TWI311154B

TWI311154B - Method of detecting pathogenic microorganism

Info

Publication number: TWI311154B
Application number: TW090132333A
Authority: TW
Inventors: Shimada Masamitsu; Hino Fumitsugu; Kato Ikunoshin
Original assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-12-26
Publication date: 2009-06-21
Also published as: EP1347060A4; EP1347060A1; JP4092201B2; JPWO2002052043A1; CN1491285A; WO2002052043A1; KR20030064420A; US20040185455A1

Description

11 131 絲2333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月）五、發明説明（1 ) A7 B7 <Yl I修正補充技術領域本發明係有關於在病原微生物的檢測上，有用的寡核菩酸探針、引子、使用這些（探針及引子）的病原微生物檢測方法以及使用該方法之套組。背景技術病原微生物之檢測方法’已知有以免疫學檢測該微生物而來之蛋白質之方法進行’或者將該微生物而來之基因的特定區域’以核酸增幅反應加以增幅而進行檢測之方法等。上述檢測基因的特定區域之方法中，例如有使用核酸增幅反應之檢測法。該核酸增幅反應，例如有，美國專利第4,683，195號、第4,683,202號、及第4,800，159號所記載之聚合酶鏈鎖反應法（PCR法）、生技趨勢（Trends in Biotechnology)第10卷、146〜152頁（1992)所記載之方法與逆轉錄酶反應组合而成之逆轉錄PCR法（RT-PCR法）、1989 年6月14曰所公開之歐洲專利申請案第320,308號所記載之結合酶鏈鎖反應（LCR; ligase chain reaction)法、PCR操作手冊（PCR Protocols, Academic Press. Inc.，1990)中， 245〜252頁所記載之轉錄增幅系統（TAS; transcription-based amplification system)法。又，可在等溫狀態下實施之核酸增幅法亦被開發出來。舉例來說，有特公平7-114718號所記載之股置換型增幅 (SDA; strand displacement amplification)法、自立複製（3SR; self-sustained sequence replication)法、日本國專利編號第 26501 59號所記載之核酸序列增幅（NASBA; nucleic acid -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝訂

線

1 WoH〗3〗號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月）五、發明説明（2 ) sequence based amplification)法、TMA (transcription-mediated amplification)法、日本國專利編號第2710159號所記載之Q泠複製酶法、甚至有美國專利編號第5,824,517 號、國際公開第99/09211號小冊子、國際公開第95/25180 號小冊子、或者國際公開第99/49081號小冊子等所記載之各種改良的SDA法。美國專利編號第5,916,777號所記載，在等溫狀態下之寡核苷酸的酵素性合成方法。進一步，國際公開弟00/28082號小冊子記載之LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification)法、國際公開第 00/56877號小冊子 1己載之 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法。如此地，在病原微生物之檢測方法中，有各式可利用之核酸增幅法，但為滿足現場實際檢查病原微生物的檢測感度之要求，欲選擇適合其各自的核酸增幅反應之標的核酸區域、適合其各自的核酸增幅方法之引子以及適合接續其各自的核酸增幅反應後之標的核酸檢測方法，毋寧是困難的。進一步，更要求要能以低操作費用’同時具有結果再現性之病原微生物檢測方法。以下，茲以結合菌群、淋菌、披衣菌（Chlamydia)、C型肝炎病毒（HCV)舉例說明。 (a)結核菌群結核病係佔從前人類死因前幾位之疾病，而即使在已開發出各種治療法的現在，也仍存在有許多病患。結核病之診斷，過去係以培養法、塗抹法進行，但由於結核菌發育速度緩慢，至得到檢查結果需1〜8週、欠乏一般約1個月與迅速性、正確性亦僅70%以下，因此並非完 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公鳘) 1311154 A7 B7 五、發明説明（3 ) 美的診斷方法。基於此一背景，最近，就以結核菌之基因為標的，而嘗試由喀痰等開發出直接、迅速、正確之檢測法及試劑。上述結核菌群中，包含結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、牛結核桿菌（Mycobacterium bovis BCG)、非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum)、田氣結核桿菌 (Mycobacterium microti)、坎尼提結核桿菌（Mycobacterium canetti)。舉例來說，已經有報告發現，可由喀痰等的檢體中，萃取DNA，並以PCR法迅速檢測結核菌存在之方法 [(Lancet)，第8671號，第1069頁（1989)]。該方法係以結核菌之65kDa抗原的編碼基因作為標的，以PCR法增幅，並以電泳法檢測之方法。又，可將16 S核醋體RN A加以增幅，再將增幅產物以化學發光探針進行檢測之套組，目前亦已市售[基因探針（Gen-Probe)公司]。進一步，編碼16S核醣體RNA之DNA為標的之PCR套組，亦已市售（羅氏公司）。另一方面，結核菌群中具有特異性之IS61 10基因序列，已經公開[核酸研究（Nucleic Acids Research)，第18卷，第 188頁（1990年）]，其被記載在結核菌群的檢測上是有用的。實際上，有報告指出以PCR法進行之IS6110基因的檢測方法[臨床微生物雜誌（J. Clin. Microbiol.)，第28卷，第 2668頁（1990)]。其後，有多數報告關於以IS6 110基因為標的之PCR法的論文，並記載其有用性。又，尚有不同於 PCR法之其他核酸增幅法，如以SDA法進行之IS6110基因 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 .—____B7 五、發明説明（4 ) 檢測相關之曰本專利第2814422號、以1^艮法進行之156110 基因檢測相關之特表平10-500023號。然而，對於上述之結核菌檢測方法’在實際的臨床上仍然法令人滿足’而期望能進一步地加以改善。舉例來說，以核醣體RNA基因為標的之核酸增幅檢測法雖已被廣泛報告，但就是將屬於Mycobacterium屬之共通部分加以增幅，再以種特異性探針來進行鑑定。該方法中，在決定對於結核菌之特異性時’就只有探針序列而已，很多報告指出在檢測感度的觀點上無法令人安心，且很多病症即使為培養陽性檢體’也沒有被檢測出來。另一方面，為提昇特異性及檢測感度，如上所述，亦有報告PCR法，其係將 IS6110的結核菌特異性基因作為標的。但是，在七個以 IS6 110為標的進行檢測之設施的比較研究中，確認以該方法得到的偽陽性之比率為3〜77%，而感度則為2〜90%，亦即各個設施中’其檢查結果竟有極大的差異[臨床微生物學雜誠（Journal of Clinical Microbiology)，第 32卷，第 277 頁（1994)]。另一方面’基於從檢體萃取核酸之方法的繁雜度，以及對於檢測員的感染等觀點，亦非考慮良善之萃取法。又’在增幅產物的檢測法中，亦有利用雜合反應法，但過去都是將所增幅之雙股核酸先在液體層以強鹼使其變性’再將變性之單股核酸在互補核酸的共同存在下，於中性條件下與探針進行雜合的方法（羅氏公司之增幅套組說明書）。在其中，探針的雜合反應，其問題點在於由雙股本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（5 ) 所分離之互補增幅核酸，會有競合性妨礙導致感度•特異性無法提昇之情形。亦即，所增幅之雙股DN A —旦因為驗性變性而成為單股，其在中和之後在中性條件下，就會與探針進行雜合反應。又，若不適於鹼性變性時雖亦有熱變性，但其並不可能將多數的檢體，進行精密度良好之檢測。因此，就造成了步驟繁多，且產生之單股DNA又會與探針進行競合性的雜合反應，而使得標的核酸之檢測感度降低。又，在過去的方法以及市售的套組中，由採取檢體到結果報告出爐，約需6小時以上，雖然像結核病這種感染疾病需要儘早進行診斷，並將病患加以隔離處理，但從採取檢體到報告結果，不能當天馬上處理卻須等到第二天，從而不能將結合感染的傳播中止在最小限度内，就變成公衛上尚未解決的最大問題點。基於以上所公開之資訊，明顯地，尚無針對結核菌的可信賴、且在醫療上有用的檢測法。 (b)淋菌淋菌（Neisseria gonorrhoeae)，是在美國被報告最為廣泛之細菌性感染的一種淋病病原體。在Miyada and Born， 1991, Mol. Cell. Probes 5: 327-335 ；美國專利第 5,256,536 號；以及美國專利第5,525,717號中，係使用與淋菌胞嘧啶 DNA甲基轉移酶基因（M. Ngo PII)的序列，具有在統計上有意義的相同性之開放閱讀序列（Open Reading Frame, 0RF1)，將由包含該ORFI之基因組片段而來之DNA探針， -8- 本紙伕尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）裝訂

線 1311154 A7 B7 五、發明説明（6 ) 作為檢測淋菌（N. gonorrhoeae)之用。然而，尚無對淋菌具特異性且有充分感度之檢測方法。又，由淋菌感染之病患，亦報告會由砂眼披衣菌 (Chlamydia trachomatis)所感染。 (c) 披衣菌（Chlamydia) 所謂「披衣菌」，係屬於披衣菌屬之微生物。披衣菌屬中的三種，砂眼披衣菌（C. trachomatis)、鹤鴻熱披衣菌（C. psittaci)、肺炎披衣菌（C. pneumoniae)，會感染人類宿主而引起疾病，在臨床上相當重要。特別是砂眼披衣菌，在男女兩性皆會引起性器的感染症，從而被報告為先進社會中最普遍的性傳染病。因此，有必要開發出能將砂眼披衣菌特異性地、且適時地檢測出來之方法及試劑。

(d) HCV 過去，血清等試劑中的HCV檢測，係以逆轉綠PCR (RT-PCR)法進行。此方法之進行步驟共計10個，為（1)由血清萃取HCV之RNA ; (2)將萃取之RNA作為模板而合成 cDNA ; (3)升降溫度，以進行PCR法之增幅；（4)與固定化探針進行雜合反應；（5)將未反應試劑洗淨除去；（6)與標誌試劑進行反應；（7)將未反應試劑洗淨除去；（8)添加呈色試劑；（9)添加呈色停止試劑；（10)測定吸光度。又，在 J. Virol. Methods Vol. 64, ρρ147·159 (1997)中，亦記載了使用實時（real time)檢測PCR法之同質性檢測法，來檢測HCV 之研究。如上所述，可將HCV以高感度、簡便、且大量檢體地， -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐）

裝玎

A7 B7

mii^lu32333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月）五、發明説明i"!~) 迅速進行低價測定者，基於血液製劑、輸血、捐血之品質管理、治療經過之判定、病例的監控、或者治療費用:二低等觀點，是非常重要的。然而，上述PCR法中，必須將溫度嚴密地加以控制，因此測定機械之操作亦頗為繁雜，此外，其處理能力在目前，僅為5小時中96個檢體的界限而已。從而，血液中心及臨床檢查中心所要求，在2小時内檢查1 0 0 0檢體以上的大量檢體之檢測，就變成不可能了。如此地，過去的方法，存在著各種各樣的問題，而企盼著一種能在一定時間内’將多數檢體中之HCv核酸，簡便且短時間地進行測定之技術。發明之目的本發明之主要目的，就是提供一種方法，可在一定時間内，關於多數之檢體，將病原微生物以高感度、簡便、且短時間地，方便地進行檢測之方法。發明之梃要本發明者們進行深入研究之結果，發現了一種病原微生物的檢測方法，其係利用較過去的核酸增幅方法更優良的核酸增幅方法，同時發現一種用於該方法之標的核酸增幅用嵌合寡核苷酸引子及標的核酸檢測用探針。進一步，並構築用於該方法之套組，而完 '成了本發明。亦即’本發明之第1個發明，係有關於一種探針，其特徵係可檢測結核菌群之結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、牛結核桿菌（Myc〇bacterium bovis BCG)、非洲刀枝桿菌（Mycobacterium africanum)、田氣結核桿菌 -10- 本紙張尺度㈣T „家標準(CNS) Μ規格(灿χ29姆) 1311154 A7

(Mycobacterium microti)、及/或坎尼提結核桿菌 (Mycobacterium canetti)的探針，並係含有序列表之序列編號39所記載的鹼基序列或其一部分之探針，或者係序列表之序列編號Π所記載的鹼基序列之探針。本發明之第2個發明，係有關於一種探針，其特徵係可檢測淋菌（Neisseria gonorrhoeae)的探針，並係含有序列表之序列編號27所記載的鹼基序列或其一部分之探針，或者係序列表之序列編號21所記載的鹼基序列之探針。本發明之第3個發明，係有關於一種探針，其特徵係可檢測砂眼披衣菌（Chlamydia trachomatis)的探針，並係含有序列表之序列編號22所記載的鹼基序列或其一部分之探針’或者係序列表之序列編號20所記載的鹼基序列之探針。本發明之第4個發明，係有關於一種探針，其特徵係可檢測HCV的探針，並係序列表之序列編號34、35所記載的鹼基序列之探針。本發明之第5個發明’係有關於一種可在鹼性區域與病原微生物之標的核酸雜合之探針。在本發明之第5個發明中’係以pH 8〜14的鹼性區域中，可與病原微生物之標的核酸雜合的探針為理想，且該病原微生物的標的核酸，則以由結核菌、淋菌、披衣菌、HCV而來之標的核酸的任一者之探針為理想。又，病原微生物之標的核酸係以由結核菌群之IS6110基因、淋菌之CppB基因 '披衣菌之pLGV440 、HCV之5'非轉譯區域的鹼基序列所選擇，且可與該基因 11 - m丨97^〇.淨7日修正 Ιΐι 13 1 1.ί§_132333號專利申請案中文说明書替換頁(97年10月）五、發明説明（9 )' 雜合之探針為理想。該探針令，結核菌群例如有含有於漏H)基因之序列表的序列編號39所示之驗基存^ 其-部分之驗基序列所構成的探針，理想則為序列# 所示之驗基序列構成的探針。又’淋菌例如有含有存在於cPPB基因之序列表的序列編號27所示之鹼其列、或其-部分之驗基序列所構成的探針，理想則為二表的序列編號21所示之鹼基序列構成的探針。又，披衣例如有含有存在..於PLGV440基因之序列表的序列編號：不之鹼基序列、或其一部分之鹼基序列所構成的探針，理想則為序列表的序列編號20所示之鹼基序列構成的探針。進一步，HCV例如有含有存在於5ι非轉譯區域之序列表的序列編號34、35所示之.鹼基序列、或其—部分之驗基序列所構成的探針，理想則為序列表的序列編號34、35所示之鹼基序列構成的探針。本發明之第1〜第5個發明的探針，亦可附加標誌。該探針，亦可為病原微生物檢測用探針，其特徵為其係具有序列表之序列編號U、20、21、34、35所示之鹼基序列令，連續8個鹼基至53個鹼基所構成之鹼基序列的寡核苷酸，且其螢光標誌者係在與標的核酸雜合時其螢光強度不會被抑制，而不與標的核酸雜合時其螢光強度就會被抑制。又，亦可為病原微生物檢測用探針，其特徵為其係具有序列表之序列編號11 ' 20、21、34、35所示之鹼基序列中，連續8個鹼基以上所構成之病原微生物檢測用探針，其係y 末端以若丹明系螢光色素或噚嗪系螢光色素標誌之探 1311154 A7

五、發明説明（針’並係序列表之序列編號34所示的鹼基序列中，連續8 個驗基以上所構成者。又’亦可為病原微生物檢測用探針’其特徵為其具有之標諸螢光色素係報導子（〒刪勞光色素及庫恩查(—)色素，且係由序列表之序列編號11、20、21、34、35所示之驗基序列中，連續8個驗基以上所構成者。上述之報導子色素可為螢光素系色素，而庫恩查色素則可為DABCYL系色素。$ —步，該探針亦可為由螢光物質、色素、酵素、生物素、金膠體、以及放射性同位素中選擇’而適當地附加之探針。本發明之第6個發明，係有關於病原微生物之檢測方法，並包含使用本發明之第卜第5個發明的探針，且進行與病原微生物之標的核酸的雜合反應之步驟。在本發明之第6個發明中，可在鹼性區域内與病原微生物之標的核酸進行雜合反應。又，該病原微生物例如有結核菌群、淋菌、披衣菌、HCV。該病原微生物若為結核菌群時’標的核酸理想為IS6110基因或其片段，可將由結核菌而^之 IS6110基因及/或其片段増幅以後，再將増幅物與本發明之第1或第5個發明的探針’進行雜合反應為理想。又，使用具有序列表之序列編號36、37各自表示之鹼基序列、或該序列中一部分重複之序列的引子，再將由結核菌群而來之 IS6110基因及/或其片段加以增幅為理想β又，該病原微生物若為淋菌時’標的核酸理想為CppB基因或其片段，可將由淋菌而來之cppB基因及/或其片段增幅以後，再將増幅物與本發明之第2或第5個發明的探針，進行雜合反應為理 _ -13- 本故張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 93 ίί· 2 4 修年月曰‘充 1311154 第090132333號專利申請案中文說明書替換頁(幻年u'月、 A7 ----二 B7 五、發明説明（1丨）想。又’使用具有序列表之序列編號28、29各自表示之鹼基序列、或該序列中—部分重複之序列的引子，再將由淋菌而來之cPPB基因及/或其片段加以增幅為理想。又，該病原微生物若為披衣菌時，標的核酸理想為pLGv440基因或其片段，可將由披衣菌而來2pLGV44〇基因及/或其片段 S幅以後’再將增幅物與本發明之第3或第$個發明的探針，進行雜合反應為理想。又，使用具有序列表之序列編號23〜26各自表示之鹼基序列、或該序列中一部分重複之序列的引子，再將由披衣菌而來之PLGV440基因及/或其片段加以增幅為理想。又，該病原微生物若為HCV時，標的核奴理想為HCV的5,非轉譯區域或其片段，可將由HCV而來<5’非轉譯區域及/或其片段増幅以後，再將增幅物與本發明之第4或第5個發明的探針，進行雜合反應為理想。又，使用具有序列表之序列編號3〇〜33各自表示之鹼基序列 '或該序列中-部分重複之序列的引子，再將由HO而來之5非轉澤區域及/或其片段加以增幅為理想。本發明之第7個發明，係有關於病原微生物之檢測方法：其偉、包含使用纟發明之第6個|明的病原#生物之標的核酸的檢測方法，而檢測由結核菌群、淋 HCV而來之核酸的步驟。水囷本發明之第8個發明，係有關於病原微生物之檢洌方法=徵為其係包含以下列步驟之核酸增幅方法所2 < 幅核酸進行檢測，亦即，係關於 ⑷將作為模板之核酸、去氧核酶核|三磷酸、具有股 -14- 本紙張尺度適財® a家標準(CNS)域格_χϋ------ 1311154 第-090132333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月)

B7

五、發明説明（12 ) 置換活性之DNA聚合酶、至少1種類的引子、以及RNaseH 加以混合’而製作成反應混合物之步驟；在此，該引子係與作為模板之核酸的驗基序列實質上互補，且至少含有由去氧核醣核坧酸或核苷酸類似物所選擇者及核醣核菩酸，該核醣核苷酸並為該引子的3,末端或在3,末端方面所配置之嵌合寡核苷酸引子；以及， (b)以反應產物可生成之充分時間’孵育反應混合物之步驟。在本發明之第8個發明中，進一步，與作為模板之核酸的鹼基序列係具有實質上相同之序列的嵌合寡核甞酸引子，以使用含有該引子之反應混合物者為理想。又，該嵌合寡核苷酸引子，其理想者係使用以下述一般式表示之嵌合寡核甞酸引子。通式· 5*-dNa-Nb-dNc-3* (a: 11以上之整數；b: i以上之整數；c: ◦或丨以上之整數；dN:去氧核醣核：y：酸及/或核菩酸類似物；n:未修飾核醣核甞酸及/或修飾核醣核甞酸，又，dNa之部位的—部分亦可被取代為dN或N) 又，^述嵌合寡核：y：酸引子之〇亦可為〇，核甞酸類似物可為去氧核醣次黃㉝呤㈣酸、去氧核醣尿树核#酸，而修飾核醣核苷酸則可為（a_s)核醣核苷酸。又，並以使用由序列表之序列編號13〜16、23〜26、28〜31各自表示的驗基序列所構成之嵌合寡核芬酸引予為理想。進一步，亦可包含使用本發明之第1〜第5個發明的探針，而檢測增巾5 -15-

1311154 五、發明説明

核酸之步驟。本發月〈第9個發明，係有關於以下述—般式表示之病原微生物檢測用的嵌合寡核^:酸引子。通式：5’-dNa-Nb-cmC-3， (3··11以上之替赵.u·，尤藏，b. 1以上之整數；c: 0或1以上之整數；dN :去最妨；1 乳核騎核甘酸及/或核甞酸類似物；N:未修飾核酷核^:酸及欠久/或修飾核醣核苷酸，又，dNa之部位的一部分亦可被取代為dN或N) 在本發明I第9個發明中，^理想可為〇，該核替酸類似物可為去氧核醣次黃嘌呤核苷酸去氧核醣尿嘧啶核荅酸’而修飾核醣核苷酸則以（a_s)核醣核苷酸之嵌合寡核苷酸引子為理想。其雖無特別之限制，但例如以使用由序列表之序列編號13〜16、23〜26、28〜3 1各自表示的病原微生物檢測用之嵌合寡核芬酸引子為理想。本發明之第10個發明係有關於，具有序列表之序列編號 3 6、3 7所各自表示的驗基序列、或該序列中一部分重複之序列’且用以將由結核菌群而來之IS6110基因及/或其片段加以增幅之引子；具有序列表之序列編號27所各自表示的鹼基序列、或該序列中一部分重複之序列，且用以將由淋菌而來之cppB基因及/或其片段加以増幅之引子；具有序列表之序列編號22所各自表示的鹼基序列、或該序列中一部分重複之序列，且用以將由披衣菌而來之pLGV440基因及/或其片段加以增幅之引子；具有序列表之序列編號 4卜43所各自表示的鹼基序列、或該序列中一部分重複之 -16- 本紙浪尺度適用中國國i^(CNS) A4规格(⑽x 297公釐) 裝訂

1311154 年第090132333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月) B 補充

發明説明（序列，且用以將由HCV而來之5,非轉譯以增幅之引子。戈’、片段加 2月之第_發明中，上述引予，亦可為其驗基序列—部分被㈣核《取代之丧合寡核誓酸引子。又，在 f發明之第9及第1〇個發明巾，亦可附加標結。刪，例如有勞光物質、色素、酵素、生物素、及金膠體。本發明之第11個發明，係有關於標的核酸檢測用之組合物，其特徵為含有本發明之第丨〜第5個發明的探針。本發明之第12個發明，係有關於標的核酸檢測用之組合物，其特徵為含有本發明之第9〜第1〇個發明的引子。本發明之第11及第12個發明，可使用於病原微生物之檢測。本發明之第13個發明，係有關於病原微生物檢測用之組。物，其係用於本發明之第6〜第8個病原微生物之檢測方法的組合物，並包含至少丨種試劑以進行標的核酸之增幅或雜合反應。在本發明之第13個發明中，亦可含有由具有股置換活性之DNA聚合酶、RNaseH、及去氧核醣核甞三磷酸中，加以選擇之試劑。該DNA聚合酶，可為由卡朵鐵鈉桿菌 (Bacillus caldotenax)而來之5，〜3,核瞀酸外切酶缺損之 BcaDNA聚合酶；該RNaseH可為由焦球菌（Pyr〇coccus)屬細菌而來及/或古球菌（Archaeoglobus)屬細菌而來之Π型 RNaseH。本發明之第14個發明，係有關於病原微生物檢測用之套 -17- 本紙張尺度適财關家標準(CNS) A4規格(21GX 297公董_)·

裝

線 4 4 於11. 年·Μ 1314被32333號專利申請案中文說明書替換頁(幻年^月）五、發明説明（15 組’其特徵係含有本發明之第卜第5個發明的探針。在本發明之第14個發明中’亦可含有本發明之第9〜第10 :發明的引子。該套組，可使用於結核菌群 '淋菌、披衣菌、HCV之檢測。又，該套組，可為用於本發明之第6〜第 :個發明的病原微生物的檢測方法上使用之套組，並可包含至少1種試劑，以進行標的核酸之增幅或雜合反應。又，亦可含有由具有股置換活性2DNA聚合酶、RNaseH ^及去氧核醣核苷三磷酸中，加以選擇之試劑。該dna聚二酶，可為由卡朵鐵鈉桿菌而來之5，— 3，核甞酸外切酶缺抽又BcaDNA聚合酶；該RNaseH可為由焦球菌屬細菌而來及/或古球菌屬細菌而來之II型RNaseH。進一步，亦可含 $用以捕捉增幅產物之載體，該載體理想則係由微滴定盤、微珠、磁性微珠、薄膜、及玻璃中，加以選擇之載體。本發明之第15個發明，係有關於結核菌群之檢測方法，其特徵係包含在結核菌群之檢測方法中，將含有結核菌之檢體以胞壁酸酶（Muramidase)處理，並萃取核酸之步驟。附圖之簡單說明圖1係表示根據本發明之方法，在測定各種hCV_rna濃度時，比較HCV-RNA濃度與螯光強度之變化關係，以及比較與過去方法在測定範圍上之差異情形。發明之詳細說明本說明書中’所謂的「去氧核醣核苷酸」（本說明書才°己載為dN) ’係指糖部分由D-2 -去氧核酷所構成之 -18- 本紙張尺度適财關家標準(CNS) Μ規格^綱挪公爱)

裝訂

線五、發明説明（ 93. Η. 24^ΓΤ] 年月日申4,月) · ϊ « * 補无

^甘酸’舉例來說’如鹼基部分且有腺碑八嘌呤、胸腺嘧啶者。進一 ^腺π 7、胞嘧啶、鳥含具有7-脫氮伙迷去氧核醣核苷酸，亦包乳馬核θ寺的修飾驗氧次黃嗓呤核芬酸之爹 Α《纟乳核酶核芬酸及去本說明書中，所噌；「乳核骑核苷酸類似物。載為Ν)，係指糗部a + u .核甘鉍」（本說明書中亦記 ’係心糖邵分由0·核醣所構基邵分具有腺嘴呤、胞❹ ^例如有驗此 ,, 馬％呤、尿°密嗓者。推一步，该核醣核贫酸亦包本供絲> 4、， α位置之蹯核甞酸。舉例來說，酸子被取代成麵子之修飾核醣核芬等，便包含^其中核芬酸、U_S)N]，以及其他衍生物 f，明書中，所謂的「嵌合寡核苷酸引子」，係指含有糖㈣酸及核醣財酸之引子而言。該引子亦可包含核苷酸類似物及/或修飾之核苷酸。本發明中所使用之嵌合寡核菩酸引子，其只要該引子的 3:末端或在3’末端方面配置有核醣核苷酸，可在本發明之万法中將核醣鏈加長’ &内核#酸酶切斷，並進行股置換反應者即T ’不論何纟皆包含於本發明之嵌合寡核苷酸引中。本說明書中’所謂的「3’末端方面」，係指在核酸，例如引子中，由其中央部向3,末端延伸之部分。同樣地，「5'末端方面」，係指在核酸中，由其中央部向5，末端延伸之部分。本說明書中，所謂的「内核甞酸酶」，其只要是對於藉 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) S3. A7 年 B7

131域糾132333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月）五、發明説明（17 ) 由與模板核酸冷卻配對之上述嵌合寡核苷酸引子進行DNA 加長所生成之雙股DNA，可加以作用，從而將該引子的核醣核甞酸部分特異性切斷者即可。本說明書中，所謂的「DNA聚合酶」，係指可以DNA鏈為模板而合成新DNA鏈之酵素而言，除了天然性的DNA聚合酶，亦包含具有前述活性之變異體酵素。該酵素，例如有具有股置換（Strand displacement)活性之DNA聚合酶、不具有5'-> 3'核甞酸外切酶活性之DNA聚合酶、同時具有逆轉錄酵素活性及内核苷酸酶活性之DNA聚合酶。本說明書中，所謂的「股置換活性」，係指依據作為模板之核酸序列來進行DNA複製之時，一面進行DNA鏈之取代，一面使與模板鏈冷卻配對之互補鏈游離，從而可以進行股置換（Strand displacement)之活性之意。本說明書中，所謂的「鹼性區域」，係指pH 7以上之區域。本說明書中，所謂的「病原微生物」，係指病原性之細菌及病毒。本說明書中，所謂的「標的核酸」，係指由作為核酸增幅或檢測對象之病原微生物而來的基因中，任意之區域而言，包含DNA或RNA之任一者、以下，茲詳細地說明本發明。 (1)本發明之探針本發明之探針，其特徵係可檢測如結核菌群、淋菌、披衣菌、或HCV等病原微生物。本發明之探針的適當型態， -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

裝玎

1311154

五、發明説明例如有可在鹼性區域下安 ^ ^ 文疋並與標的核酸雜合者。亦即，本發明之可在驗性區域下推尸换人 … 巧下進仃雜合的探針，並無特別之限例如可在超過pH 7 〇之區域，理想為pH 8〜14之範圍，特別理想為pH 8〜pH 1〇之鹼性範圍條件下可與具有其驗基序列之互補序列的科的& # ^ 的&的核酸’進行雜合反應之探針。其並無特別之限制’但例如有含有序列表之序列編號Η、 20 21 34 35所έ己載之驗基序列者。又，本發明之探針’可在過去之中性自域下進行冑合反應。使用本發明之探針，將雙股核酸讀性處理變性為單股之後，可不經中和就進行雜合反應之步驟。從而，反應過亦可簡化，且感度亦提高至過去方法的1〇倍以上。又，藉由在驗性區域進行雜合反應，還可提昇雜合反應之特異性。與由檢體而來之核酸雜合的探針，其檢測方法並無特別之限制，任何習知之檢測方法皆可適用於本發明。將上述本發明之探針，以適當的方法標誌而使用時就可以將存在於樣品中之標的核酸，有效率地及/或高感度地進行檢測。探針之標达方法並無限制，例如可使用放射性同位素 (32p等）、色素、螢光物質、發光物質、各種配體（生物素、異起基洋地肓毒配質等）、酵素等。被標諸之探針，可以違標達'相對應之檢測方法確認其存在。若無法直接檢測配體時’亦可將附加有可檢測標誌的配體結合性物質，組合於其中。舉例來說，將配體標誌探針與酵素標誌之抗 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 尤I0,正丨 131 If 5淨132333號專利申請案中文說明書替換頁(97年1〇月）五、發明説明（19 ) 配體抗體組合，再將訊號加以增幅，便可以高感度檢測出標的核酸。進一步，上述之探針，亦可為具有用以檢測之標社質。標誌物質，並無特別之限制，理想例如可使用受體物質、放射性同位性元素、螢光、發光、呈色之任一者。本發明之方法中’將具有標㈣質之探針與標的區域有增幅之核酸，進行雜合反應，並將游離之探針洗淨後進行檢測之方法，或者省略該洗淨步驟，亦即所謂的均質性檢測法，其任一者均適合使用。利用螢光之該均質性檢測法，例如可使用 Proc·，Natl. Acad· Sci USA，ν〇ι 85， P8790〜8794 (1988)所記載之螢光共振能量轉移（fret; Fluoresence resonance energy transfer)法、Nature Biotechnology，v〇l· 14，p3〇3〜3〇8 (1996)記載之分子貝肯 (Molecular Beacons)法、Anal Chem ，v〇i 72、: p3? 17~3?24 (2000)所記载之聰明探針（Sman pr〇be)法等。本發明型態之一種，例如分子貝肯法或聰明探針法其 =將該探針之5,末端以若丹明系或呤嗪系色素標誌，3，末端則以會引起遽冷（qUenching)之鹼基序列的募核苷酸及報導子色素加以標誌，進一步，該探針之5，末端方面及31末端方面再進行自我冷卻配對反應。使用上述探針時，若以本發明之增幅方法所增幅之核酸存在時，探針會與該增幅核酸雜合，並使探針之自我冷卻配對構破壞，結果就使得螢光強度不被抑制，而發射出螢光訊號。另一方面，增幅核酸若不存在時，探針仍會保 -22- 本紙張尺度通财關家料(CNS) M規格(21GX297公羡）裝訂 131 If 5斗132333號專利申請案中文說明書替換頁(97年〗〇月）一· - 五、發明説明（20 ) 持自我冷卻配對構造，由於螢光強度被抑制之故，螢光吨號便無法被檢測。 ° 亦即，若為聰明探針法時，前述螢光色素係以若丹明系色素或呤嗪系色素為理想，該色素之性質，只要是結合於2 述探針之5'末端，並與3,末端之鹼基序列協調，當該螢光探針不結合於標的核酸時，螢光色素被抑制，但該螢光探針結合於標的核酸時，螢光色素就不被抑制者，即可。另一方面，亦可為分子貝肯法之組合，即當該螢光探針未結合於標的核酸時，由於螢光共振能量轉移，可使得其螢光強度被抑制，當探針結合於（標的核酸）時，螢光強度就不被抑制。又這些螢光色素，係以FAM (6,羧基_螢光色素）及丁八河11八 (6-羧基·四曱基若丹明）及JA242 (噚嗪）及DABCYL (4_四曱胺基唑苯-4’-磺醯氣化物）為理想。這些螢光色素皆係習知’並已經市售。又，將养核苷酸以螢光標誌之方法，舉例來說，可利用 Nuc. Acids Res. » v〇l. 12 » p3387~3403 (1984) > J. Am. Chem. Soc.，vol. 112，pl253〜1254 (199〇)，或者 Αη&ι

Chem·，vo1. 70，P4771-4779 (1998)所記載之方法。 ,本發明之探針的鏈長，並無特別之限制，舉例來說，可為12 mer以上，理想可為20 mer以上，最理想可為40 mer 以上。本發明之結核菌群檢測用的探針，可檢測結核桿菌 (Mycobacterium tubercul〇sis)、牛结核桿菌（Myc〇bacterium -23- 本紙張尺度顧巾關家標竿(CNS)从見格(21QX 297公董) 1311154. A7 B7 五、發明説明 bovis BCG) ' 非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum)、田結核桿菌（Mycobacterium microti)、坎尼提結核桿菌 (Mycobacterium canettip該探針，可為檢測標的核酸之核酸，或亦可配合生物而選擇適當者，其並無特別之限制，例如可使用在結核菌群之檢測中，將IS6丨丨〇基因作為標的核酸之探針’其可由序列表之序列編號12所示、且由結核菌而來之IS6110基因的鹼基序列中，選擇適當之區域來加以設計。其並無特別之限制，但舉例來說，可由包含序列表之序列編號39所記載之鹼基序列的區域中，理想為由包含岸列表之序列編號4 0的區域中，最理想則為由包含序列表之序列編號38的區域中，來加以選擇。特別是可選自包含序列表之序列編號1 1之鹼基序列的區域。上述之探針，由於能安定地、且高特異性地，與由結核菌而來之 IS6110基因、或其片段，進行雜合反應之故，因此其在該基因之檢測，甚至於結核菌群之檢測上，特別有用。本發明之淋囷檢測用探針，可檢測淋菌（Neisseria gonorrhoeae)。該探針’可為檢測標的核酸之核酸，或亦可配合生物而選擇適當者，其並無特別之限制，例如可使用在淋菌之檢測中’將cryptic plasmid proteinB (cppB)基因作為標的核酸之探針，其可由序列表之序列編號27所示、且由淋菌而來之cppB基因的鹼基序列中，選擇適當之區域來加以設計。其並無特別之限制，但舉例來說，可由包含序列表之序列編號2 7所記載之驗基序列的區域中，理想為由包含序列表之序列編號2 1的區域中，來加以選擇。上述 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 -----____ B7 五、發明説明（22 ) 足探針，由於能安定地、且高特異性地，與由淋菌而來之 cppB基因、或其片段，進行雜合反應之故，因此其在該基因之檢測，甚至於淋菌之檢測上，特別有用。本發明4披衣菌檢測用探針，可檢測披衣菌（Chlamydia trachomatis)。該探針，可為檢測標的核酸之核酸，或亦可配合生物而選擇適當者，其並無特別之限制，例如可使用在披衣菌〜檢測中’將隱蔽質體（cryptie plasmid) pLGv44〇作為標的核酸之探針’其可由序列表之序列編號22所示、且由披衣菌而來之PLGV440基因的鹼基序列中，選擇適當之區域來加以設計。其並無特別之限制，但舉例來說可由包含序列表之序列編號22所記載之鹼基序列的區域中，理想為由包含序列表之序列編號44的區域中，更理想則為由包含序列表之序列編號20的區域中，來加以選擇。上述；之探針’由於能安定地、且高特異性地，與由披衣菌而來. 之PLGV440基因、或其片段，進行雜合反應之故，因此其在孩基因之檢測，甚至於披衣菌之檢測上，特別有用。本發明之HCV檢測用探針，其只要是對於標的核酸増幅時所使用，夾在前方面引子與後方面引子間的區域之鹼基序列’能夠進行雜合反應之探針即可，並無特別之限制。又，該探針之長度，並無特別之限制，理想為8個鹼基〜5 3 個驗基、特別理想為8個鹼基〜36個鹼基的範圍間’加以選擇即可。舉例來說，可由序列表之序列編號43所示之鹼基序列中，選擇具有上述範圍間、連續8個鹼基以上之鹼基序列的探針，其並無特別之限制，但例如有具有序列表之 __ -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1311154

序列編號34或35所示之鹼基序列中，連續8個鹼基以上之探針。 (2)本發明之檢測方法装訂

線本發明心標的核酸的檢測方法，可使用上述（丨）所記載工探針，而在由標的核酸之雙股變性為單股的變性步騾後，省略中和步驟。亦即，在本發明之標的核酸的檢測方法中，可在pH 7以上之鹼性條件，特別理想為pH 8〜14範園的鹼性條件下，與其鹼基序列互補之核酸進行雜合反應。该雜合反應之條件，並無特別之限制，但例如有「嚴密之條件」等業者習知之條件。此種條件，可使用在1989 年，冷泉灣實驗室發行，T曼尼提斯（T Maniatis)等人編輯’分子選殖實驗室手冊第二版（M〇iecuiar ci〇ning: A Laboratory Manual 2nd ed.)中所記載，以及本發明實施例所記載者。代表性的雜合反應溶液之組成，有以下：含有〇 5〇/〇 SDS、5xDenhardt’s [Denhardt’s: 0.1%牛血清白蛋白（BSA)、 0.1%聚乙烯吡咯烷酮、〇.1〇/0 Fic〇U 400]、及100# g/ml鮭魚精子 DNA之 6 X SSC(1 X SSC 為 0.15M Naa、0.015M檸檬酸鈉）。此外’本發明中之雜交反應溶液之pH亦可調整為 8〜14之範圍實施。又’雜合反應之溫度’並無特別之限制，但例如可在較探針之Tm值低5°C以上的溫度實施。在此，探針之Tm值，例如為下式所求得者：

Tm= 81.5— 16.6(logi〇[Na+])+〇.41(%G+C) —(600/N) -26- 本紙張尺度適用中固國家樣準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1311154 A7 I------— B7 五、發明説明（24P ~ --- (式中’ N為探針之鏈長，％g+c則係寡核：y：酸探針引子中，鳥嘌呤及胞嘧啶之殘基的含有量）。又，探針之鏈長若較18個鹼基為短時，Tm可由下式： Tm= [(%Α+Τ) χ 2+(%〇+C)x4] (式中’（/〇A+T)為探針中的腺嗓呤及胸腺。密咬殘基之本有量’（％G+C)則為探針中鳥嘌呤及胞嘧啶之殘基的含有量），來推定而得到。藉由在上述之雜合反應條件下，確認探針與標的核酸之雜合情形’就可以選定在標的核酸之檢測上最為適當之探针。本發明之檢測方法中’雜合反應之條件並無特別之限制’可使用習知之雜合反應條件，理想則為嚴密的雜合反應條件。又’雜合溶液的pH可調整為8〜14之範圍。本發明之標的核酸的檢測方法中，其一種型態例如可在結核菌群之檢測方法中，使用適於由結核菌群而來之 IS6110基因檢測的探針’其並無特別之限制，但本發明例如可為含有序列表的序列編號39所示之鹼基序列或其一部分、理想為含有序列表的序列編號4〇所示之鹼基序列或其一部分、更理想為含有序列表的序列編號38所示之鹼基序列或其一部分、最理想則為含有序列表的序列編號丨丨所示之驗基序列或其一部分所構成的探針。又，在淋菌之檢測方法中’使用適於由淋菌而來之cppB基因檢測的探針，其並無特別之限制，但本發明例如可為含有序列表的序列編號27所示之鹼基序列或其一部分、理想為含有序列表的序 _____-27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A*規格(21〇χ 297公董) 1311154 A 7 B7 五、發明説明（25 ) — 列編號2 1所示之鹼基序列或其一部分所構成的探針。又’ 在披衣菌之檢測方法中，使用適於由披衣菌而來之 pLGV440基因檢測的探針，其並無特別之限制，但本發明例如可為含有序列表的序列編號22所示之鹼基序列或其一部分、理想為含有序列表的序列編號44所示之鹼基序列戒其一部分、更理想為含有序列表的序列編號20所示之鹼基序列或其一部分所構成的探針。又，在HCV之檢測方法中，其並無特別之限制，可為5'非轉譯區域，例如可為含有序列表的序列編號43所示之鹼基序列或其一部分、理想為含有序列表的序列編號34所示之鹼基序列或其一部分、或者為含有序列表的序列編號35所示之鹼基序列或其一部分所構成的探針。本發明之病原微生物的檢測方法，可使用上述（1)記載 f 之探針而將各個病原微生物特異性地進行檢測。亦即，上述之探針，由於能安定地、且高特異性地，與由各病原微生物而來之基因、或其片段，進行雜合反應之故，因此其在該基因之檢測，甚至於各病原微生物之檢測上，特別有用。進一步，在本發明之檢測方法中，使用上述（丨）記載之探針，可在超過pH 7之鹼性條件下，理想為pH 8〜14之範圍，特別理想為pH 8〜10之條件下，與含有核酸之樣品間，進行雜合反應。亦即’該方法所提供者，係可在標的核酸之變性步驟後’不經中和反應，而檢測出由病原微生物而來之基因、或其片段的方法，從而利用該方法便可以 ___________ -28- 本紙張又度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(21〇X297公复） 1311154 發明說明（檢’則出含在檢體内之結核菌等。本發明之方法，可用於存在於樣品中之特定基因的檢〉貝|| 、H7 吹I °亦即’可由可能含有DNA或RNA等核酸之全部樣〇 . 、 °°甲，進行特定基因的檢測、定量。前述之樣品’並無特別之限制’例如可由全血、血清、血塊黃層、尿、糞月翅脊髓液、精液、唾液、組織（例如，癌組織、淋巴節菩、 )、細胞培養物（例如’哺乳動物細胞培養物及細菌培 $物等）等生體而來之樣品、可能混入或感染有病毒或細菌等极生物之樣品（食品、生物學性製劑等）、或土壤、排夂等所可能含有之生物的樣品中，進行特定基因之檢測、足量。甚至，舉例來說，根據標的核酸之存在與否，就可用於上述病原微生物的存在之檢測、定量等。病原性微生物 < 檢測万法，特別是在衛生、環境的領域上相當有用。在上述檢測法中作為模板而使用之核酸不論是rna或 DNA之任一者，皆適合使用。由這二材料t作含有核酸之調製物，並無特別之限制，舉例來說’可以利用界面活性劑之溶解處理、超音波處理、利用玻璃微珠之震錢拌、法式壓碎等來進行。在幾個例子中’進一步再純化核酸則更為有利(舉例來說當有内在性《酸酶存在時卜在這些料中核酸之純化可以苯驗萃取 '色層分析、離子交換、凝膠電泳或密度分配離心分離等習知之方法來進行。若以具有由RNA而來之序列的核酸為標的時可以該作為挺板進行逆轉錄反應，並將所合成之雜當作 . _ -29- 本紙張又度適财® S家標準(CNi7I^(21QX2·!^

裝 π

補充年 L3 1 y细1.32333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月）五、發明説明（28 ) 熱性桿菌屬細菌而來的DNA聚合酶等。其並無特別之限制，舉例來說，好熱性桿菌屬細菌而來的DNA聚合酶為理想、B. st而來的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）、甚至Bca DNA聚合酶為理想。舉例來說，Bca DNA聚合酶，在逆轉錄反應時無須錳離子，且可在高溫條件下，抑制模板RNA 之二次構造形成的同時，合成cDNA。具有上述之逆轉錄酵素活性之酵素，亦可在具有該活性之範圍内，使用天然生成者、或變異者之任一者。以上述方法分離之基因組DNA及PCR片段等雙股DNA ’ 以及以全RNA或mRNA進行逆轉錄反應而製作之cDNA等單股DNA ’其任一者均適合作為本發明所使用之核酸增幅法中的模板DNA。上述若為雙股DNA時，可進行變性 (Denature)使成為單股DNA之步驟。如上所述，與本發明之探針雜合的標的核酸上之區域，可以適當之核酸增幅方法進行增幅，再將其用於雜合反應中。所使用之核酸增幅方法，並無特別之限制，只要是能將標的核酸上之區域加以增幅者即可。舉例來說，可使用聚合酶鏈鎖反應法（PCR ; polymerase chain reaction，美國專利第 4,683，195 號、第 4,683,202 號、及第 4,800，159號）、結合酶鏈鎖反應（LCR ; ligase chain reaction)、股置換型增幅法（SDA ; strand displacement amplification，特公平 Τ-ΐ 14718 號）、自立複製法（3SR ; self-sustained sequence replication)、核酸序列增幅法（NaSBA 法；nucleic acid sequence based amplification，專利第 2650159號）、TMA 法 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公爱) 13 1 y (^132333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月） Α7 Β7

補充五、發明説明（29 ) (transcription-mediated amplification)、Q/3 複製酶法（專利第 2710159 號）、ICAN 法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids ，國際公開第 00/56877號小冊子）等。 IC AN法，係使用嵌合核苷酸引子及内核甞酸酶、以及具有股置換活性之DN A聚合酶，在等溫條件下，將具有模板核酸上之特定鹼基序列的DNA，連續地進行增幅之方法。在此，所謂的「連續地」，係指在反應不因反應溫度、反應液組成之變更而影響其進行而言。又，本說明書中所謂的「等溫」，係指酵素及核酸鏈在上述各步驟中可發揮其功能，從而在實質上成為一定之溫度條件而言。一般而言，嵌合核苷酸引子及内核苷酸酶，係使用由去氧核醣核苷酸及核醣核甞酸所構成，且其中核醣核苷酸係配置於其3’末端或3’末端方面者。舉例來說，具有下述一般式表示之構造的寡核甞酸，就可用來作為IC AN法之引子。通式：5’-dNa-Nb-dNc-3i (a: 11以上之整數；b: 1以上之整數；c: 0或1以上之整數；dN :去氧核醣核苷酸及/或核苷酸類似物；N :未修飾核醣核苷酸及/或修飾核醣核苷酸，又，dNa之部位的一部分亦可被取代為dN或N) 又，上述之核苷酸類似物，例如可使用去氧核醣次黃嘌呤核苷酸，而修飾核醣核甞酸，舉例來說，則可使用（a-S) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 131 14S4l32333號專利申請案 Γ * Ei P修正中文說明書替換頁(93年11月）会;；:年」^. i4補充五、發明説明（30 ) 核醣核苷酸。在不失去其實質上引子功能之範圍内，該核苷酸類似物可被包含於其内。該引子，可以模板上希望被增幅之區域的5'方面、3’方面之鹼基序列為基礎，作成具有與5’方面之鹼基序列相同的序列，以及與3'方面之鹼基序列互補的序列二種，然後再增幅來使用。本發明所使用之内核苷酸酶，只要是針對與模板核酸冷卻配對之上述記載的嵌合寡核甞酸引子，進行DNA之加長所生成的雙股DNA，可作用並發生股置換反應，從而切斷其加長鏈者即可。亦即，其係可在上述之雙股DNA中，嵌合寡核苷酸引子部分上，產生缺口之酵素。其並無特別之限制，舉例來說，可使用在本發明之核醣核苷酸酶，特別以針對由DNA及RNA所形成之雙股核酸的RNA部分，可發生作用之内核苷酸酶H (RNaseH)為理想。又，該核醣核甞酸酶，其只要是具有上述作用者，不論是常溫性或耐熱性之任一者，皆適於本發明中使用。舉例來說，如下述實施例所示，在約50°C〜約70°C的反應下，由大腸菌（E. coli)而來之RNaseH便可以使用於本發明的方法中。又，在本發明之方法中，耐熱性之核醋核苷酸酶亦適合使用。該耐熱性之核醣核苷酸酶，並無特別之限制，舉例來說，除了市售的 HybridaseTM Thermostable RNaseH (艾比先特技術公司製）之外，還有由好熱性芽胞桿菌屬細菌、嗜熱屬細菌、焦球菌屬細菌、熱托卡屬細菌、古球菌屬細菌、甲炫1球菌屬細菌等而來之RNaseH等。進一步，該核醣核嘗酸酶，不論天 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

131 y &+32333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11'月）五、發明説明（31 ) 然體或變異體皆適合使用《又，本說明書中所記載之 RNaseH的酵素單位，係基於實施例中之參考例所示的酵素單位測定方法所表示的數值。、又，上述之RNaseH，只要是可使用於本發明之方法中即可，並無特別之限制，舉例來說’可為各種的病毒、噬菌體、原核生物、真核生物而來之任一者。進一步，細胞性之RNaseH或病毒性之RNaseH的任一者亦可。舉例來說’上述細胞性RNaseH例如有大腸菌RNaseH，病毒性 RNaseH則例如有由HIV-1而來之RNaseH。本發明之方法中所使用之RNaseH型，可為I型、Π型' ΙΠ型的任一者。雖並無特別之限制，舉例來說，理想可使用由大腸菌而來之 RNaseHI、由焦球菌屬細菌而來或由古球菌屬細菌而來之 RNaseHI。又，本發明之方法中所使用的内核铝酸酶，舉例來說，由於RNaseH的切斷反應之效率，會因為上述引子的3,末端附近的鹼基序列所影響，從而影響所期望之〇1^人增幅效率之故，必須要針對所使用2RNaseH來設計最適合的引子。 ICAN法中，可使用具有會進行DNA股置換（strand displacement)活性之DNA聚合酶。又，實際上不具有5，—3, 核芬酸外切酶活性者，則特別適合使用。、在ICAN法中所使用之DNA聚合酶，其只要是具有上述 I股置換活性者即可，並無特別之限制，舉例來說，有由卡朵鐵納样菌（Bacillus caldotenax ’以下簡稱B,㈣及脂肪 -34- 本紙張尺度適财關家標準(CNS) A4規格(21Q χ挪公董) --------* 131 lg§4i32333號專利申請案年月曰修正中文說明書替換頁(93年11月） g 1)；· 11 2 4 補充五、發明説明（32 ) 嗜熱桿菌（Bacillus stearothermophilus，以下簡稱B. st)等的妤熱性桿菌屬細菌而來之DNA聚合酶的5'— 31核甞酸外切酶活性缺失之變異體，以及由大腸菌而來之DNA聚合酶I的大片段（Klenow片段）等。又，本發明所可使用之DNA聚合酶，可為常溫性至耐熱性之任一者皆適合使用。上述之酵素，可為由原本之來源進行純化而取得者，或亦可為遺傳工程上所生產之重組蛋白質。又，該酵素可以遺傳工程或其他方法進行取代、缺失、附加、插入等的改變，這種酵素的例子，有5’— 3'核苷酸外切酶活性缺失之Bca DNA聚合酶的BcaBEST DNA聚合酶（寶酒造公司製）等。該酵素在50 °C〜70°C顯示活性，係適合使用於該方法中。又，在DNA聚合酶之中，已知有在特定之條件下，具有内核苷酸酶活性（例如RNaseH活性）者。此種DNA聚合酶可使用於本發明之方法中。亦即，有一種使用型態為將該 DNA聚合酶在RNaseH活性可表現之條件（例如Mn2+之存在下）下來進行。在該型態中，可不添加上述之RNaseH而實施本發明的方法。亦即，在含有Mn2 +之緩衝液中，上述之 Bca DNA聚合酶及顯示具有RNaseH活性。上述之型態不只限於Bca DNA聚合酶，由已知同時具有RNaseH活性之習知的DNA聚合酶（例如親熱性嗜熱菌（Thermus thermophilus)) 而來之Tth DNA聚合酶，亦可使用於本發明中。 ICAN法，係將嵌合寡核苷酸引子、含有作為模板核酸之樣品、内核苷酸酶、DNA聚合酶、去氧核醣核苷三磷酸 (dNTP)等前述酵素可顯示活性之組合的緩衝液，加以混 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

裝 ΤΓ

綠 131 lg^4l32333 號專利申請案 j P μ/· >·^：·： Δ 7 ' ' * »- * 中文說明書替換頁(93年11月) Β7 ί骀1124補无: _^------------—^ i；_ 五、發明説明（33 ) 合，再將該反應液以適當的溫度，充分地進行保溫以便反應產物生成來進行。又，在反應之前，亦可先將嵌合寡核甞酸引子與作為模板之核酸加以混合，保持在雙股核酸可變性之溫度（例如 90°C以上）後，冷卻至本發明之方法可使用的反應溫度以下，再進行冷卻配對，但這並非增幅反應上所必須之步驟。又，在本發明之檢測方法中，以RNA作為模板時，亦可將逆轉錄反應與核酸增幅反應在一個階段中進行。其並無特別之限制，該逆轉錄酵素與股置換型DNA聚合酶的組合，適合者例如有AMV RTase、MMLV RTase或RAV-2 RTase與Bca DNA聚合酶之組合。進一步，亦可使用具有逆轉錄酵素活性與股置換活性的單獨之DN A聚合酶。本發明之標的核酸的檢測方法，可由含有核酸之樣品，直接地將標的核酸增幅來進行。此時，所增幅之標的核酸的鏈長，並無特別之限制，但基於感度優良且可檢測標的核酸之觀點，舉例來說，理想係以200 bp以下，更理想為 150 bp以下之區域為有效。藉由將本發明之嵌合寡核甞酸引子設定成該增幅之鏈長，就可以高感度檢測出樣品中之標的核酸。進一步，在本發明之檢測方法中，使用含有二#乙甘胺酸、麥黃酮、HEPES、$粦酸鹽或Tris緩衝成分之反應緩衝液，以及含有精胺質及丙鄰二胺之冷卻配對溶液，就可以由微量之核酸樣品，進一步地以高感度檢測出標的核酸。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公董) 131 y&432333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月） A7 B7

修正 24補充五、發明説明（34 ) 此時，所使用之内核苷酸酶與DNA聚合酶並無特別之限制，例如可為由大腸菌而來、由焦球菌屬細菌而來或由古球菌屬細菌而來之RNaseH及BcaBEST DNA聚合酶的組合。特別是，上述内核甞酸酶及DN A聚合酶，會因為種類而有不同之適合單位數，此時，以檢測感度之提昇或增幅產物量之增加作為指標，再調整該緩衝液之组成及酵素的添加量即可。又，使用雙股的模板DNA與2種嵌合寡核苷酸引子的核酸增幅方法之型態中，基於該反應之條件，會導致各引子在加長反應中各自之模板-加長鏈中間體之間，產生模板之交換，然後所合成之引子加長鏈等就可以生成冷卻配對之雙股核酸。此雙股核酸在兩端具有嵌合寡核苷酸引子，然後就可以由其兩端再一次利用股置換，來開始互補鏈加長反應。此反應之結果，可生成在一端具有引子序列之增幅產物。進一步，此反應中若發生模板之交換時，就會再度生成與前述相同之雙股核酸。本發明中所利用之核酸的增幅方法，可包含使用具有上述股置換活性之DNA聚合酶，並進行模板交換反應之步驟。在股置換反應中，具有上述之模板交換反應能力的DNA 聚合酶，例如有5'— 3'核嘗酸外切酶活性缺損之Be a DNA聚合酶的變異體酵素，就特別適合。該酵素係以BcaBEST DNA聚合酶（寶酒造公司製）而市售。在本發明之檢測方法中，在標的核酸增幅之時，會將本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1311154

dUTP作為基質而取用。因此，在將dUTp作為基質時利用尿喊唉N-糖:y：酶（uracii N-glycosidase : UNG)來將增幅產物分解’就可以防止由增幅產物攜帶過度所造成之污染的偽陽性情形。在本發明之檢測方法中，為以上述之核酸增幅方法檢測所增幅之標的核酸，可使用習知之核酸檢測方法，例如電泳所進行之特定大小的反應產物之檢測方法，以及以探針及雜合反應所進行之檢測等。進一步’以磁性微珠等組合之檢測方法亦適於使用。為進行上述電泳之檢測，一般是使用溴化乙錠等的螢光物質，但亦可與探針在雜合反應中加以組合。又’探針除了使用放射性同位素標誌之外，亦可使用生物素及螢光物質等非放射性物質來進行標諸。此外’在上述之（b)步驟中，使用標誌核苷酸，就可以將標諸核替酸抓取至增幅產物上，而很容易地進行檢測並利用該標誌而增強檢測用之訊號’進—步，亦可利用營光偏光法、螢光能量轉移等而進行檢測。進—步，藉由構築適當的檢測系統，就可从自動地檢測標的核酸，並且進行標的核酸之定量。又，以雜合色層分析法所進行之肉眼檢測法’亦適合使用。在可成為消光狀態之距離下’配置2種類以上之螢光物質所加以標誌之核醣核棼酸（RNA)引子，或核醣核甞酸及去氧核酷核：y：酸所構成之嵌合寡核菩酸引子，其任何一者皆適於使用在本發明之檢測方法中。該探針並不會產生螢光，但在與由互補性標的核酸而來之増幅DNa冷卻配對 -38· 本紙張尺度適用中國画家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱)

裝訂

1311154 A7 B7 五、發明説明（36 ) 時，RNaseH則會將該探針分解。其結果，探針上之螢光物質間的距離會增大，並會產生螢光，從而就可知道標的核酸之存在。使用RNaseH而實施本發明之核酸增幅方法時，只要在其反應液中添加上述之探針，就可檢測出標的核酸。該探針之標誌上所使用的螢光物質，例如有6-FAM (6-carboxyfluorescein)及 TAMRA (N，N, N1，N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine)之組合為理想。在本發明之檢測方法中，若使用等溫下之增幅方法時，必須要有熱循環器等的裝置。又，在本發明之增幅方法中，所使用之引子為1種或2種，而較過去的方法為少。由於dNTP等試劑亦可使用於PCR等中，可就便拿過來使用之故，營運成本係較過去的方法為低。進一步，因為本發明之方法比起PCR法，可以更短時間得到更多產物之故，所以可利用為簡便、迅速、高感度的基因檢測方法。使用本發明之檢測方法時，為解析大量的檢體，可將反應系統微量化，甚至再組合提高密集度之方法亦可。此方法中的一種，係使用最先進的超微細加工技術，將本發明之檢測方法的基本步驟，例如由細胞萃取DNA、核酸增幅反應、標的DN A的檢測等步騾，組合集中於數公分大小〜指甲大小的微晶片上。進一步，若有需要，亦可將凝膠或毛細電泳、檢測用探針加以組合，而進行雜合反應。該系統，亦稱為微晶片、微CE(capillary electophoresis)晶片或奈米晶片。

此種系統中之核酸增幅反應，其只要是可將標的之DNA -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 ________ B7____ 五、發明説明（37 ) 片段加以增幅者即可，任一種核酸增幅反應皆可以利用。其並無特別之限制，但例如可為ICAN法等可在等溫條件下將核酸增幅之方法。藉由組合該方法，可使該系統單純化’從而就非常適於利用在上述集積化之系統中。進一步’利用本發明之技術，可更進一步的構築高集積度之系統。在本發明之檢測方法中，並無特別之限制，但其適合者例如有具有序列表之序列編號13 ~ 16所各自表示之驗基序列的結核菌群檢測用嵌合寡核甞酸引子、具有序列表之序列編號28〜29所各自表示之鹼基序列的淋菌檢測用嵌合寡核芬酸引子、具有序列表之序列編號23〜26所各自表示之驗基序列的披衣菌檢測用嵌合寡核芬酸引子、具有序列表之序列編號30〜3 1所各自表示之核酸序列的HCV檢測用嵌合寡核苷酸引子。使用上述之嵌合寡核：y：酸引子，將樣品中之標的核酸加以增幅，再以電泳或實際時間（Real_time) 進行檢測’就可以確認標的之增幅產物。進一步’在本發明之檢測方法中，可使用由含有序列表之序列編號11、12、38〜40所各自表示之鹼基序列的區域中選擇之結核菌檢測用探針、由含有序列表之序列編號27 所表示之鹼基序列的區域中選擇之淋菌檢測用探針、由含有序列表之序列編號22、44所各自表示之驗基序列的區域中選擇之披衣菌檢測用探針、以及由含有序列表之序列編號43〜45所各自表示之鹼基序列的區域中選擇之HCV檢測用探針，而檢測出標的核酸。 -40- •張&度巾a g家標準(CNS) A4规格(21GX 297公釐) ~ 13111-54 A7 B7 五、發明説明（38 ) 在本發明之方法中，若使用等溫核酸增幅方法時，只要其具有恆溫層作為必備的反應裝置者即可，倒不需要熱循環器等嚴密的裝置。又，測定標誌訊號之裝置，可使用市售之分光光度計、螢光檢測器、培養盤讀取計等。因此，在一般進行大量的檢查業務之處所，就可以大量迅速地進行檢體測定。進一步，本發明之方法所必須的試劑亦已經市售。使用本發明之方法進行HCV檢測時，係由檢體根據一般方法，製作成含有萃取之HCV的RNA、逆轉錄反應用之引子、逆轉錄酵素（若使用具有逆轉錄活性之DNA聚合酶時，就不需要逆轉錄酵素）、dATP、dGTP、dCTP、dTTP 之dNTP混合溶液，於一定溫度下將HCV-RNA所生成之 cDN A作為模板，以上述嵌合寡核甞酸引子及ICAN用DN A 聚合酶使標的核酸增幅，再將其與上述螢光標誌探針以均質系進行雜合反應，然後測定其螢光強度。反應之具體條件係詳述於下述實施例中。反應中，首先係將HCV-RNA作為模板而合成cDNA，然後，再將此cDNA作為模板以IC AN法進行DNA之增幅。增幅DNA，因為含有與上述螢光探針互補之區域，因此螢光探針就會與單股狀態的增幅DNA進行雜合。另一方面，樣品中若不存在有HCV之RNA時，就不會產生雜合反應，螢光強度就被抑制而導致螢光強度很弱。因此，藉由測定螢光強度，就可以簡便、迅速、高感度地檢測出樣品中之 HCV的 RNA。 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝訂

線 1311154 A7 B7 五、發明説明（39 本發明之方法，係於均質系中沒有洗淨步驟的情形下，以螢光強度來測定HCV的RN A。本發明的另一個優點’則是改變螢光色素’並改變測定之波長，就可以多項目來同時進行測定。亦即，在血液中心，其不僅HCV，即便 HBV、HIV、HTLV亦為重要之檢查項目，準備其各自的特異性ICAN用引子及探針，將各探針以不同測定波長之螢光色素加以標諸，就可以同時測定出上述項目。又，測定反應終點的螢光強度’就可以進行如在血液中心等的大量檢體之高感度測定，另一方面’動態地將反應進行螢光測定’也可以達成治療監控用的定量測定之目的。因此，根據本發明之方法’像過去RT-PCR法等將溫度升降之複雜特殊的機器就不需要了’在有限的時間、設備内無法測定大量的檢體之不方便也被改良’洗淨步驟也不需要了，所以非常之便利。 (3)本發明之引子在本發明之檢測方法中所使用之引子，例如有嵌合寡柱甞酸引子。該引子，係由去氧核醣核苷酸、核甞酸類似物、非修飾性或修飾性核醣核甞酸所構成，而核醣核芬酸則配置於其3'末端或3'末端方面。舉例來說，具有下迷— 般式中所示構造的寡核苷酸’可作為IC AN法之引予而使用° 通式：5.-dNa-Nb-dNc-3， (a : 11以上之整數；b : 1以上之整數；c : 〇或1以上之整數；dN:去氧核醋核：y：酸及/或核：y；酸類似物；未 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐） 1311154 A7 —---------B7 五、發明説明（4〇 ) 修飾核醣核苷酸及/或修飾核醣核甞酸，又，dNa之部位的 —部分亦可被取代為dN或N) 又，上述核苷酸類似物，舉例來說，可為去氧核醣次黃 π呤核甘酸、去氧核醣尿嘧啶核荅酸或經修飾的去氧核醣核苷酸等，而修飾核醣核苷酸，舉例來說，則可為（a_s) 核醋核答酸。遠引子係以模板上期望增幅之區域的5，方面、3，方面的鹼基序列為基礎，而作成與5_方面鹼基序列具有相同序列者' 以及與3’方面鹼基序列互補者二種，並加以增幅來使用。本發明中，舉例來說，關於欲進行結核菌群檢測之樣品中’除進行上述方法之核酸增幅反應以外，在增幅物與本發明 < 探針間進行雜合反應，亦可以檢測出結核菌群。用於核酸增幅之引子，可以序列表之序列編號12所示的結核菌群IS6H0基因的鹼基序列作為參考，再設計成各種核酸増幅方法使用上所適合者而作成。其雖無特別之限制，但例如由IS6110基因中的序列表之序列編號39所示的鹼基序列或包含其一部分之區域，理想者例如序列表之序列編號 4〇所示的鹼基序列或包含其一部分之區域，更理想者例如序列表之序列編號3 8所示的鹼基序列或包含其一部分之區域’來進行增幅所得到者。進一步，含有序列表之序列編號11所記載之鹼基序列的區域，亦為適於増幅者。進一步，在本發明之引子中，將過去所報告之結核菌群 IS6 Π0驗基序列的多型，由基因銀行的基因資料庫進行解 -43- 本紙張尺度適财S g家標準(CNS) A4規格_χ297公爱) 1311154 A7 _一_____ B7 五、發明說明（Μ ) 析’仔細檢查與結核菌群之IS6 1 10具有相同性之類緣序列’特別理想者’例如使用具有序列表之序列編號36、37 所各自表示的鹼基序列之核酸增幅用引子時，就可以高感度且定量地來進行核酸之增幅。因此，該引子在各種核酸增幅法所進行之結核菌群IS6110基因或其片段的增幅上，都相當有用。本發明中’與上述結核菌群之檢測相同地，藉由使用可檢測淋菌、披衣菌、HCV之探針、嵌合寡核苷酸引子，就可以適當地對其等進行檢測。該引子並不限於上述之驗基序列，具有該驗基序列周圍、亦即該序列一部分重複之序列者，亦適於使用在本發明中。亦即，配合使用之核酸增幅方法的特徵，再選擇該序列有重複之適當的鹼基序列，就可以作成引子。這些嵌合寡核甞酸引子，在可具有任意之核酸序列的情形下’使用應用生物系統公司（ABI公司，Applied Biosystems Inc.)的DNA合成儀394型’就可以Phosphoamidite法加以合成。又，其他方法尚有填酸三酯法' H-鱗酸鹽法、硫代鱗酸鹽法等，不論用什麼方法來合成都可以β 以IC AN法進行核酸增幅時之引子，只要在該方法可使用之情形下’亦可將引子之3’末端部分的去氧核醣核益酸，取代成核醣核苷酸。此種引子的一個例予，例如有在序列表之序列編號13〜16、23〜26、28〜31上所各自表示之鹼基序列的嵌合寡核甞酸引子。進一步，這些引子亦可以適當的物質（例如螢光物質' -44- 1311154 A7 B7 五、發明説明（42 ) 色素、配體類（生物素、異羥基洋地黃毒配質）、或金膠體等），來加以標誌，舉例來說，使用以配體類標誌之引子，就可以將增幅之標的核酸捕捉至載體上，從而提供一高感度且具有簡便定量性之測定方法。此時，固相例如有微滴定盤、微珠、磁性微珠、薄膜、或玻璃等。在喀痰檢體之萃取DNA樣品中，不只人類DNA，連氣管常見細菌及病毒而來的DN A亦包含於其中。因此，為調查本發明所開發之引子的特異性，就嘗試由無結核菌感染病歷之自願者，採取其喀痰檢體來進行結核菌基因之增幅。在此試驗中，不呈現陽性結果者，就可證明本引子之特異性。針對由38名自願者採取之喀痰的萃取DNA，使用上述之嵌合寡核甞酸引子，就可以用ICAN法來進行IS6 110基因片段之增幅。其結果，沒有1例被確認為陽性結果，而證明對於上述引子之結核菌的高特異性，這顯示非IS6 110標的DNA將不會呈現偽陽性。 (4)本發明之组合物本發明係提供在前述（2)之本發明的檢測方法中所使用的組合物。該組合物，舉例來說，如含有上述（1)記載之探針及上述（3)記載之引子。或者，亦可為含有上述探針之檢測用組合物及含有上述引子之增幅用組合物之型態。進一步，亦可為含有醋酸鎂之組合物及含有引子之组合物的型態。進一步，亦可含有緩衝成分及dNTP等。進一步，亦可含有經修飾之去氧核醣核甞酸或去氧核甞三磷酸之類似物。進一步，亦可含有針對本發明之組合物中的試 -45 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS). A4規格(210 X 297公釐）

線 1311154 A7 B7 五、發明説明（43 ) 劑之分解、失活等導致之非增幅狀況（偽陰性），而用於確認之内部標準（IC ; internal control) °該内部標準，可根據本發明之引子來加以增幅。又，其他型態，則例如有含有適於本發明之檢測方法的组合之上述各種成分的組合物，該組合物只要添加適當的模板以及嵌合寡核甞酸引子，就可以進行增幅反應。進一步，如果該欲被增幅之對象在一開始就清楚的話，則以含有適於該增幅對象進行增幅之嵌合寡核甞酸引子的組合物為理想。特別適合之型態，例如有含有適於本發明之核酸增幅方法的組合之上述各種成分的組合物，該組合物只要添加適當的模板就可以進行增幅反應。進一步，當含有檢測用探針時，就可以實際時間檢測由病原微生物而來之標的核酸。雖並無特別之限制，但舉例來說，在HCV之檢測中，使用本發明之方法、及用於該方法之組合物或套組時，相較於過去的AmpliCore HCV套組之2 ORDER的測定範圍，其可擴大至3 ORDER之範圍。又，過去的AmpliCore HCV套組，相較於其使用時間為約5小時，本發明中可將使用時間大幅縮短至約45分鐘。因此，就可以增加至目前須1日處理之檢體數。 (5)本發明之套組本發明之套組，係病原微生物而來之標的核酸檢測用之套組，其並無特別之限制，但在超過pH 7的鹼性條件下， -46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（44 ) 可與標的核酸雜合之探針，雖並無特別之限制，但舉例來說，其特徵為含有上述（1)記載之探針。又，本發明之套組的一種型態，例如有用於檢測結核菌群之套組。該套組之特徵，係含有可特異性檢測出以下菌群之探針；Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovisBCG 、 Mycobacterium africanum 、 Mycobacterium microti及 /或 Mycobacterium canetti。該套組，在超過 pH 7 的鹼性條件下，亦可用於結核菌群之檢測。又，本發明之套組的一種型態，例如有用於檢測淋菌之套組β該套組之特徵，係含有可特異性檢測出Neisseria gonorrhoeae之探針。該套組，在超過pH 7的驗性條件下，亦可用於淋菌之檢測。又，本發明之套組的一種型態，例如有用於檢測披衣菌之套組。該套組之特徵，係含有可特異性檢測出Chlamydia trachomatis之探針。該套组，在超過pH 7的驗性條件下，亦可用於披衣菌之檢測。又，本發明之套組的一種型態，例如有用於檢測H C V之套組》該套組之特徵，係含有可特異性檢測出HCV之探針。該套組，在超過pH 7的鹼性條件下，亦可用於HCV之檢測。進一步，在上述套組中，亦可含有引子來作為其他的實施型態。進一步，亦可針對將標的基因增幅之核酸增幅法所用的試劑（DNA聚合酶等）、在探針檢測反應所使用之試劑、由檢體萃取核酸時所用之試劑等，而為含有其等試劑 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7

131 14 &Jl32333號專利申請案中文說明書替換頁(93年11月）五、發明説明（45 ) 之套組。該套組，由於可將本發明之結核菌群等的檢測方法，以簡便、迅速地進行之故，因此十分適合。該套組，特別是在關於許多樣品要調查其中之結核菌群等是否存在時，可以高再現性、信賴性而提供檢查之結果。又，其亦可含有用於確認偽陰性之内部標準（IC ; internal control)、以及該内部標準檢測用之探針。該内部標準，可利用本發明之引子來進行增幅。進一步，在一個實施型態中，該套组在成為包套型態中，其特徵為含有本發明之探針、引子、DNA聚合酶及内核苷酸酶所使用之指示書。進一步，亦可根據指示書選擇，並使用市售之DNA聚合酶及/或内核甞酸酶。進一步，若RNA當模板時，亦可含有逆轉錄反應用試劑。DNA 聚合酶，可由上述之DNA聚合酶中加以選擇。又，内核苷酸酶，則可由Pfu而來之RNaseHII或Afu而來之RNaseHII的任一者，來加以選擇。上述所謂的「指示書」，係包含記載該套組之使用方法 (例如股置換反應用試劑液之製備方法、建議之反應條件等）的印刷物，除了小冊子或說明單型式的說明書以外，還包括添付於套組之標籤，以及在收納套組之盒子等上所記載的内容。進一步，亦包含經由網際網路等電子媒體，而揭示、提供之資訊。又，本發明之套組中，亦可含有蠶豆葡糖苷、麥黃酮、 HEPES、磷酸鹽或Tris緩衝成分之反應緩衝液，以及冷卻配對溶液。又，亦可含有DNA聚合酶及RNaseH。進一本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（46 ) 步，也可含有經修飾之去氧核醋核嘗酸或去氧核货三鱗酸之類似物。本發明之套組中，藉由適當地選擇檢測用之探針，就可提供可在實際時間檢測由病原微生物而來之標的核酸的套組。 (6)本發明之核酸萃取方法本發明係提供可以高感度檢測結核菌等之核酸萃取方法。亦即，由臨床標本來萃取核酸，是很精細的步驟，由尿、胸腔液、骨髓液、血液等的液態檢體，到膿、喀痰等的濃厚黏性檢體，甚至於細胞、組織等，其對象實極為廣泛。現在，由這些檢體來萃取結核菌等的基因時，尚未存有標準的的操作方法，因此到現在為止所報告之結核菌等的基因檢查報告中，就使用了各種各樣的核酸萃取方法。這些傳統的方法，有的在試劑中混合了各種界面活性劑、驗性、有機溶劑、或離液（Chaotropic)試劑，有的則在玻璃微珠的存在下進行超音波處理。本發明者們將上述的各種傳統方法，以及到目前為止從 Listeria屬、Lactobacillus屬以及 Streptococcus屬萃取核酸時所使用的胞壁酸酶（muramidase，由放線菌Streptomyces globisporus而來者，係由西格瑪公司以”mutanolysin"為名販售），比較其在結核菌上使用之方法，發現將結核菌以胞壁酸酶消化之方法係最優良之方法。又，並發現將經過該酵素消化之菌體，進行5分鐘之煮沸處理，可進一步得到更為優良之結果。 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1311154. A7 B7 五、發明説明（47 ) 將含有結核菌之樣品以胞壁酸酶處理30分鐘’然後再進行96°C、5分鐘之處理後，以ICAN法將基因增幅並進行結核菌之檢測。其結果，令人驚訝地，相較於過去以界面活性劑等試劑，本發明可以10倍感度來檢測出結核菌DNA，而這也是相當於結核菌5個複製數的基因组的檢測感度。上述一連串的檢測操作，在過去使用界面活性劑及離液試劑的方法中，可將混入核酸萃取液之成分所造成的對於核酸增幅反應之抑制效果加以排除。進一步，施行加熱處理亦可造成對於結核菌等之殺菌效果，這樣便可以針對過去檢查人員困擾的檢查室中的結核菌感染上，產生預防效果的優點。因此，本操作手冊之發明，就可以迅速、安全、同時高感度地，進行結核菌等的DNA之萃取。舉例來說，若使用喀痰時，首先係以習知之喀痰處理方法的 NALC (N-acetyl-L-cysteine) -NaOH 法將落痰處理之後，再實施上述之本發明的核酸萃取方法為理想。亦即，本發明之檢測方法中，亦可以包含將含有結核菌等之檢體以胞壁酸酶加以處理，而將核酸萃取之步驟。在上述之本發明的檢測方法中所使用的全部的操作手冊，亦即探針、引子、核酸之萃取方法、核酸増幅方法，係極迅速且具信賴性，同時可以高感度進行解核菌之檢測。若使用該方法時，從採取檢體到結果報告為止，只要 3小時便可以完成，相較於過去需要6小時之套組（例如羅氏公司製的套組），檢查時間可以縮短1/2以上。亦即，本發明之方法可以在同一天中便提供檢查之結果，從而可儘 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 ________Β7_ 五、發明説明（48—) ' ---- 早將感染病患隔離，此在公共衛生上，以及結核病傳播白勺早期預防上，可帶來相當大的社會貢獻。以下’茲以實施例進行進一步詳細說明本發明，但本發明之範圍則不限於實施例之範圍。又’基於本發明，針^ 因為多重攜帶造成之增幅產物的污染方面之改良，以及將内部標準物質及其他結核菌等的基因進行同時増幅、檢測的改良，其不論任一者均應係習於此技藝者所容易類推並改良者。實施例以下，茲將本發明基於實施例具禮地加以說明，但本發明並不限於下述實施例。參考例1焦球菌（Pyrococcus furiosus)之RNaseHII基因之選殖 (1) 焦球菌（Pyrococcus furiosus)基因組DNA之製作將蛋白腺（Difco實驗室公司製）1%、酵母萃取物（Difco實驗室公司製）0.5%、可溶性澱粉（那可莱提斯公司製）1%、甲馬林S ·固體（甲馬林實驗室公司製）3.5%、甲馬林S ·液體（甲馬林實驗室公司製）0.5%、MgS04 0.003%、NaCl 0.001%、FeS04 · 7H20 0.0001%、CoS04 0.0001%、CaCl2 · 7H2〇 0.0001% ' ZnS04 0.0001% ' CuS04 · 5H20 0.1 ppm、 KA1 (S〇4)2 0.1 ppm、H3BO4 0.1 ppm、Na2Mo〇4 · 2H20 0.1 ppm ' NiCh · 6H20 0.25 ppm所組成之培養基2升’加入2升容積之中等瓶中，以120°C殺菌20分鐘之後，加入氮氣’ 再除去溶解於其中之氧氣，接種焦球菌（pyrococcus -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)_ A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 _____B7 五、發明説明（49 ) furiosus，由妥以契•薩姆倫克•逢•米闊卡尼斯曼購得： DSM3638)，於95°C下靜置培養16小時後，離心分離得到菌體。然後，將所得到之菌體懸浮於4毫升之25%蔗糖、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)中，再加入0.4毫升之10毫克/毫升的氣化溶菌酶（那可菜提斯公司製）水溶液，於2(TC下反應1小時。反應終了後，在此反應液上，加入24毫升之150 mM NaCl、1 mM EDTA、20 mM Tris-HCl (pH 8_0)、0_2毫升之 20毫克/毫升的蛋白質酶K (寶酒造公司製）以及2毫升之 10%月桂基硫酸鈉水溶液，於3 7°C下保溫1小時。反應終了後，進行苯酚氯仿萃取，再進行乙醇沉澱，製作成約1毫克之基因組DNA » (2) RNaseHII基因之選殖焦球菌（Pyrococcus horikoshii)的全部基因組序列已經公開[DNA研究（DNA Research)，第 5卷，第 55-76 頁（1998)]，並且編碼RNaseHII的類似物之基因（PH1650)已經確認有1 個存在（序列編號1，日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構網頁·· http://www.nite.go.jp/)。在此，將此PH1650基因（序列編號1)與一部分公開之焦球菌的基因组序列（University of Utah, Utah Genome Center網頁：http://www.genome.iitah.edu/sequence.html)，進行相同性檢索。其結果，發現了非常高相同性的序列。以所得到之序列作為基礎，合成引子1650Nde (序列編號2)以及1650Bam (序列編號3)。 _ - 52 - 本紙張疋度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（5〇 ) 以上述（1)所得到之焦球菌基因組DNA 200 ng作為模板，再以20 pmol的1650 Nde及20 pmol的1650 Bam作為引子，以100 # 1的容量進行PCR。PCR中之DNA聚合酶係根據添付之操作手冊，使用TAKARA Ex Taq (寶酒造公司製），並以94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 1分鐘為一循環之 PCR，進行30循環。將增幅之約0.7kb的DNA片段，以Ndel 及BamHI (皆為寶酒造公司製）加以消化，將所得到之DNA 片段再重組至質體載體pET3a (諾華珍公司製）的Ndel及 BamHI間，而製成質體pPFU220。 (3)含有RNaseHII基因之DNA片段的鹼基序列之決定將上述（2)所得到之pPFU220的插入DNA片段，利用二去氧法來決定其鹼基序列。針對所得到之鹼基序列的結果，進行解析，發現了被認為編碼RNaseHII的開放閱讀序列（ORF, open reading frame) 。此開放閱讀序列之驗基序列，係表示於序列表之序列編號4。又，由該鹼基序列所推定之RNaseHII的胺基酸序列，係表示於序列表之序列編號5。又，以質體PPFU220進行轉形之大腸菌JM109，係被命名並表示為 Escherichia coli JM109/pPFU220，由平成 12 年 9 月5曰（原寄存日）起寄存於獨立行政法人產業技術總和研究所專利生物寄存中心[日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6(郵遞區號305-8566)]，寄存編號為FERM P-18020，並基於布達佩斯條約，由前述獨立行政法人產業技術總和研究所專利生物寄存中心，在平成13年7月9日 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格（210 X 297公釐）

裝訂

線 1311154 A7 B7 五、發明説明（51 (國際移管日），以移管編號FERM BP-7654移管並寄存於 (中華民國（台灣））食品工業發展研究所，寄存編號並為 CCRC 940367。 (4)純化RNaseHII標準品之製作將上述（2)所得到之PPFU220對於大腸菌HMS174 (DE3) (諾華珍公司製）進行轉形，將所得到之含有pPFU220的大腸菌HMS 174 (DE3)’接種於含有100 "g/ml的安比西林之2 升LB培養液中，於37 °C下震盪培養16小時。培養終了後，以離心分離收集菌體，再懸浮於66.0毫升之超音波緩衝液[50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ’ 1 mM EDTA ’ 2 mM 笨曱垸磺醯氟化物]中’然後加入超音波破碎機中。將此破碎液以12000 rpm離心分離丨〇分鐘，所得到之上清液再進行60°C ' 15分鐘之熱處理。其後’再一次進行1〇分鐘12000 rpm 離心分離，收集上清液，得到61.5毫升之熱處理上清液。將此熱處理上清液供注於事先以緩衝液A [50mM Tris-HCl (pH 8.0) 、 1 mM EDTA]平衡過之 RESOURSE Q管柱（亞馬孫.法瑪西亞.生技公司製）中，再以FPLC系統（亞馬孫•法瑪西亞•生技公司製）進行色層分析。其結果， RNaseHII直接通過了 RESOURSE Q管柱。將直接通過之RNaseHII部分60.0毫升，供注於事先以緩衝液A平衡過之RESOURSE S管柱（亞馬孫.法瑪西亞.生技公司製）中，再以FPLC系統利用0〜500 mM NaCl直線濃度分配進行溶離，並在約150 mM NaCl處，得到溶離之 RNaseHII部分。 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝訂

1311154

五、發明説明（52 ) ,Λ ^改米康公將此UNaseHII部分2.0毫升，使用仙得利康-ιυ 司製）進行限外過濾以便濃縮，再將250 /z 1之澳縮'

注於事先以含有100 mM Naa、0. ImM EDTA之50 mM HCI (pH 8.0)平衡過之Super dex 200凝膠過遽管拉（ . β ii·溶離夂法瑪西亞生技公司製）中，再以同樣緩衝液進打 rj T ] 結果，在相當於17 K道爾吞的分子量位置，得到RNaSe清之溶離。此分子量，係相當於RNaseHII以一量體存在之3 形。將如此溶離之RNaseHII當作Pfu RNaseHn標準品。使用上述所得到之PfuRNaseHII標準品，根據下列之方法來'則定RNaseH活性。將 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM DTT (那可萊提斯公司製）、0.003%牛血清白蛋白（部分V，西格馬公司製）、4% 甘油、20仁g/ml聚（dT)(亞馬孫.法瑪西亞•生技公司製）、 30以g/ml聚（rA)(亞馬孫•法瑪西亞.生技公司製）加以；昆合，並於371保溫10分鐘。再將其作為用以測定RNaseH 活性之基質液。在100从1之基質液上加入1 //1之1M MnCl2，保溫於40°C 下，在其上再將上述之Pfu RNaseHII標準品適當地稀釋後加入’以便反應開始。在40°C下進行30分鐘之反應後，加入10 //1之0.5M EDTA使反應停止，並測定260 nm下之吸光度。其結果，添加有上述Pfu RNaseHII標準品之反應液，相較於事先添加10 yl之0.5MEDTA後再加入其反應液者， 55· 本纸張又度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1311154. A7 ___B7 五、發明説明（53 ) 其260 nm下之吸光度值提高了。因此，該標準品明顯地具有RNaseH活性。參考例2 Afu RNaseHII之製作古球菌（Archaeoglobus fulgidus)的 RNaseHII基因之選殖 (1) 古球菌（Archaeoglobus fulgidus)基因組 DNA之製作收集古球菌（Archaeoglobus fulgidus，由妥以契·薩姆倫克•逢·米闊卡尼斯曼及傑魯古茲藍GmbH購得；DSM4139) 8毫升相當份之菌體，然後，懸浮於丨00 #1之25%蔗糖' 50 mMTris-HCl(pH8.0)*，SMA20/zlt0.5MEDTA、10/zl 之10毫克/毫升的氯化溶菌酶（那可菜提斯公司製）水溶液，於20°C下反應1小時。反應終了後，在此反應液上，加入 800 "1 之 150 mM NaC卜 1 mM EDTA、20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 之20毫克/毫升的蛋白質酶K (寶酒造公司製）以及50从1之10%月桂基硫酸鈉水溶液，於37°C下保溫1小時。反應終了後，進行苯酚氣仿萃取，再進行乙醇沉澱，於風乾之後溶解於50之TE中，得到基因組DNA溶液。 (2) RNaseHII基因之選殖古球菌（Archaeoglobus fulgidus)的全部基因組序列已經公開[Klenk，HP等人，自然（Nature)，第 390卷，第 364-370 頁（1997)]，並且編碼RNaseHII的類似物之基因（AF0621)已經確認有1個存在（序列編號6，http://www.tigr.org/tdb/ CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。在此，將此AF0621基因（序列編號6)之序列作為基礎，合成引子AfuNde (序列編號7)以及AfuBam (序列編號8)。 -56- 未紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4规格(210X297公釐)

裝訂

線 1311154 A7 ____ B7 五、發明説明（^~) 以上述（】）所得到之古球菌（Archaeog】obus fulgidus)基因組DNA 30 ng作為模板，再以20 pmol的AfuNde及20 pmol的 AfuBam作為引子，以100 μ 1的容量進行PCR。PCR中之 DNA聚合酶係根據添付之操作手冊，使用PyroBest DNA聚合酶（寶酒造公司製），並以94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 1分鐘為一循環之PCR，進行40循環《將增幅之約〇.6kb的DNA 片段，以Ndel及BamHI (皆為寶酒造公司製）加以消化，將所得到之DNA片段再重組至質體載體pTV119Nd (將 pTV119N之Ncol位置改變成Ndel位置者）的Ndel及BamHI 間，而製成質體PAFU204。 (3)含有RNaseHII基因之DNA片段的鹼基序列之決定將上述（2)所得到之pAFU204的插入DNA片段，利用二去氧法來決定其鹼基序列。針對所得到之鹼基序列的結果，進行解析，發現了被認為編碼RNaseHII的開放閲讀序列。此開放閱讀序列之鹼基序列’係表示於序列表之序列編號9。又，由該磁·基序列所推定之RNaseHII的胺基酸序列，係表示於序列表之序列編號10。又’以質體PAFU204進行轉形之大腸菌JM109，係被命名並表示為 Escherichia coli JM109/pAFU204，由平成 13 年 2 月22曰（原寄存日）起寄存於獨立行政法人產業技術總和研究所專利生物寄存中心[日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6(郵遞區號305-8566)]，寄存編號為FERM P-18 221 ’並基於布達佩斯條約，由前述獨立行政法人產業 ____ -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 x 297公釐） 1311154. A7 B7 五、發明説明（55 ) 技術總和研究所專利生物寄存中心，在平成13年8月2曰 (國際移管曰），以移管編號FERM BP-7691移管並寄存於 (中華民國（台灣））食品工業發展研究所，寄存編號並為 CCRC 940366。 (4)純化RNaseHII標準品之製作將上述（2)所得到之pAFU204對於大腸菌JM109進行轉形，將所得到之含有PAFU204的大腸菌JM109，接種於含有100 yg/ml的安比西林之2升LB培養液中，於37°C下震盪培養16小時。培養終了後，以離心分離收集菌體，再懸浮於37.1毫升之超音波緩衝液[50 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 1 mM EDTA，2 mM苯甲烷磺醯氟化物]中，然後加入超音波破碎機中。將此破碎液以12000 rpm離心分離10分鐘，所得到之上清液再進行70°C、15分鐘之熱處理。其後，再一次進行10分鐘12000 rpm離心分離，收集上清液，得到 4〇·3毫升之熱處理上清液。將此熱處理上清液供注於事先以緩衝液A [50 mM Tris-HCl (pH 8_0) 、 1 mM EDTA]平衡過之RESOURSE Q管柱（亞馬孫•法瑪西亞•生技公司製）中，再以FPLC系統（亞馬孫.法瑪西亞•生技公司製）進行色層分析。其結果， RNaseHII直接通過了 REs〇URSE Q管柱。加入以緩衝液A平衡之RESOURSE S管柱（亞馬孫.法瑪西亞•生技公司製）使用FPLC系統（亞馬孫.法瑪西亞•生技公司製）進行層析，其結果，RNaseHII直接通過 RESOURSE S管柱。 -58- 本纸張尺度適用中國國家棣準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1311154 A7 ____B7_ 五、發明説明（56 ) 將直接通過之RNaseHII部分40.0毫升，以含有50 mM NaCl之緩衝液 B [50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 mM EDTA] 21 作為外液，再進行3次的2小時透析》將透析後之酵素液 40.2毫升供注於事先以含有50 mM NaCl之緩衝液B平衡過之HiTrap-heparin管柱（亞馬孫•法瑪西亞•生技公司製）中，再以FPLC系統利用50〜550 mM NaCl直線濃度分配進行溶離。其結果，在約240 mM NaCl處’得到溶離之 RNaseHII部分。將此RNaseHII部分7.8毫升，使用仙得利康-1〇(亞米康公司製）進行限外過濾以便濃縮，將約600私1之濃縮液分成四次，供注於事先以含有100 mM NaCl、0.1 mM EDTA之 50 mM Tris-HCl (pH 7_0)平衡過之Superose6凝膠過濾管柱 (亞馬孫.法瑪西亞.生技公司製）中，再以同樣緩衝液進行溶離之結果，在相當於30.0 K道爾呑的分子量位置，得到RNaseHH之溶離。此分子量，係相當於RNaseHII以一量體存在之情形。茲將如此溶離之RNaseHII當作Afu RNaseHII 標準品。使用上述所得到之Afu RNaseHII標準品，根據參考例卜 (4)記載之方法來測定酵素活性之結果’在Afu RNaseHII標準品上確認有RNaseH活性。本發明之方法所使用之耐熱性RNaseH的單位數’係如下計算得到。

將聚（rA)及聚（dT)(皆為亞馬孫•法瑪西亞•生技公司製） 1毫克，各自溶解含有1 mM EDTA之40 mM Tris-HCl (pH -59- 本紙浪尺度適用中國®家襟準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（57 ) 7.7) 1毫升中，而製作成聚（rA)溶液及聚（dT)溶液。然後，在含有 4 mM MgCl2、1 mM DTT、0.003% BSA、 4%甘油之40 mM Tris-HCl (pH 7.7)中，加入聚（rA)溶液成為最終濃度20 μg/ml，再加入聚（dT)溶液成為最終濃度30 以g/ml，於37°C下反應1〇分鐘後，冷卻至4°C，而製作成聚（rA)-聚（dT)溶液。在此聚（rA)-聚（dT)溶液100 /zl中’加入任意稀釋之酵素液1仁卜於40°C下反應1〇分鐘，再加入 0.5M EDTA 10仁1使反應停止，並測定260 nm之吸光度。對照組，則在上述反應液上加入0.5M EDTA 10 /il後，於 40°C下反應1〇分鐘，再測定吸光度。其後，在EDTA不存在下使其反應並求出吸光度，而得到其與對照组之吸光度相減值（吸光度差）。亦即，求出藉由酵素反應而由聚（rA)-聚（dT)雜合體所游離之核苷酸濃度的吸光度差。RNaseH之一單位，係以1 nmol的核醋核芬酸游離而相當之A26〇，在 10分鐘内增加之酵素量，並係利用下述式子而得到。單位（unit)=[吸光度差X反應液量（毫升）]/0.0152 X (110/100)X稀釋率參考例3 本發明之方法所使用的常溫性RNaseH的單位數，係根據以下方法進行測定。 (1)使用試藥液之製作力價測定用反應液：以滅菌水製作成各自之最終濃度為 40 mM Tris-HCl (pH 7.7，37°C )、4 mM 氣化鎂、1 mM DTT、0.003% BSA、4。/。甘油、24 /zM 聚（dT)。 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1311154

聚[8-3H]腺苷酸溶液：將37〇kBq之聚[8_3H]腺苷酸溶液溶解於200之滅菌水中。聚腺芬酸溶液：將聚腺甞酸以減菌超純水稀釋至3 mM。

酵素稀釋液：以滅菌水製作成各自之最終濃度為25 mM

Tris-HCl (pH 7.5 ’ 37。(：）、5mM 2-氫硫乙醇、〇 5 mM eDTA (pH 7.5，37°C )、30 mM氣化鈉、50%甘油。熱變性仔牛胸腺DNA之製作：將仔牛胸腺dna 200毫克懸浮於TE緩衝液100毫升中並使其膨潤。測定該溶液之uv 260 nm的吸光度，並以滅菌超純水稀釋至i毫克/毫升之濃度。然後，將該溶液於100°C加熱10分鐘之後，於冰浴中急速冷卻。 (2)活性測定方法在上述（1)製作之力價測定用反應液985以1中，加入聚 [8-3H]腺：y：酸溶液7 W，並於37°C下保持1〇分鐘。然後，加入聚腺甞酸8 使其最終濃度成為24仁Μ，再進一步於 3 7°C下保持5分鐘。如此地，製作成聚[8-3H] rA-聚dT反應液1000 yl。接著，分取該反應液200 //1’於30 下保持5 分鐘後，再加入以任意稀釋系列所稀釋的酵素液1 " 1，將這些反應液經時地進行取樣各50 μ 1 ’用於以後的測定。由酵素添加至取樣為止的時間定為Υ分鐘。又，全CPM用反應液50从1及空白用反應液50 y 1，係將酵素液改成酵素稀釋液1 //1而加入所製作的。在該取樣溶液上，加入 100 mM焦磷酸鈉100 、熱變性仔牛胸腺DNA溶液5〇 w 、及10%三氣醋酸300 μ 1 (測定全CPM時，超純水3〇〇 ) -61 - 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS) A4规格(210 χ 297公爱) 1311.154 A7 B7 五、發明説明（59 ) ，在0°C下保持5分鐘後，以10000 rpm離心10分鐘。離心後，將得到之上清液250 /z 1加入管型瓶中’再加入水吐-2 (NEN生命科學產物公司製）10毫升，以液體閃爍計數器來測定CPM。 (3)單位計算各酵素之單位（Unit)數，係β下述之計算式計算得到。

Unit/ml= {(測定之 CPM-空白 CPM) X 1.2* X 20 X 1000 X 稀釋率} X200 (以1)/(全 CPMX Y分 Χ20(μ 1)Χ9**) 1. 2* :全CPM中所包含之聚[8-3H] rA-聚dT的50以1所相當之nmol數 9":補正係數實施例1

(1)由喀痰萃取DNA 根據美國 CDC (Centers for Diseases Control and Prevention): 所建議之NALC法來處理喀痰。亦即，將喀痰置入50毫升容積之附有螺絲帽的管中，加入等量之NALC液體（在0.1M 檸檬酸鈉50毫升及4°/。氫化鈉50毫升的混合液中，加入0.5 克N-乙醯基-L-半胱氨酸所得到者），再以試管混合器適當地混合20秒鐘，使檢體成為液態狀。在室溫下放置15分鐘之後，以磷酸緩衝生理食鹽水（PBS)作成全量50毫升，再以3000 g以上離心20分鐘，而採取其沉澱物。在此沉澱物上，加入50 /z 1之溶解緩衝液[lysis buffer ;含有一單位的 -胞壁酸酶（mutanolysin，西格瑪公司製）之10 mM HEPES緩衝液（pH 7.8)]，再適當地混合。在37°C反應30分鐘，然後在5分鐘内進行水浴煮沸或在96°C之加熱調節器中進行加 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311154. A7 _____B7__ 五、發明説明（6〇 ) 熱處理。若有需要時，以微量高速離心器進行離心’再分取其上清液《根據以上之操作所製作的上清液’再利用下述之步驟來獲得其DNA萃取液。進一步’ 「Gen獲取酵母用」（商品名，寶酒造公司製）亦根據使用處理說明書，來用於核酸之萃取。 (2) 探針、嵌合寡核苷酸引子之製作以基因銀行編號X52471所記載之鹼基序列為基礎，製作用以檢測由結核菌群而來之iS6iίο基因的特異性寡核：y：酸探針。亦即，其係利用DNA合成機，來合成由序列表之序列編號11所示的鹼基序列構成，並在5’末端附有FITC (螢光異硫代氰酸鹽）之寡核苷酸探針MTIS-2BF。將由結核菌群IS6110基因而來之DNA片段，製作成用於 IC AN法合成之嵌合寡核甞酸引子。亦即，其係以序列表之序列編號12所示的結核菌群IS6110基因的鹼基序列為基礎，各自利用DNA合成機，來合成由序列表之序列編號13 所示的驗基序列構成的正向（Forward)引子MTIS-2F，以及由序列表之序列編號14所示的鹼基序列構成，並在5’末端附有生物素之反向（Reverse)引子MTIS2-RBio。同樣地，再各自利用DN A合成機，來合成由序列表之序列編號15所示的鹼基序列構成的正向（Forward)引子K-F 1033-2，以及由序列表之序列編號16所示的鹼基序列構成，並在5’末端附有生物素之反向（1^乂6『56)引子1|^-111133-28丨〇。 (3) 利用ICAN法進行增幅製作成如表1所示之用於IC AN反應的反應液，並於60°C 下孵育30分鐘。 __ -63- 本紙張尺度適用中國画家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（61 ) 表 1___ 組成容量 _U1) 5 X反應緩衝液（pH 7.8) 10 100 mM醋酸鎂 2 10 mM dNTPs (寶酒造公司製） 2.5 引子MTIS-2F (100 "M) 0.5 引子MTIS2-RBio (100 #M) 0.5

Pfu RNaseHII (63 ng/ ^1) 0.5

BcaBEST DNA聚合酶（寶酒造公司製，8U///1) 0.5 DNA萃取液 1 H2〇_ 32.5 共計_50 βΐ 5 X反應緩衝液之組成： 100 mM HEPES-氫化鉀（pH 7.8) " 500 mM醋酸鉀 5%二甲亞颯（DMSO) 0.05%牛血清白蛋白（BSA) 又，同樣地，在K-F1033-2/K-R1133-2Bio之組合，亦進行IC AN增幅反應。在反應終了後，將上述反應液之一部分供注於電泳之使用，以確認標的之增幅片段。 (4)利用固層板發光法進行檢測將鏈抗生物素蛋白（納可萊公司製）以2仁g/ml溶解於PBS -中，再將此溶液於白色發光檢測用96丼微滴定盤上，添加成為150 /zl/井中，於4°C下放置一夜，以進行固定化反應 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（62 。丢棄鏈抗生物素蛋白溶液之後’分注1% BSA-PBS溶液使成為200 μΐ/井，於4°C下放置一夜’以進行中止反應。丟棄此溶液後，將鏈抗生物素蛋白包覆之盤，用於以下之實驗。在上述鏈抗生物素蛋白包覆之盤中，以50 #1/井加入雜合緩衝液[含有1% Trit〇n X-100、1% BSA之5XSSC]，將含有實施例1·(3)的MTIS-2F/MTIS2-RBio引子之组合所得到之增幅片段的ICAN反應液，以10 //1/井添加並充分混合，於室溫下反應15分鐘，以將其捕捉至盤的表面。然後，以5 // 1/井來添加DNA變性液（0.1N NaOH溶液），充分混合之後

再進行3分鐘之DN A變性，將被捕捉至盤表面之雙股DN A 變性為單股DNA »再將上述之探針MTIS2BF以雜合緩衝液稀釋成5 pmol/ml，將其各添加100 //1/井再充分混合，於主溫下反應40分鐘。此時，各井之pH為13~14。反應後，丟棄井内之溶液，以200以/井的洗淨緩衝液[25 iriM Tris- 鹽酸（pH 7.5)、150 mM NaC卜 1% BSA、0.05% Tween 20]將琢丼洗淨2次。其後，將過氧化酶標誌抗FITC兔子抗體（奇米康公司製），溶解於雜合緩衝液中使成2 //g/ml，再添加於各井中使成為1〇〇 μ 1/井，於室溫下反應20分鐘。反應後’丢棄溶液，以200 # 1/井之洗淨緩衝液將各井洗淨四 '入’再各添如發光基質[SuperSignal ELIS A Pico基質（皮爾斯公司製）]使成為100 μ 1/井，然後，立即以發光盤讀取計 (實驗含$ J系統公司製），測定其相對發光強度。 <5)換·測感度之研究 ^~^^^(CNS) A4規格(210X297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（63 ) 將含有相當於0.5及10複製數之結核菌群基因組的由喀痰而來之DNA樣品，根據上述來進行結核菌群DNA之檢測。其結果，如表2所示，即使在5複製數亦檢測出S/N比約300倍之強烈發光。表2 基因組裝置發光強度（RLU) 0複製數 11 5複製數 3078 10複製數 6287 如上所示，根據本發明，可以進行迅速且高感度之結核菌的檢查。又，在本發明之結核菌的檢測方法中，並確認不論是使用本發明之核酸萃取方法或「Gen獲取酵母用試劑」，皆適合使用。因此，由操作簡便性之觀點，確認本發明之核酸萃取方法的有用性。實施例2 由懷疑有結核菌感染之病患26例中，採取喀痰，根據實施例1記載之步驟，進行結核菌DNA之檢測。又，使用同一檢體，基於編碼現存之16S rRNA的DNA作為標的之PCR 法，使用套組（AmpliCore結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis) (羅氏公司製））進行檢測，以利用小川培養基之培養法，進行結核菌之檢查。其結果示於表3中。表3 小川培養基陽性例(n=9) 陰性例(n=17) 基因增幅法 PCR法本發明法 PCR法本發明法陽性陰性陽性陰性陽性陰性陽性陰性 8 1 9 0 2 15 0 17 -66 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（64 ) 如表3所示，本發明法之培養檢查結果相當一致’但以 PCR法則檢測出培養法為陰性的偽陽性2例，且培養法為陽性的偽陰性則有1例。亦即，相較於過去的方法，確認本方法可以得到超迅速且簡便之正確地檢查結果。實施例3 茲針對本發明之檢測方法對於結核菌群之特異性進行研究。基因組DNA，則使用表4所示之37株。表4

Mycobacterium Streptococcus GTC No. 603 M. avium 1234 S. agalactiae 857 M.abscessus 1700 S. mutans 499 M. bovis BCG 261 S. pneumoniae 858 M.chelonae 262 S. pyogenes 609 M. fortuitum 217 S. sanguinis 610 M.gastri Staphylococcus 612 M. gordonae GTC No. 286 S. aureus subsp. aureus 613 M. intracellulare 289 S. epidermidis 614 M. kansasii 266 S.intermedius 616 M. marinum 265 S.saprophyticus 617 M. nonchromogenicum Enterococcus 1725 M. peregrinum 228 E. faecalis 619 M. scrofulaceum 227 E. faecium 620 M. simiae Peptostreptococcus 622 M. szulgai 200 P. magnus 623 M. terrae Stomatococcus 624 M.triviale 311 S. raucilaginosus 601 M. tuberculosis Corynebacterium 626 M. xenopi 1438 C. pseudotuberculosis Pseudomonas Listeria 2 P. aeruginosa 149 L. monocytogenes Escherichia Erysipelothrix 503 E.coli 555 * E. rhuthiopathiae -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311154 五、發明説明（65 ) 各基因組DNA，係由0D值計算其複製數，再稀釋成2X 1〇7複製數3使用上述作為模板的基因組DNA，再以下述表5所示之反應液組成進行檢測。表5 __ A7 B7 組成容量〇l) 5 X反應緩衝液（pH 7.8) 10 100 mM醋酸鍰 2 10 mM dNTPs (寶酒造公司製） 2.5 引子 MTIS-2F (100 /zM) 0.5 引子 MTIS-2RBio (100 仁Μ) 0.5 Afu RNaseHII (17.5 U//zl) 0.5 BcaBEST DNA聚合酶（16 U/yl) 0.5 DNA萃取液 1 h2o 32.5 共計 50 β\ 將上述反應液於60°C下保持1小時。檢測係根據實施例1 (4)所記載之方法進行。其結果，只有結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)及牛結核桿菌 BCG (Mycobacterium bovis BCG) 株被特異性地檢出。基此，確認本發明之方法係具有極高特異性之檢測方法。實施例4 (1)茲使用磁性微珠來進行結核菌群之檢測。引子係使用MTIS_2F&MTIS-2RBio引子。然後，將作為模板之實施例2所得到的由陽性檢體而來之萃取基因組，以滅菌水稀釋成30倍、300倍、3000倍。反應係根據下述進行。亦 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝訂

1311.154 A7 B7 五、發明説明（66 ) 即，添加最終濃度32 mM HEPES氫化鉀緩衝液（pH 7.8)、 100 mM 醋酸鉀、1% DMSO、0.01% BSA、4 mM 醋酸鎂、各 500 dNTPs、各 50 pmol的 MTIS-2F及 MTIS-2R引子、 8.75U的由Afu而來之RNaseH ' 8U的BcaBEST DNA聚合酶、各模板量1 # 1，並以滅菌水添加至最終容積成為50以1 。裝置一熱循環器並先將該反應液設定成60°C，保持於 60°C。所得到之增幅片段供注於自動檢測裝置、「留米帕斯」中，再以塗覆有鏈抗生物素蛋白之磁性微珠(皮爾斯公司製）進行檢測。將相當於1 〇〇 pmol的鏈抗生物素蛋白的固層化磁性微珠，以第一層與生物素化增幅片段反應5分鐘，再加入0.1N NaOH與FITC標誌探針MTISBF雜合5分鐘，洗淨後加入POD標誌抗FITC抗體，反應5分鐘後洗淨，再加入發光基質。其結果，顯示在現存之自動化檢測裝置中，使用磁性微珠以20分鐘之短時間，就可以進行半定量。又，試劑亦使用與實施例1相同者。發光量檢測則以計光法來進行。其結果示於表6。表6 模板計光法 S/N比 X 30 3.55 X 107 29.6 X 300 1.21 X 107 10.0 X 3000 0.21 X 107 1.75 0 0.12 X107 - 基於表6所示之結果，確認可與傳統之盤發光法以同等的感度來進行檢測。 (2)針對有内部標準（1C ; internal control)之檢測系統進 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311.154 A7 B7 五、發明説明（67 ) 行研究。亦即，以人類基因組DN A作為模板，使用序列表之序列編號17及18所記載之引子，進行PCR增幅。所得到之增幅片段以一般方法進行純化’再插入pT7 Blue T-vector (諾華珍公司製）中。該質體則作為内部標準之用。反應係與實施例3所記載之條件相同，而添加上述質體1、 3、10 pg。模板之結核菌基因組，則使用0、2及20複製數。檢測係使用具有序列表之序列編號19記載的鹼基序列，並在5'末端具有FITC標誌之1C用探針（ICF探針）及FITC 標誌探針MTISBF。其結果，不論哪種1C質體濃度皆可檢測出結核菌基因組。特別是，確認1C質體之濃度為3pg 時，最為適合。 (3)針對上述增幅片段之檢測方法，研究雜合·色層分析法。亦即，在硝化纖維素膜上，將鏈抗生物素蛋白（那可萊提斯公司製）固定於其上，連接吸水襯墊，而製作成雜合•色層分析條。使用該色層分析條，再以實施例1所得到之增幅片段進行雜合•色層分析法之檢測。檢測係以 1-step TMB-Blotting (皮爾斯公司製），使其呈色。亦即，在硝化纖維素膜上，以含有增幅片段之反應液使其展開。接著依序以〇. IN NaOH溶液，FITC標誌探針、洗淨液、發色液展開。其結果，結核菌陽性之增幅片段，被檢測出有藍色之色帶。又，藉由使用此方法，本發明之方法實施後，因為可以在5~ 10分鐘後便以肉眼進行判別，因此確認係一有用的迅速之基因檢查方法。 -70- 本紙浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（68 ) 實施例5 基於實施例1〜4之結果，構築結核菌群之套組係如下所示。 (1) ICAN增幅用試劑；50次份 5 X反應緩衝液 100 mM醋酸鎂 10 mM dNTP混合物 0.1 mM MTIS-2F 引子 0.1 mM MTIS-SRBio引子 Afu RNaseHII (17.5 U/^zl)

BcaBESTDNA聚合酶（16U/V1) (2) 檢測用試劑（50次份）鏈抗生素蛋白固相化96孔盤雜合緩衝液（5XSSC，l%TritonX100， 1% BSA) 變性劑（0_1N NaOH) 檢測用MT探針溶液（25nM MTIS-2BF探針）檢測用1C探針溶液（25nM ICF探針）標誌抗體液（布洛克艾斯（大日本製藥公司製）：PBS= 1 : 3，500 Unit POD-杭 FITC 抗體） 10X洗淨液（250 mM Tris緩衝液（pH 7_5)， 1.5M Naa，1% BSA，0.5% Tween 20) 發光試劑 A (SuperSignal ELISA Pico -71 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 。各組成 500 β\ 100 β\ 125 β\ 25 β\ 25 β\ 25 β\ 25 β\ 50個 2.5毫升 0.5毫升 5毫升 5毫升 5毫升 20毫升 2.5毫升 1311154 A7 B7 五、發明説明（69 )

Substrate A液（皮爾斯公司製））發光試劑 B (SuperSignal ELISA Pico 2.5毫升 Substrate B液（皮爾斯公司製））内部標準液（1C質體，TE緩衝液） 0.1毫升陽性控制組液（含有IS6 110之質體，TE 0.02毫升緩衝液）陰性控制组液（TE緩衝液） 0.02毫升使用上述試劑檢測結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis) 株、牛結核桿菌 BCG (Mycobacterium bovis BCG)株時，確認可迅速、高感度、高特異性地進行檢測。實施例6

(1) 由棉花棒檢體萃取DNA 以棉花棒擦拭男子尿道及女子子宮頸部而獲得棉花棒檢體，在其上加入含有界面活性劑之萃取緩衝液（AmpliCore STD用檢體處理試劑（羅氏公司）），於95°C〜l〇〇°C加熱處理 10分鐘11 (2) 探針、嵌合寡核钻酸引子之製作製作一用以檢測披衣菌之克立浦（criptic)質體的特異性寡核苷酸探針。亦即，其係利用DNA合成機，來合成由序列表之序列編號20所示的鹼基序列構成，並在5’末端附有 FITC (螢光異硫代氰酸鹽）之寡核甞酸探針CT1234。又，製作一用以檢測淋菌之cppB基因的特異性寡核甞酸探針。亦即，其係利用DNA合成機，來合成由序列表之序列編號 2 1所示的鹼基序列構成，並在5'末端附有FITC(螢光異硫代 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐〉 1311154. A7 B7 五、發明説明（7〇 ) 氰酸鹽）之寡核苷酸探針CppB3。將由披衣菌之克立浦（criptic)質體而來之DNA片段，製作成用於IC AN法合成之嵌合寡核苷酸引子。亦即，其係以序列表之序列編號22所示的披衣菌之克立浦（criptic)質體的驗基序列為基礎，各自利用DN A合成機，來合成由序列表之序列編號23及24所示的鹼基序列構成的正向 (Forward)引子F1212-22、F1 162-22，以及由序列表之序列編號25及26所示的鹼基序列構成，並在5'末端附有生物素之反向（Reverse)引子 R1272-22Bio、Rl379-22Bio。再將由淋菌cppB基因而來之DNA片段，製作成用於 IC AN法合成之嵌合寡核苷酸引子。亦即，其係以序列表之序列編號27所示的披衣菌之克立浦（criptic)質體的鹼基序列為基礎，各自利用DN A合成機，來合成由序列表之序列編號28所示的驗基序列構成的正向（Forward)引子pJDBF-1，以及由序列表之序列編號29所示的鹼基序列構成，並在y末端附有生物素之反向（Reverse)引子pJDBR-3Bio。 (3)利用ICAN法進行增幅製作成如表7所示之用於ICAN反應的反應液，並於55°C 下孵育60分鐘。 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7

表7_ 組成__ 5 X反應緩衝液（pH 7.8) 100 mM醋酸鎂

10 mM dNTPs (寶酒造公司製）引子 F1212-22 (100 #M) 引子 R1272-22Bio (100 仁Μ) 引子 pJDBF-1 (1〇〇 #Μ) 引子 pJDBR-3 (100 μΜ) Pfu RNaseHII (63 ng///l) BcaBESTDNA聚合酶（寶酒造公司製， DNA萃取液 H20___ 共計___ 5 X反應緩衝液之組成： 100 mM HEPES-氫化钾 500 mM醋酸_

容量（仁1) 10 2 2.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.51 32.5 50 β\

装 (PH 7.8) 5%二甲亞颯（DMSO) 0.05%牛血清白蛋白（BSA) 訂

用在反應終了後’將上述反應液之—部 ’以確s忍標的之増幅片段。分供注於電泳之使中成 (4)利用固層板發光法進行檢剛將鏈抗生物素蛋白（納可莱公司劁 ,ϋ 屮、—、·、λ ) 乂 2 "g/mi溶解於 ρ，再將此W於白色發光檢測用96井微滴定盤上1 為150心井中，於4t下放置—夜，以進行固定化反丟棄鏈抗生物素蛋白溶液之後，分注1% bsa_pbs溶 -74- 1311154 A7 B7 五、發明説明（72 ) 使成為200 # 1/丼，於4°C下放置一夜’以進行中止反應。丟棄此溶液後，將鏈抗生物素蛋白所包覆之盤’用於以下之實驗。在上述鏈抗生物素蛋白包覆之盤中，以50 /zl/井加入雜合緩衝液[含有1% Triton X-100、1% BSA之5 X SSC] ’將含有實施例 1-(3)的 F1212-22/R1272-22Bio 及 pJDBF-1/pJDBR-3Bio引子之組合所得到之增幅片段的ICAN反應液，以 10 V 1/井針對每一檢體添加於2井中，並充分混合，於室溫下反應15分鐘，以將其捕捉至盤的表面。然後，以5 //1/ 井來添加DNA變性液（0. IN NaOH溶液），充分混合之後再進行3分鐘之DNA變性，將被捕捉至盤表面之雙股DNA變性為單股DNA。再將上述之探針CT1234或CppB3以雜合緩衝液稀釋成5 pmol/ml，將其各添加100 μΐ/井再充分混合，於室溫下反應40分鐘。此時，各井之pH為13〜14。反應後，丢棄井内之溶液，以200私1/井的洗淨緩衝液[25 mM Tris-鹽酸（pH 7.5)、150 mM NaCl、1% BSA、0.05% Tween20]將該丼洗淨2次。其後，將過氧化酶標誌抗FITC 兔子抗體（奇米康公司製），溶解於雜合緩衝液中使成 2 /zg/m卜再添加於各井中使成為100 #1/井，於室溫下反應20分鐘。反應後，丟棄溶液，以200 /H/井之洗淨緩衝液將各井洗淨四次，再各添加發光基質[SuperSignal ELISA Pico基質（皮爾斯公司製）]使成為100 yl/井，然後，立即以發光盤讀取計（實驗室系統公司製），測定其相對發光強度。 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（73 ) (5)檢測感度之研究將含有相當於〇、10及100複製數之結核菌群基因組的 DNA樣品，根據上述來進行披衣菌DNA之檢測。其結果，如表8所示，即使在10複製數亦檢測出S/N比約30倍之強烈發光。又，將含有相當於〇、10及1〇〇複製數之淋菌基因組的DNA樣品，根據上述來進行淋菌DNA之檢測。其結果，如表9所示，即使在10複製數亦檢測出S/N比約300倍之強烈發光。

表8 基因組裝置發光強度（RLU) 0複製數 11 10複製數 347 100複製數 3961 表9 基因組裝置發光強度（RLU) 0複製數 11 10複製數 3026 100複製數 3840 裝訂

如上所示，根據本發明，可以進行迅速且高感度之披衣菌及淋菌的檢查。實施例7 由懷疑有披衣菌及淋菌混合感染之檢體12例中，根據實施例1記載之步驟，進行披衣菌及淋菌DN A之同時增幅檢測。其結果，僅披衣菌陽性者為5例，僅淋菌陽性者為1例， -76- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（74 ) 披衣菌與淋菌皆為陽性者3例，皆為陰性者則為3例。其結果，與現存之PCR法套組（AmpliCoreSTD (羅氏公司））的結果，互相一致。實施例8 引子及探針之製作根據HCV基因組之鹼基序列，來合成具有序列表之序列編號30及3 1所記載之鹼基序列的HCV-F及HCV-R1嵌合寡核苷酸引子，以及具有序列表之序列編號32及33所記載之鹼基序列的逆轉錄反應用寡核甞酸引子。進一步，再合成具有序列表之序列編號34及35所記載之鹼基序列的寡核苍酸探針。並且，以自動DN A合成機在上述寡核苷酸探針的5' 末端製作 TAMRA (N，N，N’，N'-tetramethyl-6-carboxy-rliodamine ，ABI公司製），而作為螢光標誌探針。 (2) 合成RNA之製作將Informed Consent所得到之HCV-RNA陽性血清，以 AmplicCoreHCV監控套組（羅氏公司製）來計算其複製數，再將其以套組所添付之檢體稀釋液，製作成由1 X 1〇7複製數至1複製數/// 1為止的1 0倍稀釋系列，而當作HCV-RNA。 (3) 逆轉錄反應使用上述（1)所製作之逆轉錄反應用寡核棼酸引子及 First-strand cDNA Synthesis Kit (寶酒造公司製），來由上述 (2)所製作之HCV-RNA合成cDNA。 (4) ICAN反應液之製作 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（75 ) 使用上述cDNA溶液進行ICAN反應。每管之反應液組成示於表10之中。表10 _ 成分使用量 cDNA溶液 3 #1 注射用蒸餾水 28.75 以1 5 X Hepes緩衝液 10 βΥ 10 mM dNTP混合物 2.5 /zl 100 Forward引子 0.5 仁1 100 μΜ Reverse 引子 0.5 仁1 Bca BEST DNA聚合酶（22υ/μ1) 0.25 仁1 PFU RNaseH (60U/^1) 0.5 βϊ 0.5%丙鄰二胺 2 β' 100 mM醋酸鎂 2 (5)均質系檢測在每一反應管中，加入上述反應液47 y丨，並添加（4)所製作之cDNA溶液3 //卜而於56°C下保持30分鐘。反應終了後，在此反應液上，添加上述（1)所製作之螢光標誌探針，使其最終濃度成為300 nM，於98°C下處理2分鐘後，冰浴降至25°C並保持於該溫度。以螢光檢測器、螢光掃描器（拉柏系統公司製），來測定該反應液之螢光強度。進一步，對照組方面，該利用PCR法之市售AmpliCoreHCV套組 (羅氏公司製）亦使用同一檢體，來進行測定。其結果示於圖1。圖1係測定各種HCV-RNA濃度時，有關螢光強度之 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝

線 1311154 A7 B7 五、發明説明（76 ) 變化與傳統方法的測定範圍之比較圖，左縱軸係OD450 值，右縱軸係螢光強度（SN比），橫軸則表示HCV-RNA量。又，圖1之黑色四方形，係表示使用本發明之方法的結果，黑色圓形，則表示以AmpliCoreHCV套組所得到之結果。如圖1所示，本發明之方法，可確認螢光強度（SN比）在 HCV-RNA複製數多時，就會增加。又，本發明之HCV檢測方法的所費時間為45分鐘。另一方面，對照組之 AmpliCoreHCV套組，其所費時間則為5小時。進一步，關於HCV-RNA之檢測範圍，如圖1所示，在以吸光度表示之 AmpliCoreHCV套組，雖然會因為HCV-RNA的複製數增加而增大，但測定範圍為2 ORDER，且當105複製數以上時，就確認將無法定量。另一方面，本發明之方法，已確認可擴大至3 ORDER之廣泛的範圍。進一步，即使在簡便性、迅速性上，本發明亦較優良，係相當適於處理多數檢體之方法。實施例9

(1) 由病患血清製作HCV-RNA 茲研究由臨床檢體進行HCV之檢測。使用AmpliCoreHCV 套組添付之HCV-RNA萃取試劑（羅氏公司製），由Informed Consent所得到之HCV病患血清28個檢體各100 #卜來製作 RNA。 (2) 病患血清中之HCV-RNA檢測以與實施例1(3)及（4)記載之方法同樣的方法，進行 -79- 本紙張尺度適用中國國家橾準(CNS) A4規格(210X297公釐）

裝訂

線 1311154 A7 B7 五、發明説明（77 ) HCV-RNA之增幅，以作為本發明之檢測方法之用。本實施例中，針對對照組之不含有HCV - RN A的樣品所進行之負控制組中，10管的螢光強度的平均值+3SD (標準偏差的 3倍）作為消去（Cut-Off)值，並將顯示有超過此消去值的螢光強度檢體當作陽性。另一方面’以市售之AmpliCoreHC V 套組測定同一檢體，根據套組之處理說明書判別其陽性、陰性。本發明之檢測方法與傳統方法之AmpliCoreHCV套组，其結果之比較係表示於表11中。本法陽性陰性 AmpliCore 法陽性 18例 0例陰性 0例 10例如表Π所示，本發明方法之測定結果，確認係與傳統方法所得到之成績有良好之相關性。又，本發明之方法，相較於傳統方法，確認可以高感度、迅速且簡便地進行測定。產業上可利用性根據本發明，提供了一方法、引子及探針、套組，其可以將病原微生物高感度、高特異性、迅速且簡便地進行測定，不用特殊之機器在有限的時間内，就可以將很多檢體 — 加以處理。序列表自由主文 SEQ ID N0:2 :用以選殖一編碼一由焦球菌（Pyrococcus -80- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（78 ) furiosus)而來的具有RaseNH II活性的聚胜肽基因之PCR引子 1650Nde SEQ ID N0:3 :用以選殖一編碼一由焦球菌（Pyrococcus furiosus)而來的具有RaseNH II活性的聚胜肽基因之PCR引子1650Bam SEQ ID N0:7 :用以選殖一編碼一由古球菌（Archaeoglobus fulgidus)而來的具有RaseNH II活性的聚胜肽基因之PCR引子 AfuNde SEQ ID N0:8 :用以選殖一編碼一由古球菌（Archaeoglobus fulgidus)而來的具有RaseNH II活性的聚胜肽基因之PCR引子 AfuBam SEQ ID N0:11 ：用以偵測由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來DNA之寡核答酸探針 SEQ ID N0:13 ：用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來之IS6110基因的DNA片段之嵌合寡核茹酸引子”第16到18個核甞酸為核醣核#酸-其他核：y：酸為去氧核醣核苷酸"

SEQ ID NO: 14 :用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來之IS 6 110基因的DNA片段之嵌合寡核备酸引子’'第19到21個核：y：酸為核醣核甞酸-其他核：y：酸為去氧核醣核苷酸M SEQ ID NO: 15 :用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來之IS6110基因的DNA片段之嵌合寡核甞酸引子”第19到21個核：y：酸為核醣核芬酸-其他核：y：酸為去氧 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（79 ) 核醣核苷酸" SEQ ID N0:16 ：用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來之IS61 10基因的DNA片段之嵌合寡核甞酸引子"第20到22個核苷酸為核醣核苷酸-其他核苷酸為去氧核醣核苷酸” SEQ ID NO: 1 7 :用以增幅由人類而來的米特洛蛋白質酶 (metaroprotease)基因之DNA片段的寡核答酸引子C4-MT2F-S100 SEQ ID NO: 18 :用以增幅由人類而來的米特洛蛋白質酶 (metaroprotease)基因之DNA片段的寡核答酸引子C4-MT2R-A SEQ ID NO: 19 :用以偵測内部控制DNA之寡核苷酸探針 SEQ ID NO:20 :用以偵測披衣菌克立浦（criptic)質體之寡核苷酸探針CT1234 SEQ ID NO:21 :用以债測淋菌（Neisseria gonorrhoeae) cppB基因之寡核：y：酸探針CppB3 SEQ ID NO:23 :用以增幅披衣菌克立浦（criptic)質體之 dna片段的嵌合寡核：y：酸引子”第2〇到22個核：y：酸為核醣核苷酸-其他核荅酸為去氧核醣核钻酸" SEQ ID NO:24 :用以增幅披衣菌克立浦（criptic)質體之 DNA片段的嵌合寡核甞酸引子"第20到22個核：y：酸為核醣核苷酸-其他核苷酸為去氧核醣核甞酸” SEQ ID NO:25 :用以增幅披衣菌克立浦（criptic)質體之 DNA片段的嵌合寡核苷酸引子”第20到22個核甞酸為核醣核驻酸-其他核甞酸為去氧核醣核钻酸" -82- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（8〇 ) SEQ ID NO:26 :用以增幅披衣菌克立浦（criptic)質體之 DNA片段的嵌合寡核甞酸引子”第20到22個核甞酸為核醣核苷酸-其他核甞酸為去氧核醣核：y：酸" SEQ ID NO:28 ：用以增幅淋菌（Neisseria gonorrhoeae) cppB基因之DNA片段的嵌合寡核甞酸引子”第18到20個核苷酸為核醣核苷酸-其他核苷酸為去氧核醣核甞酸” SEQ ID NO:29 ：用以增幅淋菌（Neisseria gonorrhoeae) cppB基因之DNA片段的嵌合寡核苷酸引子”第15到17個核甞酸為核醣核苷酸-其他核站酸為去氧核醣核苷酸” SEQ ID NO:30 :設計為HCV-F且用以增幅HCV—部分之經設計的嵌合寡核苷酸引子"第19到21個核：y：酸為核醣核苷酸-其他核苷酸為去氧核醣核苷酸" SEQ ID NO:31 :設計為HCV-R3且用以增幅HCV—部分之經設計的嵌合寡核苷酸引子"第16到18個核苷酸為核醣核苷酸-其他核苷酸為去氧核醣核甞酸" SEQ ID NO:32 :用以合成HCV之cDNA的經設計的寡核苷酸引子 SEQ ID NO:33 :用以合成HCV之cDNA的經設計的寡核甞酸引子 SEQ ID NO:34 :用以偵測可增幅HCV—部分的DNA片段之經設計的寡核苷酸探針 SEQ ID ΝΟ_·35 :用以偵測可增幅HCV—部分的DNA片段之經設計的寡核苷酸探針 SEQ ID ΝΟ:36 :用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium -83- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（81 ) tuberculosis)而來之IS6110基因的DNA片段之寡核荅酸引子 SEQ ID NO:37 ：用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來之IS6110基因的DNA片段之寡核嘗酸引子 SEQ ID NO:41 ：用以增幅HCV—部分的引子區域 SEQ ID NO:42 ：用以增幅HCV—部分的引子區域 SEQ ID NO:43 ：的探針區域用以偵測可增幅HC V —部分之DN A片段 -84- 木紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（82 ) 序列表 <110〉寶酒造株式會社 <120〉微生物病原之檢測方法 <130〉 <150〉 JP 2000-396321 <151〉 2000-12-26 <150> JP 2000-396222 <151> 2000-12-26 <150> JP 2001-199552 <151〉 2001-06-29 <150〉 JP 2001-278920 <151> 2001-09-13 <160> 44

<210〉 1 <211> 663 <212> DNA <213> 焦球菌(Pyrococcushorikoshii) <400〉 1 60 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt -85- 本紙張尺度適用肀國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（83 ggagtagccg tccaaacaat gacgattatt aatgaactag aagatatatg gggttgaaat gtatcggcag caaaagtatg gaagaatatt gctaggaaga tga ttatagatga taactcctgg atgttcttct aagctgagaa tggactctgc atgaagccac catcaataat gggaatttgg acaaacaata tagaggaaag gaaaaatatt gcaacgtgaa cgttaccccc attcgttgta cgatgtagat ggttatcgcc tgcaaaggtc ttctggctat tggtgacttt gtttagaaaa gagaggttac aaactattta aaggaaatag gccttgaatt cctaagaggt gagcataaag actagggata ccgagtgatc cctccaatag aatcagctaa gtgacattgg gcaaattaat atgagaggca ctttaaggat ttgctagtct ccgatgcaaa gagagataga cgagaactaa ttaggagaac cgcttgataa ggttaaagac 120 agatatccta 180 tcattctatg 240 caagccgcag 300 aataaaggct 360 gtatgagata 420 gaagctaaag 480 ggagtggctt 540 ttgggaaacc 600 attccttaag 660 663 <210〉 2 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉人工序列<220〉〈223>用以選殖一編碼一由焦球菌(Pyrococcus ftuiosus)而來的具有 RNaseHII活性的聚胜肽基因之PCR引子1650Nde <400> 2 caggaggaga gacatatgaa aataggggga att <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213〉人工序歹,j 33 裝訂 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311154 A7 B7 _ 五、發明説明（84 ) <220> <223〉用以選殖一編碼一由焦球菌(Pyrococcus f\iriosus)而來的具有 RNaseHII活性的聚胜肽基因之PCR引子1650Bam <400〉 3 gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33 <210〉 4 <211〉 672'

<212〉 DNA <213〉焦球菌(Pyrococcusfiiriosus) <400> 4 atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60 gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120 tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180 gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240 aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300 cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360 agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420 gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480 aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540 gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600 gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660 tttaagaaac ct 672

<210> 5 <211> 224 <212> PRT -87- 本紙張尺度適用十國國家標準(CNS) A4规格(210 x 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（85 ) < 213 > 焦球^菌(Pyrococcus fiiriosus) <400> 5

Met Lys lie Gly Gly lie Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala lie 1 5 10 15

Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn lie 20 25 30

Glu Lys Leu Arg Asn lie Gly Val Lys Asp Ser Lys Gin Leu Thr 35 40 45

Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gin lie Thr Ser lie Ala 50 55 60

Asp Asp Tyr Lys lie Val lie Val Ser Pro Glu Glu lie Asp Asn 65 70 75

Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu 80 85 90

Ala Leu Asn Ser Leu Gin lie Lys Pro Ala Leu lie Tyr Ala Asp 95 100 105

Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu lie Glu Arg 110 115 120

Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys lie lie Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135

Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser lie Leu Ala Lys Val 140 145 150

Val Arg Asp Glu Glu lie Glu Lys Leu Lys Lys Gin Tyr Gly Asp 155 160 165

Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu 170 175 180

Giu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro-lie Val Arg 185 190 195 -88- 本紙張疋度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297厶鳌） 1311154 A7 B7 五、發明説明（86 )

Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys lie Glu Glu Ser lie Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Ser Gin Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 215 220

<210> 6 <211> 626 <212> DNA <213> 古球菌(Archaeoglobus fiilgidus) 〈400〉 6 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626 <210> 7 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列本紙張尺度適用中画國家標準(CMS) A4规格(210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（87 ) <223>用以選殖一編碼一由古球菌(Archaeoglobus folgidus)而來的具有 RNaseHII活性的聚胜肽基因之PCR引子AfiiNde <400〉 7 aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30 <210〉 8 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以選殖一編碼一由古球菌(ArchaeoglobusfUlgidus)而來的具有 RNaseHII活性的聚胜肽基因之PCR引子AfiiBam <400> 8 tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30

<210〉 9 <211〉 638 <212> DNA <213〉古球菌(Archaeoglobus fUlgidus) <400〉 9 60 120 180 240 300 catatgaagg caggcatcga gcaggagtgg cttgcagcga aagctaagtc aggggaggag gaggttttga aagtttctcc gagattttga aggagtgcta tgaggctgga aagggctgcg tgaggatagg ctgagaaagc agaggaacta gccgaggaaa cgaaaatctc gacgaaagga cgctgaaata attctcaggc tcatcggccc actggttgtt ttggtgtgaa agactccaaa taaggaaaat ctgcagaacg tggctgctaa aaccataaac tgaagccgga aattgcttat -90- 本紙浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1311154 A7 _B7 五、發明説明（88 ) gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360 ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420 atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480 ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540 tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600 aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638

<210> 10 <211> 205 <212> PRT <213〉古球菌(Archaeoglobusftdgidus) <400〉 10

Met Lys Ala Gly lie Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val He Gly 15 10 15

Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu 20 25 30

Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gin Gly Arg 35 40 45

Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu lie Arg Lys lie Cys Arg Thr Glu 50 55 60

Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala 65 70 75

Lys Thr lie Asn Glu He Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu lie lie 80 85 90

Leu Arg Leu Lys Pro Glu lie Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val 95 100 105

He Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Lea Glu Glu lie Thr Gly Leu 110 115 120 -91 - ^張瓦度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱）裝訂

1311154 A7 B7 五、發明説明（89 )

Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val 125 130 135

Ala Ala Ala Ser lie lie Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu lie 140 145 150

Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala 155 160 165

Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp lie Ala Ser 170 175 180

Gly Arg lie Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser 185 190 195 A$n Leu Arg Gin Lys Thr Leu Asp Asp Phe 200 205 <210> 11 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉用以^[貞測由結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)而來 DNA之寡核甞酸探針 <400〉 11 20 gacctcacct atgtgtcgac

<210> 12 <211> 1378 <212> DNA <213〉結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis) -92- 本虼張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（90 ) <400> 12 aggtcggcaa cctgaaccgc cccggcatgt ccggagactc cagttcttgg aaaggatggg 60 gtcatgtcag gtggttcatc gaggaggtac ccgccggagc tgcgtgagcg ggcggtgcgg 120 atggtcgcag agatccgcgg tcagcacgat tcggagtggg cagcgatcag tgagatcgcc 180 cgtctacttg gtgttgctgc gcggagacgg tgcgtaagtg ggtgcgccag gcgcaggtcg 240 atgccggcgc acggcccggg accacgaccg aagaatccgc tgagataaag cgcttgcggc 300 gggacaacgc cgaattgcga agggcgaacg cgattttaaa gaccgcgtcg gctttcttcg 360 cggccgagct cgaccggcca gcacgctaat tacccggttc atcgccgatc atcagggcca 420 ccgcgagggc cccgatggtt tgcggtgggg tgtcgagtcg atctgcacac agctgaccga 480 gctgggtgtg ccgatcgccc catcgaccta ctacgaccac atcaaccggg agcccagccg 540 ccgcgagctg cgcgatggcg aactcaagga gcacatcagc cgcgtccacg ccgccaacta 600 cggtgtttac ggtgcccgca aagtgtggct aaccctgaac cgtgagggca tcgaggtggc 660 cagatgcacc gtcgaacggc tgatgaccaa actcggcctg tccgggacca cccgcggcaa 720 agcccgcagg accacgatcg ctgatccggc cacagcccgt cccgccgatc tcgtccagcg 780 ccgcttcgga ccaccagcac ctaaccggct gtgggtagca gacctcacct atgtgtcgac 840 ctgggcaggg ttcgcctacg tggcctttgt caccgacgcc tacgctcgca ggatcctggg 900 ctggcgggtc gcttccacga tggccacctc catggtcctc gacgcgatcg agcaagccat 960 ctggacccgc caacaagaag gcgtactcga cctgaaagac gttatccacc atacggatag 1020 gggatctcag tacacatcga tccggttcag cgagcggctc gccgaggcag gcatccaacc 1080 gtcggtcgga gcggtcggaa gctcctatga caatgcacta gccgagacga tcaacggcct 1140 atacaagacc gagctgatca aacccggcaa gccctggcgg tccatcgagg atgtcgagtt 1200 ggccaccgcg cgctgggtcg actggttcaa ccatcgccgc ctctaccagt actgcggcga 1260 cgtcccgccg gtcgaactcg aggctgccta ctacgctcaa cgccagagac cagccgccgg 1320 ctgaggtctc agatcagaga gtctccggac tcaccggggc ggttcaggcc ccgatggt 1378

<210〉 13 <211> 18 〈212〉 DNA -93- 衣紙張尺度適用中®画家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（91 <213〉人工序列 <220〉 <223>用以增幅由結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)而來之 IS6110基因的DNA片段之嵌合寡核苷酸引予”第16到18個核砮酸為核醣核苷酸-其他核:y：酸為去氧核醣核苷酸，， <400〉 13 tctcgtccag cgccgcuu <210> 14 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223>用以増幅由結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)而來之 IS6110基因的DNA片段之嵌合寡核苷酸引子"第19到21個核：y：酸為核醋核苷酸·其他核:y：酸為去氧核醣核甞酸” <400〉 14 gacaaaggcc acgtaggcga a <210〉 15 <211〉 21 <212> DNA <2L3>人工序列 <220> -94- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1311154 A7 ____B7 五、發明説明（92 ) 〈2烈〉用以增幅由結核杯菌(Mycobacterium tuberculosis)而來之 IS6110基因的DNA片段之嵌合寡核:y：酸引子"第19到21個核苷酸為核醋核嘗酸-其他核嘗酸為去氧核醣核:y：酸" <400> 15 cagtacacat cgatccgguu c 21 <210〉 16 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 用以增幅由結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)而來之 IS6110基因的DNA片段之嵌合寡核：y：酸引子"第20到22個核苷酸為核醣核苷酸-其他核:y：酸為去氧核醣核;y：酸" <400> 16 gatcgtctcg gctagtgcau ug 22 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>用以增幅由人類而來的米特洛蛋白質酶(metaroprotease) 基因之DNA片段的寡核甞酸引子C4-MT2F-S100 -95- 本紙•張尺度適用中國画家操準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（93 ) <400> 17 gatcgtctcg tccagcgccg cttgataagc actgttcctc cactcc 46 <210〉 18 <211〉 47 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉

<223〉用以增幅由人類而來的米特洛蛋白質酶(metaroprotease) 基因之DNA片段的寡核甞酸引子C4-MT2R-A <400> 18 gatcggacaa aggccacgta ggcgaagaca cagtcacacc ataaagg 47 <210〉 19 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以偵測内部控制DNA之寡核苷酸探針 <400> 19 gcactgttcc tccactccat 20

<210> 20 <211> 19 <212> DNA -96- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（94 ) <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以偵測披衣菌克立浦（criptic)質體之寡核苷酸探針CT1234 <400> 20 tcggagtctg agcacccta 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉用以偵測淋菌（Neisseria gonorrhoeae) cppB基因之寡核苷酸探針CppB3 <400〉 21 tccgtaacgt ctctaagtct 20

<210〉 22 <211> 218 <212〉 DNA <213〉披衣菌克立浦（criptic質體） <400> 22 ttgtcttctc gagaagattt atcgtacgca aatatcatct ttgcggttgc gtgtcctgtg 60 accttcatta tgtcggagtc tgagcaccct aggcgtttgt actccgtcac agcggttgct 120 -97- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311154 A7 B7 95 五、發明説明 cgaagcacgt gcggggttat cttaaaaggg attgcagctt gtagtcctgc ttgagagaac 180 gtgcgggcga tttgccttaa ccccaccatt tttccgga 218 <210〉 23 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列

<220〉 <223〉用以增幅披衣菌克立浦(criptic)質體之DNA片段的嵌合寡核苷酸引子"第20到22個核甞酸為核醣核苷酸-其他核甞酸為去氧核醣核苷酸” 裝 <400〉 23 gtgtcctgtg accttcatta ug 訂

<210〉 24 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉用以增幅披衣菌克立浦(criptic)質體之DNA片段的嵌合寡核苷酸引子"第20到22個核甞酸為核醣核苷酸-其他核甞酸為去氧核醣核苷酸" <400> 24 ttgtcttctc gagaagattu au •98- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公f) 1311154 A7 B7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（97 ) <213〉淋菌（Neisseria gonorrhoeae) <400〉 27 tctgctcgct ttgcttcaat gcctcgttga tatttttccg taacgtctct aagtctgctt 60 tcgtttgttg ctctatgctg gcggcttcgg tgcgtgatgt ctgctcg 107 <210> 28 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以增幅淋菌（Neisseria gonorrhoeae) cppB基因之 DNA片段的嵌合寡核:y：酸引子"第18到20個核苷酸為核醣核甞酸 -其他核苷酸為去氧核醣核钻酸” <400〉 28 ctttgcttca atgcctcguu 20 <210〉 29 <211> 17 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以增幅淋菌（Neisseria gonorrhoeae) cppB基因之 DNA片段的嵌合寡核:y：酸引子"第丨5到17個核甞酸為核醣核：y：酸 -其他核苷酸為去氧核醣核苷酸” -100- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（98 ) <400〉 29 catcacgcac cgaagcc 17 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>設計為HCV-F且用以增幅HCV —部分之經設計的嵌合寡核甞酸引子”第19到21個核苷酸為核醣核牮酸-其他核苷酸為去氧核醣核苷酸” <400> 30 ctgtgaggaa ctactgtcuu c 21 <210> 31 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉設計為HCV-R3且用以增幅HCV —部分之經設計的嵌合寡核苷酸引子"第16到18個核苷酸為核醣核苷酸-其他核甞酸為去氧核醣核甞酸” <400> 31 gcagaccact atggcucu 18 -101 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（99 ) <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉用以合成HCV之cDNA的經設計的寡核:y：酸引子 <400> 32 cactccacca tgaatcact 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>用以合成HCV之cDNA的經設計的寡核:y：酸引子 <'400> 33 ggtgcacggt ctacgagacc 20 <210〉 34 <211> 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以偵測可增幅HCV —部分的DNA片段之經設計的寡核甞酸探針本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311154 A7 B7 五、發明説明（100 ) <400〉 34 gccaaagcgt ctagccatgg cggg 24 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列〈220> <223〉用以偵測可增幅hcV —部分的DNA片段之經設計的寡核甞酸探針 <400〉 35 gcgagcaaag cgtctagcca tggcgttagt gctcgc 36 <210〉 36 ' <211> 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis) 而來之IS6 110基因的DNA片段之寡核:y：酸引子 <400> 36 tctcgtccag cgccgctt ig -103- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 131.1154 A7 B7 五、發明説明（) <210> 37 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以增幅由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis) 而來之IS6 110基因的DNA片段之寡核苷酸引子 <400〉 37 gacaaaggcc acgtaggcga a <210〉 38 <211> 103 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來用以增幅之IS6110基因之一部分 <400〉 38 tctcgtccag cgccgcttcg gaccaccagc acctaaccgg ctgtgggtag cagacctcac ctatgtgtcg acctgggcag ggttcgccta cgtggccttt gtc 103 <210〉 39 <211〉 410 <212> DNA <213〉人工序列 -104- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐）

裝訂

1311154 cacagcccgt gtgggtagca caccgacgcc catggtcotc cctgaaagac cgagcggctc caatgcacta A7 B7 五、發明説明（102 ) <220> <223〉由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來用以增幅之IS6 110基因之一部分 <400> 39 cccgccgatc tcgtccagcg ccgcttcgga ccaccagcac ctaaccggct gacctcacct atgtgtcgac ctgggcaggg ttcgcctacg tggcctttgt tacgctcgca ggatcctggg ctggcgggtc gcttccacga tggccacctc gacgcgatcg agcaagccat ctggacccgo caacaagaag gcgtactcga gttatccacc atacggatag gggatctcag tacacatcga tccggttcag gccgaggcag gcatccaacc gtcggtcgga gcggtcggaa gctcctatga gccgagacga tcaacggcct atacaagacc gagctgatca 410 <210> 40 <211〉 367 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉由結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)而來用以增幅之IS61 10基因之一部分 60 120 180 240 300 360 60 120 180 240 300 <400> 40 tctcgtccag ctatgtgtcg caggatcctg cgagcaagcc ccatacggat cgccgcttcg acctgggcag ggctggcggg atctggaccc aggggatctc gaccaccagc ggttcgccta tcgcttccac gccaacaaga agtacacatc acctaaccgg cgtggccttt gatggccacc aggcgtactc gatccggttc-105- ctgtgggtag gtcaccgacg tccatggtcc gacctgaaag agcgagcggc cagacctcac cctacgctcg tcgacgcgat acgttatcca tcgccgaggc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（103 ) aggcatccaa ccgtcggtcg gagcggtcgg aagctcctat gacaatgcac tagccgagac 360 gatcaac 367 <210> 41 <211> 73 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以增幅HCV—部分的引子區域 <400> 41 cactccacca tgaatcactc ccctgtgagg aactactgtc ttcacgcaga aagcgtctag 60 ccatggcgtt agt 73 〈210〉 42 <211> 41 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以增幅HCV—部分的引子區域 <400> 42 attccggtgt actcaccggt tccgcagacc actatggctc t 41

<210> 43 <211〉 53 <212> DNA -106 - _________ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1311154 A7 B7 五、發明説明（104 ) <213〉人工序列 <220〉〈223>用以偵測可增幅HCV —部分的DNA片段之探針區域 <400〉 43 cgcagaaagc gtctagccat ggcgttagta tgagtgtcgt gcagcctcca gga 53

<210> 44 <211〉 60 〈212〉 DNA <213〉披衣菌克立浦（criptic)質體 <400> 44 gtgtcctgtg accttcatta tgtcggagtc tgagcaccct aggcgtttgt actccgtcac 60 -107- 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210 x 297公爱)

Claims

1311条54i32333號專利申請案中文申請專利範圍替換本(97年10月）申請專利範園 1. 一種探針，其特徵為可檢測結核菌群之結核捍菌 (Mycobacterium tuberculosis)、牛結核桿菌 BC(} (Mycobacterium bovis BCG)、非洲分枝桿菌 (Mycobacterium africanum)、田鼠結核桿菌 (Mycobacterium microti)、及/或坎尼提結核桿菌 (Mycobacterium canetti)，其於 pH8〜14 之鹼性區域中，可與結核菌群之IS6110基因雜合，並含有序列表之序列編號U之鹼基序列。 2. 如申請專利範圍第！項之探針，其在與標的梭酸雜合時其螢光強度不會被抑制，而不與標的核酸雜合時其螢光強度則會被抑制。 3. 如申請專利範圍第〗項之探針，其5,末端係以若丹明系光色素或°号嗪系螢光色素標諸。 ’' 4. 如申請專利範圍第3項之探針，其中標諸螢光色素係具有報導子（reporter)螢光色素及庫恩查（quencher)色素/、 5. 如申請專利範圍第4項之探針，其中該報導子色素可為螢光素系色素，而庫恩查色素則可為Dabcyl.系色素 6. :申=利範圍…之探針，其係附加選自榮光物色素、酵素、生物素、金膠體以及放射性標言志。汗、< 7. 一種結㈣群之檢測方法，其係包含使用 =項。的探針於―驗性區域中進行:= 8·如申請專利範圍第7項的結核菌群之檢測方法，其係使 75794-971007.doc 本錄尺度適财國-@^^8) A4規格(2ΐ〇χ297ΐ^ 1311154 as B8 C8

、3 7之鹼基序列之弓丨子增幅再進行雜合反用具有分別表示於序列表之序列編號36 列之引子或具有與該序列—部份重複之序來自結核菌之IS6110基因及/或其片段後，應。 9. 如申請專利範圍第7之項結核菌測以包含以下列步驟之核酸增酸：群之檢測方法幅方法所得到 ’其係檢之增幅核 00 ~調製反m物之步驟’其係、將作為模板酸、去氧核酶核誓三填酸、具有股置換活性之随八节^ 酶、選自由分別表示於序列表之序列編號13〜16之驗ς 序列所組成之嵌合寡核芬酸引子群中之至h種類的$ 子以及RNaseH加以混合；在此，該引子係與作為模板之核酸的鹼基序列實質上互補，且至少含有選自去氧核酶核甞酸或核苌酸類似物者及核醣核甞酸，該核醣核菩酸係於該引子的3'末端或在3,末端側端配置有嵌合寡核苷酸引子者；以及， (b) —以生成反應產物所需之充分時間孵育反應混合物之步驟。 10.如申請專利範圍第9項的結核菌群之檢測方法，其係使用含有選自由分別表示於序列表之序列編號13〜16之鹼基序列所組成之嵌合寡核：y：酸引子群中之2種類的嵌合募核苷酸引子之反應混合物之核酸增福方法。 11· 一種結核菌群檢測用引子，其係選自： (0分別以序列表之序列編號13〜16表示者結核菌群檢測 75794-971007.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公董） A8 B8 C8 D8 、申請專利範

1311154 用肷合寡核誓酸引子； ⑻：幅來自結核菌群之18611。基因 =並具有分別以序列表之序列編號36、：二鹼基序列；及 /衣不的 (iii) (ii)中之引子酸之山人营序的一部份被置換成核糖核芬酸之肷合募核苷酸引子。甘如申請專利範圍第1〇項之引子，其係 14 Π:利：圍第12項之引子，其係附加有選：物一素、酵素、生物素及金谬體之標誌。人：如：明專利範圍第7項之結核菌群之檢測方法用組 0)申請專利範圍第1項之探針； (II) 申請專利範圍第10項之引子； (III) 具有股置換活性之£)]^八聚合酶； (iv) RNase ;及 (v) 去氧核醣核：y：三磷酸。 15•如申請專利範圍第14項之組合物，其中該簡八聚合酶係來自卡木鐵鈉桿菌（Bacillus cald〇tenax)2 5，— 31核苷酸外切酶缺損之BcaDNA聚合酶，該RNaseH係來自焦球菌 (Pyr〇C〇CCUS)屬細菌及/或來自古球菌（Archaeoglobus)屬細菌之II型RNaseH。 16. —種如申請專利範圍第7項之結核菌群之檢測方法用套組’其係含有： (i)申請專利範圍第1項之探針； 75794-971007.doc 小本紙银尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公着). 1311154 as B8 C8 ------------ D8 六、申請專利-- (1 1 )申請專利範圍第1 〇項之引子； (111)具有股置換活性之DNA聚合酶； (iv) RNase ;及 (v) 去氧核醣核甞三構酸。 Π.如申凊專利範圍第1 6項之套組，其中該DNA聚合酶係來自卡朵鐵鈉桿菌之3,核苷酸外切酶缺損之BcaDNA聚 5酶’ §亥RNaseH係來自焦球菌屬細菌及/或來自古球菌屬細菌之Η型RNaseH。 18.如申請專利範圍第16項之套組，其係含有用以捕捉增幅產物之載體。 19·如申請專利範圍第丨8項之套組，其載體係選自微滴定盤、微珠、磁性微珠、薄膜及玻璃之載體。 20.如申請專利範圍第7項之結核菌群之檢測方法，其係在結核菌群之檢測方法尹，包含以胞壁酸酶（Muramidase) 處理含有結核菌之檢體，並抽出核酸之步驟。 75794-971007.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐）.