RU2646123C1 - СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ - Google Patents
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646123C1 RU2646123C1 RU2017133677A RU2017133677A RU2646123C1 RU 2646123 C1 RU2646123 C1 RU 2646123C1 RU 2017133677 A RU2017133677 A RU 2017133677A RU 2017133677 A RU2017133677 A RU 2017133677A RU 2646123 C1 RU2646123 C1 RU 2646123C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- genitalium
- mutation
- pneumoniae
- mycoplasma
- indicates
- Prior art date
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 title claims abstract description 30
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title description 3
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 41
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 23
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 23
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 208000001572 Mycoplasma Pneumonia Diseases 0.000 abstract 1
- 201000008235 Mycoplasma pneumoniae pneumonia Diseases 0.000 abstract 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 3
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 2
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- XJSFLOJWULLJQS-NGVXBBESSA-N josamycin Chemical compound CO[C@H]1[C@H](OC(C)=O)CC(=O)O[C@H](C)C\C=C\C=C\[C@H](O)[C@H](C)C[C@H](CC=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](N(C)C)[C@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)CC(C)C)[C@](C)(O)C2)[C@@H](C)O1 XJSFLOJWULLJQS-NGVXBBESSA-N 0.000 description 1
- 229960004144 josamycin Drugs 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к диагностике, а именно: к ДНК-анализу, и может быть использовано для выявления мутаций резистентности к макролидным антибиотикам у Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumonia, а именно в позициях 2058/2059 и 2611 23S рРНК. Для детекции мутаций разрабатывают два реверсных праймера для М. pneumoniae: Mpn2611-Rv AAGCAACACTCTTCAATCTTCC(T-BHQ1)А и Mpn2059-Rv3 ATCAATATTATGCTACAGTAAAGCT(T-BHQ1)CAG, а также два реверсных праймера для М. genitalium: Mge2611-Rev AGCAAAGCTCTTCAATCTTCC(T-BHQ1)G и Mge2059-Rv3 ATCAATATTATGCTACAGTAAAGCT(T-BHQ1)CACG. Применение предложенного способа позволяет снизить трудозатраты и время анализа за счет использования технологии ПЦР в режиме реального времени. 2 ил., 3 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к диагностике, а именно: к ДНК-анализу, и может быть использовано для выявления маркеров резистентности к макролидным антибиотикам у Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumoniae. Известен способ выявления мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным антибиотикам, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в варианте FRET и анализа кривых плавления, включающий: амплификацию и детектирование точечных мутаций с использованием пары праймеров и пары зондов. В одном из существующих на данный момент методов выявления мутаций, основанных на ПЦР-РВ, детектирование мутаций: A2058G, A2059G, А2058С-(согласно нумерации для Е. coli) осуществляется с помощью праймеров к гену 23S рРНК и зондов, которые содержат флуорофор на 5'-конце и гаситель на 3'-конце; связывание этого зонда с ампликоном и последующее расщепление за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы сопровождается нарастанием флуоресценции. Выявление мутаций проводят с использованием постамплификационного анализа кривых плавления (Touati A1, Peuchant О, Jensen JS, , Pereyre S. Direct detection of macrolide resistance in Mycoplasma genitalium isolates from clinical specimens from France by use of real-time PCR and melting curve analysis. J Clin Microbiol. 2014 May; 52 (5): 1549-55).
Основные недостатки этого способа:
1. Не позволяет одновременно выявлять в этом же клиническом материале нуклеотидные замены в позиции 2611 в гене 23S рРНК М. genitalium и М. pneumoniae.
2. Не позволяет выявлять все возможные виды мутаций, метод детектирует наличие только трех: в позиции A2058G, A2059G и А2058С в гене 23S рРНК М. genitalium.
3. Не был адаптирован и апробирован для выявления мутаций к макролидным антибиотикам у М. pneumoniae.
Техническим результатом предлагаемого способа является выявление наличия мутаций в гене 23S рРНК М. genitalium и М. pneumoniae в клиническом материале пациента для выбора адекватной антибиотикотерапии и контроля эпидемиологического процесса.
Сущность предлагаемого способа состоит в том, что осуществляют выявление любых нуклеотидных замен в позициях 2058, 2059 и 2611 в гене 23S рРНК М. genitalium и М. pneumoniae с помощью ПЦР-РВ и последующего анализа кривых плавления зондов на двух каналах FAM и JOE, непосредственно в клиническом материале в мультиплексном формате (в одной пробирке), используя в реакции две пары праймеров и два зонда соответственно для каждого вида микоплазм. Система праймеров и зондов построена следующим образом: две пары праймеров к 5'-концевому фрагменту 23S рРНК и два зонда содержат различные флуоресцентные метки (R6G-меченный зонд) для выявления замен в позиции 2611 и (FAM-меченный зонд) для выявления замен в позиции 2058/2059, при этом о наличии в исследуемом образце однонуклеотидных замен судят по характерным пикам плавления, которые имеют меньшую температуру плавления относительно образцов, имеющих генотип WT-дикий тип.
Используемые зонды и праймеры удовлетворяют следующим требованиям:
1) 100% консервативность участков связывания во всех известных последовательностях 23S рРНК внутри детектируемых видов;
2) специфичность последовательностей для детектируемых видов;
3) длина от 22 до 29 нуклеотидов;
4) большее содержание С по сравнению с G;
5) отсутствие 4 последовательно расположенных G;
6) не более двух G/C на 3'-конце;
7) температура плавления зондов на 7-8°С выше температуры плавления праймеров;
Способ осуществляется следующим образом.
Образцы ДНК М. genitalium или М. pneumoniae выделяют из клинического материала (моча, урогенитальные и респираторные мазки, образцы тканей, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж) и используют как мишень для последующего анализа.
Этап амплификации и одновременного детектирования флуоресцентного сигнала, а также последующий анализ кривых плавления ПЦР-продуктов проводят с помощью ДНК-амплификатора, работающего в режиме реального времени.
В пробирке смешивают реакционную смесь объемом 25 мкл: к воде добавляют олигонуклеотидные праймеры и зонды (синтез ЗАО «Синтол», Россия) в концентрации, указанной в таблице на Фиг. 1 и Фиг. 2, 0,2 мМ дНТФ, 2 мМ MgCl2, 5 ед. ДНК-полимеразы SNP-detect, 1х ПЦР буфер SNP detect (Evrogen, Россия) и 5 мкл образца ДНК. Используют специальную полимеразу SNP-detect с характеристиками, позволяющими с высокой точностью выявлять однонуклеотидные полиморфизмы, а также обеспечить горячий старт реакции. Амплификацию проводят с использованием прибора Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: начальная инкубация 15 мин при 95°С; затем 55 циклов: 20 сек. денатурации при 95°С и 15 сек. отжига-элонгации при 55°С с детекцией флуоресценции на каналах FAM и JOE (R6G); затем проводят анализ кривых плавления с начальной инкубацией 2 мин при 45°С и последующим повышением температуры на 1°С каждые 10 сек. до 85°C с детекцией флуоресценции не только на канале FAM, но и на канале JOE (R6G). Для детекции мутаций в мультиплексном варианте в двух целевых участках гена 23S рРНК М. pneumoniae и М. genitalium, включающих позиции 2058-2059 и 2611, разрабатывают два реверсных праймера для М. pneumoniae: Mpn2611-Rv AAGCAACACTCTTCAATCTTCC(T-BHQ1) А и Mpn2059-Rv3 ATCAATATTATGCTACAGTAAAGCT(T-BHQ1)CAG, а также два реверсных праймера для М. genitalium: Mge2611-Rev AGCAAAGCTCTTCAATCTTCC(T-BHQ1)G и Mge2059-Rv3 ATCAATATTATGCTACAGTAAAGCT(T-BHQ1)CACG, которые в процессе реакции формируют цепь ДНК, комплементарную зонду. Эти праймеры располагаются непосредственно перед областью связывания зонда и содержат внутренний нефлуоресцирующий (темновой) гаситель флуоресценции (BHQ1). Для детекции целевой последовательности, располагающейся внутри участка связывания праймеров, разрабатывают два олигонуклеотидных зонда, содержащих флуорофоры (FAM и R6G) на 3'-конце и полностью комплементарные последовательностям 23S рДНК дикого типа, указанные в таблице на Фиг. 1 и Фиг. 2.
В соответствии с описанным выше дизайном, мутации в участках 23S рРНК выявляют с помощью постамплификационного анализа кривых плавления зондов: образцы, содержащие однонуклеотидные замены в области связывания зонда, характеризуются сниженной аффинностью и, соответственно, меньшей температурой плавления (Tm) зонда. В качестве целевого фрагмента для выявления мутаций выбирают специфичный участок, который характеризуется областью с высокой Г-Ц (гуанин-цитозин) насыщенностью и содержанием вторичных структур («сложное» генетическое окружение), окружающее полиморфизмы. Несмотря на «сложное» генетическое окружение способ выявляет различные (известные и неизвестные) мутации в заданных позициях. После этапа плавления зондов визуально оценивают полученные пики одновременно на двух детектируемых каналах FAM и JOE (R6G), сравнивают температуры плавления полученных пиков с контрольными образцами и делают вывод о наличии мутации в исследуемом образце: если на канале FAM исследуемый образец имеет Tm=62°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии «дикого» фенотипа - без мутации; если Tm=52°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации A2058/2059G; если Tm=55°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации А2059С; если Tm=56,8°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации А2058С; если на канале JOE исследуемый образец имеет Tm=62°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии «дикого» фенотипа - без мутации; если Tm=53°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации A2611G; если Tm=54,5°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации А2611Т, что отражено в таблице Фиг. 5.
Контрольные образцы ДНК М. pneumoniae и М. genitalium, несущие мутации A2058G и A2059G, дают одинаковые пики и характеризуются Tm=52,3°С±0,3°С, но хорошо дифференцируются от образцов «дикого типа» по температуре плавления зонда Mpn2058-Pb2 на 9,8°С. Контрольный образец, имеющий замену в позиции А2059С, имеет ΔTm=2,7°С, по сравнению с контрольным пиком A2058G/A2059G, и ΔTm=7,1°С по сравнению с образцом «дикого типа», а А2058С имеет ΔTm=4,5°С, по сравнению с контрольным пиком A2058G/A2059G, и ΔTm=5,3°С по сравнению с образцом «дикого типа». Анализ расчетных и экспериментальных Tm показывает, что значимые мутации в позициях A2058G/A2059G, А2059С и А2058С хорошо дифференцируются при скрининговом анализе, а также визуально отличаются от образцов «дикого типа». Таким образом, предложенный способ характеризуется хорошей дискриминирующей способностью, что согласуется с результатами, полученными для контрольных образцов.
Пример одновременного выявления различных мутаций устойчивости к макролидам в гене 23S рРНК М. pneumoniae и М. genitalium с помощью оценки кривых плавления флюоресцентно-меченных зондов после проведения мультиплексной ПЦР-РВ на канале FAM представлен на Фиг. 3. Пример одновременного выявления различных мутаций устойчивости к макролидам в гене 23S рРНК М. pneumoniae и М. genitalium с помощью оценки кривых плавления флюоресцентно-меченных зондов после проведения мультиплексной ПЦР-РВ на канале JOE (R6G) представлен на Фиг. 4. Разница в температуре плавления зонда Mpn2611-Pb для мутантного образца C2611G по сравнению с образцом дикого типа составляет 9,0°С. Визуально различимая ΔTm образцов, имеющих мутации и «дикого» фенотипа, указывает на хорошую дискриминирующую способность предложенного способа выявления мутаций к макролидным антибиотикам.
Пример 1. Пациент В., 35 лет, поступил на амбулаторный прием в кожно-венерологический диспансер (КВД) с жалобами на зуд, жжение и болезненность при мочеиспускании в области уретры. При объективном осмотре: кожные покровы наружных половых органов чистые, высыпаний нет. Отделяемое уретры скудное, светлое. Общее состояние пациента оценивалось как удовлетворительное. У пациента был взят соскоб из уретры для стандартных исследований. С использованием коммерческой системы методом ПЦР в режиме реального времени была выявлена ДНК М. genitalium. Пациенту назначена антибактериальная терапия: доксициклин по 100 мг 2 раза в день 10 дней.
Через 4 недели мужчина явился для контрольного обследования с аналогичными жалобами на зуд, жжение и болезненность в уретре. В результате ПЦР-исследования была повторно обнаружена ДНК М. genitalium. Терапия была изменена: джозамицин 500 мг 3 раза в день в течение 10 дней. Повторно пациент обратился на прием к врачу через 1,5 месяца, результаты анализа подтвердили положительный тест на М. genitalium, это указывало на отсутствие клинического эффекта терапии.
Врачи КВД передали клинические образцы для дополнительного анализа. Для более детального исследования клинического материала все три образца исследовались с применением разработанного способа выявления мутаций к макролидным антибиотикам. В результате исследования во всех образцах была выявлена мутация в 23S рРНК М. genitalium, характеризующаяся нуклеотидной заменой A2058G. Наличие замены подтверждено результатами секвенирования. Был сделан вывод о том, что пациент первично был заражен устойчивым к макролидам штаммом, но ввиду распространения в популяции (40-60%) устойчивости урогенитальных микоплазм к тетрациклинам стартовая терапия доксициклином была неэффективна, штамм сохранял свою жизнеспособность.
Пример 2. С целью расшифровки эпидемиологических особенностей вспышки пневмонии, вызванной М. pneumoniae у детей младшего школьного возраста в Хабаровске, был проведен дополнительный молекулярно-генетический скрининг клинического материала на выявление мутаций к макролидным антибиотикам. В связи с тем, что эти антибиотики являются препаратами выбора для терапии пациентов с инфекциями, вызванными М. pneumoniae, наличие маркеров резистентности может снизить эффективность терапии и привести к осложнениям. Из 30 обследованных пациентов, выделивших М. pneumoniae, 19 образцов (63%) продемонстрировали специфические пики плавления, характерные для фенотипа A2058/2059G. Это самый распространенный фенотип резистентности, характерный для вспышек такого рода. Результаты исследования были подтверждены секвенированием, все образцы имели профиль A2058G. Таким образом, антибактериальная терапия была скорректирована с учетом выявленных мутаций, это обеспечило быстрое выздоровление пациентов.
Предлагаемый способ был использован для быстрого выявления мутаций и прогнозирования возможной устойчивости респираторных микоплазм к макролидным антибиотикам, это является очень важным инструментом, особенно в случаях возникновения вспышек в организованных коллективах.
В модельных экспериментах по оценке аналитической чувствительности способа выявления мутаций с использованием разведений ДНК показано, что нижний предел обнаружения для М. genitalium и М. pneumoniae в присутствии избыточного количества ДНК человека (200 нг) составляет не менее 500 геном-эквивалентов на реакцию. При этом неспецифическая амплификация отсутствует при исследовании типичной урогенитальной и респираторной флоры.
Для оценки клинической чувствительности и специфичности предложенного способа проведен параллельный анализ 450 урогенитальных образцов и 223 респираторных образцов. Для всех образцов получены типичные профили плавления зондов Mge2611-Pb и Mpn2611-Pb «дикого типа». Специфические последовательности 23S рРНК М. genitalium были обнаружены в 436 образцах (относительная чувствительность 97%) и М. pneumoniae в 218 образцах (относительная чувствительность 97,8%).
Предлагаемый способ выявления мутаций к макролидным антибиотикам у Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumoniae с помощью ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером обеспечивает следующие преимущества:
1. Позволяет выявлять любые нуклеотидные замены в позициях 2058, 2059 и 2611 в гене 23S рРНК Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumoniae с помощью анализа кривых плавления зондов непосредственно после проведения амплификации в мультиплексном формате с использованием уникальных праймеров и зондов.
2. Благодаря высокой чувствительности и специфичности может использоваться не только для анализа культивированных штаммов, но и для прямой диагностики в образцах клинического материала.
3. Может являться дополнительным инструментом в тактике подбора адекватной терапии, особенно в случаях возникновения вспышек в организованных коллективах, вызванных Mycoplasma pneumoniae.
4. Предложенный способ может быть использован для прогнозирования возможной устойчивости к антибиотикам при наличии неуспехов терапии.
5. Позволяет снизить трудозатраты и время анализа за счет использования технологии ПЦР в режиме реального времени.
Claims (1)
- Способ выявления мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumoniae к макролидным антибиотикам, включающий амплификацию выделенной ДНК исследуемого образца, ПЦР-амплификацию мишени: 2058 и 2059 позиции гена 23S рРНК Mycoplasma genitalium, оценку кривых плавления зондов на детектируемом канале FAM, отличающийся тем, что в реакционную пробирку в мультиплексном варианте добавляют пару праймеров и один зонд для каждой позиции М. pneumoniae и М. genitalium. Для детекции мутаций в мультиплексном варианте в двух целевых участках гена 23S рРНК М. pneumoniae и М. genitalium, включающих позиции 2058-2059 и 2611, добавляют два реверсных праймера для М. pneumoniae: Mpn2611-Rv AAGCAACACTCTTCAATCTTCC(T-BHQ1)А и Mpn2059-Rv3 ATCAATATTATGCTACAGTAAAGCT(T-BHQ1)CAG, а также два реверсных праймера для М. genitalium: Mge2611-Rev AGCAAAGCTCTTCAATCTTCC(T-BHQ1)G и Mge2059-Rv3 ATCAATATTATGCTACAGTAAAGCT(T-BHQ1)CACG; для детекции целевой последовательности, располагающейся внутри участка связывания праймеров, разрабатывают два олигонуклеотидных зонда, содержащих флуорофоры (FAM и R6G) на 3'-конце и полностью комплементарные последовательностям 23S рДНК дикого типа, содержащих флуорофоры (FAM и R6G) для каждой детектируемой мишени 2058, 2059, а также 2611 позиции гена 23S рРНК Mycoplasma genitalium или Mycoplasma pneumoniae, проводят амплификацию ДНК-мишени с последующим этапом плавления зондов, при этом визуально оценивают полученные пики одновременно на двух детектируемых каналах FAM и JOE (R6G), сравнивают температуры плавления полученных пиков с контрольными образцами и делают вывод о наличии мутации в исследуемом образце: если на канале FAM исследуемый образец имеет Tm = 62°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии «дикого» фенотипа - без мутации; если Tm = 52°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации A2058/2059G; если Tm = 55°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации А2059С; если Tm = 56,8°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации А2058С; если на канале JOE (R6G) исследуемый образец имеет Tm = 62°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии «дикого» фенотипа - без мутации; если Tm = 53°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации A2611G; если Tm = 54,5°С±0,3°С, это свидетельствует о наличии мутации А2611Т.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017133677A RU2646123C1 (ru) | 2017-09-27 | 2017-09-27 | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017133677A RU2646123C1 (ru) | 2017-09-27 | 2017-09-27 | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2646123C1 true RU2646123C1 (ru) | 2018-03-01 |
Family
ID=61568833
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017133677A RU2646123C1 (ru) | 2017-09-27 | 2017-09-27 | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2646123C1 (ru) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2725477C1 (ru) * | 2019-11-15 | 2020-07-02 | Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека | Способ выявления наличия мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам |
RU2732626C1 (ru) * | 2019-08-06 | 2020-09-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Система олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления ДНК Mycoplasma bovigenitalium |
WO2022016153A1 (en) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | Gen-Probe Incorporated | Detection of macrolide-resistant mycoplasma genitalium |
RU2778666C1 (ru) * | 2021-09-27 | 2022-08-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Смоленский государственный медицинский университет" министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ выявления мутаций в участках генов parC и gyrA QRDR, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда |
-
2017
- 2017-09-27 RU RU2017133677A patent/RU2646123C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
PEUCHANT O. и др. Increased macrolide resistance of Mycoplasma pneumoniae in France directly detected in clinical specimens by real-time PCR and melting curve analysis, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Volume 64, Issue 1, 1 July 2009, Pages 52-58. * |
PEUCHANT O. и др. Increased macrolide resistance of Mycoplasma pneumoniae in France directly detected in clinical specimens by real-time PCR and melting curve analysis, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Volume 64, Issue 1, 1 July 2009, Pages 52-58. ЭЙДЕЛЬШТЕЙН И.А. и др. Выявление мутаций устойчивости к макролидам в гене 23S рРНК Mycoplasma pneumoniae с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тихоокеанский медицинский журнал, 2015, н.1, с.63-66. * |
ЭЙДЕЛЬШТЕЙН И.А. и др. Выявление мутаций устойчивости к макролидам в гене 23S рРНК Mycoplasma pneumoniae с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тихоокеанский медицинский журнал, 2015, н.1, с.63-66. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2732626C1 (ru) * | 2019-08-06 | 2020-09-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Система олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления ДНК Mycoplasma bovigenitalium |
RU2725477C1 (ru) * | 2019-11-15 | 2020-07-02 | Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека | Способ выявления наличия мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам |
WO2022016153A1 (en) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | Gen-Probe Incorporated | Detection of macrolide-resistant mycoplasma genitalium |
RU2778666C1 (ru) * | 2021-09-27 | 2022-08-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Смоленский государственный медицинский университет" министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ выявления мутаций в участках генов parC и gyrA QRDR, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Choi et al. | Body fluid identification by integrated analysis of DNA methylation and body fluid-specific microbial DNA | |
Pantchev et al. | New real-time PCR tests for species-specific detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus from tissue samples | |
Peters et al. | The prevalence of three species of feline haemoplasmas in samples submitted to a diagnostics service as determined by three novel real-time duplex PCR assays | |
US20100075306A1 (en) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification | |
US9868995B2 (en) | Method for detecting Helicobacter pylori DNA in a stool sample | |
RU2646123C1 (ru) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ | |
Goire et al. | A duplex Neisseria gonorrhoeae real-time polymerase chain reaction assay targeting the gonococcal porA pseudogene and multicopy opa genes | |
Nakanishi et al. | Identification of feces by detection of Bacteroides genes | |
Shipitsyna et al. | Evaluation of polymerase chain reaction assays for the diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia | |
Wang et al. | Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans | |
Benga et al. | Development of a multiplex PCR assay based on the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodent Pasteurellaceae | |
Kim et al. | Direct triplex loop-mediated isothermal amplification assay for the point-of-care molecular detection of Salmonella genus, subspecies I, and serovar Typhimurium | |
CN112063747A (zh) | 一种基于荧光pcr技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用 | |
US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
Akutsu et al. | Development of a multiplex RT-PCR assay and statistical evaluation of its use in forensic identification of vaginal fluid | |
Amoupour et al. | Differentiation of Brucella abortus and B. melitensis biovars using PCR-RFLP and REP-PCR | |
Takanashi et al. | Development and clinical application of an InvaderPlus® assay for the detection of genital mycoplasmas | |
RU2725477C1 (ru) | Способ выявления наличия мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам | |
CN105755134A (zh) | 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用 | |
Ciervo et al. | Rapid detection and differentiation of Bartonella spp. by a single-run real-time PCR | |
CN115038797A (zh) | 用于确定肠道寄生虫的存在的方法 | |
RU2715333C1 (ru) | Набор реагентов для выявления и идентификации днк возбудителей бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции в реальном времени "ом-скрин-бруцеллез-рв" | |
Mania‐Pramanik et al. | Diagnosis of Chlamydia trachomatis infection | |
US20230323478A1 (en) | Methods for Detecting the Presence of a Hypervirulent Clostridium Difficile Strain | |
RU2778666C1 (ru) | Способ выявления мутаций в участках генов parC и gyrA QRDR, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190928 |