KR101742016B1 - 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및/또는 나이세리아 고노로이에(Neisseria gonorrhoeae)균을 탐지하는 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 PCR 조성물, 및 PCR 키트에 관한 것으로서, 기존 사용하던 프로브 및 이를 이용한 PCR 키트에 비해 특이도 및 민감도가 현저히 우수한 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에주 탐지용 PCR 키트 및 탐지방법를 제공한다.

Description

클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트{Oligonucleotide for detecting Chlamydia trachomatis and/or Neisseria gonorrhoeae, and kit using the same}
본 발명은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및/또는 나이세리아 고노로이에(Neisseria gonorrhoeae)를 탐지하기 위한 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 조성물, 및 이를 이용하여 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및/또는 나이세리아 고노로이에(Neisseria gonorrhoeae)를 탐지하는 방법을 제공한다.
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)는 구형의 운동성 그람 음성 세균으로, 사람 사이의 접촉 또는 호흡기를 통해서 감염이 되며, 성병에 있어서 임균(Neisseria gonorrhoeae)과 더불어 가장 심각한 문제를 일으키는 세균 중 하나이다.
클라미디아의 감염은 Elementary Body(EB)가 숙주 세포에 침입한 후, EB 가 Reticulate Body (RB)를 형성하게 된다. 그 후, RB는 여러 차례 분열하게 되고, 그 과정 중에서 EB를 재생산하게 된다. 이렇게 재생산된 EB는 숙주 세포가 깨지는 과정에서 다른 세포로 이동할 수 있게 되어, 세포 간 감염이 확산이 된다.
클라미디아 속에는 클라미디아 트라코마티스 외에 클라미디아 시터시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 페코룸(Chlamydia pecorum) 등이 있다. 이 중에서 사람에게 영향을 미치는 세균은 클라미디아 트라코마티스와 클라미디아 뉴모니아이고, 이 중에서 클라미디아 트라코마티스는 사람의 성병과 관련이 있는 세균이다.
클라미디아 트라코마티스는 최소한 15개 혈청형(serotype)으로 나뉘는 데, 이러한 구분은 클라미디아 트라코마티스의 주요 외막 단백질(major outer membrane protein)를 항원-항체 반응을 기준으로 수행된다. 또한, 혈청형에 따라서 유발하는 질병이 다른데, 혈청형 A, B, C 타입은 안구 트라코마(oculartrachoma)를 유발하고, 혈청형 D, E, F, G, H, I, J, K 경우에는 요도염(urethritis), 부고환염(epididymitis), 자궁경부염(cervicitis), 난관염(salpingitis) 등을 유발시킨다. 또한 혈청형 L1, L2, L3 경우 성병성 림프육아종을 유발한다. 크게 나누어, 혈청형 A 형부터 K 형까지는 점막의 표피세포에 감염되고, 혈청형 L1, L2, L3 경우 림프 조직에서 증식하거나 전신성 감염(Systemic Infection)을 유발시킨다.
클라미디아 트라코마티스 감염증의 경우 세계적으로 발생률이 높은 성병 중 하나이며, 자각 증세가 없는 불현성 감염이 50%가 넘는다. 초기에 발견했을 경우 쉽게 치료가 되지만, 치료가 늦어질 경우에는 골반염, 불임 등의 합병증을 유발하기 때문에, 이에 대해 확실한 검사가 요구된다.
나이세리아 고노노리에(Neisseria gonorrhoeae)는 그람-음성의 호기성 쌍구균으로, 임질을 일으키는 세균으로 알려져있다. 전 세계적으로 매년 6천만 명 이상의 사람이 나이세리아 고노로이에에 감염되는 것으로 보고되고 있으며, 이러한 나이세리아 고노로이에에 감염은 임질 발병을 유발시킨다. 임질은 감염된 여성의 30 내지 60%, 감염된 남성의 10% 이하에서 자각 증상이 없기 때문에 인지되지 않고, 치료되지 않은 나이세리아 고노로이에가 수개월 동안 숙주에서 감염성인 채로 존재할 수 있으며, 이는 임질의 만연을 촉진하는 하나의 원인이 되고 있다.
나이세리아 고노로이에에 감염된 경우, 여성은 배뇨통, 질분비물, 간격을 둔 질내 출혈, 및 복통의 증상을 나타낸다. 또한, 남성은 배뇨통 및 요도로부터의 화농성 분비물이 발생하는 증상이 나타난다. 또한, 남성은 요도로부터 남성 생식관의 기타 부분으로 만연되어, 부고환염, 전립선염, 및 다양한 기타 질환, 예를 들어 요도 주위의 농양을 야기할 수 있다. 드물게는 혈액을 통해 세균이 유포되어, 관절염, 세균혈증 또는 심내막염을 야기할 수도 있다. 또한, 나이세리아 고노로이에는 주로 성적으로 감염되나 감염된 산도를 통하여 신생아에 감염될 수 있다. 이는 아기에게 실명, 관절 감염 또는 생명을 위협하는 혈액 감염을 야기할 수 있어 나이세리아 고노로이에의 조기 탐지가 감염을 제어하기 위해 필수적이다.
현재 미국 FDA에서 공인을 받은, 클라마이디아 트라코마티스, 나이세리아 고노로이에 등을 검색하는 PCR 및 리얼타임(real time) PCR 키트가 시판되고 있으나, 아직까지 상기 균을 신속하고 정확하게 파악할 수 있을 뿐 아니라, 항생제 내성까지 검사하여 임상 진단에 크게 도움을 줄 수 있는 PCR 키트는 더욱 보기 드물다. 특히 본 발명에서와 같은, 클라마이디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로이에의 진단과 함께 그 항생제 내성균까지 모두 검색할 수 있는 PCR 키트는 아직 상업화가 되어 있지 않다.
그러나 상기 PCR 키트는 정확도 및 민감도에 문제가 있었으며, 따라서, 따라서, 클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로이에를 동시에 간단하고, 정확하게 탐지할 수 있을 뿐만 아니라 높은 특이도와 민감도를 갖는 탐지 방법 및 키트, 이에 사용되는 프로브를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
또한, 상기 탐지키트, 이에 사용되는 프로브는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 높은 특이도 및 민감도로 분석하여, 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 더욱 정확하게 탐지할 수 있어야 함과 동시에, 하나의 PCR 키트 상에서 탐지 가능한 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에의 프로브 간에 혼성화가 발생하지 않아야 한다.
1종 이상의 세균을 동시에 탐지하면서도 높은 특이도 및 민감도도 분석하기 위해서는, 프로브의 길이, 반응이 일어나는 온도, GC함량, 비표적 서열과 서열 유사도 등을 개선한 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 프로브의 개발이 절실하다.
본 발명의 일 예는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 높은 특이도 및 민감도로 탐지하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 유용하다.
다른 예는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에의 DNA 와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하기 위한 세균 탐지용 조성물을 제공한다.
다른 예는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하기 위한 신규한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 PCR 키트를 제공한다.
다른 예는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하기 위한 신규한 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하는 방법을 제공한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드, 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하기 위한 세균 탐지용 조성물 및 PCR 키트, 및 상기 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지방법을 제공한다.
본 발명자들은 검체로부터 얻어진 시료 DNA를 분석하여 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하고, 탐지된 세균의 종류를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구 노력한 결과, 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 탐지용 조성물 및 PCR 키트를 개발하였다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로이에 각각에 특이적으로 교잡(hydridization) 반응을 수행한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 고효율로 탐지하고, 탐지된 세균의 종류를 정확하게 판별할 수 있으며, 비표적 영역과 서열유사도가 낮고, 교차 교잡반응이 일어나지 않으며, 2차 구조형성이 방지되어, 특이도와 민감도가 높다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 예는 서열번호 1 내지 6에 기재된 염기서열을 포함하며, 구체적으로, 서열번호 1 내지 3은 각각 클라미디아 트라코마티스 탐지용 올리고뉴클레오타이드이며, 서열번호 4 내지 6은 각각 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드이다. 구체적인 예를 하기 표 1에 기재하였다.
Primer
/probe		 서열 (5'-3') 서열
번호		 Tm
(℃)		 GC
함량(%)		 증폭산물(bp)
CT_F AAGGGATTGCAGCTTGTAG 1 60 47.3 113
CT_R GTACATCGGTCAACGAAGAG 2 60 50.0
CT_P AACGTGCGGGCGATTTGCCTTAAC 3 70 50.0
NG_F CGTTCTTGACGCTCCATATC 4 60 50.0 101
NG_R GGCAGTATTCAAGCCCTATC 5 60 50.0
NG_P ATGACTATCAACCCTGCCGCCGAT 6 69 54.1
IC_F CTGCCTATCAGAAAGTGGTG 7 60 50.0 119
IC_R GTAGTTGGACTTAGGGAACAAA 8 60 40.9
IC_P TACTTGTGGGCCAGGGCATTAGCC 9 70 58.3
상기 표 1에 기재의 약자는 다음과 같다.
IC: Internal Control (Human hemogolbin β gene)
CT: Chlamydia trachomatis
NG: Neisseria gonorrhoeae
IC는 내부 대조구(internal control)로서, DNA 추출부터 증폭까지, 전 과정이 제대로 실험이 되었는지 확인할 수 있으며, 실험상 신뢰도를 높이기 위해 사용된다.
본 발명에 따른 탐지용 올리고뉴클레오타이드는 구체적으로 세균 탐지용 표적 유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머와 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 서열을 포함한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 프라이머는 서열번호 1 내지 2, 서열번호 4 내지 5 및 서열번호 7 내지 8의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 2의 염기서열로 구성된 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 4 내지 5의 염기서열로 구성된 나이세리아 고노로이에 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 7 내지 8의 염기서열로 구성된 IC (Internal Control)의 탐지용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에 따른 세균 탐지용 표적 유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머를 이용한 탐지의 특이도와 민감도를 높이기 위해 고려되어야 할 사항으로는, i) 올리고뉴클레오타이드의 적절한 길이를 선정하고, ii) 비교적 좁은 범위의 반응이 일어나는 온도(melting temperature range)을 가지며, iii) 가급적 2차 구조를 형성하지 않도록 제작하며, iv) 적절한 신호강도를 갖는 40 내지 60%의 GC 함량을 설정하고, v) 교차 교잡반응(cross hybridization)을 방지하기 위해 서열의 반복을 최소화하고, vi) 탐지대상서열 (표적 서열)의 선택성을 높이고자 비표적 서열과 서열 상동성(nucleotide sequence identity)이 높지 않아야 하며, 예를 들면 비표적 염기서열과의 서열동일성이 약 75% 이하인 것이 바람직하다. 표적서열과 비표적 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드의 염기서열 동일성을 낮추기 위하여, 예를 들면 Cluster W program 사용으로 비표적 서열과의 유사도를 측정하여 75% 미만의 염기서열 동일성을 가지도록 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. 본 발명에 따른 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오로타이드는 서열이 모두 상이하며, 적정 GC함량, 2차 구조(Secondary structures)가 없고, 반복서열의 최소화, 비표적 서열과 75% 이하의 염기서열 동일성을 갖는 특성이 있어 이를 이용한 세균 탐지용 조성물 및 PCR 키트는 특이도와 정확도를 높이고 교차 교잡반응의 오류를 더욱 줄일 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 프로브는 서열번호 3의 염기서열 또는 이와 상보적으로 결합 가능한 염기서열을 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브, 서열번호 6의 염기서열 또는 이와 상보적으로 결합 가능한 염기서열을 포함하는 나이세리아 고노로이에 탐지용 프로브, 서열번호 9의 염기서열 또는 이와 상보적으로 결합 가능한 염기서열을 포함하는IC(Internal Control) 프로브이다.
상기 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 (예컨대, 나이세리아 고노로이에 탐지용 프로브), 클라미디아 트라코마티스 탐지용 올리고뉴클레오타이드 (예컨대, 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브), 또는 이들의 조합은 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 탐지 가능한 표지물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 표지물질은, FAM, HEX, Cy5, 및 ROX로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 형광 물질, IABkFQ 및 IAbRQSp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 소광 물질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표지 물질에 대한 특성을 하기 표 2에 기재하였다. 본 발명에 따른 프로브는 5-말단에 형광물질을, 3-말단에 소광물질을 표지할 수 있다. 상기 IABkFQ 및 IAbRQSp는 단파장 발산을 위한 소광물질(퀸처)을 나타낸다.
표지물질 흡광파장
(nm)		 방출파장
(nm)		 빛의 색깔 표적
FAM 495 520 Dark green CT
HEX 535 556 Light green NG
Cy5 650 670 Red IC
ROX 575 608 Red Reference (calibration)
본 발명의 일예에서, CT_P의 경우 5-말단은 6-FAM으로, 3-말단은 IABkFQ으로 표지된 서열일 수 있다. NG_P의 경우 5-말단은 HEX으로, 3-말단은 IABkFQ로 표지된 서열일 수 있다. IC_P의 경우 5-말단은 Cy5으로, 3-말단은 IAbRQSp으로 표지된 서열일 수 있다.
실시간 중합연쇄효소반응은 반응에 사용되는 프로브의 한쪽 말단에 형광물질을 표지하고, 반대쪽 말단엔 소광물질을 표지하면, 실시간 중합연쇄효소반응이 시작되지 않은 단계에서는 소광물질이 형광물질의 형광 방출을 억제하여 형광이 발현되지 않으나, 실시간 중합연쇄효소반응이 시작되면 소광물질이 떨어져 나가면서 프로브의 한쪽 말단에 표지된 형광물질의 형광이 발현하게 되며 이를 탐지할 수 있다.
본 발명은 상기 클라미디아 트라코마티스 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 나이세리아 고노로이에 및 클라미디아 트라코마티스 탐지를 위한 세균 탐지용 조성물 또는 탐지키트를 제공한다.
구체적인 예에서, 상기 탐지용 조성물은 (1) 클라미디아 트라코마티스 탐지용 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 조성물 또는 탐지키트를 제공하거나, (2) 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 나이세리아 고노로이에 탐지용 조성물 또는 탐지키트를 제공하거나, (3) 클라미디아 트라코마티스 탐지용 올리고뉴클레오타이드와 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드를 함께 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로이에로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 탐지하는 조성물 또는 키트를 제공할 수 있다. 상기 탐지용 올리고뉴클레오타이드에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 탐지용 조성물 또는 탐지키트는 세균의 표적 유전자 증폭용 프라미어와 표적 유전자 탐지용 프로브를 각각 별개로 포함하거나 함께 포함할 수 있으며, 바람직하게는 세균의 표적 유전자 증폭용 프라미어와 표적 유전자 탐지용 프로브 함께 포함할 수 있다.
또한, 상기 세균 탐지용 조성물들은 IC용 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 서열번호 7 내지 8의 염기서열을 포함하는 프라미머, 및/또는 서열번호 9의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열을 갖는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 탐지용 조성물 또는 키트는 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 외에, 선택적으로 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액 DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열안정 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자, 및 4개의 다른 뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 상기 나이세리아 고노로이에 및/또는 클라미디아 트라코마티스 탐지를 위한 세균 탐지용 조성물을 이용하는 나이세리아 고노로이에 및 클라미디아 트라코마티스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 세균을 탐지하기 위한 탐지 방법을 제공한다. 세균 탐지용 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
구체적인 탐지 방법은, 시료 DNA에 상기 세균 탐지용 조성물을 반응시켜 시료 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 더욱 자세하게는 a) DNA 시료에 상기 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지를 위한 세균 탐지용 조성물을 처리하는 단계, b) DNA 시료를 증폭시키는 증폭된 DNA를 얻는 DNA 시료 증폭 단계, c) 상기 증폭된 DNA를 상기 조성물에 포함된 프로브와 교잡반응(hybridization)시켜 프로브와 교잡된 DNA를 얻는 교잡 반응 단계, 및 d) 상기 프로브와 교잡된 DNA를 검출하는 검출 단계를 포함한다.
상기 시료 DNA의 증폭단계는 IC용 프라이머 세트와 탐지대상 세균의 표적 유전자 증폭용 프라이머 세트, 예를 들면 서열번호 1 내지 2의 염기서열로 구성된 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 4 내지 5의 염기서열로 구성된 나이세리아 고노로이에 증폭용 프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 8의 염기서열로 구성된 IC(Internal Control)의 탐지용 프라이머 세트로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 시료 DNA를 증폭할 수 있다.
상기 시료 DNA의 증폭은 통상의 PCR 반응으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2종 이상의 프라이머를 사용하여 동시에 증폭하는 다중 PCR 증폭법 또는 real-time PCR일 수 있다. 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 유전자 증폭을 위한 가장 적합한 조건을 선정하여 수행할 수 있다.
본 발명의 시료 DNA는 검체로부터 분리된 것이며, 상기 검체는 동물일 수 있으며, 예를 들어 인간을 포함한 포유류일 수 있다. 시료 DNA을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 검출단계는, 증폭산물을 전기영동하여 목적 증폭산물의 밴드를 확인하여 결정하거나, 탐지 가능한 표지가 결합된 증폭산물의 존재 여부를 검출하여 결정할 수도 있다. 예를 들면 프로브와 교잡된 DNA를 프로브의 표지물질을 검출하여 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하는 것으로서 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 표지물질을 다양한 방법으로 검출할 수 있으며, 표지물질이 형광표지인 경우에는 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)를 사용하려 수행할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 클라미디아 트라코마티스, 나이세리아 고노로이에 및 시험대조군(IC) 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 그리고 중합효소 (예, Taq 폴리머라제)를 포함하고, 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 PCR 기기에 넣고, 95℃에서 3분간 전변성(Pre-denaturation)후, 95℃에서 10초간 변성(denaturation), 58℃에서 40초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension) 과정을 39회 반복 후 95℃에서 10초, 50℃에서 30초간 더 연장(extension) 반응을 하여, 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지할 수 있다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 고민감도 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 세균 탐지용 조성물 및 PCR 키트를 제공하며, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 이용한 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 PCR 키트를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지할 경우, 신속하고 간단하며 정확하게 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지할 수 있으므로, 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지를 위한 프로토콜을 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지를 위해 PCR 증폭 후 파장에 따른 증폭결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 올리고뉴클레오타이드의 제조 및 특성확인
1-1: 올리고뉴클레오타이드의 제조
Chlamydia trachomatis(CT)와 Neisseria gonorrhoeae(NG)를 탐지하기 위해, 클라미디아 트라코마티스, 나이세리아 고노로이에, 또는 시험대조군(IC) DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 새로운 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 각 올리고뉴클레오타이드의 염기서열은 하기 표 3과 서열목록에 나타냈다.
1-2: 올리고뉴클레오타이드의 특성분석
하기 표 3에 나타낸 올리고뉴클레오타이드에 대해서, melting temperature 및 GC함량을 분석하여 표시하였다. 본 실시예에서 제공하는 올리고뉴클레오타이드는 i) 비교적 좁은 범위의 반응이 일어나는 온도(melting temperature range)를 가지며, ii) 2차 구조를 형성하지 않으며, iii)적절한 신호강도를 갖는 40 내지 60%의 GC 함량을 가지고, iv) 교차 혼성화(cross hybridization)를 방지하기 위해 서열의 반복을 최소화하였고, v) 비표적 서열과의 염기서열의 서열동일성이 약 75% 이하임을 확인하였다.
Primer
/probe		 서열 (5'-3') 서열
번호		 Tm
(℃)		 GC
함량(%)		 증폭산물의 크기(bp)
CT_F AAGGGATTGCAGCTTGTAG 1 60 47.3 113
CT_R GTACATCGGTCAACGAAGAG 2 60 50.0
CT_P AACGTGCGGGCGATTTGCCTTAAC 3 70 50.0
NG_F CGTTCTTGACGCTCCATATC 4 60 50.0 101
NG_R GGCAGTATTCAAGCCCTATC 5 60 50.0
NG_P ATGACTATCAACCCTGCCGCCGAT 6 69 54.1
IC_F CTGCCTATCAGAAAGTGGTG 7 60 50.0 119
IC_R GTAGTTGGACTTAGGGAACAAA 8 60 40.9
IC_P TACTTGTGGGCCAGGGCATTAGCC 9 70 58.3
실시예 2: PCR을 이용한 성능 평가
2-1. 균주 정보
클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노로이에 증폭 시험을 위하여 ATCC에서 농도를 알 수 있는 표준 균주를 구입하여 균주별 배양 조건에 따라 배양한 후 게놈 DNA를 추출하여 사용하였다. 구체적인 균주의 정보는 하기 표 4에 나타내었다.
Product ATCC No. Strain DNA concentration 260/280 Ratio
Chlamydia trachomatis Serovar H VR-879DTM UW-43/Cx DNA 1.66㎍/ml
1.48*109 copies/ml		 1.71
Neisseria gonorrhoeae (Zopf) Trevisan 53420D-5TM no type 68㎍/ml
2.92*1010 copies/ml		 1.8
2-1. IC ( internal control ) 테스트용 농도 결정
IC 증폭을 위한 적절한 주형 DNA 양의 농도를 결정하기 위하여 무작위적으로 선택한 여성의 vaginal swap 검체 14개에서 추출된 DNA의 농도 및 순도를 측정하였다. DNA 추출 방법은 위의 spin-column 방법으로 진행하였으며, 농도 및 순도 측정은 DNA 농도 측정기를 이용하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
구체적으로, DNA의 농도는 260nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였으며, DNA 순도는 260nm의 흡광도 값을 280nm의 흡광도 값과의 비율로 결정하였다. 260/280 ratio가 1.8 내지 2.0인 경우 순도가 좋음을 의미한다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
구체적으로, 시료 DNA를 추출하는 방법은 튜브에 시료 200-400㎕와 lysis 버퍼 200㎕를 넣고 5초 정도 가볍게 vortex 하고, 프로테이나제케이(PK) 용액을 튜브에 첨가한 후, 가볍게 vortex 한 후에, 60℃에서 10분간 반응하였다. 반응 종료 후에, 튜브에 이소프로판올을 혼합하고 5초 정도 spin down 하여 뚜껑에 있는 용액을 떨어뜨리고, 사기 혼합물을 준비된 스핀 컬럼에 넣었다. 이때 스핀 컬럼의 뚜껑이 젖지 않도록 주의하며 원심분리를 수행하였다. 스핀컬럼을 통과한 여과액이 담긴 튜브는 버리고 다시 스핀 컬럼을 새로운 튜브에 장착하고, 세척버퍼 1을 스핀 컬럼의 가장자리가 젖지 않도록 넣어주고 원심분리를 수행하였다. 스핀컬럼을 통과한 여과액은 따라버리고 다시 스핀 컬럼을 새 튜브에 장착하고, 세척버퍼 2를 스핀 컬럼의 가장자리가 젖지 않도록 넣어주고, 원심분리를 수행하였다. 스핀 컬럼을 통과한 여과액은 따라버리고 다시 스핀 컬럼을 새 튜브에 장착하고, 스핀 컬럼을 12,000rpm에서 원심분리를 수행하였다. Absolute ethanol이 완전히 제거된 스핀컬럼을 새로운 튜브에 옮기고 용출 버퍼를 스핀컬럼의 가장자리가 젖지 않도록 중앙에 넣고 5분간 상온에 방치한 후에, 원심분리 하여 용출을 수행하였다.
Sample DNA (ng/㎕) 260/280 Ratio
Swap 01 20.9 1.82
Swap 02 32.8 1.75
Swap 03 11.9 1.96
Swap 04 75.2 1.77
Swap 05 58.4 1.87
Swap 06 40.6 1.85
Swap 07 228.4 (최대값 제외) 1.84
Swap 08 76.9 1.84
Swap 09 16.8 1.84
Swap 10 5.8 (최소값 제외) 1.89
Swap 11 16.4 1.84
Swap 12 142.8 1.83
Swap 13 21.6 1.92
Swap 14 145.7 1.84
Mean 57.5 1.86
상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 평균 DNA의 농도는 57.5 ng/ul이며 260/280 ratio가 1.86으로 관찰되었으며 이를 근거로 본 연구를 위한 IC 증폭용 기준 농도를 50ng/ul로 결정하여 이후 실험을 진행하였다. IC는 분석과정에서 질병의 유무, 즉 증폭대상 유전자의 유무와 관계없이 증폭이 확인되어야 한다. IC 농도는 DNA 농도와 비례하기 때문에 무작위 샘플을 이용하여 DNA를 추출하여 농도를 측정하여 평균 농도를 계산하는 것이다.
실시예 3: 검출한계( LOD ) 평가 및 검증
3-1. 패널 구성
탐지용 PCR 키트로의 성능을 평가하기 위하여 ATCC에서 구입한 Chlamydia trachomatis Serovar H, Neisseria gonorrhoeae (Zopf) Trevisan 표준 균주의 DNA를 혼합하여 아래 표와 같이 패널을 구성하였다.
구분 CT DNA 농도 NG DNA 농도 HeLa DNA 농도 (IC)
P1-1 10pg/㎕ 10pg/㎕ 50ng/㎕
P1-2 1pg/㎕ 1pg/㎕ 50ng/㎕
P1-3 100fg/㎕ 100fg/㎕ 50ng/㎕
P1-4 10fg/㎕ 10fg/㎕ 50ng/㎕
P1-5 1fg/㎕ 1fg/㎕ 50ng/㎕
3-2. 표준 DNA를 이용한 검출 한계
상기 제작된 패널을 사용하여 CT와 NG 동시 증폭 및 복합 감염에 대한 성능을 확인하여, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. CT/NG/IC 프라이머와 형광물질이 탑제된 프로브가 포함한 PCR 조성물을 사용하였으며, 세 가지 표적유전자를 모두 증폭과 동시에 형광을 측정하였다. 표준 DNA를 이용한 PCR은 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 및 Taq 폴리머라제와 버퍼를 PCR 기기에 넣고, 95℃에서 3분간 전변성(Pre-denaturation)후, 95℃에서 10초간 변성(denaturation), 58℃에서 40초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension) 과정을 39회 반복 후 95℃에서 10초, 50℃에서 30초간 더 연장(extension) 반응을 수행하였다. 상기 실험결과를 표 7에 나타냈다. CT의 경우 119%의 PCR 효율성을 나타냈고, NG의 경우 92% PCR 효율을 나타냈다.
Fluor Target
concentration 		1st run ( Cq ) 2nd run ( Cq ) Mean S.E
Cy5 IC 50ng/㎕ 29.71 29.13 29.42 0.21
Cy5 IC 50ng/㎕ 2966 27.92 28.79 0.61
Cy5 IC 50ng/㎕ 29.02 27.49 28.26 0.54
Cy5 IC 50ng/㎕ 29.32 27.92 28.62 0.50
Cy5 IC 50ng/㎕ 29.21 28.32 28.77 0.31
FAM CT 10pg/㎕ 28.15 30.42 29.29 0.80
FAM CT 1pg/㎕ 32.11 33.87 32.99 0.62
FAM CT 100fg/㎕ 36.21 36.88 36.54 0.24
FAM CT 10fg/㎕ 37.86 N/A
FAM CT 1fg/㎕ N/A N/A
HEX NG 10pg/㎕ 24.18 24.18 24.13 0.03
HEX NG 1pg/㎕ 27.47 27.47 27.42 0.03
HEX NG 100fg/㎕ 31.35 31.35 31.13 0.16
HEX NG 10fg/㎕ 34.87 34.59 34.73 0.09
HEX NG 1fg/㎕ 38.86 N/A
상기 표에서 확인할 수 있듯이 CT의 경우 10fg, NG의 경우 1fg의 검출 한계를 보였다.
3-3: 검출한계( LOD ) 검증
CT의 10fg과 NG의 1fg에서 검출한계를 20번 반복 측정하여 95%의 양성율을 보이는지 확인하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
실험 횟수 10fg 1fg
IC CT IC NG
1 30.67 36.59 31.01 36.02
2 31.01 37.87 32.05 36.09
3 31.23 38.10 31.47 35.89
4 31.04 38.08 31.05 35.86
5 29.57 36.87 31.16 35.92
6 30.08 37.01 31.00 36.16
7 30.53 36.62 30.54 35.73
8 30.65 36.39 30.20 36.04
9 30.77 36.41 31.45 36.51
10 30.96 36.06 31.88 36.53
11 30.85 36.43 31.65 36.62
12 30.69 36.68 31.33 36.31
13 29.83 36.62 31.90 36.20
14 30.31 36.69 31.73 36.49
15 30.48 36.96 31.28 36.26
16 30.38 37.16 31.25 36.27
17 30.64 36.97 32.01 36.45
18 32.02 37.19 31.92 36.45
19 30.97 35.97 32.27 36.11
20 31.17 37.30 31.72 36.59
% 100 100 100 100
상기 표 8에서 확인할 수 있듯이, CT의 10fg과 NG의 1fg에서 검출한계를 20번 반복 측정하여 95%의 양성율을 보이는지 확인한 결과 100%의 검출 능력을 보여 LOD값을 검증하였다.
실시예 4: 진단민감도 및 진단특이도 평가
진단민감도, 진단특이도 확인을 위한 NG 양성 검체 27개, CT 양성 검체 45개, NG와 CT 복합감염 검체 5개로 총 77개의 검체에 대하여 다음과 같이 PCR 분석을 수행하였다. 임상 검체를 이용하여 DNA 추출 후 저희가 설계한 real- time PCR를 수행하여 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
감염군 LabGun rt CT/NG
CT NG CT, NG negative
CT 41 - - 4
NG - 27 - 0
CT, NG - 2 3 0
상기 표 9의 결과를 하기의 식에 대입하여, 진단민감도, 진단특이도, 양성예측률, 및 음성예측률을 계산하였다. 하기 용어 중 "TP"는 True positive, "TN"은 True negative, "FP"는 False positive, "FN"은 False negative를 의미한다.
진단민감도(%) = TP / (TP + FN) × 100
진단특이도(%) = TN / (FP + TN) × 100
양성예측률(%) = TP / (TP + FP) × 100
음성예측률(%) = TN / (FN + TN) × 100
그 결과 CT의 경우에는 진단민감도는 88%, 진단특이도는 100%, 양성예측률은 100%, 음성예측률은 81.8%로 나타났으며, NG의 경우에는 진단민감도, 진단특이도, 양성예측률, 및 음성예측률 모두 100%로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 성인성 질환의 원인균 탐지용 고감도 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 PCR 키트를 이용할 경우, 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 대한 민감도 및 특이도가 우수하므로, 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에를 탐지하는 효과가 우수함을 확인하였다.
<110> Labgenomics <120> Oligonucleotide for detecting Chlamydia trachomatis and/or Neisseria gonorrhoeae, and kit using the same <130> DPP20163099KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT_F <400> 1 aagggattgc agcttgtag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT_R <400> 2 gtacatcggt caacgaagag 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT_P <400> 3 aacgtgcggg cgatttgcct taac 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_F <400> 4 cgttcttgac gctccatatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_R <400> 5 ggcagtattc aagccctatc 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_P <400> 6 atgactatcn aaccctgccg ccgat 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_F <400> 7 ctgcctatca gaaagtggtg 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_R <400> 8 gtagttggac ttagggaaca aa 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_P <400> 9 tacttgtggg ccagggcatt agcc 24

Claims (15)

  1. 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 나이세리아 고노로이에(Neisseria Gonorrea, NG) 유전자 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트의 나이세리아 고노로이에 유전자의 검출 한계는 시료 내에 포함된 나이세리아 고노로이에의 DNA의 농도가 1fg/㎕인 것인, 나이세리아 고노로이에 유전자 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트에 의해 증폭된 나이세리아 고노로이에 유전자 증폭산물과 특이적으로 결합하며, 서열번호 6의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 것인, 나이세리아 고노로이에(Neisseria Gonorrea, NG) 탐지용 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 5'-말단 및 3'-말단 중 적어도 하나의 말단에 연결된 탐지 가능한 표지 물질을 추가로 포함하는 것인, 나이세리아 고노로이에 탐지용 프로브.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표지 물질은 FAM, Cy5, HEX, ROX, IABkFQ 및 IAbRQSp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지 물질인 것인, 나이세리아 고노로이에 탐지용 프로브.
  6. 제1항의 나이세리아 고노로이에(Neisseria Gonorrea, NG) 유전자 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트, 및
    서열번호 6의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 나이세리아 고노로이에 탐지용 프로브를 포함하는 세균 탐지용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은,
    서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 중합효소연쇄반응용 대조구 프라이머 세트,
    서열번호 9의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 대조구 프로브, 또는
    상기 대조구 프라이머 세트 및 프로브의 조합을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 5'-말단 및 3'-말단 중 적어도 하나의 말단에 연결된 탐지 가능한 표지 물질을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표지 물질은 FAM, Cy5, HEX, ROX, IABkFQ 및 IAbRQSp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지 물질인 것인, 조성물.
  10. 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자, 및 뉴클레오티드 트리포스페이트로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  11. 제1항의 나이세리아 고노로이에(Neisseria Gonorrea, NG) 유전자 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 이용하여, 시료 DNA를 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 세균 탐지 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 증폭단계에는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 중합효소연쇄반응용 대조구 프라이머 세트를 추가로 포함하여 수행하는 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 검출단계는, 상기 증폭산물을 서열번호 6의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 나이세리아 고노로이에 탐지용 프로브를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 검출단계는, 상기 증폭단계에서 얻어진 증폭산물을 서열번호 9의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 대조구 프로브를 추가로 사용하여 수행되는 것인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 프로브는 FAM, Cy5, HEX, ROX, IABkFQ 및 IAbRQSp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 탐지 가능한 표지물질을 5'-말단 및 3'-말단 중 적어도 하나의 말단에 추가로 포함하는 것인, 방법.
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