcattat ccgcgagcgg  660
gtgcactgcc ttcccaaggc ggaaagtgtc cacgtatcag tcgccgccgc ctcgatcatc  720
gcccgctatg tgtttttaga ggagatggag caattatccc gcgccgtcgg cctcctgctt  780
ccaaaaggcg ccggcgccat tgtcgatgaa gccgcggcca acatcatccg cgcgcggggg  840
gcggaagcgc ttgagacatg cgccaagctt catttcgcca atacaaaaaa ggcgctggac  900
atcgccaaac gccgg 915
<210>17
<211>305
<212>PRT
<213>热坚芽孢杆菌的RNA酶HIII的氨基酸序列。
<400>17
Met Ile Gln Ala Asp Gln Gln Leu Leu Asp Ala Leu Arg Ala His
  1               5                  10                  15
Tyr Gln Asp Ala Leu Ser Asp Arg Leu Pro Ala Gly Ala Leu Phe
                 20                  25                  30
Ala Val Lys Arg Pro Asp Val Val Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gly
                 35                  40                  45
Lys Val Leu Phe Gln Gly Lys Ala Ala Glu Gln Glu Ala Ala Lys
                 50                  55                  60
Trp Ile Ser Gly Ala Ser Ala Ser Asn Glu Thr Ala Asp His Gln
                 65                  70                  75
Pro Ser Ala Leu Ala Ala His Gln Leu Gly Ser Leu Ser Ala Ile
                 80                  85                  90
Gly Ser Asp Glu Val Gly Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Pro Ile Val
                 95                 100                 105
Val Ala Ala Ala Tyr Val Asp Arg Pro His Ile Ala Lys Ile Ala
                110                 115                 120
Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ala Ile
                125                 130                 135
Lys Arg Ile Ala Pro Ala Ile Met Glu Thr Val Pro His Ala Val
                140                 145                 150
Thr Val Leu Asp Asn Ala Glu Tyr Asn Arg Trp Gln Arg Ser Gly
                155                 160                 165
Met Pro Gln Thr Lys Met Lys Ala Leu Leu His Asn Arg Thr Leu
                170                 175                 180
Val Lys Leu Val Asp Ala Ile Ala Pro Ala Glu Pro Glu Ala Ile
                185                 190                 195
Ile Ile Asp Glu Phe Leu Lys Arg Asp Ser Tyr Phe Arg Tyr Leu
                200                 205                 210
Ser Asp Glu Asp Arg Ile Ile Arg Glu Arg Val His Cys Leu Pro
                215                 220                 225
Lys Ala Glu Ser Val His Val Ser Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile
                230                 235                 240
Ala Arg Tyr Val Phe Leu Glu Glu Met Glu Gln Leu Ser Arg Ala
                245                 250                 255
Val Gly Leu Leu Leu Pro Lys Gly Ala Gly Ala Ile Val Asp Glu
                260                 265                 270
Ala Ala Ala Asn Ile Ile Arg Ala Arg Gly Ala Glu Ala Leu Glu
                275                 280                 285
Thr Cys Ala Lys Leu His Phe Ala Asn Thr Lys Lys Ala Leu Asp
                290                 295                 300
Ile Ala Lys Arg Arg
                305
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BcaRNIIINde，其可用于从热坚芽孢杆菌中扩增编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
<400>18
cgaacgttgt caaaccatat gattcaagcc gaccaacag  39
<210>19
<211>663
<212>DNA
<213>保留在PH1650和激烈热球菌基因组序列的一部分间的核苷酸序列。
<400>19
atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt  60
ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac  120
tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta  180
gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg  240
aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag  300
aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct  360
gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata  420
gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag  480
caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt  540
gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc  600
gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag  660
tga 663
<210>20
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物1650Nde，其可用于从激烈热球菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>20
caggaggaga gacatatgaa aataggggga att  33
<210>21
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物1650Bam，其可用于从激烈热球菌中克隆编码具有RNA酶HH活性的多肽的基因。
<400>21
gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta    33
<210>22
<211>672
<212>DNA
<213>激烈热球菌的RNA酶HII的ORF的核苷酸序列。
<400>22
ATGAAAATAG GGGGAATTGA CGAAGCAGGA AGAGGACCAG CGATAGGGCC ATTAGTAGTA  60
GCTACTGTCG TCGTTGATGA GAAAAACATT GAGAAGCTCA GAAACATTGG AGTAAAAGAC  120
TCCAAACAAC TAACACCCCA TGAAAGGAAG AATTTATTTT CCCAGATAAC CTCAATAGCG  180
GATGATTACA AAATAGTGAT AGTATCCCCA GAAGAAATCG ACAATAGATC AGGAACAATG  240
AACGAGTTAG AGGTAGAGAA GTTTGCTCTC GCCTTAAATT CGCTTCAGAT AAAACCAGCT  300
CTTATATACG CTGATGCAGC GGATGTAGAT GCCAATAGAT TTGCAAGCTT GATAGAGAGA  360
AGACTCAATT ATAAGGCGAA GATTATTGCC GAACACAAGG CCGATGCAAA GTATCCAGTA  420
GTTTCAGCAG CTTCAATACT TGCAAAGGTT GTTAGGGATG AGGAAATTGA AAAATTAAAA  480
AAGCAATATG GAGACTTTGG CTCTGGGTAT CCAAGTGATC CAAAAACCAA GAAATGGCTT  540
GAAGAGTACT ACAAAAAACA CAACTCTTTC CCTCCAATAG TCAGACGAAC CTGGGAAACT  600
GTAAGAAAAA TAGAGGAAAG CATTAAAGCC AAAAAATCCC AGCTAACGCT TGATAAATTC  660
TTTAAGAAAC CT  672
<210>23
<211>224
<212>PRT
<213>激烈热球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
<400>23
Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile
  1               5                  10                  15
Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile
                 20                  25                  30
Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr
                 35                  40                  45
Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala
                 50                  55                  60
Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn
                 65                  70                  75
Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu
                 80                  85                  90
Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp
                 95                 100                 105
Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg
                110                 115                 120
Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp
                125                 130                 135
Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val
                140                 145                 150
Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp
                155                 160                 165
Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu
                170                 175                 180
Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg
                185                 190                 195
Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala
                200                 205                 210
Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro
                215                 220
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物915-F1，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>24
aaaaagc ttg ggaatagatg agctttac  28
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物915-F2，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>25
aaaccatggg aatagatgag ctttac  26
<210>26
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物915-R1，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>26
aaatctagat cctcaacttt gtcgatgtg  29
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物915-R2，其可用于从海栖热袍菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
<400>27
aatctagatt aaaaaagagg gagattatgg   30
<210>28
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为pUC19 upper 150，用于扩增质粒pUC19的一部分。“核苷酸24-25是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>28
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtaug                                        25
<210>29
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MR1N3，用于扩增质粒pUC19的一部分。“核苷酸28-30是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>29
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatguu                                   30
<210>30
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为M13M4。
<400>30
gttttcccag tcacgac                                                 17
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>31
tgtcattcgc tctgcaatag gua                                          23
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>32
caccagacaa tgtaaccgct guu                                          23
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>33
tactgggttt ttcttcggua                                              20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>34
atagacatca agccctcgua                                              20
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MCR-F，用于扩增长DNA片段。
<400>35
ccattcaggc tgcgcaactg tt                                           22
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MCR-R，用于扩增长DNA片段。
<400>36
tggcacgaca ggtttcccga ct                                           22
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MF2N3(24)，用于扩增长DNA片段。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>37
gctgcaaggc gattaagttg ggua                                         24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MR1N3(24)，用于扩增长DNA片段。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>38
ctttatgctt ccggctcgta tguu                                         24
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸””
<400>39
cctttctctg tttttgtccg                                              20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>40
aagcacctca ttaccctugc                                              20
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分
<400>41
gggcggcgac ctcgcgggtt ttcg                                         24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分
<400>42
gctgcttatg ctctataaag tagg                                         24
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>43
aggaatcttt atttaccaug                                              20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>44
tggtgtttaa acttattgcg                                              20
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分
<400>45
ccatcagcta taaacacaaa cagc                                         24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分
<400>46
tgttttgacc aaacatagta atgc                                         24
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>47
tcgttaaata gtatacggac a                                            21
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>48
tgctcaataa tcagacgaag                                              20
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分
<400>49
aaatggggta ctgtgcctgt tact                                         24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分
<400>50
ctctgtatct gcctgaagcg taag                                         24
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>51
tacctgggtt tttcttcggu a                                            20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>52
atagactttt cgacccaaca                                              20
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>53
atagacatca agccctcgua                                              20
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。
<400>54
tcgttaaata gtatacggac a                                            21
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。
<400>55
atagacatca agccctcgta                                              20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>56
gaacaatgga agtcaacaaa                                              20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
<400>57
tacttgtggt tcctgtggtg                                              20
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
<400>58
atactaaggt tccaagggct                                              20
<210>59
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>59
ggaaacctgg aggaaguc                                                18
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>60
gtgaaaaccc tgtttaggau                                              20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>61
acctagatat aagctctaca                                              20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>62
aaatagatgt tttagcagag                                              20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增黄杆菌属物种DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>63
atagataaaa aaaactccac                                              20
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸18是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>64
tcgttaaata gtatacgiac a                                            21
<210>65
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>65
tcgttaaata gtatacigac a                                            21
<210>66
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>66
tcgttaaata gtataiggac a                                            21
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>67
tgctcaataa tcagaciaag                                              20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>68
tgctcaataa tcagaigaag                                              20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，核苷酸15是肌苷，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>69
tgctcaataa tcagicgaag                                              20
<210>70
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸9-11和19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>70
tacctggguu uttcttcggu a                                            21
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸8-10和18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>71
atagacauca agccctcgua                                              20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>72
gtcccctgag atatatguuc                                              20
<210>73
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，用于检测从出血性大肠杆菌O-157的vero毒素2-编码序列扩增的DNA片段
<400>73
ccaacaaagt tatgtctctt cgttaaatag                                   30
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>74
atgccattga gttcatcaac                                              20
<210>75
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>75
tcttggtggc aaagatgag                                               19
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
<400>76
atgccattga gttcatcaac                                              20
<210>77
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
<400>77
tcttggtggc aaagatgag                                               19
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为GMO-PCR-F 20聚体
<400>78
atcgttgaag atgcctctgc                                              20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为GMO-PCR-R 20聚体
<400>79
tccgtatgat cgcgcgtcat                                              20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-S1 20聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>80
tttggagagg acacgctgac                                              20
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-S220聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>81
ggacacgctg acaagctgac                                              20
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-A1 20聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>82
ggctgtagcc actgatgcug                                              20
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为GMO-A220聚体。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>83
ttccggaaag gccagaggau                                              20
<210>84
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>84
tactgggtt tttcttcggu a                                             20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素2-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>85
atagacatca agccctcgua                                              20
<210>86
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS-编码序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>86
tcatgccatt gagttcatca ac                                           22
<210>87
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>87
tggtaggttc ctgttgtttc ua                                           22
<210>88
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
<400>88
tcatgccatt gagttcatca ac                                           22
<210>89
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
<400>89
tggtaggttc ctgttgtttc ta                                           22
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>90
ctgcgaggcg gtggcaaggg                                              20
<210>91
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增λDNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>91
ctgcctcgct ggccgtgccg c                                            21
<210>92
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>92
ctcatgccat tgagttcatc aac                                          23
<210>93
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>93
gctggtaggt tcctgttgtu uc                                           22
<210>94
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>94
agctctgtat ctggcggac                                               19
<210>95
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>95
gatcgggatt tttggactca g                                            21
<210>96
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HPV DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>96
caaaagagaa ctgcaatguu u                                            21
<210>97
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HPV DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>97
gttgcttgca gtacacacau u                                            21
<210>98
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增HPV DNA的一部分。
<400>98
gaggacccac aggagcgacc cagaaag                                      27
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增HCV DNA的一部分。
<400>99
cactccacca tgaatcactc                                              20
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增HCV DNA的一部分。
<400>100
ggtgcacggt ctacgagacc                                              20
<210>101
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>101
ctgtgaggaa ctactgtcuu c                                            21
<210>102
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>102
gcagaccact atggcucu                                                18
<210>103
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增部分HCV的DNA片段。
<400>103
gtatgagtgt cgtgcagcct ccaggacccc                                   30
<210>104
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>104
tgagacatat tatctgccac g                                            21
<210>105
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>105
aaatggctag gaggtggaag a                                            21
<210>106
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>106
ttatcagcca gtacctctuc g                                            21
<210>107
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。
<400>107
tgagacatat tatctgccac g                                            21
<210>108
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。
<400>108
aaatggctag gaggtggaag a                                            21
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
<400>109
ggggaaacct ggaggaagtc                                              20
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
<400>110
cgggtagtag ccaaaggaag                                              20
<210>111
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AIDNA的一部分。
<400>111
agctctgtat ctggcggac                                               19
<210>112
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增pDON-AIDNA的一部分。
<400>112
gatcgggatt tttggactca g                                            21
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>113
ggggataatt tgtttgcagu                                              20
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>114
tcgttcaaca ataagccgua                                              20
<210>115
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。
<400>115
cgcccttcct ctggatctac ccctctgaca                                   30
<210>116
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从肉毒梭菌中扩增肉毒毒素A编码序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>116
caccagaagc aaaacaaguu c                                            21
<210>117
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从肉毒梭菌中扩增肉毒毒素A编码序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>117
ctattgatgt taacaacatt cuu                                          23
<210>118
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，用于检测从肉毒梭菌扩增肉毒毒素A编码序列的一部分的DNA片段。
<400>118
gggagttaca aaattatttg agagaattta                                   30
<210>119
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>119
cacccttcct ttagtttccu u                                            21
<210>120
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>120
cgttgaagct tcagttguuu                                              20
<210>121
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增类病毒CSVd的一部分的DNA。
<400>121
ccttcctctc ctggagaggt cttctgccct                                   30
<210>122
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>122
cacccttcct ttagtttccu u                                            21
<210>123
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>123
cgttgaagct tcagttgtuu c                                            21
<210>124
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
<400>124
cacccttcct ttagtttcct t                                            21
<210>125
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增类病毒CSVd的一部分。
<400>125
cgttgaagct tcagttgttt c                                            21
<210>126
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>126
gactgaatat aaacttgugg                                              20
<210>127
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>127
ctattgttgg atcatatucg                                              20
<210>128
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。
<400>128
gactgaatat aaacttgtgg                                              20
<210>129
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-ki-ras癌基因的一部分。
<400>129
ctattgttggatcatattcg                                               20
<210>130
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>130
gacttttcga cccaacaaag                                              20
<210>131
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从出血性大肠杆菌O-157中扩增vero毒素1-编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>131
atatccacag caaaataacu                                              20
<210>132
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
<400>132
cacaaggcca catcggattt c                                            21
<210>133
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增iNOS编码序列的一部分
<400>133
tgcataccac ttcaacccga g                                            21
<210>134
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为pUC19 upper 150，用于扩增质粒pUC19的一部分
<400>134
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg                                        25
<210>135
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为pUC19 lower NN，用于扩增质粒pUC19的一部分
<400>135
gataacactg cggccaactt acttc                                        25
<210>136
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为SEA-1，用于扩增金黄色葡萄球菌的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>136
tgtatgtatg gtggtgtaac g                                            21
<210>137
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为SEA-2，用于扩增金黄色葡萄球菌的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>137
taaccgtttc caaaggtacu g                                            21
<210>138
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-F3，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>138
gcgtctagcc atggcguua                                               19
<210>139
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-R1，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>139
gcagaccact atggcucu                                                18
<210>140
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MF2，用于扩增pUC19质粒DNA的一部分
<400>140
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta                                   30
<210>141
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MR1，用于扩增pUC19质粒DNA的一部分
<400>141
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt                                   30
<210>142
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增腺病毒的一部分。
<400>142
ttatcagcca gtacctcttc g                                            21
<210>143
<211>714
<212>DNA
<213>海栖热袍菌RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。
<400>143
atgggaatag atgagcttta caaaaaagag tttggaatcg tagcaggtgt ggatgaagcg  60
ggaagagggt gcctcgcagg tcccgttgtg gcggccgctg tcgttctgga aaaagaaata  120
gaaggaataa acgattcaaa acagctttcc cctgcgaaga gggaaagact tttagatgaa  180
ataatggaga aggcagcagt tgggttagga attgcgtctc cagaggaaat agatctctac  240
aacatattca atgccacaaa acttgctatg aatcgagcac tggagaacct gtctgtgaaa  300
ccatcatttg tactcgttga cgggaaagga atcgagttga gcgttcccgg tacatgctta  360
gtgaagggag accagaaaag caaattgata ggagcagctt ccattgttgc gaaggtcttc  420
agagatagat tgatgagcga gtttcacagg atgtatccac agttttcctt ccacaaacac  480
aaaggttacg ccacaaaaga acatctgaac gaaatcagaa agaacggagt tttaccaatc  540
caccggctga gttttgaacc tgttttagaa cttctgaccg atgatttgtt gagggagttc  600
ttcgaaaaag gcctcatctc cgaaaatcga ttcgaacgaa tattgaatct tctgggggcg  660
agaaaaagtg tggttttccg gaaagaaaga acaaaccata atctccctct tttt   714
<210>144
<211>238
<212>PRT
<213>海栖热袍菌RNA酶HII基因的氨基酸序列。
<400>144
Met Gly Ile Asp Glu Leu Tyr Lys Lys Glu phe Gly Ile Val Ala
  l               5                  10                  15
Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Cys Leu Ala Gly Pro Val Val
                 20                  25                  30
Ala Ala Ala Val Val Leu Glu Lys Glu Ile Glu Gly Ile Asn Asp
                 35                  40                  45
Ser Lys Gln Leu Ser Pro Ala Lys Arg Glu Arg Leu Leu Asp Glu
                 50                  55                  60
Ile Met Glu Lys Ala Ala Val Gly Leu Gly Ile Ala Ser Pro Glu
                 65                  70                  75
Glu Ile Asp Leu Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Thr Lys Leu Ala Met
                 80                  85                  90
Asn Arg Ala Leu Glu Asn Leu Ser Val Lys Pro Ser Phe Val Leu
                 95                 100                 105
Val Asp Gly Lys Gly Ile Glu Leu Ser Val Pro Gly Thr Cys Leu
                110                 115                 120
Val Lys Gly Asp Gln Lys Ser Lys Leu Ile Gly Ala Ala Ser Ile
                125                 130                 135
Val Ala Lys Val Phe Arg Asp Arg Leu Met Ser Glu Phe His Arg
                140                 145                 150
Met Tyr Pro Gln Phe Ser Phe His Lys His Lys Gly Tyr Ala Thr
                155                 160                 165
Lys Glu His Leu Asn Glu Ile Arg Lys Asn Gly Val Leu Pro Ile
                170                 175                 180
His Arg Leu Ser Phe Glu Pro Val Leu Glu Leu Leu Thr Asp Asp
                185                 190                 195
Leu Leu Arg Glu Phe Phe Glu Lys Gly Leu Ile Ser Glu Asn Arg
                200                 205                 210
Phe Glu Arg Ile Leu Asn Leu Leu Gly Ala Arg Lys Set Val Val
                215                 220                 225
Phe Arg Lys Glu Arg Thr Asn His Asn Leu Pro Leu Phe
                230                 235
<210>145
<211>663
<212>DNA
<213>Pyrococcus horikoshii PH1650的核苷酸序列。
<400>145
atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt  60
ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac  120
tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta  180
gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg  240
aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag  300
aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct  360
gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata  420
gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag  480
caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt  540
gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc  600
gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag  660
tga  663
<210>146
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PhoNde，可用于从Pyrococcus horikoshii中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
<400>146
aggaggaaaa tcatatgaag gttgctggag   30
<210>147
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物PhoBam，可用于从Pyrococcus horikoshii中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
<400>147
ttacatgaag gatccaagat cacttaagga  30
<210>148
<211>663
<212>DNA
<213>Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列
<400>148
atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt  60
ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac  120
tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta  180
gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg  240
aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag  300
aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct  360
gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata  420
gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag  480
caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt  540
gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc  600
gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag  660
tgatcttgga tcc   663
<210>149
<211>220
<212>PRT
<213>Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII的氨基酸序列
<400>149
Met Lys Val Ala Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile
  1               5                  10                  15
Gly Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile
                 20                  25                  30
Glu Arg Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr
                 35                  40                  45
Pro Gly Gln Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu
                 50                  55                  60
Asp Asp Tyr Tyr Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu
                 65                  70                  75
Arg His His Ser Met Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val Val
                 80                  85                  90
Ala Leu Asn Ser Leu Arg Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp
                 95                 100                 105
Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala
                110                 115                 120
Gly Leu Lys Tyr Glu Ala Thr Val Ile Ala Glu His Lys Ala Asp
                125                 130                 135
Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val
                140                 145                 150
Thr Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys Gln Lys Tyr Gly Glu
                155                 160                 165
Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr Lys Glu Trp Leu
                170                 175                 180
Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Pro Ile Val Arg
                185                 190                 195
Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe Arg Lys
                200                 205                 210
Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys
                215                 220
<210>150
<211>626
<212>DNA
<213>闪烁古生球菌的AF0621的核苷酸序列
<400>150
atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca  60
ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag  120
ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag  180
gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag  240
attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt  300
gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg  360
agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc  420
atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc  480
ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca  540
ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag  600
acgcttgacg atttctaaac gaaacc   626
<210>151
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物AfuNde，用于从闪烁古生球菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
<400>151
aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg                                   30
<210>152
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物AfuBam，用于从闪烁古生球菌中克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因
<400>152
tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc                                   30
<210>153
<211>638
<212>DNA
<213>闪烁古生球菌的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。
<400>153
catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt  60
gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa  120
aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg  180
gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac  240
gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat  300
gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg  360
ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca  420
atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat  480
ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct  540
tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag  600
aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc   638
<210>154
<211>205
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
<400>154
Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly
  1               5                  10                  15
Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu
                 20                  25                  30
Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg
                 35                  40                  45
Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu
                 50                  55                  60
Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala
                65                  70                  75
Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile
                80                  85                  90
Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val
                95                  100                 105
Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu
                110                 115                 120
Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val
                125                 130                 135
Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile
                140                 145                 150
Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala
                155                 160                 165
Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser
                170                 175                 180
Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser
                185                 190                 195
Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe
                200                 205
<210>155
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2F，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>155
tctcgtccag cgccgcuu                                                18
<210>156
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2R，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>156
gacaaaggcc acgtaggcga a                                            21
<210>157
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为CT2F，用于扩增沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>157
ctggatttat cggaaaccuu                                              20
<210>158
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为CT2R，用于扩增沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>158
aggcctctga aacgacuu                                                18
<210>159
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-F-1033(60)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>159
cacatcgatc cggttcagc                                               19
<210>160
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-R-1133(62)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>160
tgatcgtctc ggctagtgca                                              20
<210>161
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-F-1033(68)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>161
gtacacatcg atccggttca gc                                           22
<210>162
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为K-R-1133(68)，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>162
gttgatcgtc tcggctagtg ca                                           22
<210>163
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为F26，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
<400>163
ccggagactc cagttcttgg                                              20
<210>164
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为R1310，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
<400>164
gtctctggcg ttgagcgtag                                              20
<210>165
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为pDON-AI-68-1，用于扩增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>165
actagctctg tatctggcgg ac                                           22
<210>166
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为pDON-AI-68-2，用于扩增pDON-AIDNA的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>166
acgatcggga tttttggact cag                                          23
<210>167
<211>300
<212>DNA
<213>人类原癌基因Wnt-5a的核苷酸序列
<400>167
cactagattt tttgtttggg gaggttggct tgaacataaa tgaaatatcc tgtattttct  60
tagggatact tggttagtaa attataatag tagaaataat acatgaatcc cattcacagg  120
tttctcagcc caagcaacaa ggtaattgcg tgccattcag cactgcacca gagcagacaa  180
cctatttgag gaaaaacagt gaaatccacc ttcctcttca cactgagccc tctctgattc  240
ctccgtgttg tgatgtgatg ctggccacgt ttccaaacgg cagctccact gggtcccctt  300
<210>168
<211>300
<212>DNA
<213>人类核糖体蛋白S5的核苷酸序列
<400>168
cgccgagtga cagagacgct caggctgtgt tctcaggatg accgagtggg agacagcagc  60
accagcggtg gcagagaccc cagacatcaa gctctttggg aagtggagca ccgatgatgt  120
gcagatcaat gacatttccc tgcaggatta cattgcagtg aaggagaagt atgccaagta  180
cctccctcac agtgcagggc ggtatgccgc aaacgctttc cgcaaagctc agtgtcccat  240
tgtggagcgc ctcactaact ccatgatgat gcacggccgc aacaacggca agaagctcat  300
<210>169
<211>300
<212>DNA
<213>人类心肌黄酶的核苷酸序列
<400>169
tctatacaaa ttttcagaag gttattttct ttatcattgc taaactgatg acttaccatg  60
ggatggggtc cagtcccatg accttggggt acaattgtaa acctagagtt ttatcaactt  120
tggtgaacag ttttggcata atagtcaatt tctacttctg gaagtcatct cattccactg  180
ttggtattat ataattcaag gagaatatga taaaacactg ccctcttgtg gtgcattgaa  240
agaagagatg agaaatgatg aaaaggttgc ctgaaaaatg ggagacagcc tcttacttgc  300
<210>170
<211>300
<212>DNA
<213>人类protocadherin的核苷酸序列
<400>170
agtctcttgg gatcccctaa ccagagcctt tttgccatag ggctgcacac tggtcaaatc  60
agtactgccc gtccagtcca agacacagat tcacccaggc agactctcac ggtcttgatc  120
aaagacaatg gggagccttc gctctccacc actgctaccc tcactgtgtc agtaaccgag  180
gactctcctg aagcccgagc cgagttcccc tctggctctg ccccccggga gcagaaaaaa  240
aatctcacct tttatctact tctttcccta atcctggttt ctgtggggtt tgtggtcaca  300
<210>171
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸，用于制备pIC62。
<400>171
catgtacatc acagtagtcg ttcacagggt tttccggcca taatggcctt tcctgtgtgt  60
gtgctacagc tagtcagtca       80
<210>172
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为ICAN2。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>172
actgactagc tgtagcacac                                              20
<210>173
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为ICAN6。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>173
acatcacagt agtcgttcac                                              20
<210>174
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为ICAN2DNA。
<400>174
actgactagc tgtagcacac                                              20
<210>175
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为ICAN6 DNA。
<400>175
acatcacagt agtcgttcac                                              20
<210>176
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于小从小鼠中扩增核糖体蛋白S18编码序列的一部分。
<400>176
gtctctagtg atccctgaga agt                                          23
<210>177
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增核糖体蛋白S18编码序列的一部分。
<400>177
tggatacacc cacagttcgg ccc                                          23
<210>178
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增转铁蛋白受体(TFR)编码序列的一部分。
<400>178
ccgcgctccg acaagtagat gga                                          23
<210>179
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增转铁蛋白受体(TFR)编码序列的一部分。
<400>179
ccaaagagtg caaggtctgc ctc                                          23
<210>180
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增基质细胞来源的因子4(Sdf4)编码序列的一部分。
<400>180
tctgatggat gcaaccgcta gac                                          23
<210>181
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增基质细胞来源的因子4(Sdf4)编码序列的一部分。
<400>181
gaactcttca tgcacgttgc ggg                                          23
<210>182
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增细胞质β-肌动蛋白编码序列的一部分。
<400>182
tgatggtggg aatgggtcag aag                                          23
<210>183
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增细胞质β-肌动蛋白编码序列的一部分。
<400>183
agaagcactt gcggtgcacg atg                                          23
<210>184
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增鸟氨酸脱羧酶编码序列的一部分。
<400>184
gatgaaagtc gccagagcac atc                                          23
<210>185
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增鸟氨酸脱羧酶编码序列的一部分。
<400>185
ttgatcctag cagaagcaca ggc                                          23
<210>186
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)编码序列的一部分。
<400>186
ggacaggact gaaagacttg ctc                                          23
<210>187
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)编码序列的一部分。
<400>187
gtctggcctg tatccaacac ttc                                          23
<210>188
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增酪氨酸3-单加氧酶编码序列的一部分。
<400>188
atgagctggt gcagaaggcc aag                                          23
<210>189
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用于从小鼠中扩增酪氨酸3-单加氧酶编码序列的一部分。
<400>189
ttcccctcct tctcctgctt ctg                                          23
<210>190
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MCS-F。
<400>190
ccattcaggc tgcgcaatgt t                                            21
<210>191
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MCS-R。
<400>191
tggcacgaca ggtttcccga ct                                           22
<210>192
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MF2N3(24)。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>192
gctgcaaggc gattaagttg ggua                                         24
<210>193
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MR1N3(24)。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>193
ctttatgctt ccggctcgta tguu                                         24
<210>194
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2F-16，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>194
tcgtccagcg ccgcuu                                                  16
<210>195
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为MTIS2R-ACC，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>195
caaaggccac gtaggcgaac                                              20
<210>196
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MTIS-PCR-F-2，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
<400>196
cgaccgcatc aaccgggagc                                              20
<210>197
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为MTIS-PCR-R-2，用于扩增结核分支杆菌DNA的一部分。
<400>197
cccaggatcc tgcgagcgta                                              20
<210>198
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为SP6-HCV-F，用于扩增HCV的一部分。
<400>198
ccatttaggt gacactatag aatactgatg ggggcgacac tccac                  45
<210>199
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，命名为SP6-HCV-R，用于扩增HCV的一部分。
<400>199
agctctaata cgactcacta tagggtcgca agcaccctat caggc                  45
<210>200
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-AS，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>200
gggtcctttc ttggatcaac                                              20
<210>201
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，命名为HCV-AA，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
<400>201
gacccaacac tactcggcua                                              20

Claims (113)

1.核酸扩增方法，该方法包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合来制备反应混合物，其中，此引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列互补的嵌合寡核苷酸引物，并且此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；及
(b)对反应混合物孵育足够时间以产生反应产物。
2.权利要求1中的方法，其中此反应混合物进一步含有一种嵌合寡核苷酸引物，此引物具有与作为模板的核酸的核苷酸序列同源的序列。
3.核酸扩增方法，该方法包括：
(a)用至少一种与作为模板的核酸的核苷酸序列互补的引物及DNA聚合酶处理作为模板的核酸，以合成与模板互补的引物延伸链并合成双链核酸，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)在RNA酶H存在下，用具有链置换活性的DNA聚合酶对互补于在前面的步骤中获得的、作为模板的双链核酸的核苷酸序列进行延伸，以引起链置换并合成置换后的链及双链核酸；及
(c)在步骤(b)中重新利用步骤(b)中获得的双链核酸作为模板。
4.用至少两种引物进行核酸扩增的方法，此方法包括：
(a)用至少一种与作为模板的核酸的核苷酸序列互补的引物及DNA聚合酶处理作为模板的核酸，以合成与模板互补的引物延伸链，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)在RNA酶H存在下，用具有链置换活性的DNA聚合酶对互补于在前面的步骤中获得的、作为模板的双链核酸的核苷酸序列进行延伸，以引起链置换并合成置换后的链及双链核酸；
(c)在步骤(b)中重新利用步骤(b)中获得的双链核酸作为模板；
(d)利用至少一种与步骤(a)中所用的引物不同的引物及DNA聚合酶处理步骤(b)中获得的、作为模板的置换后的链，以合成与置换后的链互补的引物延伸链，其中与步骤(a)中所用的引物不同的此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物与置换后链的核苷酸序列互补，并且含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(e)在RNA酶H存在下，用具有链置换活性的DNA聚合酶对互补于在前面的步骤中获得的、作为模板的双链核酸的核苷酸序列进行延伸，以引起链置换并合成置换后的链及双链核酸；及
(f)在步骤(e)中重新利用步骤(e)中获得的双链核酸作为模板。
5.权利要求3或4中的方法，其中的DNA聚合酶是至少一种具有链置换活性的DNA聚合酶。
6.核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；及
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由模板和引物延伸链组成的双链核酸。
7.核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；及
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸。
8.核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸和由相互退火的模板组成的、与步骤(a)中的两种引物退火的双链核酸；
(d)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(c)中获得的、与两种引物退火的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸和由相互退火的模板组成的、与步骤(a)中的两种引物退火的双链核酸；和
(e)在步骤(d)中，重新利用步骤(d)中获得的、与两引物退火的双链核酸。
9.核酸扩增方法，此方法包括：
(a)利用分别与双链核酸模板的每条链的核苷酸序列互补的两种引物及具有链置换活性的DNA聚合酶处理作为模板的双链核酸分子，以合成与模板互补的引物延伸链，并获得由相互退火的合成的引物延伸链组成的双链核酸，其中每个引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物、定位于引物3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)利用内切核酸酶，切割步骤(a)中获得的、由引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；
(c)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(b)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由相互退火的引物延伸链组成的双链核酸和由相互退火的模板组成的、与步骤(a)中的两种引物退火的双链核酸；
(d)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(c)中获得的、与两种引物退火的双链核酸的各个引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以实现链置换并获得由模板和引物延伸链组成的双链核酸；
(e)利用内切核酸酶，切割步骤(d)中获得的、由模板和引物延伸链组成的双链核酸的包含核糖核苷酸的位点；和
(f)利用具有链置换活性的DNA聚合酶从步骤(e)中获得的、其中的引物延伸链被切割的双链核酸的引物部分的3′末端开始对互补于模板的核苷酸序列进行延伸，以合成置换后的链。
10.权利要求6-9中任意一项的方法，其中的内切核酸酶是内切核糖核酸酶。
11.权利要求10中的方法，其中的内切核糖核酸酶是RNA酶H。
12.权利要求1-5和11中任意一项的方法，其中的RNA酶H选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于栖热袍菌属细菌的RNA酶H、来自于栖热菌属细菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H、来自于古生球菌属细菌的RNA酶H、来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H。
13.权利要求1-12中任意一项的方法，其中的待扩增核酸区域的长度为200bp或更短。
14.权利要求1-13中任意一项的方法，其中使用下列通式所表示的嵌合寡核苷酸引物：
               通式：5′-dNa-Nb-dNc-3′
(a：等于或大于11的整数；b：等于或大于1的整数；c：0或等于或大于1的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可为Ns所替换，并且可对3′末端的核苷酸进行修饰，这样不会发生通过DNA聚合酶的作用而进行的从3′末端开始的延伸)。
15.权利要求14中的方法，其中c为0。
16.权利要求14或15中的方法，其中的核苷酸类似物是脱氧肌苷核糖核苷酸或脱氧尿嘧啶核糖核苷酸，并且修饰的核糖核苷酸为(α-S)核糖核苷酸。
17.权利要求14-16中任意一项的方法，其中DNA延伸反应是在适合于权利要求14-16中任意一项所定义的嵌合寡核苷酸引物的DNA延伸反应温度下进行的。
18.权利要求1-17中任意一项的方法，其包括在含有可增强核酸退火到引物上的物质的退火溶液中，将作为模板的核酸退火到嵌合寡核苷酸引物上，所述引物与核酸的核苷酸序列互补。
19.权利要求18中的方法，其中退火溶液含有亚精胺和/或丙二胺。
20.权利要求18或19中的方法，其中在等于或大于90℃下，对含有作为模板的核酸及与所述核酸的核苷酸序列互补的嵌合寡核苷酸引物的退火溶液进行孵育，随后将溶液冷却到进行扩增反应的温度或此温度以下，从而进行退火。
21.权利要求1-20中任意一项的方法，其中的扩增反应是在含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分的缓冲溶液中进行的。
22.权利要求1-21中任意一项的方法，其中具有链置换活性的DNA聚合酶选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于自嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
23.权利要求1-5和11-22中任意一项的方法，其中具有链置换活性的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且RNA酶H选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H、和来自于古生球菌属细菌的RNA酶H。
24.权利要求23中的方法，其中RNA酶H是来自于大肠杆菌的I型RNA酶H，或来自于火球菌属细菌或古生球菌属细菌的II型RNA酶H。
25.权利要求1-24中任意一项的方法，其中使用具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
26.权利要求25中的方法，其中的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且是在允许BcaDNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质存在下使用Bca DNA聚合酶。
27.权利要求26中的方法，其中允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质是锰离子。
28.权利要求1-27中任意一项的方法，其中的扩增反应是在抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质存在下进行的。
29.权利要求28中的方法，其中抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质为乙膦甲酸。
30.权利要求1-29中任意一项的方法，其中作为模板的核酸是单链DNA或双链DNA。
31.权利要求30中的方法，其是在将作为模板的双链DNA转化为单链DNA后进行的。
32.权利要求30或31中的方法，其中的作为模板的核酸是以RNA为模板通过逆转录反应得到的cDNA。
33.权利要求32中的方法，其是在以RNA为模板通过逆转录反应合成cDNA后进行的。
34.权利要求32或33中的方法，其中具有逆转录酶活性的DNA聚合酶被用作逆转录酶。
35.权利要求31-34中任意一项的方法，其中利用具有逆转录酶活性和链置换活性的一种DNA聚合酶来进行逆转录反应并合成与模板互补的延伸链。
36.权利要求35中的方法，其中的DNA聚合酶是来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶或来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
37.权利要求1-36中任意一项的方法，其中的核酸扩增反应是在等温条件下进行的。
38.权利要求1-37中任意一项的方法，其是在脱氧核糖核苷三磷酸类似物存在下进行的。
39.权利要求38中的方法，其中的脱氧核糖核苷三磷酸类似物为脱氧尿苷三磷酸或其衍生物。
40.用于扩增核酸的组合物，包含：
(a)至少一种与作为模板的核酸的核苷酸序列互补的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)内切核酸酶；及
(c)具有链置换活性的DNA聚合酶。
41.用于扩增核酸的组合物，包含：
(a)至少两种与作为模板的双链核酸的各条链的核苷酸序列分别互补的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个；
(b)内切核酸酶；及
(c)具有链置换活性的DNA聚合酶。
42.用于扩增核酸的组合物，其是通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和内切核酸酶混合而获得的，其中此引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列互补的嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个。
43.用于扩增核酸的组合物，其是通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种引物和内切核酸酶混合而制得的，其中每种引物都是嵌合寡核苷酸引物，此引物与作为模板的双链核酸的每条链的核苷酸序列互补，并且此引物含有核糖核苷酸及选自脱氧核糖核苷酸及核苷酸类似物、定位于引物的3′末端或3′末端侧的核糖核苷酸中的至少一个。
44.权利要求40-43中任意一项的组合物，其中的引物为下面的通式表示的嵌合寡核苷酸引物：
               通式：5′-dNa-Nb-dNc-3′
(a：等于或大于11的整数；b：等于或大于1的整数；c：0或等于或大于1的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可为Ns所替换，并且可对3′末端的核苷酸进行修饰，这样不会发生通过DNA聚合酶的作用而进行的从3′末端开始的延伸)。
45.权利要求44中的组合物，其中c为0。
46.权利要求44或45中的组合物，其中的核苷酸类似物是脱氧肌苷核糖核苷酸或脱氧尿嘧啶核糖核苷酸，并且修饰的核糖核苷酸为(α-S)核糖核苷酸。
47.权利要求40-46中任意一项的组合物，其包含适于核酸扩增反应的缓冲成分。
48.权利要求47中任意一项的组合物，其含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分。
49.权利要求40-48中任意一项的组合物，其中选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶被用作具有链置换活性的DNA聚合酶。
50.权利要求40-49中任意一项的组合物，其中的内切核酸酶是内切核糖核酸酶。
51.权利要求50中的组合物，其中的内切核糖核酸酶是RNA酶H。
52.权利要求51中的组合物，其中的RNA酶H选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于栖热袍菌属细菌的RNA酶H、来自于栖热菌属细菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H、来自于古生球菌属细菌的RNA酶H、来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H。
53.权利要求40-52中任意一项的组合物，其中具有链置换活性的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的BcaDNA聚合酶，并且内切核酸酶是选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H和来自于古生球菌属细菌的RNA酶H的RNA酶H。
54.权利要求53中的组合物，其中RNA酶H是来自于大肠杆菌的I型RNA酶H或来自于火球菌属细菌或古生球菌属细菌的II型RNA酶H。
55.权利要求40-54中任意一项的组合物，其中使用具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
56.权利要求55中的组合物，其中的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，该组合物含有允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质。
57.权利要求56中的组合物，其中允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质是锰离子。
58.权利要求40-57中任意一项的组合物，其含有抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质。
59.权利要求58中的组合物，其中抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质为乙膦甲酸。
60.权利要求40-59中任意一项的组合物，其含有脱氧核糖核苷三磷酸类似物。
61.权利要求60中的组合物，其中的脱氧核糖核苷三磷酸类似物为脱氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
62.用于权利要求1-5中任意一项所定义的核酸扩增方法的核酸扩增组合物，此组合物包含：
(a)RNA酶H；及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
63.用于权利要求6-9中任意一项所定义的核酸扩增方法的核酸扩增组合物，此组合物包含：
(a)内切核酸酶，及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
64.权利要求63中的组合物，其中的内切核酸酶是内切核糖核酸酶。
65.权利要求64中的组合物，其中的内切核糖核酸酶是RNA酶H。
66.权利要求62或65中的组合物，其中的RNA酶H选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于栖热袍菌属细菌的RNA酶H、来自于栖热菌属细菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H、来自于古生球菌属细菌的RNA酶H、来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H。
67.权利要求62-66中任意一项的组合物，其含有适于核酸扩增反应的缓冲成分。
68.权利要求67中的组合物，其含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分。
69.权利要求62-68中任意一项的组合物，其中选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶被用作具有链置换活性的DNA聚合酶。
70.权利要求62中的组合物，其中具有链置换活性的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且RNA酶H是选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H和来自于古生球菌属细菌的RNA酶H的RNA酶H。
71.权利要求63中的组合物，其中具有链置换活性的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，并且内切核酸酶是选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H和来自于古生球菌属细菌的RNA酶H的RNA酶H。
72.权利要求62-71中任意一项的组合物，其中使用具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
73.权利要求72中的组合物，其中的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，该组合物含有允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质。
74.权利要求73中的组合物，其中允许DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质是锰离子。
75.权利要求62-74中任意一项的组合物，其含有抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质。
76.权利要求75中的组合物，其中抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质为乙膦甲酸。
77.权利要求62-76中任意一项的组合物，其含有脱氧核糖核苷三磷酸类似物。
78.权利要求77中的组合物，其中的脱氧核糖核苷三磷酸类似物为脱氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
79.用于权利要求1-5中任意一项所定义的核酸扩增方法的核酸扩增试剂盒，此试剂盒含有：
(a)RNA酶H；及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
80.用于权利要求6-9中任意一项所定义的核酸扩增方法的核酸扩增试剂盒，此试剂盒含有：
(a)内切核酸酶；及
(b)具有链置换活性的DNA聚合酶。
81.权利要求80中的试剂盒，其中的内切核酸酶是内切核糖核酸酶。
82.权利要求81中的试剂盒，其中的内切核糖核酸酶是RNA酶H。
83.权利要求79或82中的试剂盒，其中的RNA酶H选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于栖热袍菌属细菌的RNA酶H、来自于栖热菌属细菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H、来自于古生球菌属细菌的RNA酶H、来自于芽胞杆菌属细菌的RNA酶H。
84.权利要求79-83中任意一项的试剂盒，其含有适于核酸扩增反应的缓冲成分。
85.权利要求84中的试剂盒，其含有用于核酸扩增的、含有选自N-二[羟乙基]甘氨酸和HEPES的缓冲成分的缓冲液。
86.权利要求79-85中任意一项的试剂盒，其含有退火溶液，此退火溶液含有增强作为模板的核酸退火到与所述核酸的核苷酸序列互补的引物上的物质。
87.权利要求86中的试剂盒，其中的退火溶液含有亚精胺和/或丙二胺。
88.权利要求79-87中任意一项的试剂盒，其中选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶被用作具有链置换活性的DNA聚合酶。
89.权利要求79中的试剂盒，其中具有链置换活性的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且RNA酶H是选自来自于大肠杆菌的RNA醇H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H和来自于古生球菌属细菌的RNA酶H的RNA酶H。
90.权利要求80中的试剂盒，其中具有链置换活性的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，并且内切核酸酶是选自来自于大肠杆菌的RNA酶H、来自于火球菌属细菌的RNA酶H和来自于古生球菌属细菌的RNA酶H的RNA酶H。
91.权利要求89或90中的试剂盒，其中RNA酶H是来自于大肠杆菌的I型RNA酶H或来自于火球菌属细菌或古生球菌属细菌的II型RNA酶H。
92.权利要求79或91中的试剂盒，其中使用具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
93.权利要求92中的试剂盒，其中的DNA聚合酶是来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，该试剂盒含有允许Bca DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质。
94.权利要求93中的试剂盒，其中允许DNA聚合酶的内切核酸酶活性表达的物质是锰离子。
95.权利要求79-94中任意一项的试剂盒，其含有抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质。
96.权利要求95中的试剂盒，其中抑制DNA聚合酶的逆转录活性的物质为乙膦甲酸。
97.权利要求79-96中任意一项的试剂盒，其含有脱氧核糖核苷三磷酸类似物。
98.权利要求97中的试剂盒，其中的脱氧核糖核苷三磷酸类似物为脱氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
99.权利要求79的试剂盒，此试剂盒以包装形式存在，并且进一步含有指导具有链置换活性的DNA聚合酶及RNA酶H的使用的说明书。
100.权利要求80的试剂盒，此试剂盒以包装形式存在，并且进一步含有指导具有链置换活性的DNA聚合酶及RNA酶H的使用的说明书。
101.样品中靶核酸的检测方法，此方法包括：
(a)利用权利要求1-39中任意一项所定义的核酸扩增方法进行扩增核酸；及
(b)对步骤(a)中扩增的核酸进行检测。
102.权利要求101中的方法，其包括利用探针对扩增后的核酸进行检测。
103.权利要求102中的方法，其中用于检测的探针是用标记物质进行标记的探针。
104.权利要求103中的方法，其中的探针是用间隔了导致淬灭状态的距离的两种或多种荧光物质标记的RNA探针。
105.核酸扩增方法，其包括利用具有链置换活性的DNA聚合酶来实现模板交换反应。
106.权利要求105中的方法，其中具有链置换活性的DNA聚合酶选自大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、来自于自嗜热脂肪芽胞杆菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及来自于热坚芽孢杆菌的缺乏5’-3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
107.含有固定化核酸的物质的制备方法，此物质中的核酸是排列在预定的区域中，此方法包括：
(a)利用权利要求1-39中任意一项所定义的核酸扩增方法来扩增待固定化的核酸；及
(c)将步骤(a)中扩增得到的核酸排列并固定化在预定的区域中。
108.含有固定化核酸的物质，此物质中的核酸是利用权利要求107定义的方法制备并排列在预定的区域中的。
109.大量制备核酸的方法，此方法包括：
(a)利用权利要求1-39中任意一项所定义的核酸扩增方法扩增核酸；及
(b)收集步骤(a)中扩增得到的核酸。
110.核酸扩增方法，此方法包括：
(a)复制含有待扩增序列的DNA或RNA以制备作为模板的核酸；及
(b)利用权利要求1-39中的任意一项所定义的核酸扩增方法对步骤(a)中获得的作为模板的核酸进行扩增。
111.对核酸的核苷酸序列进行确定的方法，该方法包括按照权利要求1-39、109和110中的任意一项所定义的方法扩增核酸。
112.制备单链核酸的方法，包括利用权利要求1-39中的任意一项所定义的方法来制备单键核酸。
113.权利要求112中的方法，其中使用至少两种不同浓度的引物。
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