RU2778666C1 - Способ выявления мутаций в участках генов parC и gyrA QRDR, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда - Google Patents
Способ выявления мутаций в участках генов parC и gyrA QRDR, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778666C1 RU2778666C1 RU2021128513A RU2021128513A RU2778666C1 RU 2778666 C1 RU2778666 C1 RU 2778666C1 RU 2021128513 A RU2021128513 A RU 2021128513A RU 2021128513 A RU2021128513 A RU 2021128513A RU 2778666 C1 RU2778666 C1 RU 2778666C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- parc
- gyra
- qrdr
- mutations
- mutation
- Prior art date
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 title claims abstract description 30
- 101710033303 gyrA1 Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims description 8
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 title claims description 7
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 title claims description 7
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 title claims description 7
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 title claims description 7
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 title claims description 7
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 title claims description 7
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 title claims description 7
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 title claims description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 27
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001809 detectable Effects 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 7
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 101710005041 PARPB Proteins 0.000 description 15
- 101710029898 kanC Proteins 0.000 description 15
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 5
- 102200006183 CDKN2A D84N Human genes 0.000 description 4
- 241001138504 Mycoplasma bovis Species 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 229940041033 Macrolides Drugs 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 3
- 101700013200 gyrB1 Proteins 0.000 description 3
- 101700072042 parE Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 102200006184 CDKN2A D84Y Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 210000004392 Genitalia Anatomy 0.000 description 2
- XJSFLOJWULLJQS-NGVXBBESSA-N JOSAMYCIN Chemical compound CO[C@H]1[C@H](OC(C)=O)CC(=O)O[C@H](C)C\C=C\C=C\[C@H](O)[C@H](C)C[C@H](CC=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](N(C)C)[C@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)CC(C)C)[C@](C)(O)C2)[C@@H](C)O1 XJSFLOJWULLJQS-NGVXBBESSA-N 0.000 description 2
- 102200028613 RNMT D79N Human genes 0.000 description 2
- 102200077458 TBC1D17 D84G Human genes 0.000 description 2
- 102200089578 VHL S80N Human genes 0.000 description 2
- 102200089579 VHL S80R Human genes 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000001586 eradicative Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229960004144 josamycin Drugs 0.000 description 2
- 229940005931 ophthalmologic Fluoroquinolone antiinfectives Drugs 0.000 description 2
- 102220278857 rs1438838735 Human genes 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 230000001568 sexual Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940041075 systemic Fluoroquinolone antibacterials Drugs 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1H-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005097 23S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102200091907 ALB D87N Human genes 0.000 description 1
- 229920002287 Amplicon Polymers 0.000 description 1
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N Azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 229960004434 Doxycycline Monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 206010013990 Dysuria Diseases 0.000 description 1
- 229940080389 Levofloxacin 250 MG Drugs 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FABPRXSRWADJSP-MEDUHNTESA-N Moxifloxacin Chemical compound COC1=C(N2C[C@H]3NCCC[C@H]3C2)C(F)=CC(C(C(C(O)=O)=C2)=O)=C1N2C1CC1 FABPRXSRWADJSP-MEDUHNTESA-N 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000582 Semen Anatomy 0.000 description 1
- 206010040490 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical group C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 210000003708 Urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 1
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960003702 moxifloxacin Drugs 0.000 description 1
- 229940006361 moxifloxacin 400 MG Drugs 0.000 description 1
- 230000000171 quenching Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920002973 ribosomal RNA Polymers 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области медицины и биологии. Осуществляют ПЦР-амплификацию QRDR-области гена parC и gyrA M. genitalium. Осуществляют детекцию целевой последовательности с флуорофорами FAM и R6G. Сравнивают температуры плавления (Tm) полученных пиков с контрольными образцами и делают вывод о наличии мутации в исследуемом образце. Если на канале FAM исследуемый образец имеет Tm=57°С±0,5°С, это свидетельствует о наличии дикого фенотипа. Если Tm=45-49°С, это свидетельствует о наличии мутации в parC QRDR. Если на канале R6G исследуемый образец имеет Tm=63-64°С, это свидетельствует о наличии дикого фенотипа. Если Tm=57-59°С, это свидетельствует о наличии мутации в gyrA QRDR. Изобретение обеспечивает выявление наличия всех возможных мутаций в генах parC и gyrA М. genitalium непосредственно в клиническом материале пациента для выбора адекватной антибиотикотерапии и контроля за эпидемиологическим процессом. 2 ил., 3 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к диагностике, а именно: к ДНК-анализу, и может быть использовано для выявления маркеров резистентности к фторхинолоновым антибиотикам у Mycoplasma genitalium.
- Известен способ выявления мутаций, приводящих к резистентности к фторхинолоновым антибиотикам у Mycoplasma bovis, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в варианте TaqMan, включающий: амплификацию целевого фрагмента и детектирование точечных мутаций с использованием пары праймеров и четырех зондов. В одном из существующих на данный момент методов выявления мутаций, основанных на ПЦР-РВ, детектирование мутаций: G250A, Т252С (согласно нумерации, для Е. coli) осуществляется с помощью праймеров к участку гена parC М. bovis и зондов, которые содержат флуорофор на 5'-конце и гаситель на 3'-конце; связывание этого зонда с ампликоном и последующее расщепление за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы сопровождается нарастанием флуоресценции. Выявление нуклеотидных замен осуществляется за счет разной эффективности гибридизации зондов к матричной ДНК, в зависимости от наличия тех или иных мутаций и, как следствие, разной эффективности расщепления зондов. Выявление мутаций проводят путем анализа кривых нарастания флюоресценции на каналах FAM и HEX, сигналы на данных каналах считаются положительным, если кривая накопления флюоресценции пересекает линию порога (М. Ben Shabat, I. Mikula, I. Gerchman, and I. Lysnyansky Development and Evaluation of a Novel Single-Nucleotide-Polymorphism Real-Time PCR Assay for Rapid Detection of Fluoroquinolone-Resistant Mycoplasma bovis). Основные недостатки этого способа:
1. Существующий метод, основанный на ПЦР-РВ разработан для М. bovis (вызывает заболевания у крупного рогатого скота) и не адаптирован для выявления мутаций у М. genitalium, инфицирующих человека.
2. Позволяет выявлять мутации только в гене parC QRDR.
3. Не позволяет выявлять все возможные виды мутаций, метод детектирует наличие только строго двух: в позиции G250A и Т252С в гене parC QRDR. Наиболее близким аналогом изобретения является способ выявления мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в варианте TaqMan с использованием трех пар праймеров и трех зондов, причем зонды полностью комплементарны варианту нуклеотидной последовательности «дикого типа» (патент № RU 2725477). Он включает амплификацию фрагмента гена гиразы gyrB, участка V домена гена 23 S рРНК и участка QRDR гена parC М. genitalium с флуоресцентной детекцией накопления продуктов амплификации. Выявление нуклеотидных замен также основано на разной эффективности гибридизации зондов к матричной ДНК, в зависимости от наличия тех или иных мутаций и, как следствие, разной эффективности расщепления зондов. Поскольку зонд полностью комплементарен последовательности «дикого типа», в случае наличия мутаций в QRDR участке, расщепление зонда будет происходить с меньшей эффективностью, о чем свидетельствуют: меньший уровень максимальной флуоресценции, более пологая кривая нарастания флуоресценции, а также более поздний пороговый цикл по сравнению с геном gyrB. Для заключения о наличии или отсутствии мутаций в исследуемых участках предлагается вычислить соотношение уровня флуоресценции исследуемого участка к максимальному уровню флуоресценции во всех образцах данного сета, вычислить тангенс угла наклона линейного участка нарастания флуоресценции к оси X и сравнить log 10 концентрации исследуемого фрагмента и концентрации участка гена gyrB. Основные недостатки этого способа:
1. Позволяет выявлять мутации только в гене parC QRDR.
2. Не позволяет дифференцировать типы мутации
3. Необходимо выполнение сложных математических вычислений после проведения ПЦР.
4. Для дополнительного вычисления требуется время и специальное программное обеспечение.
Техническим результатом предлагаемого способа является выявление наличия всех возможных мутаций в генах parC, а также gyrA М. genitalium непосредственно в клиническом материале пациента для выбора адекватной антибиотикотерапии и контролем за эпидемиологическим процессом. Сущность предлагаемого способа состоит в том, что осуществляют выявление любых нуклеотидных замен в гене parC и gyrA QRDR М. genitalium с помощью ПЦР-РВ и последующего анализа кривых плавления зондов на двух каналах FAM и R6G, непосредственно в клиническом материале в мультиплексном формате (в одной пробирке). Система праймеров и зондов построена следующим образом: две пары праймеров, амплифицирующие участки генов parC и gyrA ORDR и два олигонуклеотидных зонда, содержащих флуорофоры на 3'- конце FAM и R6G для QRDR участков parC и gyrA соответственно, позволяют получить в ходе реакции амплификационный продукт, при этом о наличии в исследуемом образце олигонуклеотидных замен судят по характерным пикам плавления, которые имеют меньшую температуру плавления относительно образцов, имеющих генотип WT-дикий тип. Используемые зонды и праймеры удовлетворяют следующим требованиям:
1) 100% консервативность участков связывания во всех известных последовательностях гена parC и gyrA QRDR внутри детектируемого вида;
2) Специфичность последовательностей для детектируемого вида;
3) длина от 23 до 25 нуклеотидов;
4) большее содержание С по сравнению с G;
5) отсутствие 4 последовательно расположенных G;
6) не более двух G/С на 3’-конце
7) температура плавления зондов на 7-8°С выше температуры плавления праймеров;
Способ осуществляется следующим образом. Образцы ДНК М. genitalium выделяют из клинического материала (моча, урогенитальные мазки, образцы тканей, сперма) и используют как мишень для последующего анализа.
Этап амплификации и одновременного детектирования флуоресцентного сигнала, а также последующий анализ кривых плавления ПЦР-продуктов проводят с помощью ДНК- амплификатора, работающего в режиме реального времени. В пробирке смешивают реакционную смесь объемом 25 мкл: к воде добавляют олигонуклеотидные праймеры и зонды (синтез ЗАО «Синтол», Россия) в концентрации, указанной в таблице 1, 0,2 мМ дНТФ, 2 мМ MgCl2, 5 ед. ДНК-полимеразы SNP-detect, lx ПЦР буфер SNP detect (Evrogen, Россия) и 5 мкл образца ДНК. Используют специальную полимеразу SNP-detect с характеристиками, позволяющими с высокой точностью выявлять однонуклеотидные полиморфизмы, а также обеспечить горячий старт реакции. Амплификацию проводят с использованием прибора Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: начальная инкубация 3 мин. при 95°С; затем 55 циклов: 20-сек. денатурации при 95°С и 15-сек. отжига-элонгации при 55°С с детекцией флуоресценции на каналах FAM и R6G; затем проводят анализ кривых плавления с начальной инкубацией 2 мин. при 40°С и последующим повышением температуры на 1°С каждые 10 сек. до 77°С с детекцией флуоресценции не только на канале FAM, но и на канале R6G.
В соответствии с описанным выше дизайном, мутации в участке QRDR М. genitalium выявляют с помощью постамплификационного анализа кривых плавления зондов: образцы, содержащие однонуклеотидные замены в области связывания зонда, характеризуются сниженной аффинностью и, соответственно, меньшей температурой плавления (Tm) зонда. В качестве целевого фрагмента для выявления мутаций выбирают специфичный участок, который характеризуется областью с высокой ГЦ (гуанин-цитозин) насыщенностью и содержанием вторичных структур («сложное» генетическое окружение), окружающее полиморфизмы. Несмотря на «сложное» генетическое окружение способ выявляет различные (известные и неизвестные) мутации в заданных позициях. После этапа плавления зондов визуально оценивают полученные пики одновременно на двух детектируемых каналах FAM и R6G, сравнивают температуры плавления полученных пиков с контрольными образцами и делают вывод о наличии мутации в исследуемом образце: если на канале FAM исследуемый образец имеет Tm=57°С±0,5°С, это свидетельствует о наличии «дикого» фенотипа-без мутации; если Тт находится в диапазоне Tm=45-49°С, это свидетельствует о наличии мутации; если на канале JOE исследуемый образец имеет Tm=63-64°С, это свидетельствует о наличии «дикого» фенотипа-без мутации; если Tm находится в диапазоне Tm=57-59°С, это свидетельствует о наличии мутации, что представлено в таблице 2.
Пример одновременного выявления наиболее значимых мутаций устойчивости к фторхинолонам в гене parC QRDR с помощью оценки кривых плавления флюоресцентно-меченных зондов после проведения мультиплексной ПЦР-РВ на канале FAM представлен на Фиг. 1. Пример одновременного выявления наиболее значимых мутаций устойчивости к фторхинолонам в гене gyrA QRDR с помощью оценки кривых плавления флюоресцентно-меченных зондов после проведения мультиплексной ПЦР-РВ на канале JOE (R6G), представлен на Фиг. 2.
При использовании контрольных образцов ДНК М. genitalium с известными мутациями, тип аминокислотной замены в клинических образцах выявляют на основании сравнения температуры плавления клинического и контрольного образцов.
Контрольные образцы ДНК М. genitalium, несущие мутации D84N, D79A, D84G, D84Y, S80I, S80N и S80R (нумерация по Е. coli) демонстрируют на канале FAM пики 45-53°С и хорошо дифференцируют от образцов «дикого типа» по Tm зонда Mge_parC_Pb1. Аналогично, на канале JOE контрольные образцы ДНК, несущие мутации M83I, дают пики 57-59°С и хорошо дифференцируют от образцов «дикого типа» по температуре плавления зонда Mge_gyrA_Pb. Анализ расчетных и экспериментальных Tm показывает, что значимые мутации в позициях D84N, D79A, D84G, D84Y, S80I, S80N, S80R и M83I хорошо визуально отличают от образцов «дикого типа» по профилям кривых плавления, а также дифференцируются при скрининговом анализе, что отражено в таблице 3.
Таким образом, предложенный способ характеризуется хорошей дискриминирующей способностью, что согласуется с результатами, полученными для контрольных образцов.
Пример 1. Пациент Е., 36 лет, обратился в кожно-венерологический диспансер (КВД) г. Смоленска с жалобами на слизисто-гнойные выделения из половых органов, беспокоящие в течение 2 недель, учащенное и болезненное мочеиспускание, тянущие боли в области лобка. В анамнезе незащищенный половой контакт около 3х недель назад. На протяжении 7 дней занимался самолечением: принимал Левофлоксацин по 250 мг в день. Ввиду отсутствия улучшений, обратился за медицинской помощью. Пациенту был сделан анализ соскоба из уретры с использованием коммерческой системы методом ПЦР в режиме реального времени, который показал наличие ДНК Mycoplasma genitalium. Также клинический образец был исследован на наличие мутаций, приводящих к устойчивости Mycoplasma genitalium к макролидам и фторхинолонам с использованием предложенного способа. В результате выполненного анализа, была обнаружена мутация в гене parC ORDR, приводящая к аминокислотной замене S80I (Ser-80-Ile). Мутаций, приводящих к устойчивости к макролидам не обнаружено. На основании результатов исследований, пациенту был назначен однократный прием внутрь 1000 мг Азитромицина. На контрольном визите пациент чувствовал себя хорошо, жалобы отсутствовали, ДНК Mycoplasma genitalium не обнаружена.
Пример 2. Для оценки клинической чувствительности и специфичности предложенного способа проведен параллельный анализ 873 урогенитальных образцов, для которых получены типичные профили плавления зондов MgegyrAPb и Mge_parC_Pbl «дикого типа». Специфические последовательности гена parC QRDR и гена gyrA QRDR М. genitalium были обнаружены в 847 образцах (относительная чувствительность 97%). Пример 3. Пациент Б. 1991 г. р. обратился в частную клинику г. Смоленска с жалобами на зуд и жжение в области половых органов, появившиеся вскоре после незащищенного полового контакта с новым половым партнером. После осмотра, клинический материал (соскоб из уретры) пациента был направлен в лабораторию НИИ антимикробной химиотерапиии и проанализирован на наличие инфекций, передающихся половым путем метода ПЦР. Обнаружена ДНК М. genitalium. В качестве эрадикационной терапии был назначен джозамицин в дозе 500 мг 3 раза в сутки перорально в течение 10 дней. Результаты контрольного теста через три недели показали наличие в соскобе ДНК М. genitalium. Терапия была изменена на моксифлоксацин в дозе 400 мг 2 раза в сутки перорально в течение 10 дней. Контрольный тест через две недели подтвердил наличие ДНК М. genitalium несмотря на терапию препаратом другой группы. Все пробы пациента были исследованы на наличие мутаций, приводящих к устойчивости М. genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам. По результатам выполненного исследования, во всех образцах биологического материала, полученного у пациента, как до, так и после назначения терапии молекулярно-генетическая характеристика показала наличие мутации A2058G в 23S рРНК М. genitalium, приводящей к устойчивости к макролидам. Данный факт объясняет неудачу лечения джозамицином. В результате применения предложенного способа была выявлена мутация в гене parC QRDR, приводящая к аминокислотной замене D87N, обуславливающая устойчивость к фторхинолонам. Исследование методом секвенирования по Сэнгеру подтвердило наличие мутаций в указанных локусах. Поскольку лечение моксифлоксацином не привело к эрадикации М. genitalium, пациенту был назначен антибиотик тетрациклиновой группы -доксициклина моногидрат в дозе 100 мг перорально 2 раза в сутки в течение 10 дней. На контроль лечения пациент не явился.
Предлагаемый способ выявления мутаций к фторхинолоновым антибиотикам у Mycoplasma genitalium с помощью ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером обеспечивает следующие преимущества:
1. Позволяет выявлять любые нуклеотидные замены в участках генов parC и gyrA ORDR Mycoplasma genitalium с помощью анализа кривых плавления зондов непосредственно после проведения амплификации в мультиплексном формате с использованием уникальных праймеров и зондов.
2. Благодаря высокой чувствительности и специфичности может использоваться не только для анализа культивированных штаммов, но и для прямой диагностики в образцах клинического материала.
3. Предложенный способ может быть использован для прогнозирования возможной устойчивости к антибиотикам, при наличии неуспехов терапии.
4. Позволяет снизить трудозатраты и время анализа за счет использования технологии ПЦР в режиме реального времени.
Claims (1)
- Способ выявления мутаций в участках генов parC и gyrA QRDR, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда, включающий амплификацию выделенной ДНК исследуемого образца, ПЦР-амплификацию мишени: QRDR-области гена parC и gyrA Mycoplasma genitalium, и детектирование точечных мутаций с использованием пары праймеров и четырех зондов, характеризующийся тем, что в реакционную пробирку в мультиплексном варианте добавляют пару праймеров и один зонд для каждой позиции Mycoplasma genitalium, для детекции мутаций в мультиплексном варианте в двух целевых участках Mycoplasma genitalium, включающих позиции 83-87 QRDR-области гена parC и gyrA, добавляют два реверсных праймера: Mge_parC_Rpml GCTTTGGGACATTCTGATAATTG и Mge_gyrA_Rpm GTCTTGAGCCATTCTTGACA(T-BHQ1)G; для детекции целевой последовательности, располагающейся внутри участка связывания праймеров, добавляют два олигонуклеотидных зонда, содержащих флуорофор FAM и флуорофор R6G на 3'-конце и полностью комплементарные последовательностям QRDR-области гена parC и gyrA дикого типа, содержащих флуорофор FAM и флуорофор R6G для каждой детектируемой мишени QRDR-области гена parC и gyrA Mycoplasma genitalium, проводят амплификацию ДНК-мишени с последующим этапом плавления зондов, при этом визуально оценивают полученные пики одновременно на двух детектируемых каналах FAM и R6G, сравнивают температуры плавления полученных пиков с контрольными образцами и делают вывод о наличии мутации в исследуемом образце: если на канале FAM исследуемый образец имеет Tm=57°С±0,5°С, это свидетельствует о наличии дикого фенотипа - без мутации; если Tm находится в диапазоне Tm=45-49°С, это свидетельствует о наличии мутации в parC QRDR; если на канале R6G исследуемый образец имеет Tm=63-64°С, это свидетельствует о наличии дикого фенотипа - без мутации; если Tm находится в диапазоне Tm=57-59°С, это свидетельствует о наличии мутации в gyrA QRDR.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2778666C1 true RU2778666C1 (ru) | 2022-08-22 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105392896A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-03-09 | 达雅高生物科技有限公司 | 快速并灵敏基因型鉴定及核酸检测 |
| RU2646123C1 (ru) * | 2017-09-27 | 2018-03-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Смоленский государственный медицинский университет" министерства здравоохранения Российской Федерации | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ |
| RU2725477C1 (ru) * | 2019-11-15 | 2020-07-02 | Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека | Способ выявления наличия мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105392896A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-03-09 | 达雅高生物科技有限公司 | 快速并灵敏基因型鉴定及核酸检测 |
| RU2646123C1 (ru) * | 2017-09-27 | 2018-03-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Смоленский государственный медицинский университет" министерства здравоохранения Российской Федерации | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ |
| RU2725477C1 (ru) * | 2019-11-15 | 2020-07-02 | Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека | Способ выявления наличия мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЧЕРНОВА О.А. и др. Микоплазмы и их устойчивость к антибиотикам: проблемы и перспективы контроля микоплазменных инфекций и контаминаций клеточных культур. Acta Naturae. 2016; 2(29): 27-38. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9670531B2 (en) | Dynamic flux nucleic acid sequence amplification | |
| Choi et al. | Body fluid identification by integrated analysis of DNA methylation and body fluid-specific microbial DNA | |
| JP7072385B2 (ja) | ニューモシスチス肺炎を診断、予測又はモニタリングするための手段 | |
| JP2020191876A (ja) | 結腸直腸癌のためのメチル化マーカー | |
| RU2646123C1 (ru) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ | |
| MX2011004763A (es) | Polimorfismos geneticos en la degeneracion macular relacionada con la edad. | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| JP6108407B2 (ja) | マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法及び検出キット | |
| Takanashi et al. | Development and clinical application of an InvaderPlus® assay for the detection of genital mycoplasmas | |
| WO2020016814A1 (en) | Nucleic acid-based detection of carbapenemase-producing bacteria | |
| RU2725477C1 (ru) | Способ выявления наличия мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам | |
| RU2778666C1 (ru) | Способ выявления мутаций в участках генов parC и gyrA QRDR, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда | |
| JP5258760B2 (ja) | メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法 | |
| TW202144584A (zh) | 克雷柏氏菌屬細菌之檢測用之引子組及探針 | |
| KR20160009397A (ko) | 약제 내성 결핵균을 검출하는 방법 | |
| RU2699189C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ количественного выявления кокковой микрофлоры методом LAMP | |
| US11898210B2 (en) | Tools for assessing FimH blockers therapeutic efficiency | |
| RU2241042C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики chlamydia spp., chlamydophila pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов | |
| Vitrenko et al. | A dual-target strategy for the detection of Chlamydia trachomatis by real-time PCR | |
| RU2621863C2 (ru) | Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение | |
| KR102444179B1 (ko) | Hpv 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 hpv 감염 진단을 위한 정보제공방법 | |
| KR20190084476A (ko) | 다복제유전자를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법 | |
| KR101742016B1 (ko) | 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트 | |
| VILLARREAL JULIO Sr et al. | DEVELOPMENT OF AN IDENTIFICATION METHOD FOR Leishmania spp BASED ON REAL-TIME PCR WITH HIGH-RESOLUTION MELTING | |
| KR20180033911A (ko) | 표적 핵산 또는 유전적 변이를 다중 검출하는 방법 |