CN1491285A

CN1491285A - 致病微生物的检测方法

Info

Publication number: CN1491285A
Application number: CNA018227740A
Authority: CN
Inventors: �ź㴫; 茑田雅光; 日野文嗣; ֮; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Takara Bio Inc
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-12-26
Publication date: 2004-04-21
Also published as: EP1347060A4; WO2002052043A1; EP1347060A1; US20040185455A1; JP4092201B2; TWI311154B; KR20030064420A; JPWO2002052043A1

Abstract

本发明公开了可用于检测致病微生物的寡核苷酸探针和引物；使用所述探针和引物检测致病微生物的方法；以及用于所述方法的试剂盒。

Description

致病微生物的检测方法

技术领域

本发明涉及可用于检测致病微生物的寡核苷酸探针或引物、使用所述探针或引物检测致病微生物的方法、以及用于所述方法的试剂盒。

背景技术

用免疫学方法检测来源于致病微生物的蛋白的方法、以及例如在用核酸扩增反应扩增来源于致病微生物的基因的特定区而检测所述区的方法已知是致病微生物的检测方法。核酸扩增反应包括：聚合酶链式反应(PCR)法(美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,800,159号)；逆转录-PCR(RT-PCR)法，是PCR法和逆转录酶反应的组合(Trends in Biotechnology，10：146-152(1992))；连接酶链式反应(LCR)法(EP 320,308，于1989年6月14日公开)；和基于转录的扩增系统(TAS)法(PCR Protocols，Academic Press Inc.，1990，第245-252页)。

已经开发了可以在等温条件下进行的核酸扩增法。其实例包括：链置换扩增(SDA)法(JP-B 7-114718)；自身支持性序列扩增(NASBA)法(日本专利2650159号)；转录介导扩增(TMA)法；Qβ复制酶(3SR)法；基于核酸序列的扩增(日本专利2710159号)；和各种改进的SDA法(美国专利第5,824,517号、WO 99/09211、WO 95/25180和WO 99/49081)。在美国专利第5,916,777号中描述了一种在等温条件下酶促合成寡核苷酸的方法。此外，环介导的等温扩增(LAMP)法(WO 00/28082)以及等温嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)法(WO 00/56877)也是已知的。

如上所述，在致病微生物检测方法中可以利用各种核酸扩增法。然而，通过选择靶核酸中一个适合于所述核酸扩增反应的区、选择适合于核酸扩增法的引物以及选择适合于在所述核酸扩增法后进行的靶核酸检测法的探针而达到实用的致病微生物检验所需的检测灵敏度一直是困难的。此外，一直需要可以以低操作成本提供可再现结果的致病微生物的检测方法。下文描述了结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)复合体、淋病球菌、衣原体和丙型肝炎病毒(HCV)作为致病微生物的实例。

(a)结核分枝杆菌复合体

结核病是在人类死因中排名靠前的一种疾病。虽然迄今已经开发了各种疗法，但仍有许多患者。

结核病在常规上用培养法或涂片法诊断。由于结核分枝杆菌复合体生长缓慢，所以需要1-8周(通常约1个月)来获得试验结果。因此，常规方法不是快速的。此外，其准确度为70％或更低。因而，该方法并不是一个令人满意的诊断方法。在这种情况下，最近开发了多种用结核分枝杆菌复合体基因作为靶从痰等直接检测的快速而准确的方法和用于所述方法的试剂。结核分枝杆菌复合体包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG、非洲分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)和Mycobacteriumcanetti。

例如，在Lancet，No.8671，第1069页(1989)中描述了一种用从试样如痰中提取的DNA通过PCR法快速检测结核分枝杆菌复合体的方法。在该方法中，用PCR法扩增一种作为靶的编码结核分枝杆菌复合体65kDa抗原的基因，然后通过电泳检测。可供用于检测用化学发光探针通过扩增16S核糖体RNA所获得的扩增产物的试剂盒在市场上可得自Gen-Probe。用于将编码16S核糖体RNA的DNA用作靶的PCR的试剂盒，在市场上也可得自Roche。

结核分枝杆菌复合体特异性的、称为IS 6110的基因的序列已经发表(Nucleic Acids Research，18：188(1990))，据描述该基因可用作用于检测结核分枝杆菌复合体的探针。事实上，使用PCR法检测IS 6110基因的方法已有报道(J.Clin.Microbiol.，28：2668(1990))。此后，许多文献描述了使用IS 6110基因作为靶的PCR法以及该基因的实用性。用除PCR法以外的核酸扩增法如SDA法(日本专利2814422号)或LCR法(JP-A 10-500023)检测IS 6110基因已有描述。

然而，由于用于检测结核分枝杆菌复合体的上述方法对于实际临床试验并不令人满意，所以需要进一步改进。例如，在许多文献中报道了用核糖体RNA基因作为靶的核酸扩增检测法。在这样一种方法中，扩增属于分枝杆菌属细菌中一个共同的部分，然后用种特异性探针鉴定结核分枝杆菌复合体。由于对于结核分枝杆菌复合体的特异性仅取决于按照上述方法的探针序列，因而方法的可靠性包括检测灵敏度不够。此外，已经报道了在依照培养法测定为阳性的许多病例中按照所述方法检测方面的失败情况。已经报道了用结核分枝杆菌复合体特异性的IS 6110基因作为靶以便提高特异性和检测灵敏度的PCR法。然而，在7个部门中对于用IS 6110基因作为靶的试验的比较性研究已经证明，用该方法获得的试验结果在各部门之间有很大变化(假阳性：3-77％；灵敏度：2-90％)(J.Clin.Microbiol.，32：277(1994))。

从试样中提取核酸的方法复杂，并且从试验者感染的危险的角度来看不够安全。

在扩增产物的检测方法中利用杂交。通常使用这样一种方法：首先用强碱在液相中使扩增的双链核酸变性，然后将通过变性产生的单链核酸与探针在中性条件下、在被解链的互补核酸存在下杂交(Amplicor试剂盒所附的说明，得自Roche)。依照此方法，有一个问题，即灵敏度和特异性并未提高，因为从双链核酸解链的互补扩增核酸以竞争方式干扰探针的杂交。换句话说，在该方法中，所扩增的双链DNA通过碱变性被转变为单链，被中和，然后与探针在中性条件下杂交。另一方面，可以进行热变性，而避开碱变性。在这种情况下，精确检查大量试样是不可能的。结果，需要许多步骤，将转变为单链的其中一条DNA链以竞争方式与探针杂交，因而降低了检测靶核酸的灵敏度。

由于结核病是一种传染病，故需要立即诊断和采取措施，例如隔离患者。然而，由于依照常规方法或者使用市售试剂盒从收集试样到报告结果需要约6小时或更长的时间，所以结果的报告以及对患者采取的相应措施并不是在收集试样的当天进行，而是在第二天进行。因此，对公众健康产生的一个严重问题即不能最大限度地降低结核病感染传播仍有待解决。

如上所述的已发表的信息表明，没有可靠且可用于实用医学的处理结核分枝杆菌复合体的方法。

(b)淋病球菌

淋病球菌(或淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))是美国最常报道的细菌感染之一的淋病的病原体。在Miyada和Born，1991，Mol.Cell.Probes，5：327-335；美国专利第5,256,536号；和美国专利第5,525,717号中，描述了用来源于含有与淋病奈瑟氏球菌胞嘧啶DNA甲基转移酶基因(M.Ngo PII)序列显著同源的可读框(ORF1)的基因组片段的DNA探针检测淋病奈瑟氏球菌。然而，已知没有可以用来特异性地检测淋病球菌并且有足够灵敏度的方法。

已经报道了一例也感染沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的感染淋病球菌的患者。

(c)衣原体

“衣原体”是指属于衣原体属(Chlamydia)的微生物。衣原体属的三个物种-沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和肺炎衣原体(C.pneumoniae)在临床上有重要性，因为它们可以感染人类而引起疾病。其中，据报道，在男性和女性中都引起生殖道感染的沙眼衣原体的感染是发达社会最为常见的性感染。因而，需要可以用来特异性地及时检测沙眼衣原体的方法和供所述方法用的试剂。

(d)HCV

传统上，采用逆转录-PCR(RT-PCR)法检测诸如血清的样品中的HCV。该方法包括如下10个步骤：(1)从血清提取HCV的RNA；(2)用所提取的RNA作为模板合成cDNA；(3)通过其中将温度上下调节的PCR法进行扩增；(4)与固定化探针杂交；(5)通过洗涤除去未反应的试剂；(6)与标记试剂反应；(7)通过洗涤除去未反应的试剂；(8)加入显色试剂；(9)加入试剂以终止显色；和(10)测量吸光度。已经检查了通过采用实时检测PCR法的均相检测法对HCV的检测(J.Virol.Methods，Vol.64，第147-159页(1997))。

对于血液制品、或者用于输血的血液或捐献的血液的质量控制、治疗进程的判断、病情的监测或治疗费用的降低而言，高灵敏度、方便、快速并且低成本地对大量试样进行HCV测定是非常重要的。PCR法所需的严格的温度控制，需要复杂而过大的测量装置，而目前最大通量是5小时内最多96个试样。测量大量试样则是不可能的(在血液中心或临床实验室检验中心需要在2小时内测量1000个或更多试样)。

由于常规方法有上述各种问题，因此需要用于在限定的短时间内在大量试样中测量HCV核酸的简便的技术。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种用于高灵敏度、准确、方便、在限定的短时间内低成本地对大量试样测量致病微生物的方法。

发明概述

由于深入的研究，本发明人发现了一种利用优于常规核酸扩增法的核酸扩增法检测致病微生物的方法。此外，本发明人还发现了可供所述方法使用的用于扩增靶核酸的嵌合寡核苷酸引物以及用于检测靶核酸的探针。另外，本发明人构建了可供该方法用的试剂盒。因而完成了本发明。

本发明的第一个方面涉及一种含有SEQ ID NO：39的核苷酸序列或其部分、或者由SEQ ID NO：11的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测结核分枝杆菌复合体即结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和/或Mycobacterium canetti。

本发明的第二个方面涉及一种含有SEQ ID NO：27的核苷酸序列或其部分、或者由SEQ ID NO：21的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测淋病球菌-淋病奈瑟氏球菌。

本发明的第三个方面涉及一种含有SEQ ID NO：22的核苷酸序列或其部分、或者由SEQ ID NO：20的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测衣原体-沙眼衣原体。

本发明的第四个方面涉及一种由SEQ ID NO：34或35的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测HCV。

本发明的第五个方面涉及一种可以在碱性pH下与得自致病微生物的靶核酸杂交的探针。依照第五个方面，优选可以在8-14的碱性pH下与得自致病微生物的靶核酸杂交的探针，并且得自所述致病微生物优选为结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV。所述致病微生物的靶核酸选自来自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因的核苷酸序列、来自淋病球菌的cppB基因的核苷酸序列、来自衣原体的pLGV440的核苷酸序列或者来自HCV的5’非翻译区的核苷酸序列，并且可以优选使用能够与所述基因杂交的探针。这样一种探针的实例如下：含有SEQ ID NO：39的核苷酸序列或其部分的探针，其中所述SEQ ID NO：39的核苷酸序列存在于来自结核分枝杆菌复合体的IS6110基因中，最好是由SEQ ID NO：11的核苷酸序列组成的探针；含有SEQ ID NO：27的核苷酸序列或其部分的探针，其中所述SEQ IDNO：27的核苷酸序列存在于来自淋病球菌的cppB基因中，最好是由SEQ ID NO：21的核苷酸序列组成的探针；含有SEQ ID NO：22的核苷酸序列或其部分的探针，其中所述SEQ ID NO：22的核苷酸序列存在于来自衣原体的pLGV440中，最好是由SEQ ID NO：20的核苷酸序列组成的探针；或含有SEQ ID NO：34或35的核苷酸序列或其部分的探针，其中所述SEQ ID NO：34和35的核苷酸序列存在于来自HCV的5’非翻译区中，最好是由SEQ ID NO：34或35的核苷酸序列组成的探针。

可以对第一个至第五个方面的探针进行标记。所述探针可以是这样一种用于检测致病微生物的探针：为具有来自SEQ ID NO：11、20、21、34或35的核苷酸序列的8-53个连续核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸，所述探针可以被荧光标记，使得荧光强度在探针与靶核酸杂交时不受抑制，而荧光强度在探针不与靶核酸杂交时受到抑制。所述探针可以是这样一种用于检测致病微生物的探针：所述探针由来自SEQID NO：11、20、21、34或35的核苷酸序列的8个或8个以上连续核苷酸的序列组成，或者所述探针可以用罗丹明型荧光染料或者噁嗪型荧光染料在5’端标记，并且所述探针由来自SEQ ID NO：34的核苷酸序列的8个或8个以上连续核苷酸的序列组成。所述探针可以是这样一种用于检测致病微生物的探针：具有一种报道荧光染料和一种作为荧光染料的猝灭染料用于标记，并且由来自SEQ ID NO：11、20、21、34或35的核苷酸序列的8个或8个以上连续核苷酸的序列组成。所述报道染料可以是荧光素型染料，而猝灭染料可以是DABCYL型染料。可以优选使用具有选自荧光物质、染料、酶、生物素、胶体金和放射性同位素的标记的探针。

本发明的第六个方面涉及一种用于检测致病微生物的方法，所述方法包括进行第一个至第五个方面的探针与得自致病微生物的靶核酸的杂交。依照第六个方面，与得自致病微生物的靶核酸的杂交可以在碱性pH下进行。所述致病微生物的实例为结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV。如果所述致病微生物是结核分枝杆菌复合体，则所述靶核酸优选为IS 6110基因或其片段。优选进行第一个或第五个方面的探针与得自结核分枝杆菌复合体的扩增IS 6110基因和/或其片段的杂交。优选用具有SEQ ID NO：36或37的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自结核分枝杆菌复合体的IS6110基因和/或其片段。如果所述致病微生物是淋病球菌，则所述靶核酸优选为cppB基因或其片段。优选进行第二个或第五个方面的探针与得自淋病球菌的扩增cppB基因和/或其片段的杂交。优选用具有SEQID NO：28或29的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自淋病球菌的cppB基因和/或其片段。如果所述致病微生物是衣原体，则所述靶核酸优选为pLGV440或其片段。优选进行第三个或第五个方面的探针与得自衣原体的扩增pLGV440和/或其片段的杂交。优选用具有SEQ ID NO：23-26中的任一核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自衣原体的pLGV440和/或其片段。如果致病微生物是HCV，则所述靶核酸优选为得自HCV的5’非翻译区或其片段。优选进行第四个或第五个方面的探针与得自HCV的扩增的5’非翻译区和/或其片段的杂交。优选用具有SEQ ID NO：30-33中的任一核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自HCV的5’非翻译区和/或其片段。

本发明的第七个方面涉及一种检测致病微生物的方法，所述方法包括用第六个方面的检测得自致病微生物的靶核酸的方法，来检测得自结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV的核酸。

本发明的第八个方面涉及一种检测致病微生物的方法，所述方法包括检测依照包括下述步骤的核酸扩增法扩增的核酸：

(a)通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，制备反应混合物，其中所述引物是一种与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补的嵌合寡核苷酸引物，并且含有核糖核苷酸以及至少一种选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的物质，所述核糖核苷酸位于引物的3’末端或者位于3’端一侧；以及

(b)将反应混合物保温足够的时间，以产生反应产物。依照第八个方面，优选所述反应混合物还包含一种其序列与作为模板的核酸的核苷酸序列基本同源的嵌合寡核苷酸引物。可以优选使用一种以下通式所示的嵌合寡核苷酸引物：

通式：5’-dNa-Nb-dNc-3’(a：11或11以上的整数；b：1或1以上的整数；c：0或者1或1以上的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的某些dN可以被N取代)。

在所述嵌合寡核苷酸引物中，c可以是0，所述核苷酸类似物可以是脱氧核糖肌苷核苷酸或者脱氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述经修饰的核糖核苷酸可以是(α-S)核糖核苷酸。优选使用由SEQ ID NO：13-16、23-26和28-31中的任一核苷酸序列组成的嵌合寡核苷酸引物。所述方法还包括用第一个至第五个方面的探针检测扩增的核酸。

本发明的第九个方面涉及一种以下通式所示的、用于检测致病微生物的嵌合寡核苷酸引物：

依照第九个方面，可以优选使用其中c为0的引物。优选其中所述核苷酸类似物为脱氧核糖肌苷核苷酸或脱氧核糖尿嘧啶核苷酸、而所述经修饰的核糖核苷酸为(α-S)核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物。虽然并不打算限制本发明，但优选例如由SEQ ID NO：13-16、23-26和28-31中的任一序列表示的、用于检测致病微生物的嵌合寡核苷酸引物。

本发明的第十个方面涉及：用于从结核分枝杆菌复合体扩增IS6110基因和/或其片段、具有SEQ ID NO：36或37的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物；用于从淋病球菌扩增cppB基因和/或其片段、具有SEQ ID NO：27的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物；用于从衣原体扩增pLGV440和/或其片段、具有SEQ IDNO：22的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物；和用于从HCV扩增5’非翻译区和/或其片段、具有SEQ ID NO：41-43中的任一核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物。

依照第十个方面，所述引物可以是其中所述核苷酸序列中的一部分被核糖核苷酸取代的嵌合寡核苷酸引物。可以对第九个或第十个方面的引物进行标记。所述标记的实例为荧光物质、染料、酶、生物素或胶体金。

本发明的第十一个方面涉及一种用于检测靶核酸的组合物，所述组合物含有第一个至第五个方面的探针。

本发明的第十二个方面涉及一种用于检测靶核酸的组合物，所述组合物含有第九个或第十个方面的引物。

第十一个或第十二个方面可以用来检测致病微生物。

本发明的第十三个方面涉及一种用于检测致病微生物的组合物，所述组合物用于第六个至第八个方面的检测致病微生物的方法，并且所述组合物含有至少一种用于靶核酸扩增或者杂交的试剂。

依照第十三个方面，可以含有选自具有链置换活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脱氧核糖核苷酸三磷酸的一种试剂。所述DNA聚合酶可以是得自热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，而所述RNA酶H可以是得自属于热球菌属(Pyrococcus)细菌和/或属于古生球菌属(Archaeoglobus)细菌的II型RNA酶H。

本发明的第十四个方面涉及一种用于检测致病微生物的试剂盒，所述试剂盒含有第一个至第五个方面的探针。

依照第十四个方面，可以含有第九个或第十个方面的引物。所述试剂盒可以用来检测结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV。所述试剂盒可以是用于第六个至第八个方面的检测致病微生物的方法、并且含有至少一种用于靶核酸扩增或杂交的试剂的试剂盒。可以含有选自具有链置换活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脱氧核糖核苷酸三磷酸的一种试剂。所述DNA聚合酶优选是得自热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，而所述RNA酶H可以是得自属于热球菌属细菌和/或属于古生球菌属细菌的II型RNA酶H。所述试剂盒可以含有一种用于捕获扩增产物的支持体。可以优选使用其中所述支持体选自微量滴定板、微珠、磁珠、膜和玻璃的试剂盒。

本发明的第十五个方面涉及一种检测结核分枝杆菌复合体的方法，所述方法包括用胞壁质酶处理含结核分枝杆菌复合体的试样，以提取核酸。

附图简述

图1：一幅图，说明HCV-RNA浓度和荧光强度变化之间的关系以及当依照本发明的方法在不同HCV-RNA浓度下进行测量时与常规方法在测量范围方面的差别的比较。

发明详述

此中所用的脱氧核糖核苷酸(也称为dN)是指其糖部分由D-2-脱氧核糖组成的核苷酸。所述脱氧核糖核苷酸包括例如具有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶作为碱基部分的脱氧核糖核苷酸。此外，所述脱氧核糖核苷酸也包括具有经修饰碱基如7-脱氮鸟苷的脱氧核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸类似物如脱氧肌苷核苷酸。

此中所用的核糖核苷酸(也称为N)是指其糖部分由D-核糖组成的核苷酸。所述核糖核苷酸包括具有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶作为碱基部分的核糖核苷酸。所述核糖核苷酸也包括经修饰的核糖核苷酸如其中α位磷酸基团的氧原子被硫原子取代的经修饰的核糖核苷酸(也称为(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)或其它衍生物。

此中所用的嵌合寡核苷酸引物是指含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的引物。所述引物可以含有核苷酸类似物和/或经修饰的核糖核苷酸。

本发明中所使用的嵌合寡核苷酸引物包括具有位于引物的3’末端或3’端一侧的核糖核苷酸的任何嵌合寡核苷酸引物，所述嵌合寡核苷酸引物可以在本发明的方法中用来延伸核酸链，可以用内切核酸酶切割，并且可以用来进行链置换反应。

此中所用的3’端一侧是指从诸如引物的核酸中心至3’末端的部分。同样，5’端一侧是指从核酸中心至5’端的部分。

此中所用的内切核酸酶可以是作用于通过从已退火到作为模板的核酸上的所述嵌合寡核苷酸引物延伸DNA所产生的双链DNA、并且在所述引物中含有核糖核苷酸的部分特异性切割所述核酸的任何内切核酸酶。

此中所用的DNA聚合酶是指用DNA链作为模板从头合成DNA链的酶。所述DNA聚合酶包括天然存在的DNA聚合酶和具有上述活性的变异型酶。例如，这样的酶包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和也具有逆转录酶活性或内切核酸酶活性的DNA聚合酶。

此中所用的“链置换活性”是指可以实现链置换的活性，也就是说它可以基于作为模板的核酸的序列继续进行DNA复制、同时置换所述DNA链而释放已经退火到模板链上的互补链。另外，由于链置换而从作为模板的核酸释放的DNA链在此被称为“置换链”。

此中所用的碱性pH是指高于7的pH。

此中所用的致病微生物是指致病细菌或病毒。

此中所用的靶核酸是指得自致病微生物的基因中经受核酸扩增或检测的任何区，所述靶核酸可以是DNA或是RNA。

在下文将详细描述本发明。

(1)本发明的探针

本发明探针的特征在于，它可以用来检测致病微生物，例如结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV。在碱性pH下可以与靶核酸稳定杂交的探针是本发明探针的一个优选实施方案的例子。虽然并不打算限制本发明，但是例如可以在碱性条件下、例如在高于7.0的碱性pH、优选在pH8-14范围内、更优选在pH8-10范围内可以与具有所述探针的核苷酸序列互补序列的靶核酸杂交的探针，是依照本发明的可以在碱性pH下杂交的探针的例子。虽然并不打算限制本发明，但其实例包括含有SEQ ID NO：11、20、21、34或35的核苷酸序列的探针。本发明的探针可以用来在中性pH的常规条件下杂交。

使用本发明的探针，可以在一个杂交步骤中使用通过碱性处理而变性为单链的双链核酸，而无需中和。结果，与常规方法相比，所述方法被简化，灵敏度被提高10倍或10倍以上。此外，在碱性pH下杂交，可以提高杂交特异性。

对于检测与得自试样的核酸杂交的探针的方法并无具体限制。任何已知的检测方法都可以用于本发明。

使用以合适方法标记的本发明探针，可以有效地和/或高灵敏度地检测样品中的靶核酸。

对于标记探针的方法并无具体限制。例如，可以使用放射性同位素(³²P等)、染料、荧光物质、发光物质、各种配体(生物素、洋地黄毒苷等)、酶等。标记探针的存在可以用适用于该标记的检测方法加以证实。就不能直接检测的配体而论，可以结合使用具有可检测标记并且能够与所述配体结合的物质。例如，通过联合使用配体标记的探针和酶标记的抗配体抗体扩增信号，可以高灵敏度地检测靶核酸。

所述探针可以具有标记物质以供检测。例如，配体或受体物质、放射性同位素、荧光物质、发光物质或显色物质可以优选用作标记物质，但并不限于此。

依照本发明的方法，可以优选使用所谓均相检测法。在所述均相检测法中，将具有标记物质的探针与通过扩增目标区所获得的核酸杂交，然后在洗涤游离探针之后进行检测。或者，可以省去洗涤步骤。例如，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.85，第8790-8794页(1996)中描述的荧光共振能量转移(FRET)法、Nature Biotechnology vol.14，第303-308页(1996)中描述的分子信标法、Anal.Chem.，vol.72，第3717-3724页(2000)中描述的巧妙探针法(smart probe method)等可以优选用作利用荧光的均相检测法。

其中探针在5’端用罗丹明型染料或噁嗪型染料标记、而在3’端用具有引起猝灭的核苷酸序列的寡核苷酸或报道染料标记、并且探针的5’端一侧和3’端一侧自我退火的分子信标(molecular beacons)法或巧妙探针法，是本发明一个实施方案的例子。

如果在用本发明的扩增法扩增的核酸存在下使用这样一种探针，则所述探针与扩增的核酸杂交，去除了所述探针的自我退火结构，导致荧光信号发射，不抑制荧光强度。另一方面，如果缺乏扩增的核酸，则因为所述探针保留自我退火结构，荧光强度被抑制，所以检测不到荧光信号。

具体地说，就巧妙探针法而论，所述荧光染料优选为罗丹明型染料或噁嗪型染料。所述染料可以是连接于探针5’端以便与3’端核苷酸序列合作的任一种染料。由于所述合作，如果荧光探针不与靶核酸结合，则荧光强度受抑制，而如果荧光探针与靶核酸结合，则荧光强度不受抑制。

就分子信标法而论，可以使用其中当荧光探针不与靶核酸结合时由于荧光共振能量转移导致荧光强度受抑制，而结合时荧光强度不受抑制的组合。

优选使用FAM(6-羧基-荧光素)、TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明)、JA242(噁嗪)或DABCYL(4-二甲氨基偶氮苯-4’-磺酰氯)作为所述荧光染料。这样一种荧光染料是本领域已知的，并且是市售的。

例如，Nuc.Acids Res.，vol.12，第3387-3403页(1984)，J.Am.Chem.Soc.，vol.112，第1253-1254页(1990)或Anal.Chem.，vol.70，第4771-4779页(1998)中描述的方法可以用作将寡核苷酸荧光标记的方法。

对于本发明探针的长度并不具体限制。长度可以例如为12聚体或12聚体以上，优选20聚体或20聚体以上，更优选为40聚体或40聚体以上。

本发明的用于检测结核分枝杆菌复合体的探针可以用来检测结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和/或Mycobacterium canetti。所述探针的靶核酸根据待检测的核酸或生物而适当地选择。虽然并不打算限制本发明，但是例如以IS 6110基因作为靶核酸的探针可以用来检测结核分枝杆菌复合体。通过从由SEQ IDNO：12表示的得自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因的核苷酸序列中选择合适的区，可以设计这样一种探针。虽然并不打算限制本发明，但是可以例如从含有SEQ ID NO：39的核苷酸序列的区、优选从含有SEQ ID NO：40的核苷酸序列的区、更优选从含有SEQ ID NO：38的核苷酸序列的区中，选择所述序列。特别是，可以从含有SEQ ID NO：11的核苷酸序列的区中选择所述序列。由于这样一种探针与得自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因或其片段高特异性地稳定杂交，所以它对于所述基因的检测和结核分枝杆菌复合体的检测特别有用。

本发明的检测淋病球菌的探针可以用来检测淋病奈瑟氏球菌。可以根据待检测的核酸或生物，适当地选择所述探针的靶核酸。虽然并不打算限制本发明，但是可以例如使用以隐蔽性质粒蛋白B(cppB)基因作为靶核酸的探针来检测淋病球菌。通过从由SEQ ID NO：27表示的得自淋病球菌的cppB基因的核苷酸序列中选择合适的区，可以设计这样一种探针。虽然并不打算限制本发明，但是可以例如从含有SEQ IDNO：27的核苷酸序列的区、优选从含有SEQ ID NO：21的核苷酸序列的区中选择所述序列。由于这样一种探针与得自淋病球菌的cppB基因或其片段高特异性地稳定杂交，所以它对于所述基因的检测和淋病球菌的检测特别有用。

本发明的用于检测衣原体的探针可以用来检测沙眼衣原体。根据待检测的核酸或生物，适当地选择所述探针的靶核酸。虽然并不打算限制本发明，但是例如可以以隐蔽性质粒pLGV440作为靶核酸的探针可以用来检测衣原体。通过从由SEQ ID NO：22表示的得自衣原体的pLGV440的核苷酸序列选择合适的区，可以设计这样一种探针。虽然并不打算限制本发明，但是可以例如从含有SEQ ID NO：22的核苷酸序列的区、优选从含有SEQ ID NO：44的核苷酸序列的区、更优选从含有SEQ ID NO：20的核苷酸序列的区选择所述序列。由于这样一种探针与得自衣原体的pLGV440或其片段高特异性地稳定杂交，所以它对于所述基因的检测和衣原体的检测特别有用。

对于本发明的用于检测HCV的探针并无具体限制，只要它是可以与以扩增靶核酸所用的正向引物和反向引物为界的区的核苷酸序列杂交。虽然并不打算限制本发明，但是可以优选在8个碱基至53个碱基的范围内、更优选在8个碱基至36个碱基的范围内选择所述探针的长度。例如，可以从SEQ ID NO：43的核苷酸序列选择具有上述范围内的8个或8个以上连续核苷酸的核苷酸序列的探针。虽然并不打算限制本发明，但是具有从SEQ ID NO：34或35的核苷酸序列选择的8个或8个以上连续核苷酸的核苷酸序列的探针，是这样一种探针的例子。

(2)本发明的检测方法

依照本发明的检测靶核酸的方法，用上述(1)中所述的探针，可以省去在使双链靶核酸变性为单链的步骤之后的中和步骤。换句话说，依照本发明的检测靶核酸的方法，与具有与探针的核苷酸序列互补序列的核酸的杂交，可以在pH高于7、优选在pH8-14范围内的pH的碱性条件下进行。所述杂交条件包括但不限于本领域技术人员称为“严格性条件”的条件。在T.Maniatis等(编著)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2^nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中描述的那些条件或在此中的实施例中描述的那些条件可以用作这样的条件。

杂交溶液的典型组成的实例包括以下组成：含有0.5％SDS、5×Denhardt氏溶液(0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400)和100μg/ml鲑精DNA的6×SSC(1×SSC：0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)。杂交溶液的pH可以依照本发明调节至8-14。

虽然并不打算限制本发明，但是杂交可以在例如低于所述探针Tm值5℃或5℃以上的温度下进行。

探针的Tm值可以例如按照以下等式确定：

Tm＝81.5-16.6(log₁₀[Na]⁺)+0.41(％G+C)-(600/N)其中N是探针的链长；％G+C是探针中鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含量。

如果探针的链长短于18个碱基，则Tm值可以按照以下公式估计：

Tm＝[(％A+T)×2+(％G+C)×4]其中(％A+T)是探针中腺嘌呤和胸腺嘧啶残基的含量；(％G+C)是探针中鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含量。

通过证实探针与靶核酸在上述杂交条件杂交，可以选择出适合于检测靶核酸的探针。

对于依照本发明的检测法的杂交条件并无具体限制。使用已知的杂交条件，优选严格性杂交条件。杂交溶液的pH可以在8-14范围内调节。

在作为本发明的检测靶核酸的方法的示例性实施方案的一个检测结核分枝杆菌复合体的方法中，可以优选使用适合于检测得自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因的探针。虽然并不打算限制本发明，但是依照本发明，可以优选使用含有例如SEQ ID NO：39的核苷酸序列或其部分、优选SEQ ID NO：40的核苷酸序列或其部分、更优选SEQ IDNO：38的核苷酸序列或其部分、最优选SEQ ID NO：11的核苷酸序列的探针。在一个检测淋病球菌的方法中，可以优选使用例如适合于检测得自淋病球菌的cppB基因的探针。虽然并不打算限制本发明，但是依照本发明，可以优选使用含有例如SEQ ID NO：27的核苷酸序列或其部分、优选SEQ ID NO：21的核苷酸序列或其部分的探针。在一个检测衣原体的方法中，可以优选使用适合于检测得自衣原体的pLGV440的探针。虽然并不打算限制本发明，但是依照本发明，可以优选使用含有例如SEQ ID NO：22的核苷酸序列或其部分、优选SEQ ID NO：44的核苷酸序列或其部分、更优选SEQ ID NO：20的核苷酸序列或其部分的探针。在一个检测HCV的方法中，虽然并不打算限制本发明，但优选5’非翻译区。依照本发明，可以优选使用含有例如SEQ ID NO：43的核苷酸序列或其部分、优选SEQ ID NO：34的核苷酸序列或其部分、或者SEQ ID NO：35的核苷酸序列或其部分的探针。

依照本发明的检测致病微生物的方法，使用上述(1)中所述的探针，可以特异性地检测相应的致病微生物。由于所述探针与得自每种致病微生物的基因或其片段高特异性地稳定杂交，所以它对于所述基因的检测和每种致病微生物的检测特别有用。

使用上述(1)中所述的探针，依照本发明的检测法，可以在pH高于7、优选pH8-14、更优选pH8-10的碱性条件下，进行所述探针和含核酸的样品之间的杂交。因此，所述方法提供了一种检测得自致病微生物的基因或其片段的方法，所述方法不包括在使靶核酸变性的步骤之后的中和步骤。依照该方法，可以检测在试样中含有的结核分枝杆菌复合体等。

本发明的所述方法可以用来检测或定量测定样品中的特定基因。换句话说，可以从可能含有核酸(DNA或RNA)的任何样品中检测或定量测定特定的基因。可以从中检测或定量测定特定基因的样品的实例包括但不限于：得自生物体的样品，如全血、血清、血沉棕黄层、尿液、粪、脑脊髓液、精液、唾液、组织(例如癌组织或淋巴结)和细胞培养物(例如哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物)、怀疑污染或感染微生物(如病毒或细菌)的样品(例如食品或生物制剂)、和可能含有生物体的样品如土壤和废水。此外，所述方法可以用来例如基于靶核酸的存在检测致病微生物的存在或定量测定致病微生物。特别是，所述检测致病微生物的方法可用于卫生或环境领域。可以优选用RNA或DNA作为供上述检测方法用的待用作模板的核酸。

通过使用例如用去垢剂、超声处理、振荡/用玻璃珠搅拌或弗氏压碎器来裂解，可以从上述材料中制备含核酸的制备物，但并不限于此。在某些情况下，最好进一步加工所述制备物，以纯化核酸(例如在存在内源核酸酶的情况下)。在某些情况下，采用已知方法，例如酚抽提、层析、离子交换、凝胶电泳或密度梯度离心，来纯化核酸。

当使用具有来源于RNA的序列的核酸作为靶时，可以用通过用RNA作为模板的逆转录反应所合成的cDNA作为模板，进行本发明的所述方法。

在所用的反应条件下退火到作为模板的RNA上的任何引物，都可以用于逆转录反应中。所述引物可以是具有与作为模板的特定RNA互补的核苷酸序列的引物(特异性引物)、寡聚dT(脱氧胸腺嘧啶)引物和具有随机序列的引物(随机引物)。从特异性退火的观点来看，用于逆转录的引物的长度优选为6个或6个以上的核苷酸、更优选9个或9个以上的核苷酸。从寡核苷酸合成的观点来看，长度优选为100个或更少的核苷酸，更优选30个或更少的核苷酸。嵌合寡核苷酸引物可以用作逆转录的引物。所述嵌合寡核苷酸引物也可以在使用逆转录之后获得的cDNA作为模板的本发明的扩增核酸的方法中，用作链置换反应的引物。这样一种引物可以是具有以下(3)中所述特性并且可以用于从RNA进行的逆转录反应中的任一种引物。例如，可以优选使用具有SEQ ID NO：32或33的核苷酸序列的引物。

具有用RNA作为模板合成cDNA的活性的任何酶，都可以用于逆转录反应中。其实例包括来源于各种来源的逆转录酶，例如禽类成髓细胞瘤病毒源逆转录酶(AMV RTase)、莫洛尼鼠类白血病病毒源逆转录酶(MMLV RTase)和劳斯相关病毒2逆转录酶(RAV-2 RTase)。另外，可以使用也具有逆转录活性的DNA聚合酶。对于本发明，优选在高温下具有逆转录活性的酶，例如得自栖热菌属(Thermus)细菌的DNA聚合酶(例如Tth DNA聚合酶)和得自芽孢杆菌属(Bacillus)的嗜热菌的DNA聚合酶。虽然并不打算限制本发明，但是例如优选得自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶，例如得自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.st)的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)和BcaDNA聚合酶。例如，BcaDNA聚合酶并不需要锰离子来进行逆转录反应。此外，它可以合成cDNA，而同时抑制作为模板的RNA在高温条件下形成二级结构。具有逆转录酶活性的天然存在的酶和所述酶的变异体都可以使用，只要它们具有所述活性。

双链DNA(例如上述分离的基因组DNA或PCR片段)和单链DNA(例如通过逆转录反应从总RNA或mRNA制备的cDNA)都可以优选用作本发明所用核酸扩增法中的模板DNA。优选双链DNA在使其变性为单链DNA后使用。

如上所述，靶核酸上与本发明探针杂交的区，在用合适的核酸扩增法扩增后，可以用于杂交。对于待使用的核酸扩增法并无具体限制，只要它可以用来扩增靶核酸上的一个区。例如，可以使用的核酸扩增法包括：聚合酶链式反应(PCR)法(美国专利第4,683,195、4,683,202和4,800,159号)；连接酶链式反应(LCR)；链置换扩增(SDA)法(JP-B 7-114718)；自身支持性序列扩增(3SR)法；基于核酸序列的扩增(NASBA)法(日本专利2650159号)；转录介导扩增(TMA)法；Qβ复制酶法(日本专利2710159号)；和等温嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)(WO00/56877)。

ICAN法是这样一种方法，其中在等温条件下，用嵌合寡核苷酸引物、内切核酸酶和具有链置换活性的DNA聚合酶，连续扩增具有模板核酸上特定核苷酸序列的DNA。

“连续”是指反应在不改变反应温度或反应混合物的组成的条件下进行。此中所用的“等温”是指每个步骤中酶和核酸链作用的温度基本恒定的条件。

通常，由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸组成、并且所述核糖核苷酸位于3’端或3’端一侧的引物，可以用作嵌合寡核苷酸引物。例如，一种具有以下通式所示结构的寡核苷酸可以用作ICAN法的引物：

例如，脱氧核糖肌苷核苷酸可以用作核苷酸类似物，而(α-S)核糖核苷酸可以用作经修饰的核糖核苷酸。可以含有所述核苷酸类似物，只要所述掺入基本上不消除作为引物的功能。

基于模板上需要扩增的区的5’和3’核苷酸序列，制备两种引物(一种具有与5’核苷酸序列同源的序列，而另一种具有与3’核苷酸序列互补的序列)，并将其用于扩增。

在本发明中，可以使用可以作用于通过从已退火到作为模板的核酸上的上述嵌合寡核苷酸引物延伸DNA而产生的双链DNA、并且切割延伸的链以实现链置换反应的任何内切核酸酶。也就是说，所述内切核酸酶是可以在双链DNA的所述嵌合寡核苷酸引物部分产生缺口的酶。可以用于本发明的内切核酸酶的实例包括但不限于核糖核酸酶。特别是，可以优选使用作用于由DNA和RNA组成的双链核酸的RNA部分的内切核糖核酸酶H(RNA酶H)。在本发明中，可以优选使用具有上述活性的任何核糖核酸酶，包括嗜常温酶和耐热性酶。例如，在以下实施例中所述的本发明方法中，得自大肠杆菌的RNA酶H可以用于约50℃至约70℃的反应中。在本发明的方法中，也可以优选使用耐热性核糖核酸酶。可以优选使用的耐热性核糖核酸酶的实例包括但不限于：市售的核糖核酸酶Hybridase^TM Thermostable RNase H(Epicenter Technologies)、以及得自芽孢杆菌属嗜热菌、栖热菌属细菌、热球菌属细菌、栖热袍菌属(Thermotoga)、古生球菌属细菌、甲烷球菌属(Methanococcus)细菌等的RNA酶H。此外，可以优选使用天然存在的核糖核酸酶和变异体。此中所示的RNA酶H的酶单位是依照参比实施例中所述的测量酶单位的方法表示的数值。

所述RNA酶H并不限于特定的RNA酶H，只要它可以用于本发明的方法。例如，所述RNA酶H可以来源于各种病毒、噬菌体、原核生物或真核生物。它可以或者是细胞RNA酶H或者是病毒RNA酶H。所述细胞RNA酶H的实例为大肠杆菌RNA酶HI，而病毒RNA酶H的实例为得自HIV-1的RNA酶H。在本发明的方法中可以使用I型、II型或III型RNA酶H。例如，可以优选使用但不限于得自大肠杆菌的RNA酶HI或者得自热球菌属细菌或古生球菌属细菌的RNA酶HII。

使用在本发明方法中所用的内切核酸酶如RNA酶H进行切割反应的效率，可能随引物3’端周围的核苷酸序列而变，并且可能影响所需DNA的扩增效率。因此，设计对于所用的RNA酶H最适的引物是很自然的。

在ICAN法中，使用对DNA具有链置换活性的DNA聚合酶。特别是，可以优选使用基本上无5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。

在ICAN法可以使用具有所述链置换活性的任何DNA聚合酶，但不限于此。其实例包括得自芽孢杆菌属嗜热菌如热坚芽孢杆菌(下文称为B.ca)和嗜热脂肪芽孢杆菌(下文称为B.st)的缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的变异体、以及得自大肠杆菌的DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)。嗜常温和耐热性DNA聚合酶都可以优选用于本发明。所述酶可以或者是从其原始来源纯化的酶、或者是用基因工程技术产生的重组蛋白。所述酶可以经过修饰，例如通过使用基因工程技术或其它方法取代、缺失、添加或插入。这类酶的实例包括BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)，它是缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。这种酶在50℃至70℃表现出其活性，可以优选用于所述方法。

已知某些DNA聚合酶在特定条件下具有内切核酸酶活性，如RNA酶H活性。这样的DNA聚合酶可以用于本发明的方法中。一方面，可以在允许RNA酶H活性表达的条件下，例如在Mn²⁺存在下，使用所述DNA聚合酶。在这种情况下，可以无需加入RNA酶H，而进行本发明的方法。其中Bca DNA聚合酶可以在含Mn²⁺的缓冲液中表现出RNA酶活性的方面并不限于使用Bca DNA聚合酶。已知具有RNA酶H活性的DNA聚合酶，例如得自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的Tth DNA聚合酶，可以用于本发明中。

通过将嵌合寡核苷酸引物、含作为模板的核酸的样品、内切核酸酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)等在具有所述酶可在其中表现出其活性的组成的缓冲液中混合，然后在合适的温度下将反应混合物保温达足以产生反应产物的时间，进行ICAN法。

在所述反应之前，可以将嵌合寡核苷酸引物和作为模板的核酸混合，在使双链核酸变性的温度(例如90℃或更高)下保温，然后冷却至本发明方法所用的反应温度或所述温度以下进行退火，虽然这样的步骤对于扩增反应并非必不可少的。

如果用RNA作为本发明检测方法中的模板，则可以用一个步骤进行逆转录反应和核酸扩增反应。虽然并不打算限制本发明，但是例如可以优选使用AMV RTase、MMLV RTase或RAV-2 RTase与BcaDNA聚合酶的组合，作为逆转录酶和链置换型DNA聚合酶的组合。或者，可以使用一种具有逆转录酶活性和链置换活性的DNA聚合酶。

本发明的检测靶核酸的方法可以通过从含靶核酸的样品中直接扩增靶核酸来进行。在这种情况下，待扩增的靶核酸的链长并不限于特定长度。例如，200bp或更短的区、优选150bp或更短的区对于靶核酸的灵敏检测是有效的。通过设计本发明的嵌合寡核苷酸引物以产生上述待扩增的链长，可以高灵敏度地检测样品中的靶核酸。

另外，使用含有Bicine、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris作为缓冲组分的反应缓冲液以及含有亚精胺或丙二胺的退火溶液，用本发明的检测方法，甚至从微量核酸样品中也可以以较高的灵敏度检测靶核酸。在这种情况下，所使用的内切核酸酶和DNA聚合酶并不限于具体的内切核酸酶和DNA聚合酶。例如，优选得自大肠杆菌、热球菌属细菌或古生球菌属细菌的RNA酶H和BcaBEST DNA聚合酶的组合。认为内切核酸酶和DNA聚合酶的优选单位可以随所述酶的类型而变。在这样一种情况下，所述缓冲液的组成和所述酶的加入量可以用检测灵敏度或者扩增产物量的增加作为指标来加以调节。

在其中使用双链DNA作为模板和使用两种嵌合寡核苷酸引物的核酸扩增法的该方面，在从所述引物产生由合成的相互退火的引物-延伸链组成的双链核酸的延伸反应期间，可以在模板-延伸链中间体中发生模板转换，虽然模板转换取决于反应条件等。所述双链核酸在两个末端均具有嵌合寡核苷酸引物。然后，可以再从两端起始包括链置换的延伸互补链的反应。作为所述反应的结果，产生在一端具有引物序列的扩增产物。此外，如果模板转换发生在所述反应期间，则又产生与上述相似的双链核酸。

可以依照本发明利用一种扩增核酸的方法，所述方法包括用上述具有链置换活性的DNA聚合酶进行模板转换反应。

例如，缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶的变异型酶，优选具体用作能够在链置换反应期间实现模板转换反应的DNA聚合酶。这样一种酶在市场上可作为BcaBEST DNA聚合酶(TakaraShuzo)获得。它也可以依照日本专利2978001号中所述的方法，从含有所述酶的基因的大肠杆菌HB101/pUI205(FERM BP-3720)制备。大肠杆菌HB101/pUI205(FERM BP-3720)从1991年5月10日(原始保藏日)起保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)。

在本发明的检测法中，可以在靶核酸扩增期间将dUTP作为底物掺入。因此，如果用dUTP作为底物，则有可能通过用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解扩增产物，而防止由于扩增产物的夹带物污染所致的假阳性。

依照本发明的检测法，可以用已知的核酸检测方法来检测用上述核酸扩增法扩增的靶核酸。这类方法的实例包括通过电泳检测具有特定大小的反应产物、以及通过与探针杂交的检测。此外，可以优选使用其中结合使用磁珠等的检测方法。在经电泳检测中，通常使用荧光物质，例如溴化乙锭。与探针的杂交可以与通过电泳检测相结合。所述探针可以用放射性同位素或非放射性物质如生物素或荧光物质来标记。另外，在步骤(b)中使用标记核苷酸，可以有助于检测掺入了标记核苷酸的扩增产物，或者可以增强供利用所述标记检测用的信号。也可以用荧光偏振法、荧光能量转移等来进行检测。通过构建合适的检测系统，可以自动检测或定量测定靶核酸。另外，可以优选使用通过混合式层析法(hybrid chromatography method)的肉眼检测。

在本发明的检测方法中，可以使用核糖核苷酸(RNA)探针或由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成的嵌合寡核苷酸探针，所述探针用以导致猝灭状态的距离定位的两种或更多种荧光物质标记。所述探针不发射荧光。当它退火到从与所述探针互补的靶核酸扩增的DNA上时，RNA酶H则消化所述探针。所述探针上荧光物质之间的距离则增加，导致发射荧光。因此，所述发射显示出存在靶核酸。如果在本发明的扩增核酸的方法中使用RNA酶H，则仅通过加入所述探针至反应混合物中，就可以检测靶核酸。例如，可以优选使用荧光物质6-羧基荧光素(6-FAM)和N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)的组合，来标记所述探针。

用于本发明检测方法的等温扩增法并不需要使用诸如热循环仪之类的设备。在本发明的扩增法中所使用的引物数可以是一种或两种，这低于常规方法中所用的引物数。由于PCR所使用的诸如dNTP等之类的试剂可以应用于本发明的所述方法中，所以与常规方法相比，操作费用可以降低。因此，本发明的所述方法可以优选用于例如常规进行检测的遗传检验领域。本发明的所述方法在比PCR更短的时间内提供更大量的扩增产物。因而，本发明的方法可以用作便捷、快速和灵敏的检测基因的方法。

当使用本发明的检测方法时，可以结合使用使得反应系统小且提高集成程度的装置，以便分析大量的试样。其中通过应用最近的超精细加工技术将本发明检测方法的基本过程(例如从细胞提取DNA、核酸扩增反应、目标DNA的检测等)集成到几平方厘米至指尖大小的微芯片上的系统可以结合使用作为这样的装置。此外，可以任选地结合包括凝胶电泳或毛细管电泳的过程或者与检测探针的杂交。这样一种系统被称为微芯片-CE(毛细管电泳)微芯片或纳米芯片。

任何核酸扩增反应都可以用于所述系统，只要目标DNA片段使用所述方法来扩增。虽然并不打算限制本发明，但是例如可以优选使用可以用来在等温条件下扩增核酸的方法，例如ICAN法。由于联合使用这样一种方法可以简化所述系统，因而所述方法非常适用于如上所述的集成系统。利用本发明的技术，可以构建更高度集成的系统。

虽然并不打算限制本发明，但是例如可以依照本发明的检测方法优选使用以下嵌合寡核苷酸引物：用于检测结核分枝杆菌复合体、具有SEQ ID NO：13-16中任一个所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物；用于检测淋病球菌、具有SEQ ID NO：28或29所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物；用于检测衣原体、具有SEQ ID NO：23-26中任一个所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物；或用于检测HCV、具有SEQ ID NO：30或31所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。目标扩增产物可以通过用这样一种嵌合寡核苷酸引物扩增样品中的靶核酸、然后电泳或实时检测来证实。

此外，靶核酸可以用以下探针，依照本发明的检测方法来检测：用于检测结核分枝杆菌复合体、从含有SEQ ID NO：11、12和38-40中任一个所示的核苷酸序列的区中选择的探针；用于检测淋病球菌、从含有SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列的区中选择的探针；用于检测衣原体、从含有SEQ ID NO：22或44所示的核苷酸序列的区中选择的探针；或用于检测HCV、从含有SEQ ID NO：43-45中任一个所示的核苷酸序列的区中选择的探针。

如果在本发明的所述方法中使用等温核酸扩增法，则仅需要一个恒温水浴作为反应设备，并且无需诸如热循环仪之类的精密设备。可以用市售的分光光度计、荧光检测器、平板读出仪等作为用于测量荧光信号的设备。因此，有可能对大量试样快速进行测量，而取代常规的检验工作。本发明的所述方法所必需的试剂也是市售的。

用本发明的所述方法如下检测HCV：制备一种含有以下成分的混合物：依照常规方法从试样中提取的HCV RNA、逆转录反应的引物、逆转录酶(如果使用具有逆转录活性的DNA聚合酶，则不需要逆转录酶)和dNTP(包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP)；用从所述HCV RNA产生的cDNA作为模板，使用所述嵌合寡核苷酸引物和用于ICAN的DNA聚合酶，在恒温下扩增靶核酸；在均相系统中进行扩增产物与荧光标记探针的杂交；并且测量荧光强度。在以下实施例中详细描述所述反应的具体条件。

在所述反应中，首先从作为模板的HCV-RNA合成cDNA，然后用所述cDNA作为模板，用ICAN法进行DNA扩增。由于所扩增的DNA含有与荧光探针互补的一个区，因此荧光探针与所述单链扩增DNA杂交。荧光探针的杂交，消除了对荧光强度的抑制，导致荧光强度增加。另一方面，如果样品不含HCV RNA，则不发生杂交，那么荧光强度仍受抑制，荧光强度弱。因此，通过测量荧光强度，可以便捷、快速而高特异性地检测样品中的HCV RNA。

依照本发明的所述方法，基于均相系统中的荧光强度，检测HCVRNA，而无需洗涤步骤。本发明的优势在于：它可以通过改变荧光染料和测量波长而处理多个项目的同时测量。具体地说，除HCV之外，HBV、HIV和HTLV也是血液中心的重要检测项目。采用ICAN引物和相应项目特异性的探针，并且用具有不同测量波长的荧光染料标记所述探针，可以同时对所述项目进行测量。反应终点时荧光强度的测量，使得能够灵敏且定量测量大量的试样，例如在血液中心。另一方面，反应的动态荧光测量使得能够定量测定以便监测治疗。因此，本发明的所述方法非常便捷，因为它不需要复杂而专门的设备来进行常规RT-PCR法所需的上下调节温度，它改进了大量试样不能在有限时间和装备下测量的不便之处，并且不需要洗涤步骤。

(3)本发明的引物

嵌合寡核苷酸引物是本发明检测方法所用的引物的例子。使用由脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或者未经修饰或经修饰的核糖核苷酸组成并且所述核糖核苷酸定位于引物3’端或3’端一侧的引物作为所述引物。例如，可以用具有以下通式所示结构的寡核苷酸作为ICAN法的引物：

例如，脱氧核糖核肌核苷酸、脱氧核糖尿嘧啶核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸等可以用作核苷酸类似物，而(α-S)核糖核苷酸可以用作经修饰的核糖核苷酸。

例如，通过依照上述方法，用待检测结核分枝杆菌复合体样品进行核酸扩增反应，然后进行扩增产物和本发明探针之间的杂交，可以依照本发明检测结核分枝杆菌复合体。可以参考得自结核分枝杆菌复合体的如SEQ ID NO：12所示的IS 6110基因的核苷酸序列，设计和制备核酸扩增的引物，使得它适用于各种核酸扩增法。虽然并不打算限制本发明，但是可以用来扩增IS 6110基因以下区的引物优选用于本发明：例如含有SEQ ID NO：39的核苷酸序列或其部分的区；优选含有SEQ ID NO：40的核苷酸序列或其部分的区；更优选含有SEQ ID NO：38的核苷酸序列或其部分的区。另外，优选可以用来扩增含SEQ IDNO：11的核苷酸序列的区的引物。

此外，通过用GenBank基因数据库分析先前所报道的结核分枝杆菌复合体IS 6110的核苷酸序列的多态性，并且进行搜索，包括搜索与结核分枝杆菌复合体IS 6110同源的相关序列，可以采用所获得的本发明的引物，优选使用具有SEQ ID NO：36或37的核苷酸序列的核酸扩增引物，进行高灵敏度的定量核酸扩增。这样一种引物可用于采用各种核酸扩增法扩增得自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因或其片段。

与如上所述的结核分枝杆菌复合体的检测一样，可以适当地使用探针和嵌合寡核苷酸引物，依照本发明来检测淋病球菌、衣原体或HCV。

所述引物不限于具有上述核苷酸序列的引物。按照本发明，可以优选使用具有所述核苷酸序列周围的序列(即与所述序列部分重叠的序列)的引物。通过根据所用的核酸扩增法的特征，适当地选择与所述序列重叠的核苷酸序列，可以制备引物。

采用例如得自Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成仪，依照亚磷酰胺法，可以合成具有所需核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。或者，可以用任何方法，包括磷酸三酯法、H-膦酸酯法和硫代膦酸酯法，合成所述嵌合寡核苷酸引物。

可以使用引物3’端部分中的脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代、使得可以用于ICAN法的引物，作为使用ICAN法的核酸扩增引物。这类引物的实例包括分别具有SEQ ID NO：13-16、23-26和28-31中任一核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。

所述引物可以用适当的物质标记，所述物质例如荧光物质、染料、配体(生物素、洋地黄毒苷等)或胶体金。例如，通过在支持体上捕获用以配体标记的引物所扩增的靶核酸，提供了一种灵敏、便捷的定量测量法。在这种情况下，微量滴定板、微珠、磁珠、膜和玻璃是示例性的固相。

从痰试样提取的DNA样品可能含有来源于除人类DNA之外的呼吸道固有细菌或病毒的DNA。那么，用得自从未感染过结核分枝杆菌复合体的志愿者的痰作为试样，检验得自结核分枝杆菌复合体的基因的扩增，以便检查依照本发明研制的引物的特异性。无阳性，导致这样的检验可以证明所述引物的特异性。采用所述嵌合寡核苷酸引物，通过ICAN法，进行从收集于38位志愿者的痰提取的每种DNA的IS6110基因片段的扩增。结果没有观察到阳性结果，证明所述引物对于结核分枝杆菌复合体的特异性高，并且从非IS 6110靶DNA中没有获得假阳性结果。

(4)本发明的组合物

本发明提供一种用于以上(2)中所述的本发明检测法的组合物。所述组合物的实例包括含有以上(1)中所述探针和以上(3)中所述引物的组合物。另一方面，所述组合物可以采用包含含所述探针的检测用组合物和含所述引物的扩增用组合物的形式。所述组合物可以采用包含含乙酸镁的组合物和含所述引物的组合物的形式。所述组合物可以含有缓冲组分、dNTP等。它可以含有经修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸三磷酸类似物。此外，它可以含有用于检验由于降解、失活等所致的本发明组合物中试剂扩增失败(假阴性)的内部对照(IC)。所述内部对照可以用本发明的引物来扩增。

含有适当浓度的上述各种组分的用于本发明检测方法的组合物是另一实施方案的例子。扩增反应可以仅通过加入合适的模板和对于这种组合物合适的嵌合寡核苷酸引物来进行。如果扩增的对象是事先已知，则优选含有适合于扩增所述对象的嵌合寡核苷酸引物的组合物。

含有适合于本发明核酸扩增法的浓度的上述各种组分的组合物是一个特别优选的实施方案的例子。可以仅通过加入合适的模板至这样的组合物中，进行扩增反应。如果所述组合物含有检测探针，则可以以实时方式检测来源于致病微生物的靶核酸。

虽然并不打算限制本发明，但是例如通过用本发明的所述方法或用于所述方法的组合物或试剂盒来检测HCV，与常规Amplicor HCV试剂盒(两个数量级)相比，可以使测量范围更宽，高至3个数量级。此外，与常规Amplicor HCV试剂盒所需的约5小时的总时间相比，依照本发明可以将总时间大大缩短至约45分钟。因此，可以增加可以在一天内处理的试样数。

(5)本发明的试剂盒

本发明的试剂盒是用于检测得自致病微生物的靶核酸的试剂盒。虽然并不打算限制本发明，但是它含有可以在pH高于7的碱性条件下与靶核酸杂交的探针，例如以上(1)中所述的探针。

用于检测结核分枝杆菌复合体的试剂盒是本发明试剂盒的一个实施方案的例子。所述试剂盒含有可以用来特异性检测结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和/或Mycobacterium canetti的探针。所述试剂盒可以用来在pH高于7的碱性条件下检测结核分枝杆菌复合体。

用于检测淋病球菌的试剂盒是本发明试剂盒的一个实施方案的例子。所述试剂盒含有可以用来特异性检测淋病奈瑟氏球菌的探针。所述试剂盒可以用来在pH高于7的碱性条件下检测淋病球菌。

用于检测衣原体的试剂盒是本发明试剂盒的一个实施方案的例子。所述试剂盒含有可以用来特异性检测沙眼衣原体的探针。所述试剂盒可以用来在pH高于7的碱性条件下检测衣原体。

用于检测HCV的试剂盒是本发明试剂盒的一个实施方案的例子。所述试剂盒含有可以用来特异性检测HCV的探针。所述试剂盒可以用来在pH高于7的碱性条件下检测HCV。

在另一实施方案中，所述试剂盒可以含有一种引物。所述试剂盒可以含有用于扩增靶基因的核酸扩增法的试剂(例如DNA聚合酶)、用于检测探针反应的试剂、用于从试样提取核酸的试剂等。这样一种试剂盒优选用于便捷快速地进行本发明的检测结核分枝杆菌复合体等的方法。特别是，在检查大量样品中结核分枝杆菌复合体等存在时，所述试剂盒可以用来高度再现性和可靠性地提供试验结果。此外，所述试剂盒可以含有用于检验假阴性的内部对照(IC)和用于检测所述内部对照的探针。所述内部对照可以用本发明的所述引物来扩增。

在一个实施方案中，所述试剂盒采用包装形式，带有关于依照本发明使用探针、引物、DNA聚合酶和内切核酸酶的说明。可以选择市售的DNA聚合酶和/或内切核酸酶，并且依照本发明使用。另外，所述试剂盒可以含有当用RNA作为模板时所使用的逆转录反应的试剂。所述DNA聚合酶可以选自上述的DNA聚合酶。所述内切核酸酶可以选自Pfu RNA酶HII或Afu RNA酶HII。

“说明”是描述所述试剂盒使用方法的印刷品，例如说明制备用于链置换反应的试剂溶液的方法、建议的反应条件等。所述说明包括小册子或传单形式的说明手册、粘贴到试剂盒上的标签和含所述试剂盒的包装表面上的说明。所述说明也包括通过电子媒介例如Internet公开或提供的信息。

本发明的试剂盒还可以含有含Bicine、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris作为缓冲成分的反应缓冲液和退火溶液。另外，它可以含有DNA聚合酶和RNA酶H。此外，所述试剂盒可以含有经修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核苷酸三磷酸类似物。

通过适当选择本发明试剂盒所用的检测探针，提供可以用来检测得自致病微生物的靶核酸的试剂盒。

(6)本发明的核酸提取方法

本发明提供一种用于提取核酸的方法，所述方法可用来高度灵敏地检测结核分枝杆菌复合体等。从临床样本中提取核酸是一个精密而繁琐的程序。所述程序的对象范围宽泛，包括液体试样(尿液、胸膜液、脊髓液、血液等)、粘稠的试样(脓、痰等)、细胞和组织。目前，对于从这样的试样中提取结核分枝杆菌复合体等的基因没有标准方法。因此，迄今在关于结核分枝杆菌复合体等的遗传检验的报道中，使用各种核酸提取方法。在常规方法中，在含有去垢剂、碱、有机溶剂或离液剂的溶液中进行混合，或者在有玻璃珠的情况下进行超声处理。

本发明人比较了上述各种常规方法与其中对结核分枝杆菌复合体使用胞壁质酶(一种来源于一种放线菌-球孢链霉菌(Streptomycesglobisporus)的胞壁质酶由Sigma出售，名称为变溶菌素)，胞壁质酶已经用于从属于李斯特氏菌属(Listeria)、乳杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus)的微生物中提取核酸。本发明人发现，其中用胞壁质酶消化结核分枝杆菌复合体的方法最好。此外，本发明人发现，通过将用所述酶消化过的细胞煮沸5分钟，可以获得更好的结果。

检查了通过下述步骤对结核分枝杆菌复合体的检测：用胞壁质酶处理含结核分枝杆菌复合体的样品达30分钟，然后于96℃处理5分钟，用ICAN法扩增基因。结果，意外地发现，可以以10倍于使用诸如去垢剂的试剂的常规方法的灵敏度，检测得自结核分枝杆菌复合体的DNA。这种检测灵敏度相当于5个拷贝的结核分枝杆菌复合体基因组。

上述顺序检测程序可以排除依照使用去垢剂或离液剂的常规方法可能污染核酸提取物的组分对核酸扩增反应的抑制效应。此外，加热步骤达到将结核分枝杆菌复合体等灭菌的效果。因而，所述方法的优势在于：它提供防止实验室中对于检验人员已成为麻烦的结核分枝杆菌复合体等感染的效应。因此，采用本发明的方案，可以快速、安全而高度灵敏地从结核分枝杆菌复合体等中提取DNA。

例如，如果用痰作为样品，则最好首先依照已知用于加工痰的NALC(N-乙酰-L-半胱氨酸)-NaOH法加工痰，然后进行上述本发明的核酸提取方法。本发明的检测方法可以包括用胞壁质酶处理含有结核分枝杆菌复合体等的试样以提取核酸的步骤。

包括探针、引物、核酸提取方法和核酸扩增法在内的用于本发明检测方法的完整方案，使得能够非常快速、可靠而高度灵敏地检测结核分枝杆菌复合体等。使用所述方法在3小时内完成从收集试样到报道结果的程序是可能的。检验所需的时间与常规试剂盒(例如得自Roche的试剂盒)所需的时间(6小时)相比减少一半。因此，本发明的所述方法使得能够在当天提供检验结果并且立即隔离受感染的患者，并且从公众健康的角度来看，由于早期防止结核病的传播，对社会作出更多的贡献。

以下实施例更详细地说明本发明，但不应解释为限制本发明的范围。另外，本领域技术人员通过根据本发明进行类推，可以容易地在防止扩增产物夹带物污染方面作出改进，以及作出同时扩增和检测另一结核分枝杆菌复合体基因等的内部对照的改进。

实施例

以下实施例进一步详细描述本发明，但不应解释为限制本发明的范围。

参比实施例1：激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)RNA酶HII基因的克隆

(1)从激烈热球菌制备基因组DNA

将含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO₄、0.001％NaCl、0.0001％FeSO₄·7H₂O、0.0001％CoSO₄、0.0001％CaCl₂·7H₂O、0.0001％ZnSO₄、0.1ppm CuSO₄·5H₂O、0.1ppmKAl(SO₄)₂、0.1ppm H₃BO₄、0.1ppm Na₂MoO₄·2H₂O和0.25ppmNiCl₂·6H₂O的2L培养基置于2L培养瓶中，于120℃灭菌20分钟，通入氮气，以除去溶解氧，然后在培养基中接种激烈热球菌(从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(德意志微生物保藏中心)购买；DSM3638)，于95℃不振荡培养16小时。培养后，通过离心收集细胞。

然后将所得细胞悬浮于4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。向其中加入0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶(lysozyme chloride)(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。

反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制备约1mg基因组DNA。

(2)RNA酶HII基因的克隆

Pyrococcus horkioshii的完整基因组序列已经发表[DNA Research，5：55-76(1998)]。已知在基因组中存在一个编码RNA酶HII同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO：1，National Institute of Technology andEvaluation：http：//www.nite.go.jp/的主页)。

搜索了PH1650基因(SEQ ID NO：1)和激烈热球菌的部分发表的基因组序列(University of Utah，Utah Genome Center：http：//www.genome.utah.edu/sequence.html的主页)之间的同源性。结果，发现一个高度同源的序列。

根据所述同源序列，合成引物1650Nde(SEQ ID NO：2)和1650Bam(SEQ ID NO：3)。

用在(1)中获得的200ng激烈热球菌基因组DNA作为模板，用20pmol 1650Nde和20pmol 1650Bam作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR：94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行30个循环。约0.7kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。将所得的DNA片段插入到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，制备质粒pPFU220。

(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定

按照双脱氧法，测定在(2)中获得的插入到pPFU220中的所述DNA片段的核苷酸序列。

所测定的核苷酸序列的分析揭示出存在一个推定编码RNA酶HII的可读框(ORF)。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO：4中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5中。

用质粒pPFU220转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pPFU220，并且于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Intemational PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM P-18020，并且根据布达佩斯条约在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心于2001年7月9日(转至国际保藏单位的日期)转为保藏号FERM BP-7654。

(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备

用(2)中获得的pPFU220转化大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen)。将所得的带有pPFU220的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于66.0ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于60℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得61.5ml热处理上清液。

将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。

将60.0ml所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约150mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。

用Centricon-10(Amicon)，通过超滤浓缩2.0ml所述RNA酶HII流分。将250μl所述浓缩液经过用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(AmershamPharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于17千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。

将如此洗脱出的RNA酶HII用作Pfu RNA酶HII制剂。如下测定如此获得的Pfu RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。

将10mM tris-HCl(pH8.0)、1mM二硫苏糖醇(Nacalai Tesque)、0.003％牛血清白蛋白(fraction V，Sigma)、4％甘油、20μg/ml poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)和30μg/ml poly(rA)(AmershamPharmacia Biotech)混合在一起。让混合物于37℃保温10分钟，用作供测量RNA酶H活性用的底物溶液。

加入1μl 1M MnCl₂至100μl底物溶液中。让混合物于40℃保温。加入适当稀释的Pfu RNA酶HII制剂至所述混合物中，以起始反应。于40℃反应30分钟后，向其中加入10μl 0.5M EDTA以终止反应。然后测量260nm的吸光度。

结果，加入Pfu RNA酶HII制剂的反应混合物的260nm吸光度高于用在加入PfuRNA酶HII制剂之前加入10μl 0.5M EDTA的反应混合物观测到的吸光度。因此，表明该制剂具有RNA酶H活性。

参比实施例2：Afu RNA酶HII的制备

得自闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的RNA酶HII基因的克隆

(1)从闪烁古生球菌制备基因组DNA

将从8ml培养物收集的闪烁古生球菌(从德意志微生物和细胞保藏中心购买；DSM4139)细胞悬浮于100μl 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中加入20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mMtris-HCl(pH8.0)的800μl混合物、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和50μl 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀并风干，然后溶于50μl TE中，获得基因组DNA溶液。

(2)RNA酶HII基因的克隆

闪烁古生球菌的完整基因组序列已经发表[Klenk，HP等，Nature，390：364-370(1997)]。已知存在一个编码RNA酶HII同源物的基因(AF0621)(SEQ ID NO：6，http：//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。

根据AF0621基因(SEQ ID NO：6)的序列，合成引物AfuNde(SEQID NO：7)和AfuBam(SEQ ID NO：8)。

用(1)中制备的30ng闪烁古生球菌基因组DNA作为模板，用AfuNde和AfuBam各20pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR：94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行40个循环。约0.6kb扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然后通过将所得的DNA片段加入到质粒载体pTV119Nd(一种其中pTV119N的NcoI位点被转变为NdeI位点的质粒)的NdeI位点和BamHI位点之间，构建质粒pAFU204。

(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定

按照双脱氧法，测定在(2)中获得的插入到pAFU204中的所述DNA片段的核苷酸序列。

所测定的核苷酸序列的分析揭示出一个推定编码RNA酶HII的可读框。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO：9中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO：10中。

用质粒pAFU204转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pAFU204，并且于2001年2月22日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Intemational PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM P-18221，并且根据布达佩斯条约在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心于2001年7月9日(转至国际保藏单位的日期)转为保藏号FERM BP-7691。

(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备

用(2)中获得的pAFU204转化大肠杆菌JM109。将所得的带有pAFU204的大肠杆菌JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2LLB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于37.1ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于70℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得40.3ml热处理上清液。

所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham PharmaciaBiotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过所述RESOURSE S柱。

将40.0ml所述流通RNA酶HII流分用2L含有50mM NaCl的缓冲液B[50mM tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA]透析2小时。再重复透析2次。将40.2ml透析过的酶溶液经过用含有50mM NaCl的缓冲液B平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果，获得用约240mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。

用Centricon-10(Amicon)，通过超滤浓缩7.8ml所述RNA酶HII流分。将从约600μl所述浓缩液分离出的4个部分分别经过用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50 mM tris-HCl(pH7.0)平衡的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于30.0千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。将如上所述洗脱出的RNA酶HII用作Afu RNA酶HII制剂。

按照参比实施例1-(4)中所述的方法，测定如此获得的Afu RNA酶HII制剂的酶活性。结果，观察到所述Afu RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。

如下计算本发明所述方法中所用的耐热性RNA酶H的单位值。

将1mg poly(rA)或poly(dT)(都得自Amersham Pharmacia Biotech)溶于含有1mM EDTA的1ml 40mM tris-HCl(pH7.7)中，制备poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。

然后加入poly(rA)溶液(至终浓度为20μg/ml)和poly(dT)溶液(至终浓度为30μg/ml)至含有4mM MgCl₂、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。让混合物于37℃反应10分钟，然后冷却至4℃，制备poly(rA)-poly(dT)溶液。加入1μl适当稀释的酶溶液至100μl所述poly(rA)-poly(dT)溶液中。让混合物于40℃反应10分钟。向其中加入10μl 0.5M EDTA，以终止反应。然后测量260nm的吸光度。作为对照，加入10μl 0.5M EDTA至反应混合物中，让所得混合物于40℃反应10分钟，然后测量吸光度。通过从无EDTA时反应物的吸光度中减去对照的吸光度，获得一个数值(吸光度之差)。因此，基于所述吸光度之差，测量由于所述酶促反应从poly(rA)-poly(dT)杂合体中释放的核苷酸的浓度。一个单位的RNA酶H定义为按照以下公式计算、增加相当于在10分钟内释放1nmol核糖核苷酸的A₂₆₀的酶量：

单位＝[吸光度之差×反应体积(ml)]/0.0152×(110/100)×稀释率

参比实施例3

依照以下方法，测量本发明所述方法中所用的嗜常温RNA酶H的单位值。

(1)所用试剂溶液的制备

供测量活性用的反应混合物：在无菌水中含有指定终浓度的以下物质：40mM tris-HCl(pH7.7，37℃)、4mM氯化镁、1mM DTT、0.003％BSA、4％甘油和24μM poly(dT)。

poly[8-³H]腺苷酸溶液：将370kBq poly[8-³H]腺苷酸溶液溶于200μl无菌水中。

聚腺苷酸溶液：用无菌超纯水将聚腺苷酸稀释至3mM的浓度。

酶稀释液：在无菌水中含有指定终浓度的以下物质：25mMtris-HCl(pH7.5，37℃)、5mM 2-巯基乙醇、0.5mM EDTA(pH7.5，37℃)、30mM氯化钠和50％甘油。

热变性小牛胸腺DNA的制备：将200mg小牛胸腺DNA悬浮于100ml TE缓冲液中并让其溶胀。基于在UV 260nm下测量的吸光度，用无菌超纯水将溶液稀释至1mg/ml的浓度。将所述稀释液于100℃加热10分钟，然后在冰浴中快速冷却。

(2)用于测量活性的方法

加入7μl poly[8-³H]腺苷酸溶液至以上(1)中制备的测量活性用的985μl反应混合物中。将混合物于37℃保温10分钟。加入8μl聚腺苷酸至混合物中，使终浓度为24μM。再将混合物于37℃保温5分钟。如此制备了1000μl poly[8-³H]rA-poly-dT反应混合物。然后将200μl反应混合物于30℃保温5分钟。向其中加入1μl酶溶液的适当连续稀释液。在规定时间内从反应混合物中取出每种样品50μl，用于随后的测量。将按分钟计的从加入酶至取样的时间定义为Y。加入1μl所述酶稀释液以取代酶溶液，制备总CPM或空白的50μl反应混合物。向样品中加入100μl 100mM焦磷酸钠、50μl热变性小牛胸腺DNA溶液和300μl 10％三氯乙酸(对于测量总CPM，300μl超纯水)。将混合物于0℃保温5分钟，然后以10000rpm离心10分钟。离心后，将250μl所得上清液置于小瓶中。向其中加入10ml Aquasol-2(NEN LifeScience Products)。在液体闪烁计数器中测量CPM。

(3)单位的计算

按照以下公式计算每种酶的单位值：单位/ml＝{(测量的CPM-空白CPM)×1.2^*×20×1000×稀释率}200(μl)/(总CPM×Y(min.)×50(μl)×9^**)

1.2^*：每50μl总CPM中所含有的poly[8-³H]rA-poly-dT量(nmol)。

9^**：校正系数。

实施例1

(1)从痰中提取DNA

依照美国CDC(Centers for Diseases Control and Prevention)建议的NALC法加工痰。具体地说，将痰置于50ml螺旋盖试管中。向其中加入等体积NALC溶液(通过加入0.5g N-乙酰-L-半胱氨酸至50ml 0.1M柠檬酸钠和50ml 4％氢氧化钠的混合物中而制备的)。用试管混合器将混合物充分搅拌20秒，制备试样液(fluidal)。于室温静置15分钟后，加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)至总体积为50ml。然后，通过以3000×g或更高速度离心20分钟，收集沉淀。加入50μl裂解缓冲液(含有1单位变溶菌素(Sigma)的10mM HEPES缓冲液(pH7.8))至沉淀中并充分混合。将混合物于37℃反应30分钟，然后在沸水或96℃的加热块中加热5分钟。任选用微量离心机离心，获得上清液。如上所述制备的上清液用作随后程序中得自痰的DNA提取物。另外，也用Dr.GenTLE(得自酵母)(Takara Shuzo)，按照所附的说明进行核酸提取。

(2)探针和嵌合寡核苷酸引物的制备

根据GenBank登记号X52471的核苷酸序列，制备用于检测得自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因的特异性寡核苷酸探针。具体地说，用DNA合成仪，合成在5’端具有异硫氰酸荧光素(FITC)的寡核苷酸探针MTIS-2BF(SEQ ID NO：11)。

制备用于用ICAN法合成来源于结核分枝杆菌复合体IS 6110基因的DNA片段的嵌合寡核苷酸引物。具体地说，根据得自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)，用DNA合成仪合成在5’端具有生物素的正向引物MTIS-2F(SEQ ID NO：13)和反向引物MTIS2-RBio(SEQ ID NO：14)。同样，用DNA合成仪，合成在5’端具有生物素的正向引物K-F1033-2(SEQ ID NO：15)和反向引物K-R1133-2Bio(SEQ ID NO：16)。

(3)用ICAN法扩增

制备表1中所示的用于ICAN反应的反应混合物，并于60℃保温30分钟。

表1

组分	体积(μl)
组分	体积(μl)	5×反应缓冲液(pH 7.8)100mM乙酸镁10mM dNTP(Takara Shuzo)引物MTIS-2F(100μM)引物MTIS-2RBio(100μM)Pfu RNA酶HII(63ng/μl)BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo，8U/μl)DNA提取物H₂O	1022.50.50.50.50.5132.5
合计	50μl		1022.50.50.50.50.5132.5

5×反应缓冲液的组成：

100mM HEPES-氢氧化钾(pH7.8)

500mM乙酸钾

5％二甲基亚砜(DMSO)

0.05％牛血清白蛋白(BSA)

也用引物K-F1033-2/K-R1133-2的组合，同样进行ICAN扩增反应。反应后，用一部分反应混合物进行电泳，以证实目标扩增片段。

(4)用固相平板发光法检测

将链霉抗生物素蛋白(Nacalai Tesque)以2μg/ml的浓度溶于PBS中，向96孔微量滴定板的各孔中加入150μl所得的溶液，以供白色发光检测。让板于4℃静置过夜，以进行固定化。弃去链霉抗生物素蛋白溶液后，将200μl 1％BSA-PBS溶液加入各孔中，让板于4℃静置过夜以进行封闭。弃去溶液，将如此获得的板用于随后的实验中，作为链霉抗生物素蛋白包被板。

将50μl杂交缓冲液(含有1％Triton X-100和1％BSA的5×SSC)和10μl含有用实施例1-(3)中的引物组合MTIS-2F/MTIS2-RBio获得的扩增片段的ICAN反应混合物，加入至链霉抗生物素蛋白包被板的各孔中。将混合物充分混合，于室温反应15分钟，以使其被捕获到所述板的表面。接着，向各孔中加入5μl DNA变性溶液(0.1N NaOH)。将所得混合物充分混合，经过DNA变性3分钟，以使被捕获到板表面的双链DNA变性为单链DNA。用杂交缓冲液稀释上述探针MTIS2BF至5pmol/ml的浓度，向各孔加入100μl所述稀释液。将混合物充分混合，于室温反应40分钟。各孔的pH为13-14。反应后，弃去孔中的溶液。各孔用200μl/孔的洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、1％BSA、0.05％Tween20)洗涤两次。随后，向各孔加入100μl含有杂交溶液中2μg/ml浓度的过氧化物酶标记的抗FITC兔抗体(Chemicon)的溶液。让混合物于室温反应20分钟。反应后，弃去混合物，各孔用200μl/孔的洗涤缓冲液洗涤4次，向各孔加入100μl发光底物SuperSignal ELISA Pico Substrate(Pierce)。立即用发光平板读出仪(Labsystems)对所述板测量相对发光强度。

(5)检测灵敏度的测量

用含有得自痰的相当于0、5或10个拷贝的结核分枝杆菌复合体基因组的DNA的样品，如上所述检测结核分枝杆菌复合体DNA。结果，对于含有5个拷贝所述基因组的样品，可以检测到S/N比约为300的强发光，如表2所示。

表2

基因组发光强度(RLU)

0拷贝 11

5个拷贝 3078

10个拷贝 6287

如上所述，证明本发明使得能够快速而高度灵敏地检验结核分枝杆菌复合体。此外，证明本发明的核酸提取法和其中使用得自酵母的Dr.GenTLE的试剂的方法，都可以稳定地用于本发明的检测结核分枝杆菌复合体的方法。因此，证明本发明的核酸提取法就操作便捷而论是有用的。

实施例2

按照实施例1中所述的方法，对从26位怀疑感染结核分枝杆菌复合体的患者收集的痰进行结核分枝杆菌复合体DNA的检测。另外，对相同的试样用Amplicor Mycobacterium tuberculosis(Roche)和依照使用Ogawa培养基的培养法的结核分枝杆菌复合体检验进行检测，Amplicor Mycobacterium tuberculosis(Roche)是一种基于PCR的常规试剂盒，在所述试剂盒中用编码16S rRNA的DNA作为靶。结果示于表3。

表3

Ogawa培养阳性病例阴性病例

法 (n＝9) (n＝17)

基因扩增法 PCR 本发明方法 PCR 本发明方法

P^* N^* P^* N^* P^* N^* P^* N^*

8 1 9 0 2 15 0 17^*P：阳性；N：阴性。

如表3所示，用本发明的方法获得的结果与用培养检验获得的结果很好地相符。依照所述PCR法，依照所述培养法测定为阴性的两个病例被测定为假阳性，而依照所述培养法测定为阳性的一个病例被测定为假阴性。

因此，证明与所述常规方法相比，用本发明的方法可以非常快速和便捷地获得准确的试验结果。

实施例3

检查了本发明的检测方法对于结核分枝杆菌复合体的特异性。使用得自表4中所列的37种菌株的基因组DNA。

表4

分枝杆菌属(Mycobacterium)

GTC No.603 鸟分枝杆菌(M.avium)

857 脓肿分枝杆菌(M.abscessus)

499 牛分枝杆菌(M.bovis)BCG

858 龟分枝杆菌(M.chelonae)

609 偶发分枝杆菌(M.fortuitum)

610 胃分枝杆菌(M.gastri)

612 戈登分枝杆菌(M.gordonae)

613 胞内分枝杆菌(M.intracellulare)

614 堪萨斯分枝杆菌(M.kansadii)

616 海分枝杆菌(M.marinum)

617 无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)

1725 外来分枝杆菌(M.peregrinum)

619 瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)

620 猿分枝杆菌(M.simiae)

622 斯氏分枝杆菌(M.szulgai)

623 土分枝杆菌(M.terrae)

624 次要分枝杆菌(M.triviale)

601 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)

626 蟾分枝杆菌(M.xenopi)

假单胞菌属(Psedomonas)

2 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)

埃希氏菌属(Escherichia)

503 大肠杆菌(E.coli)

链球菌属(Streptococcus)

1234 无乳链球菌(S.agalactiae)

1700 变异链球菌(S.mutans)

261 肺炎链球菌(S.pneumoniae)

262 化脓链球菌(S.pyogenes)

217 S.sanguinis

葡萄球菌属(Staphylococcus)

GTC No.286 金黄色葡萄球菌金黄亚种(S.aureus subsp.aureus)

289 表皮葡萄球菌(S.epidermidis)

266 中间葡萄球菌(S.intermedius)

265 腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)

肠球菌属(Enterococcus)

228 粪肠球菌(E.faecalis)

227 屎肠球菌(E.faecium)

消化链球菌属(Peptostreptococcus)

200 大消化链球菌(P.magnus)

口腔球菌属(Stomatococcus)

311 粘滑口腔球菌(S.mucilaginosus)

棒杆菌属(Corynebacterium)

1438 假结核棒杆菌(C.pseudotuberculosis)

李斯特氏菌属(Listeria)

149 单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)

丹毒丝菌属(Erysipelothrix)

555 猪红斑丹毒丝菌(E.rhuthiopathiae)

基于OD值计算相应基因组DNA的拷贝数，制备各含有2×10⁷拷贝的稀释液。用基因组DNA作为模板，以便用具有表5所示组成的反应混合物进行检测。

表5

组分体积(μl)

5×反应缓冲液(pH7.8) 10

100mM乙酸镁 2

10mM dNTP(Takara Shuzo) 2.5

引物MTIS-2F(100μM) 0.5

引物MTIS-2RBio(100μM) 0.5

Afu RNA酶HII(17.5U/μl) 0.5

BcaBEST DNA聚合酶(16U/μl) 0.5

DNA提取物 1

H₂O 32.5

合计

50μl

将反应混合物于60℃保温1小时。如实施例1(4)中所述进行检测。结果仅可以特异性地检测到结核分枝杆菌菌株和牛分枝杆菌BCG菌株。根据这些结果，证明本发明的方法是高度特异性的。

实施例4

(1)检查用磁珠对结核分枝杆菌复合体的检测。用引物MTIS-2F和MTIS-2RBio作为引物。作为模板，用无菌水制备从实施例2中的阳性试样提取的基因组的30倍、300倍和3000倍稀释液。反应如下进行。简而言之，将按终浓度计的32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM乙酸镁、dNTP各500μM、引物MTIS-2F和MTIS-2R各50pmol、8.75 U Afu RNA酶H、8 U BcaBEST DNA聚合酶和1μl所述模板以及无菌水混合至50μl的终体积。将反应混合物置于已经设定于60℃的热循环仪ThermalCycler Personal中，保温60分钟。用链霉抗生物素蛋白包被磁珠(Pierce)，在自动检测仪Lumipuls(Fujirebio)中对所得的扩增片段进行检测。让具有固定化链霉抗生物素蛋白、能够结合100pmol生物素的磁珠与比色杯第一层上的生物素酰化扩增片段反应5分钟。然后，向其中加入0.1N NaOH。与FITC标记探针MTISBF杂交5分钟。洗涤后，向其中加入POD标记的抗FITC抗体。反应5分钟并且洗涤后，向其中加入发光底物。结果表明，在常规自动检测仪中，用磁珠可以在短时间(20分钟)内半定量地进行检测。使用实施例1中所述的试剂。通过光计数(photocounting)测量发光水平，进行检测。结果示于表6。

表6

模板光计数 S/N比

×30 3.55×10⁷ 29.6

×300 1.21×10⁷ 10.0

×3000 0.21×10⁷ 1.75

0 0.12×10⁷ -

根据表6所示的结果，证明可以以等同于常规平板发光法的灵敏度进行检测。

(2)检查结合使用内部对照(IC)的检测系统。如下制备内部对照。简而言之，用人类基因组DNA作为模板，用SEQ ID NO：17和18的引物进行PCR扩增。按照常规方法纯化所得的扩增片段，将其插入到pT7 Blue T-vector(Novagen)中。将该质粒用作内部对照。按照实施例3中所述的方法进行反应，加入1pg、3pg或10pg所述质粒。作为模板，使用0、2或20个拷贝的结核分枝杆菌复合体基因组。使用在5’端具有FITC标记的用于IC的探针(SEQ ID NO：19)(ICF探针)和FITC标记的探针MTISBF进行检测。结果，用每种浓度的IC质粒，可以检测结核分枝杆菌复合体基因组。特别是，表明优选使用3pg的所述IC质粒。

(3)检查作为检测上述扩增片段的混合式层析法。将链霉抗生物素蛋白(Nacalai Tesque)固定化至硝化纤维素膜上。将一个吸水性垫与其相连，构成一个混合式层析条(strip)。依照混合式层析法，用这种条检测在实施例1中获得的扩增片段。通过用1步TMB-印迹法(Pierce)显色来进行检测。具体地说，让含有扩增片段的反应混合物在硝化纤维素膜上显色。然后，用0.1N NaOH溶液、FITC标记探针、洗涤溶液和显色溶液按该顺序显色。结果，检测到结核分枝杆菌复合体阳性扩增片段的蓝色条带。证明该方法可用作快速遗传检验法，因为在进行本发明的所述方法中，用肉眼在5-10分钟内获得结果。

实施例5

在实施例1-4中获得的结果基础上，构建了一种用于结核分枝杆菌复合体的试剂盒。相应的组分示于以下：

(1)用于ICAN扩增的试剂(50个反应)

5×反应缓冲液 500μl

100mM乙酸镁 100μl

10mM dNTP混合物 125μl

0.1mM MTIS-2F引物 25μl

0.1mM MTIS-SRBio引物 25μl

Afu RNA酶HII(17.5U/μl) 25μl

BcaBEST DNA聚合酶(16U/μl) 25μl

(2)用于检测的试剂(50个反应)

链霉抗生物素蛋白固定化96孔板 50块板

杂交缓冲液 2.5ml

(5×SSC，1％Triton X100，1％BSA)

变性试剂(0.1N NaOH) 0.5ml

MT探针检测溶液 5ml

(25nM MTIS-2BF探针)

IC探针检测溶液 5ml

(25nM ICF探针)

标记抗体溶液(BlockAce 5ml

(Dainippon Pharmaceutical)∶PBS＝1∶3，

500单位POD-抗FITC抗体)

10×洗涤溶液(250mM tris缓冲液(pH7.5)，1.5M 20ml

NaCl，1％BSA，0.5％Tween20)

发光试剂A(SuperSignal ELISA Pico Substrate A 2.5ml

溶液(Pierce))

发光试剂B(SuperSignal ELISA Pico Substrate B 2.5ml

溶液(Pierce))

内部对照溶液(IC质粒，TE缓冲液) 0.1ml

阳性对照溶液(含IS 6110的质粒，TE缓冲液) 0.02ml

阴性对照溶液(TE缓冲液) 0.02ml

用上述试剂检测到结核分枝杆菌菌株和牛分枝杆菌BCG菌株。因此证明，所述试剂可以快速、灵敏而特异性地检测。

实施例6

(1)从棉拭试样提取DNA

将含有去垢剂(Amplicor STD(Roche)的一种试样处理试剂)的提取缓冲液加入到通过用棉拭摩擦男性尿道和女性宫颈取出的棉拭试样中。将混合于95℃-100℃加热10分钟。

(2)探针和嵌合寡核苷酸引物的制备

制备用于检测得自衣原体的隐蔽性质粒的特异性寡核苷酸探针。具体地说，用DNA合成仪，合成在5’端具有异硫氰酸荧光素(FITC)的寡核苷酸探针CT1234(SEQ ID NO：20)。另外，制备用于检测得自淋病球菌的cppB基因的特异性寡核苷酸探针。具体地说，用DNA合成仪，合成在5’端具有异硫氰酸荧光素(FITC)的寡核苷酸探针CppB3(SEQ ID NO：21)。

制备用于用ICAN法合成来源于衣原体的隐蔽性质粒的DNA片段的嵌合寡核苷酸引物。具体地说，根据得自衣原体的隐蔽性质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)，用DNA合成仪合成在5’端分别具有生物素的正向引物F1212-22(SEQ ID NO：23)和F1162-22(SEQ ID NO：24)以及反向引物R1272-22Bio(SEQ ID NO：25)和R1379-22Bio(SEQ IDNO：26)。

制备用于用ICAN法合成来源于淋病球菌的cppB基因的DNA片段的嵌合寡核苷酸引物。具体地说，根据得自衣原体的隐蔽性质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)，用DNA合成仪合成在5’端具有生物素的正向引物pJDBF-1(SEQ ID NO：28)和反向引物pJDBR-3Bio(SEQ IDNO：29)。

(3)用ICAN法扩增

制备表7中所示的用于ICAN法的反应混合物，并于55℃保温60分钟。

表7

组分体积(μl)

5×反应缓冲液(pH 7.8) 10

100mM 乙酸镁 2

10mM dNTP(Takara Shuzo) 2.5

引物F1212-22(100μM) 0.5

引物R1272-22Bio(100μM) 0.5

引物pJDBF-1(100μM) 0.5

引物pJDBR-3(100μM) 0.5

Pfu RNA酶HII(63ng/μl) 0.5

BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo，8U/μl) 0.5

DNA提取物 1

H₂O 32.5

合计 50μl

5×反应缓冲液的组成：

100mM HEPES-氢氧化钾(pH7.8)

500mM乙酸钾

5％二甲基亚砜(DMSO)

0.05％牛血清白蛋白(BSA)

反应后，用一部分反应混合物进行电泳，观察到目标扩增片段。

(4)用固相平板发光法检测

将50μl杂交缓冲液(含有1％Triton X-100和1％BSA的5×SSC)加入至链霉抗生物素蛋白包被板的各孔中。向各孔中加入10μl含有用实施例1-(3)中的引物F1212-22/R1272-22Bio和pJDBF-1/pJDBR-3Bio的组合获得的扩增片段的ICAN反应混合物(每个试样两个孔)。将混合物充分混合，于室温反应15分钟，以使其被捕获到所述板的表面。接着，向各孔中加入5μl DNA变性溶液(0.1N NaOH)。将所得混合物充分混合，经过DNA变性3分钟，以使被捕获到板表面的双链DNA变性为单链DNA。用杂交缓冲液稀释上述探针CT1234或CppB3至5pmol/ml的浓度，向各孔加入100μl所述稀释液。将混合物充分混合，于室温反应40分钟。各孔的pH为13-14。反应后，弃去孔中的溶液。各孔用200μl/孔的洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、1％BSA、0.05％Tween20)洗涤两次。随后，向各孔加入100μl含有杂交溶液中2μg/ml浓度的过氧化物酶标记的抗FITC兔抗体(Chemicon)的溶液。让混合物于室温反应20分钟。反应后，弃去混合物，各孔用200μl/孔的洗涤缓冲液洗涤4次，向各孔加入100μl发光底物SuperSignal ELISA Pico Substrate(Pierce)。立即用发光平板读出仪(Labsystems)对所述板测量相对发光强度。

(5)检测灵敏度的测量

用含有相当于0、10或100个拷贝的衣原体基因组的DNA的样品，如上所述检测衣原体DNA。结果，对于含有10个拷贝所述基因组的样品，可以检测到S/N比约为30的强发光，如表8所示。用含有相当于0、10或100个拷贝的淋病球菌基因组的DNA的样品，如上所述检测淋病球菌DNA。结果，对于含有10个拷贝所述基因组的样品，可以检测到S/N比约为300的强发光，如表9所示。

表8

基因组发光强度(RLU)

0拷贝 11

10个拷贝 347

100个拷贝 3961

表9

基因组发光强度(RLU)

0拷贝 11

10个拷贝 3026

100个拷贝 3840

如上所述，证明本发明使得能够快速而高度灵敏地检验衣原体和淋病球菌。

实施例7

依照实施例1中所述的程序，从怀疑具有衣原体和淋病球菌混合感染的12个试样中同时扩增和检测衣原体DNA和淋病球菌DNA。

结果如下：仅衣原体阳性(5个病例)；仅淋病球菌阳性(1个病例)；衣原体和淋病球菌均为阳性(3个病例)；以及衣原体和淋病球菌均为阴性(3个病例)。这些结果与用常规PCR试剂盒(Amplicor STD(Roche))获得的结果一致。

实施例8

引物和探针的制备

基于HCV基因组的核苷酸序列，合成嵌合寡核苷酸引物HCV-F(SEQ ID NO：30)和HCV-R1(SEQ ID NO：31)以及逆转录反应的寡核苷酸引物(SEQ ID NO：32和33)。另外，合成寡核苷酸探针(SEQ ID NO：34和35)。用DNA自动合成仪，制备在5’端具有TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基-罗丹明，ABI)的寡核苷酸探针，并且将其用作荧光标记探针。

(2)合成RNA的制备

对于在征得同意后获得的HCV-RNA阳性血清，用AmplicorHCVMonitor试剂盒(Roche)检测到一个拷贝数。用所述试剂盒所附的试样稀释溶液制备浓度范围为1拷贝/μl至1×10⁷拷贝/μl的10倍连续稀释液，将其用作HCV-RNA。

(3)逆转录反应

用以上(1)中制备的逆转录反应引物和第一链cDNA合成试剂盒(Takara Shuzo)，从以上(2)中制备的HCV-RNA，合成cDNA。

(4)ICAN反应混合物的制备

用所述cDNA溶液进行ICAN反应。一个试管中的反应混合物的组成示于表10中。

表10

组分	体积
组分	体积	cDNA溶液	3μl
注射用蒸馏水	28.75μl	cDNA溶液	3μl
注射用蒸馏水	28.75μl	5×Hepes缓冲液	10μl
10mM dNTP混合物	2.5μl	5×Hepes缓冲液	10μl
10mM dNTP混合物	2.5μl	100μM正向引物	0.5μl
100μM反向引物	0.5μl	100μM正向引物	0.5μl
100μM反向引物	0.5μl	Bca BEST DNA聚合酶(22U/μl)	0.25μl
PFU RNA酶H(60U/μl)	0.5μl	Bca BEST DNA聚合酶(22U/μl)	0.25μl
PFU RNA酶H(60U/μl)	0.5μl	0.5％丙二胺	2μl
100mM乙酸镁	2μl	0.5％丙二胺	2μl

(5)均相检测

向每个试管中加入47μl反应混合物。向其中加入3μl在(4)中制备的cDNA溶液。将试管于56℃保温30分钟。反应后，加入在以上(1)中制备的荧光标记探针至反应混合物中，终浓度为300nM。于98℃处理2分钟后，用冰冷却将混合物冷却至25℃，然后于室温保温。用荧光检测器Fluoroscan(Labsystems)，对所述反应混合物测量荧光强度。另外，用市售的基于PCR的Amplicor HCV试剂盒(Roche)，测量相同的试样作为对照。结果示于图1。图1是一幅曲线图，说明荧光强度的变化以及当用不同HCV-RNA浓度下进行测定时与所述常规方法测量范围的比较。左边的纵轴代表OD450值；右边纵轴代表荧光强度(SN比)；横轴代表HCV-RNA量。在图1中，实心方框代表用本发明的方法获得的结果，实心圆代表用Amplicor HCV试剂盒获得的结果。

如图1所示，证明由于依照本发明的方法，HCV-RNA的拷贝数被增加，所以观察到更强的荧光强度(SN比)。本发明方法检测HCV所需的总时间是45分钟。另一方面，作为对照的Amplicor HCV试剂盒需要约5小时。关于HCV-RNA检测范围，证明由于用Amplicor HCV试剂盒增加了HCV-RNA的拷贝数，所以吸光度增加，如图1所示。然而，其测量范围为2个数量级，并且对于含有10⁵拷贝或更多拷贝的样品不能定量测定。另一方面，证明本发明的方法导致3个数量级的宽的检测范围。此外，证明本发明的方法就便捷和快速而论有优势，因此所述方法适合于处理大量的试样。

实施例9

(1)从患者血清中制备HCV-RNA

检查对临床试样的HCV的检测。用Amplicor HCV试剂盒(Roche)所附的HCV-RNA提取试剂，从在征得同意后所获得的患有HCV的28位患者血清试样各100μl，制备RNA。

(2)患者血清中HCV-RNA的检测

依照实施例1(3)和(4)中所述的程序扩增HCV-RNA，对其进行本发明的检测法。在该实施例中，截留值定义为用作为对照的无HCV-RNA样品从10个阴性对照实验获得的平均荧光强度值±3SD(3倍标准偏差)。产生高于截留值的荧光强度的试样被确定为阳性。另一方面，用市售的Amplicor HCV试剂盒依照试剂盒所附的说明对相同的试样进行测量，以确定所述样品是阳性还是阴性。本发明检测方法和作为常规方法的Amplicor HCV试剂盒之间比较的结果示于表11中。

表11

	本发明的方法
	本发明的方法		阳性	阴性
	Amplicor法		阳性	阴性
阳性	Amplicor法		18个病例	0个病例
阳性	阴性	0个病例	18个病例	0个病例	10个病例

如表11所示，证明用本发明的方法获得的测量结果与用所述常规方法获得的结果相关性很好。进一步证明，与依照所述常规方法相比，依照本发明方法的测量更为灵敏，更快速并且更便捷。

工业实用性

本发明提供了使得能够灵敏、特异性、快速且便捷地测量致病微生物、并且可以用来在限定的时间内处理大量试样而无需应用专门设备的方法、引物和探针以及试剂盒。

序列表的独立文本

SEQ ID NO：2：PCR引物1650Nde，用于从激烈热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。

SEQ ID NO：3：PCR引物1650Bam，用于从激烈热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。

SEQ ID NO：7：PCR引物AfuNde，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。

SEQ ID NO：8：PCR引物AfuBam，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。

SEQ ID NO：11：寡核苷酸探针，用于检测得自结核分枝杆菌的DNA。

SEQ ID NO：13：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌的IS 6110基因的DNA片段。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：14：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌的IS 6110基因的DNA片段。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：15：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌的IS 6110基因的DNA片段。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：16：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌的IS 6110基因的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：17：寡核苷酸引物C4-MT2F-S100，用于从人类扩增metaroprotease基因的DNA片段

SEQ ID NO：18：寡核苷酸引物C4-MT2R-A，用于从人类扩增metaroprotease基因的DNA片段

SEQ ID NO：19：寡核苷酸探针，用于检测内部对照DNA

SEQ ID NO：20：寡核苷酸探针CT1234，用于检测所述衣原体隐蔽性质粒

SEQ ID NO：21：寡核苷酸探针CppB3，用于检测淋病奈瑟氏球菌cppB基因

SEQ ID NO：23：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：24：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：25：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：26：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：28：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏球菌cppB基因的DNA片段。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：29：嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏球菌cppB基因的DNA片段。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：30：设计的嵌合寡核苷酸引物，名为HCV-F，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：31：设计的嵌合寡核苷酸引物，名为HCV-R3，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”

SEQ ID NO：32：设计的寡核苷酸引物，用于合成HCV的cDNA。

SEQ ID NO：33：设计的寡核苷酸引物，用于合成HCV的cDNA。

SEQ ID NO：34：设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增HCV一部分的DNA片段。

SEQ ID NO：35：设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增HCV一部分的DNA片段。

SEQ ID NO：36：寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌的IS6110基因的DNA片段。

SEQ ID NO：37：寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌的IS6110基因的DNA片段。

SEQ ID NO：41：引物区，用于扩增HCV的一部分。

SEQ ID NO：42：引物区，用于扩增HCV的一部分。

SEQ ID NO：43：探针区，用于检测扩增HCV一部分的DNA片段。

序列表<110>宝酒造株式会社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>毒性微生物的检测方法<130>662981<150>JP 2000-396321<151>2000-12-26<150>JP 2000-396222<151>2000-12-26<150>JP 2001-199552<151>2001-06-29<150>JP 2001-278920<151>2001-09-13<160>44<210>1<211>663<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii<400>1atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tga 663<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物1650Nde，用于从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>2caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物1650Bam，用于从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>3gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33<210>4<211>672<212>DNA<213>激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)<400>4atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660tttaagaaac ct 672<210>5<211>224<212>PRT<213>激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)<400>5Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile1 5 10 15Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile

20 25 30Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr

35 40 45Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala

50 55 60Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn

65 70 75Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu

80 85 90Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp

95 100 105Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg

110 115 120Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp

125 130 135Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val

140 145 150Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp

155 160 165Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu

170 175 180Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg

185 190 195Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala

200 205 210Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro

215 220<210>6<211>626<212>DNA<213>闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)<400>6atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物AfuNde，用于从闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>7aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物AfuBam，用于从闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>8tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30<210>9<211>638<212>DNA<213>闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)<400>9catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638<210>10<211>205<212>PRT<213>闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)<400>10Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly1 5 10 15Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu

20 25 30Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg

35 40 45Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu

50 55 60Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala

65 70 75Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile

80 85 90Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val

95 100 105Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu

110 115 120Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val

125 130 135Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile

140 145 150Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala

155 160 165Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser

170 175 180Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser

185 190 195Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe

200 205<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸探针，用于检测得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的DNA。<400>11gacctcacct atgtgtcgac 20<210>12<211>1378<212>DNA<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>12aggtcggcaa cctgaaccgc cccggcatgt ccggagactc cagttcttgg aaaggatggg 60gtcatgtcag gtggttcatc gaggaggtac ccgccggagc tgcgtgagcg ggcggtgcgg 120atggtcgcag agatccgcgg tcagcacgat tcggagtggg cagcgatcag tgagatcgcc 180cgtctacttg gtgttgctgc gcggagacgg tgcgtaagtg ggtgcgccag gcgcaggtcg 240atgccggcgc acggcccggg accacgaccg aagaatccgc tgagataaag cgcttgcggc 300gggacaacgc cgaattgcga agggcgaacg cgattttaaa gaccgcgtcg gctttcttcg 360cggccgagct cgaccggcca gcacgctaat tacccggttc atcgccgatc atcagggcca 420ccgcgagggc cccgatggtt tgcggtgggg tgtcgagtcg atctgcacac agctgaccga 480gctgggtgtg ccgatcgccc catcgaccta ctacgaccac atcaaccggg agcccagccg 540ccgcgagctg cgcgatggcg aactcaagga gcacatcagc cgcgtccacg ccgccaacta 600cggtgtttac ggtgcccgca aagtgtggct aaccctgaac cgtgagggca tcgaggtggc 660cagatgcacc gtcgaacggc tgatgaccaa actcggcctg tccgggacca cccgcggcaa 720agcccgcagg accacgatcg ctgatccggc cacagcccgt cccgccgatc tcgtccagcg 780ccgcttcgga ccaccagcac ctaaccggct gtgggtagca gacctcacct atgtgtcgac 840ctgggcaggg ttcgcctacg tggcctttgt caccgacgcc tacgctcgca ggatcctggg 900ctggcgggtc gcttccacga tggccacctc catggtcctc gacgcgatcg agcaagccat 960ctggacccgc caacaagaag gcgtactcga cctgaaagac gttatccacc atacggatag 1020gggatctcag tacacatcga tccggttcag cgagcggctc gccgaggcag gcatccaacc 1080gtcggtcgga gcggtcggaa gctcctatga caatgcacta gccgagacga tcaacggcct 1140atacaagacc gagctgatca aacccggcaa gccctggcgg tccatcgagg atgtcgagtt 1200ggccaccgcg cgctgggtcg actggttcaa ccatcgccgc ctctaccagt actgcggcga 1260cgtcccgccg gtcgaactcg aggctgccta ctacgctcaa cgccagagac cagccgccgg 1320ctgaggtctc agatcagaga gtctccggac tcaccggggc ggttcaggcc ccgatggt 1378<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的IS6110基因的DNA片段。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>13tctcgtccag cgccgcuu 18<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的IS6110基因的DNA片段。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>14gacaaaggcc acgtaggcga a 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的IS6110基因的DNA片段。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>15cagtacacat cgatccgguu c 21<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的IS6110基因的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>16gatcgtctcg gctagtgcau ug 22<210>17<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物C4-MT2F-S100，用于从人类扩增metaroprotease基因的DNA片段<400>17gatcgtctcg tccagcgccg cttgataagc actgttcctc cactcc 46<210>18<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物C4-MT2R-A，用于从人类扩增metaroprotease基因的DNA片段<400>18gatcggacaa aggccacgta ggcgaagaca cagtcacacc ataaagg 47<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸探针，用于检测内部对照DNA<400>19gcactgttcc tccactccat 20<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸探针CT1234，用于检测所述衣原体隐蔽性质粒<400>20tcggagtctg agcacccta 19<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸探针CppB3，用于检测淋病奈瑟氏球菌cppB基因<400>21tccgtaacgt ctctaagtct 20<210>22<211>218<212>DNA<213>衣原体隐蔽性质粒<400>22ttgtcttctc gagaagattt atcgtacgca aatatcatct ttgcggttgc gtgtcctgtg 60accttcatta tgtcggagtc tgagcaccct aggcgtttgt actccgtcac agcggttgct 120cgaagcacgt gcggggttat cttaaaaggg attgcagctt gtagtcctgc ttgagagaac 180gtgcgggcga tttgccttaa ccccaccatt tttccgga 218<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>23gtgtcctgtg accttcatta ug 22<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>24ttgtcttctc gagaagattu au 22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>25tgtgacggag tacaaacgcc ua 22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增衣原体隐蔽性质粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>26tccggaaaaa tggtggggtu aa 22<210>27<211>107<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)<400>27tctgctcgct ttgcttcaat gcctcgttga tatttttccg taacgtctct aagtctgctt 60tcgtttgttg ctctatgctg gcggcttcgg tgcgtgatgt ctgctcg 107<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)cppB基因的DNA片段。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>28ctttgcttca atgcctcguu 20<210>29<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)cppB基因的DNA片段。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>29catcacgcac cgaagcc 17<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的嵌合寡核苷酸引物，名为HCV-F，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>30ctgtgaggaa ctactgtcuu c 21<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的嵌合寡核苷酸引物，名为HCV-R3，用于扩增HCV的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>31gcagaccact atggcucu 18<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于合成HCV的cDNA。<400>32cactccacca tgaatcact 19<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于合成HCV的cDNA。<400>33ggtgcacggt ctacgagacc 20<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增HCV一部分的DNA片段。<400>34gccaaagcgt ctagccatgg cggg 24<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸探针，用于检测扩增HCV一部分的DNA片段。<400>35gcgagcaaag cgtctagcca tggcgttagt gctcgc 36<210>36<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的IS 6110基因的DNA片段。<400>36tctcgtccag cgccgctt 18<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物，用于扩增得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的IS 6110基因的DNA片段。<400>37gacaaaggcc acgtaggcga a 21<210>38<211>103<212>DNA<213>人工序列<220><223>可供从结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)扩增用的IS6110基因的一部分<400>38tctcgtccag cgccgcttcg gaccaccagc acctaaccgg ctgtgggtag cagacctcac 60ctatgtgtcg acctgggcag ggttcgccta cgtggccttt gtc 103<210>39<211>410<212>DNA<213>人工序列<220><223>可供从结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)扩增用的IS61 10基因的一部分<400>39cacagcccgt cccgccgatc tcgtccagcg ccgcttcgga ccaccagcac ctaaccggct 60gtgggtagca gacctcacct atgtgtcgac ctgggcaggg ttcgcctacg tggcctttgt 120caccgacgcc tacgctcgca ggatcctggg ctggcgggtc gcttccacga tggccacctc 180catggtcctc gacgcgatcg agcaagccat ctggacccgc caacaagaag gcgtactcga 240cctgaaagac gttatccacc atacggatag gggatctcag tacacatcga tccggttcag 300cgagcggctc gccgaggcag gcatccaacc gtcggtcgga gcggtcggaa gctcctatga 360caatgcacta gccgagacga tcaacggcct atacaagacc gagctgatca 410<210>40<211>367<212>DNA<213>人工序列<220><223>可供从结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)扩增用的IS6110基因的一部分<400>40tctcgtccag cgccgcttcg gaccaccagc acctaaccgg ctgtgggtag cagacctcac 60ctatgtgtcg acctgggcag ggttcgccta cgtggccttt gtcaccgacg cctacgctcg 120caggatcctg ggctggcggg tcgcttccac gatggccacc tccatggtcc tcgacgcgat 180cgagcaagcc atctggaccc gccaacaaga aggcgtactc gacctgaaag acgttatcca 240ccatacggat aggggatctc agtacacatc gatccggttc agcgagcggc tcgccgaggc 300aggcatccaa ccgtcggtcg gagcggtcgg aagctcctat gacaatgcac tagccgagac 360gatcaac 367<210>41<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物区，用于扩增HCV的一部分。<400>41cactccacca tgaatcactc ccctgtgagg aactactgtc ttcacgcaga aagcgtctag 60ccatggcgtt agt 73<210>42<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物区，用于扩增HCV的一部分。<400>42attccggtgt actcaccggt tccgcagacc actatggctc t 41<210>43<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>探针区，用于检测扩增HCV一部分的DNA片段。<400>43cgcagaaagc gtctagccat ggcgttagta tgagtgtcgt gcagcctcca gga 53<210>44<211>60<212>DNA<213>衣原体隐蔽性质粒<400>44gtgtcctgtg accttcatta tgtcggagtc tgagcaccct aggcgtttgt actccgtcac 60

Claims

1.一种含有SEQ ID NO：39的核苷酸序列或其部分的探针，所述探针可以用来检测结核分枝杆菌复合体结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)和/或Mycobacterium canetti。

2.一种由SEQ ID NO：11的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测结核分枝杆菌复合体结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和/或Mycobacterium canetti。

3.一种含有SEQ ID NO：27的核苷酸序列或其部分的探针，所述探针可以用来检测淋病球菌-淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)。

4.一种由SEQ ID NO：21的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测淋病球菌-淋病奈瑟氏球菌。

5.一种含有SEQ ID NO：22的核苷酸序列或其部分的探针，所述探针可以用来检测衣原体-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)。

6.一种由SEQ ID NO：20的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测衣原体-沙眼衣原体。

7.一种由SEQ ID NO：34或35的核苷酸序列组成的探针，所述探针可以用来检测丙型肝炎病毒(HCV)。

8.一种可以在碱性pH下与得自致病微生物的靶核酸杂交的探针。

9.权利要求8的探针，所述探针可以在8-14的碱性pH下与得自致病微生物的靶核酸杂交。

10.权利要求8或9的探针，其中所述致病微生物是结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV。

11.权利要求10的探针，其中所述得自致病微生物的靶核酸选自来自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因的核苷酸序列、来自淋病球菌的cppB基因的核苷酸序列、来自衣原体的pLGV440的核苷酸序列或者来自HCV的5’非翻译区的核苷酸序列。

12.权利要求11的探针，所述探针含有SEQ ID NO：39的核苷酸序列或其部分，其中所述SEQ ID NO：39的核苷酸序列存在于来自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因中。

13.权利要求12的探针，所述探针由SEQ ID NO：11的核苷酸序列组成。

14.权利要求11的探针，所述探针含有SEQ ID NO：27的核苷酸序列或其部分，其中所述SEQ ID NO：27的核苷酸序列存在于来自淋病球菌的cppB基因中。

15.权利要求14的探针，所述探针由SEQ ID NO：21的核苷酸序列组成。

16.权利要求11的探针，所述探针含有SEQ ID NO：22的核苷酸序列或其部分，其中所述SEQ ID NO：22的核苷酸序列存在于来自衣原体的pLGV440中。

17.权利要求16的探针，所述探针由SEQ ID NO：20的核苷酸序列组成。

18.权利要求11的探针，所述探针含有SEQ ID NO：34或35的核苷酸序列或其部分，其中所述SEQ ID NO：34和35的核苷酸序列存在于来自HCV的5’非翻译区中。

19.权利要求18的探针，所述探针由SEQ ID NO：34或35的核苷酸序列组成。

20.权利要求1-19中任一项的探针，所述探针被标记。

21.权利要求20的探针，所述探针是具有来自SEQ ID NO：11、20、21、34或35的核苷酸序列的8-53个连续核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸，并且所述探针被荧光标记，使得所述荧光强度在所述探针与所述靶核酸杂交时不受抑制，而所述荧光强度在所述探针不与所述靶核酸杂交时受到抑制。

22.权利要求21的探针，所述探针由来自SEQ ID NO：11、20、21、34或35的核苷酸序列的8个或8个以上连续核苷酸的序列组成。

23.权利要求22的探针，所述探针用罗丹明型荧光染料或者噁嗪型荧光染料在5’端标记，并且所述探针由来自SEQ ID NO：34的核苷酸序列的8个或8个以上连续核苷酸的序列组成。

24.权利要求22的探针，所述探针具有报道荧光染料和作为荧光染料的猝灭染料以供标记，并且所述探针由来自SEQ ID NO：11、20、21、34或35的核苷酸序列的8个或8个以上连续核苷酸的序列组成。

25.权利要求24的探针，其中所述报道染料是荧光素型染料，而所述猝灭染料是DABCYL型染料。

26.权利要求20的探针，所述探针具有选自荧光物质、染料、酶、生物素、胶体金和放射性同位素的标记。

27.一种检测致病微生物的方法，所述方法包括进行权利要求1-26中任一项所限定的探针与得自致病微生物的靶核酸的杂交。

28.权利要求27的方法，其中所述与得自致病微生物的靶核酸的杂交在碱性pH下进行。

29.权利要求27或28的方法，其中所述致病微生物是结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV。

30.权利要求29的方法，其中所述得自致病微生物的靶核酸是来自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因或其片段。

31.权利要求30的方法，其中进行权利要求1、2、9-11、12、13和20-26中任一项所限定的探针与得自结核分枝杆菌复合体的扩增的IS 6110基因和/或其片段的杂交。

32.权利要求31的方法，其中用具有SEQ ID NO：36或37的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自结核分枝杆菌复合体的IS 6110基因和/或其片段。

33.权利要求29的方法，其中所述得自致病微生物的靶核酸是来自淋病球菌的cppB基因或其片段。

34.权利要求33的方法，其中进行权利要求3、4、9-11、14、15和20-26中任一项所限定的探针与得自淋病球菌的扩增的cppB基因和/或其片段的杂交。

35.权利要求34的方法，其中用具有SEQ ID NO：28或29的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自淋病球菌的cppB基因和/或其片段。

36.权利要求29的方法，其中所述得自致病微生物的靶核酸是来自衣原体的pLGV440或其片段。

37.权利要求36的方法，其中进行权利要求5、6、9-11、16、17和20-26中任一项所限定的探针与得自衣原体的扩增的pLGV440和/或其片段的杂交。

38.权利要求37的方法，其中用具有SEQ ID NO：23-26中的任一核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自衣原体的pLGV440和/或其片段。

39.权利要求29的方法，其中所述靶核酸是得自HCV的5’非翻译区或其片段。

40.权利要求39的方法，其中进行权利要求7、8、9-11、18、19和20-26中任一项所限定的探针与得自HCV的扩增的5’非翻译区和/或其片段的杂交。

41.权利要求40的方法，其中用具有SEQ ID NO：30-33中的任一核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列的引物，扩增得自HCV的5’非翻译区和/或其片段。

42.一种检测致病微生物的方法，所述方法包括用权利要求27-41中任一项所限定的方法，检测得自结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV的核酸。

43.一种检测致病微生物的方法，所述方法包括检测依照包括下述步骤的核酸扩增法扩增的核酸：

(a)通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，制备反应混合物，其中所述引物是一种与作为模板的所述核酸的核苷酸序列基本互补的嵌合寡核苷酸引物，并且含有核糖核苷酸以及至少一种选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的物质，所述核糖核苷酸位于所述引物的3’端或者位于3’端一侧；以及

(b)将所述反应混合物保温足够的时间，以产生反应产物。

44.权利要求43的方法，其中所述反应混合物还包含一种其序列与作为模板的所述核酸的核苷酸序列基本同源的嵌合寡核苷酸引物。

45.权利要求44的方法，其中所述嵌合寡核苷酸引物由以下通式表示：

46.权利要求45的方法，其中c为0。

47.权利要求45的方法，其中所述核苷酸类似物是脱氧核糖肌苷核苷酸或者脱氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述经修饰的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。

48.权利要求43的方法，其中所述嵌合寡核苷酸引物由SEQ IDNO：13-16、23-26和28-31中的任一核苷酸序列组成。

49.权利要求27-42中任一项的方法，所述方法包括使用由权利要求1-26中任一项所限定的探针检测扩增的核酸。

50.一种由以下通式所示的、用于检测致病微生物的嵌合寡核苷酸引物：

51.权利要求50的嵌合寡核苷酸引物，其中c为0。

52.权利要求50的嵌合寡核苷酸引物，其中所述核苷酸类似物是脱氧核糖肌苷核苷酸或脱氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述经修饰的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。

53.权利要求52的嵌合寡核苷酸引物，所述嵌合寡核苷酸引物由SEQ ID NO：13-16、23-26和28-31中的任一个表示。

54.一种用于从结核分枝杆菌复合体扩增IS 6110基因和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：36或37的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列。

55.一种用于从淋病球菌扩增cppB基因和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：27的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列。

56.一种用于从衣原体扩增pLGV440和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：22的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列。

57.一种用于从HCV扩增5’非翻译区和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：41-43中的任一核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列。

58.权利要求54-57中任一项的引物，所述引物是其中所述核苷酸序列中的一部分被核糖核苷酸取代的嵌合寡核苷酸引物。

59.一种选自以下的标记引物：

(i)一种用于检测致病微生物、由以下通式表示的嵌合寡核苷酸引物：

通式：5’-dNa-Nb-dNc-3’(a：11或11以上的整数；b：1或1以上的整数；c：0或者1或1以上的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸，其中dNa中的某些dN可以被N取代)；

(ii)(i)的嵌合寡核苷酸引物，其中c为0；

(iii)(i)的嵌合寡核苷酸引物，其中所述核苷酸类似物是脱氧核糖肌苷核苷酸或脱氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述经修饰的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸；

(iv)由SEQ ID NO：13-16、23-26和28-31中的任一个表示的(iii)的嵌合寡核苷酸引物；

(v)一种用于从结核分枝杆菌复合体扩增IS 6110基因和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：36或37的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列；

(vi)一种用于从淋病球菌扩增cppB基因和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：27的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列；

(vii)一种用于从衣原体扩增pLGV440和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：22的核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列；

(viii)一种用于从HCV扩增5’非翻译区和/或其片段的引物，所述引物具有SEQ ID NO：41-43中的任一核苷酸序列或与所述序列部分重叠的序列；和

(ix)(v)-(viii)中任一项的引物，所述引物是其中所述核苷酸序列中的一部分被核糖核苷酸取代的嵌合寡核苷酸引物。

60.权利要求59的引物，所述引物具有选自荧光物质、染料、酶、生物素和胶体金的标记。

61.一种用于检测靶核酸的组合物，所述组合物含有权利要求1-26中任一项所限定的探针。

62.一种用于检测靶核酸的组合物，所述组合物含有权利要求50-60中任一项所限定的引物。

63.权利要求61或62的组合物，所述组合物用于检测致病微生物。

64.一种用于检测致病微生物的组合物，所述组合物用于权利要求43所限定的检测致病微生物的方法，并且所述组合物含有至少一种用于扩增靶核酸的试剂。

65.权利要求64的组合物，所述组合物含有选自具有链置换活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脱氧核糖核苷酸三磷酸的一种试剂。

66.权利要求65的组合物，其中所述DNA聚合酶是得自热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。

67.权利要求65的组合物，其中所述RNA酶H是得自属于热球菌属(Pyrococcus)细菌和/或属于古生球菌属(Archaeoglobus)细菌的II型RNA酶H。

68.一种用于检测致病微生物的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1-26中任一项所限定的探针。

69.一种用于检测致病微生物的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求50-60中任一项所限定的引物。

70.权利要求68或69的试剂盒，其中所述致病微生物是结核分枝杆菌复合体、淋病球菌、衣原体或HCV。

71.一种用于检测致病微生物的试剂盒，所述试剂盒用于权利要求27所限定的检测致病微生物的方法，并且所述试剂盒含有至少一种用于扩增靶核酸的试剂。

72.权利要求71的试剂盒，所述试剂盒含有选自具有链置换活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脱氧核糖核苷酸三磷酸的一种试剂。

73.权利要求72的试剂盒，其中所述DNA聚合酶是得自热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。

74.权利要求72的试剂盒，其中所述RNA酶H是得自属于热球菌属细菌和/或属于古生球菌属细菌的II型RNA酶H。

75.权利要求72的试剂盒，所述试剂盒含有一种用于捕获扩增产物的支持体。

76.权利要求75的试剂盒，其中所述支持体选自微量滴定板、微珠、磁珠、膜和玻璃。

77.一种检测结核分枝杆菌复合体的方法，所述方法包括用胞壁质酶处理含结核分枝杆菌复合体的试样，以提取核酸。