MX2011004763A - Polimorfismos geneticos en la degeneracion macular relacionada con la edad. - Google Patents

Abstract

Métodos para determinar si un paciente se encuentra en riesgo incrementado de desarrollar AMD húmeda o si un paciente tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad.

Description

POLIMORFISMOS GENÉTICOS EN LA DEGENERACIÓN MACULAR RELACIONADA CON LA EDAD SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 USC 119(e) para la solicitud de patente provisional de E. U. número 61/111,667, presentada el 5 de noviembre de 2008, y la solicitud de patente provisional de E. U. número 61/174,856, presentada el Io de mayo de 2009, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente mediante la referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general al tratamiento de enfermedades humanas. Más específicamente, la invención se refiere a la degeneración macular húmeda relacionada con la edad (AMD) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La AMD es la causa principal de una pérdida de visión severa e irreversible entre las personas de edad avanzada. Bressler (2004) JAMA 291:1900-01. Sé caracteriza por un amplio espectro de hallazgos clínicos y patológicos, incluyendo manchas de color amarillo pálido conocidas como drusas, la alteración del epitelio pigmentario retinal (RPE) , neovascularización coroidal (CNV) , y degeneración macular disciforme. Las manifestaciones de la enfermedad se clasifican en dos formas: no exudativa (seca) y exudativa (húmeda o ne'ovascular) . Recientemente, se han aprobado varias terapias para el tratamiento de la AMD húmeda terapia fotodinámica utilizando verteporfina (Visudyne®) ; un aptámero de unión a VEGF, pegaptantib (Macugen®) ; y un fragmento de anticuerpo anti-VEGF, ranibizumab (Lucentis®) .

Los polimorfismos genéticos se presentan en una población cuando diferentes alelos, en genes particulares dan como resultado diferentes fenotipos, incluyendo el desarrollo o progresión de enfermedades y la respuesta a fármacos terapéuticos. Se han identificado múltiples polimorfismos que se asocian con -el desarrollo o progresión de AMD (e.g., Despriet ' ef al . (2007) Arch Ophthal ol. 125:1270-71; Seddon ¦ et al. (2007) JAMA 297:1793-99, 2585; Boon et al. (2008) A . J. Human Genet. 82:516-23). Trabajos anteriores han demostrado que los polimorfismos particulares en la posición 402 de aminoácidos del gen del factor H del complemento (CFH) se asocian con la respuesta a PDT . con la verteporfina o terapia de bevacizumab sin marca para AMD (Brantley et al. (2008) Eye publicado en línea el 22 de Febrero, pp. 1-6; Brantley et al. (2007) Ophthalmology 114:2168-73). Puede utilizarse la identificación de polimorfismos predictivos de la eficacia o seguridad de terapias particulares para diseñar mejores terapias para los pacientes que se beneficiarían mejor de ellas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en parte en la identificación de polimorfismos genéticos que son predictivos del riesgo de AMD o de la probabilidad incrementada de que el tratamiento con anticuerpos anti-VEGF de alta afinidad beneficiará a los pacientes con AMD.

En un aspecto, la invención proporciona un método para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo Y402H del gen del factor H del complemento (CFH) que corresponde a rsl061170, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse de dicho tratamiento si el genotipo correspondiente comprende CC o CT. En otro aspecto, la invención proporciona un método para predecir, si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo I802V del gen del componente del complemento C5 (C5) que corresponde con rsl7611, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse de dicho tratamiento si el genotipo correspondiente comprende AA o AG. En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo A69S de la serina proteasa 1 de Hrta (HTRA1 ) que corresponde a rsl0490924, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse de dicho tratamiento si el genotipo correspondiente comprende GT. En algunas modalidades, el método comprende además tratar al paciente con un anticuerpo anti-VEGF.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF se une al mismo epítope que el anticuerpo A4.6.1 anti-VEGF monoclonal producido por el hibridoma ATCC® HB 10709. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de la región de determinación de complementariedad (CDR) de cadena pesada: CDRHl (GYDFTHYGMN; SEQ ID N0:1), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEQ ID NO : 2) y CDRH3 (YPYYYGTSHWYFDV; SEQ ID NO : 3 ) y un dominio variable de cadena ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera: CDRLl ¦ (SASQDISNYLN; SEQ ID NO: 4), CDRL2 (FTSSLHS; SEQ ID NO: 5) y CDRL3 (QQYSTVPWT; SEQ ID NO: 6) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF tiene el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de Y0317. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF es ranibizumab.

En otro aspecto, la invención proporciona un equipo para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con ranibizumab que comprende un primer oligonucleótido segundos oligonucleótidos específicos para un polimorfismo C/T en el alelo CFH Y402H que corresponde a rsl061170. En algunas modalidades, los oligonucleótidos pueden utilizarse para amplificar una parte del gen CFH que comprende un polimorfismo C/T en el alelo CFH Y402H.

En otro aspecto, la invención proporciona un equipo para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF que comprende un primer oligonucleótido y segundos oligonucleótidos específicos para uh polimorfismo A/G en el alelo C5 I802V que corresponde con rsl7216529. En algunas modalidades, los oligonucleótidos pueden utilizarse para amplificar una parte del gen CFH que comprende un polimorfismo A/G en el alelo C5 I802V.

En otro aspecto, la invención proporciona un equipo para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido específico para un polimorfismo G/T en el alelo HTRAl A69S que corresponde a rsl0490924. En algunas modalidades, los oligonucleótidos pueden utilizarse para amplificar una parte del gen CFH que comprende un polimorfismo G/T en el alelo HTRAl A69S.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para predecir si un individuo tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo C5 I145V que corresponde a rsl7216529, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD si el genotipo correspondiente comprende GG o AG.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para predecir si un individuo tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD húmeda o seca con GA AMD, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo C5 I802V que corresponde a rsl7611, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD si el genotipo correspondiente comprende el alelo T (ile (isoleucina) ) .

DESCRIPCIÓ DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo las técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales se encuentran dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ("Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio"), segunda edición^ (Sambrook et al. 1989); "Oligonucleotide Synthesis" ("Síntesis de Oligonucleótidos") (M. J. Gait, ed. , 1984); "Animal Cell Culture" ("Cultivo Celular Animal") (R. I. Freshney, ed. , 1987); "Methods in Enzymology" ("Métodos en Enzimología" ) (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" ("Protocolos Actuales en Biología Molecular") (F. M. Ausubel et al. eds . , 1987, y actualizaciones periódicas) ,- "PCR: The Polymerase Chain Reaction" ("PCR: Reacción en Cadena de Polimerasas" ) (Mullís et al. eds. , 1994) .

A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto ordinario en la materia a la cual pertenece esta invención. Singleton et al. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (Diccionario de Microbiología y Biología Molecular) 2a ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure (Reacciones, Mecanismos y Estructura de la Química Orgánica Avanzada en Marcha) 4a ed. , John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), proporcionan a un experto en la materia una guía general de muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo las solicitudes y publicaciones de patente, se incorporan mediante la referencia en su totalidad.

DEFINICIONES Como se utiliza en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen los plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. Por ejemplo, "una" célula también incluirá "células".

El término "comprende" se propone para referirse a que las composiciones y métodos incluyen los elementos citados, pero no excluye otros.

Los términos "VEGF" y "VEGF-A" se utilizan intercambiablemente para referirse al factor de crecimiento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos y/o los factores de crecimiento celular endotelial vascular de 121 , 189 y 206 aminoácidos relacionados, como se describe por Leung et al. Science, 246 : 1306 ( 1989 ) , y Houck et al. Mol. Endocrin. , 5 : 1806 ( 1991 ) , junto con las formas alélicas y procesadas de los mismos que se presentan de manera natural .

Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se une a VEGF con afinidad y especificidad suficientes. Preferentemente, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede utilizarse como un agente terapéutico al dirigirse e interferir con enfermedades o condiciones en donde se encuentra involucrada la actividad de VEGF. Un anticuerpo anti-VEGF no se unirá usualmente a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, u otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo anti-VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epitope que el anticuerpo A4.6.1 anti-VEGF monoclonal producido por el hibridoma ATCC® HB 10709 y es un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad. Un "anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad" tiene al menos 10 veces mejor afinidad para VEGF que el anticuerpo A4.6.1 anti-VEGF monoclonal. Preferentemente el anticuerpo anti-VEGF es un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con la WO 98/45331, incluyendo un anticuerpo que comprende las CDRs o las regiones variables de Y0317. Más preferentemente, el anticuerpo anti-VEGF es el fragmento de anticuerpo conocido como ranibizumab (Lucentis®) .

El término "anticuerpo" se utiliza en el más amplio sentido e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud total o intactos) , anticuerpos policlonales , anticuerpos multivalentes , anticuerpos multiespecíficos (e.g., anticuerpos biespecífieos) , y fragmentos de anticuerpo siempre que exhiban la actividad biológica deseada. .

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Los individuos con necesidad del tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno así como aquellos en los cuales se va a prevenir el trastorno.

El término "polimorfismo" se refiere ' a una ubicación en la secuencia de un gen que varía dentro de una población. Un polimorfismo comprende diferentes "alelos". La ubicación de tal polimorfismo puede identificarse por su posición en el gen y los diferentes aminoácidos o bases que se encuentran allí. Por ejemplo, Y402H CFH indica que existe una variación entre la tirosina (Y) y la histidina (H) en la posición de aminoácido 402 en el gen CFH. Este cambio de aminoácido es el resultado de dos posibles bases variantes, C y T, que son dos alelos diferentes. Debido a que el genotipo se encuentra comprendido de dos alelos separados, pueden observarse cualquiera de varias posibles variantes en cualquier individuo (e.g., para este ejemplo, CC, CT o TT) . Los polimorfismos individuales son también identificadores únicos asignados ("Referencia SNP" , "refSNP" o "rs#") conocidos por el experto en la materia y se utilizan, e.g., en la Base de Datos del Polimorfismo de Nucleótido Único (dbSNP) de la Variación de Secuencia de Nucleótidos disponible en el sito de red NCBI.

El término "genotipo" se refiere a los alelos específicos de un cierto gen en una muestra celular o de tejido. En el ejemplo de arriba, CC, CT o TT son genotipos posibles en el polimorfismo Y402H CFH.

El término "muestra" incluye una muestra celular o de tejido tomada de un paciente. Por ejemplo, una muestra puede incluir una muestra de piel, una muestra celular de mejilla, o células sanguíneas.

La identificación del genotipo particular en una muestra puede llevarse a cabo por cualquier número de métodos conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, la identificación del polimorfismo puede llevarse a cabo al clonar el alelo y secuenciarlo utilizando técnicas muy conocidas en la materia. Alternativamente, las secuencias genéticas pueden amplificarse del ADN genómico, e.g., utilizando PCR, y el producto secuenciado. Se describen abajo varios métodos no limitantes para analizar un ADN del paciente para mutaciones en un sitio genético dado.

Puede utilizarse tecnología de micromatrices de ADN, e.g., dispositivos de chip para ADN y micromatrices de alta densidad para aplicaciones de la detección sistemática de alto rendimiento y micromatrices de baja densidad. Los métodos para la fabricación de micromatrices se conocen en la materia e incluyen varias deposiciones de chorro de tinta y de microinyección o tecnologías y procesos de tinción, in situ o procesos de síntesis de oligonucleótidos fotolitográficos in situ o en chip, y procesos que se dirigen a sondas electrónicas de ADN. Las aplicaciones de hibridación de micromatrices de ADN se han aplicado exitosamente en las áreas del análisis de la expresión genética y el genotipo para mutaciones por punto de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) , y cortas repeticiones en tándem (STRs) . Los métodos adicionales incluyen micromatrices de ARN de interferencia y combinaciones de micromatrices y otros métodos tales como la microdisección de captura con láser. (LCM) ; hibridación genómica comparativa (CGH) e inmunoprecipitacion de cromatina (ChiP) . Ver, e.g., He et al., (2007) Adv. Exp. Med. Biol. 593:117-133 y Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129- 153. Otros métodos incluyen PCR, xMAP, ensayo invasor, espectrometría de masas y pirosecuenciación (Wang et al . , (2007) Tecnología de Micromatrices y Perfil Genético del - Cáncer Vol 593 de las series del libro Avances en Medicina y Biología Experimental, Pub. Springer Nueva York) .

Otro método de detección es la hibridación específica del alelo utilizando sondas que recubren el sitio polimórfico y que tienen aproximadamente 5, o alternativamente 10, o alternativamente . 20, o alternativamente 25, o alternativamente 30 nucleótidos alrededor de la región polimórfica. Por ejemplo, varias sondas capaces de hibridar específicamente a la variante alélica se unen a un soporte de fase sólida, e.g., un "chip" . Los oligonucleótidos pueden unirse a un soporte sólido mediante una variedad de procesos, incluyendo litografía. El análisis de detección de mutación que utiliza estos chips comprende oligonucleótidos, también llamados "ensayos de sonda de ADN" que se describe en e.g., Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244.

En otros métodos de detección, es necesario primero amplificar al menos una porción del gen antes de identificar la variante alélica. La amplificación puede llevarse a cabo, e.g., mediante PCR y/o LCR u otros métodos muy conocidos en la materia.

En algunos casos, la presencia del alelo específico en el ADN de un sujeto puede mostrarse mediante el análisis de enzima de restricción. Por ejemplo, el polimorfismo de nucleótido específico puede dar como resultado una secuencia de nucleótidos que comprende un sitio de restricción que se encuentra ausente de la secuencia de nucleótidos de otra variante alélica.

En una modalidad adicional, puede utilizarse la protección de agentes de desdoblamiento (tales como una nucleasa, hidroxilamina o tetróxidó de osmio y con piperidina) para detectar bases desacopladas en heteroduplas de ARN/ARN ADN/ADN o ARN/ADN (ver, e.g., Myers et al., (1985) Science 230:1242). En general, la técnica del "desdoblamiento de desacoplamiento" inicia al proporcionar heteroduplas formadas al hibridar un ácido nucleico de control, que se marca opcionalmente, e.g., ARN o ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos de la variante alélica del gen con una ácido nucleico muestra, e.g., ARN o ADN obtenido de una muestra de tejido. Las duplas bicatenarias se tratan con un agente que divide las regiones monocatenarias de las duplas tales como duplas formadas en base a desacoplamientos de pares bases entre los filamentos de control y de muestra. Por ejemplo, las duplas ARN/ADN pueden tratarse con híbridos de RNasa y de ADN/ADN tratados con SI nucleasa para digerir enzimáticamente las regiones desacopladas. Alternativamente, las duplas de ya sea ADN/ARN o de ARN/ADN pueden tratarse con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina a fin de digerir las regiones desacopladas. Después de la digestión de las regiones desacopladas, el material resultante se separa entonces por tamaño al desnaturalizar los geles de poliacrilamida para determinar si los ácidos nucleicos de control y muestra tienen una secuencia de nucleótidos idéntica o en qué nucleótidos son diferentes. Ver, por ejemplo, la Pat. de E. U. No. 6,455,249, Cotton et al. (1988) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 85:4397; Saleeba et al., (1992) Meth. Enzymol. 217:286-295.

Las alteraciones en la movilidad electroforética también pueden utilizarse para identificar la variante alélica particular. Por ejemplo, puede utilizarse el polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) para detectar las diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y el tipo silvestre (Orita et al., (1989) Proa Nati. Acad. Sci. USA 86:2766; Cotton (1993) Mutant. Res. 285:125-144 y Hayashi (1992) Genet . Anal. Tech. Appl . 9:73-79). Los fragmentos de ADN monocatenarios de los ácidos nucleicos de muestra y control se desnaturalizan y se dejan renaturalizar . La estructura secundaria de los ácidos nucleicos monocatenarios varía de acuerdo con la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de aún un simple cambio de base. Los fragmentos de ADN pueden etiquetarse o detectarse con sondas etiquetadas. La sensibilidad del ensayo puede mejorarse al utilizar ARN (en lugar de ADN) , en la cual la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En otra modalidad preferida, el método objetivo utiliza análisis de heterodupla para separar las moléculas de heterodupla bicatenarias sobre la base de cambios en la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5).

La identidad de la variante alélica también puede obtenerse al analizar el movimiento de un ácido nucleico que comprende la región polimórfica en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalización, el cual se ensaya utilizando electroforesis de gel de gradiente de desnaturalización (DGGE) (Myers et al. ( 1985 ) Nature 313 : 495 ) . Cuando se utiliza DGGE como el método de análisis, el ADN se modificará para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo al agregar un clamp GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de alta fusión mediante PCR. En una modalidad adicional, se utiliza un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente de agente desnaturalizante para identificar las diferencias en la movilidad del ADN de control y de muestra (Rosenbaum y Reissner ( 1987 ) Biophys . Chem. 265 : 1275 ) .

Ejemplos de técnicas para detectar las diferencias de al menos un nucleótido entre 2 ácidos nucleicos incluyen pero no se limitan a, la hibridación selectiva de oligonucleótidos , la amplificación selectiva o extensión selectiva del iniciador. Por ejemplo, pueden prepararse las sondas de oligonucleótidos en las cuales el nucleótido polimórfico conocido se coloca centralmente (sondas específicas de alelo) y después se hibridan al ADN objetivo bajo condiciones que permiten la hibridación solo si se encuentra una igualación perfecta (Saiki et al. ( 1986 ) Nature 324 : 163 ) ; Saiki et al. ( 1989 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 : 6230 ) . Tales técnicas de hibridación de oligonucleótidos específicas del alelo pueden utilizarse para la detección de los cambios de nucleótidos en la región polimórfica del gen.

Por ejemplo, los oligonucleótidos que tienen la secuencia de oligonucleótidos de la variante alélica específica se unen a una membrana de hibridación y esta membrana se híbrida entonces con el ácido nucleico de muestra etiquetado. El análisis de la señal de hibridación revelará entonces la identidad de los nucleótidos del ácido nucleico de muestra.

Alternativamente, la tecnología de amplificación específica de alelo que depende de la amplificación selectiva de PCR puede utilizarse junto con la invención actual. Los oligonucleótidos utilizados como iniciadores para la amplificación específica pueden llevar la variante alélica de interés en el centro de la molécula (de manera que la amplificación dependa de la hibridación diferencial) (Gibbs et al., ( 1989 ) Nucí. Acids. Res. 17 : 2437 -2448 ) o en el extremo 3 ' final de un iniciador, en donde bajo condiciones apropiadas, puede evitarse el desacoplamiento o reducirse la extensión de la polimerasa (Prossner ( 1993 ) Tibtech 11 : 238 y Newton et al., ( 1989 ) Nucí. Acids. Res. 17 : 2503 ) . Esta técnica también se llama "PROBE" para Probé Oligo Base. Extensión. Además puede ser deseable introducir un nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para crear la detección en base al desdoblamiento (Gasparini et al. ( 1992 ) Mol. Cell. Probes 6 : 1 ) .

En otra modalidad, la identificación de la variante alélica se lleva a cabo utilizando un ensayo de ligación de oligonucleótido (OLA), como se describe, e.g. , en la Pat. de E. U. No. 4 , 998 , 617 y en Laridegren, U. et al., Science 241 : 1077 - 1080 ( 1988 ) . El protocolo OLA utiliza dos oligonucleótidos que se diseñan para ser capaces de hibridarse a las secuencias colindantes monocatenarias de un objetivo. Uno de los oligonucleótidos se enlaza a un marcador de separación, e.g., biotinilado, y el otro se etiqueta de manera detectable. Si la secuencia complementaria precisa se encuentra en una molécula objetivo, los oligonucleótidos se hibridarán de tal manera que sus terminales se ' empalmen y creen un sustrato de ligación. La ligación permite entonces que el oligonucleótido etiquetado se recupere utilizando avidina, u otro ligando de biotina. Nickerson, D. A. et al., ha descrito un ensayo de detección de ácido nucleico que combina los atributos de PCR y OLA (Nickerson, D. A. et al., ( 1990 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87 : 8923 -8927 ) . En este método, PCR se utiliza para lograr la amplificación exponencial del ADN objetivo, que se detecta entonces utilizando OLA.

La invención proporciona métodos para detectar un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en CFH y C5. Debido a que los polimorfismos de nucleótido único se flanquean por regiones de secuencia invariante, sus análisis requieren no más que la determinación de la identidad del nucleótido de variante única y no es necesario determinar la secuencia genética completa para cada paciente.. Diversos métodos se han desarrollado para facilitar el análisis de SNPs.

El polimorfismo de base única puede detectarse al utilizar un nucleótido especializado resistente a la exonucleasa, como se describe, e.g., en la Patente de E. U. No. 4,656,127. De acuerdo con el método, un iniciador complementario a la secuencia alélica inmediata a 3 ' en el sitio polimórfico se deja hibridar a una molécula objetivo obtenida de un animal o humano particular. Si el sitio polimórfico en la molécula objetivo contiene un nucleótido que es complementario al presente derivado de nucleótido resistente a la exonucleasa particular, entonces ese derivado se incorporará en el extremo del iniciador hibridado . Tal incorporación proporciona el iniciador resistente a la exonucleasa, y mediante esto permite su detección. A partir de que se conoce la identidad del derivado de la muestra resistente a la exonucleasa, el hallazgo de que el iniciador se ha vuelto resistente a las exonuleasas, revela que el nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula objetivo fue complementario al del derivado de nucleótido utilizado en la reacción. Este método tiene la ventaja de que no requiere la determinación de grandes cantidades de datos de secuencias extrañas.

También puede utilizarse un método en base a la solución para determinar la identidad del nucleótido del sitio polimórfico (WO 91/02087). Como en lo anterior, se emplea un iniciador que es complementario a las secuencias alélicas inmediatas a 3' en un sitio polimórfico. El método determina la identidad del nucleotido de ese sitio utilizando derivados de dideoxinucleótido etiquetados, que si son complementarios al nucleotido del sitio polimórfico, se incorporarán en la terminal del iniciador.

Se describe un método alternativo en la WO 92/15712. Este método utiliza mezclas de terminadores etiquetados y un iniciador que es complementario a la secuencia 3' en un sitio polimórfico. El terminador etiquetado que se incorpora se determina así, y es complementario al nucleotido presente en el sitio polimórfico de la molécula objetivo a evaluarse. El método es usualmente un ensayo de fase heterogénea, en el cual se inmoviliza el iniciador o la molécula objetivo a una fase sólida.

Se han descrito muchos otros procedimientos de incorporación de nucleótidos guiados por iniciador para ensayar sitios polimórficos en ADN (Komher, J. S. et al., (1989) Nucí. Acids . Res. 17 : 7779-7784 ; Sokolov, B. P. (1990) Nucí. Acids. Res. 18:3671; Syvanen, A.-C, et al. (1990) Genomics 8:684-692; Kuppuswamy, M. N. et al., (1991) Porc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1143-1147; Prezant, T. R. et al., (1992) Hum Mutat.. 1:159-164; Ugozzoli L. et al., (1992) GATA 9:107-112; Nyren, P. et al., (1993) Anal. Biochem. 208:171- 175) . Estos métodos todos dependen de la incorporación de los desoxinucleótidos etiquetados para discriminar entre las bases en un sitio polimórfico.

Además, se entenderá que puede utilizarse cualquiera de los métodos anteriores para detectar alteraciones en . un gen o producto de gen o variantes polimórficas para monitorear el curso del tratamiento o terapia .

Los métodos descritos en la presente pueden llevarse a cabo por ejemplo, al utilizar equipos de diagnóstico pre-empacados , tales como los descritos abajo, que comprenden al menos una sonda o ácido nucleico iniciador, que puede utilizarse convenientemente, e.g., para determinar si un individuo tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD o si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF.

El ácido nucleico de muestra para utilizarse en los métodos de diagnóstico y pronóstico antes descritos, puede obtenerse a partir de cualquier tipo de célula o tejido de un sujeto. Por ejemplo, un fluido corporal de un sujeto (e.g., sangre) puede obtenerse mediante técnicas conocidas. Alternativamente, las pruebas de ácido nucleico pueden llevarse a cabo sobre muestras secas (e.g., cabello o piel).

La invención descrita en la presente se refiere a métodos y composiciones para determinar e identificar el alelo presente en diversos alelos, incluyendo los alelos Y402H CFH, el I145V C5, y el I802V C5. Pueden utilizarse las sondas para determinar directamente el genotipo de la muestra o pueden utilizarse simultáneamente o subsecuente a la amplificación. El término "sondas" incluye ácidos nucleicos mono o bicatenarios recombinantes o que se presentan de manera natural o ácidos nucleicos químicamente sintetizados. Pueden etiquetarse mediante traducción de corte, reacción de relleno leno , PCR u otros métodos conocidos en la materia. Las sondas de la presente invención, su preparación y/o etiquetado se describen en Sambrook et al., ( 1989 ) supra. Una sonda puede ser un polinucleótido de cualquier longitud adecuada para la hibridación selectiva a un ácido nucleico que contiene una región- polimórfica de la invención. La longitud de la sonda utilizada dependerá en parte, de la naturaleza del ensayo utilizado y las condiciones de hibridación empleadas .

Las sondas etiquetadas también pueden utilizarse en conjunto con la amplificación de un polimorfismo. (Holland et al., ( 1991 ) Porc. Nati. Acad. Sci. USA 88 : 7276 -7280 ) . La Pat. de E. U. No. 5 , 210 , 015 describe procedimientos en base a la fluorescencia para proporcionar mediciones en tiempo real de los productos de amplificación durante PCR. Tales procedimientos han empleado ya sea tintas de intercalación \ (tales como bromuro de etidio) para indicar la cantidad de ADN bicatenario presente, o se han empleado sondas que contienen pares de fluorescencia-atenuadbr (también referidos como el procedimiento "TaqMan®") en donde la sonda se divide durante la amplificación para liberar una molécula fluorescente cuya concentración es proporcional a la cantidad del ADN bicatenario presente. Durante la amplificación, la sonda se digiere por la actividad de la nucleasa de una polimerasa cuando se híbrida a la secuencia objetivo para ocasionar que la molécula fluorescente se separe de la molécula atenuadora, ocasionando mediante esto que aparezca la fluorescencia de la molécula informadora. El procedimiento TaqMan® utiliza una sonda que contiene un par de molécula informadora—molécula atenuadora que se híbrida específicamente a una región de un polinucleótido objetivo que contiene el polimorfismo.

Las sondas pueden fijarse a superficies para utilizarse como "genochips". Tales genochips pueden utilizarse para detectar las variaciones genéticas mediante un número de técnicas conocidas por un experto en la materia. En una técnica, los oligonucleótidos se ordenan en un genochip para determinar la secuencia de ADN mediante secuenciación por el procedimiento de hibridación, tal como el resumido en las Pats. de E. U. Nos. 6 , 025 , 136 y 6 , 018 , 041 . Las sondas de la invención también pueden utilizarse para la detección fluorescente de una secuencia genética. Tales técnicas se han descrito por ejemplo, en las Pats . de E. U. Nos. 5,968,740 y 5,858,659. También puede fijarse una sonda a una superficie de electrodo para la detección eletroquímica de las secuencias de ácidos nucleicos tales como las descritas en la Pat. de E. U. No. 5,952,172 y por Kelley, S. O. et al., (1999) Nucí . Acids. Res. 27:4830-4837.

Adicionalmente, los ácidos nucleicos aislados utilizados como sondas o iniciadores pueden modificarse para volverse más estables. Las moléculas de ácido nucleico , ejemplares que se modifican incluyen análogos de ADN de fosforamidato, fosfotioato y metilfosfonato (ver también las Pats. de E. U. Nos. 5,176,996; 5,264,564 y 5,256,775) .

Como se establece en la presente, la invención proporciona también métodos de diagnóstico para determinar el tipo de variantes alélicas de las regiones polimórficas presentes en CFH o C5. En algunas modalidades, los métodos utilizan sondas o iniciadores que comprenden secuencias de nucleótidos que son complementarias a una región polimórfica de CFH o C5. Por consiguiente, la invención proporciona equipos para llevar a cabo estos métodos.

En algunas modalidades, la invención proporciona un equipo para determinar si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF, incluyendo un anticuerpo anti- VEGF de alta afinidad. Tales equipos contienen una o más de las composiciones descritas en la presente e instrucciones para su uso. Solo como un ejemplo, la invención proporciona también equipos para determinar si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con ranibizumab que comprende un primer oligonucleótido y segundos oligonucleótidos específicos para un polimorfismo C/T en el alelo Y402H CFH. Los oligonucleótidos "específicos para" un sitio genético se unen ya sea a la región polimórfica del sitio o se unen adyacentes a la región polimórfica del sitio. Para los oligonucleótidos que se utilizan como iniciadores para la amplificación, los iniciadores se encuentran adyacentes si se encuentran suficientemente cercanos para utilizarse para producir un polinucleótido que comprende la región polimórfica. En una modalidad, los oligonucleótidos se encuentran adyacentes si se unen dentro de aproximadamente 1-2 kb, e.g., menos de 1 kb desde el polimorfismo. Los oligonucleótidos específicos son capaces de hibridarse a una secuencia, y bajo condiciones adecuadas no se unirán a una secuencia que difiere por un solo nucleótido.

El equipo puede comprender al menos una sonda o iniciador que sea capaz de hibridarse específicamente a la región polimórfica del CFH o C5 e instrucciones para su uso. El equipo usualmente comprende al menos uno de los ácidos nucleicos antes descritos. Los equipos para amplificar al menos una porción de CFH o C5 generalmente comprenden dos iniciadores, al menos uno de los cuales es capaz de hibridarse a la secuencia variante alélica. Tales equipos son adecuados para la detección del genotipo mediante por ejemplo, la detección de fluorescencia, mediante la detección electroquímica o mediante otra detección.

Los oligonucleótidos , si se utilizan como sondas o iniciadores, contenidos en un equipo pueden etiquetarse de manera detectable. Las etiquetas pueden detectarse ya sea directamente por ejemplo, por etiquetas fluorescentes, o indirectamente. La detección indirecta puede incluir cualquier método de detección conocido por un experto en la materia, incluyendo interacciones de biotina-avidina, unión a anticuerpo y lo similar. Los oligonucleótidos fluorescentemente etiquetados también pueden contener una molécula de atenuación. Los oligonucleótidos pueden unirse a una superficie. En algunas modalidades, la superficie es sílice o vidrio. En algunas modalidades, la superficie es un electrodo metálico.

Aún otros equipos de la invención comprenden al menos un reactivo necesario para llevar a cabo el ensayo. Por ejemplo, el equipo puede comprender una enzima. Alternativamente el equipo puede comprender un amortiguador o cualquier otro reactivo necesario.

El equipo puede incluir todos o algunos de los controles positivos, controles negativos, reactivos, iniciadores, marcadores de secuenciación, sondas y anticuerpos descritos en la presente para determinar el genotipo del sujeto en la región polimorfica de CFH o C5.

El siguiente ejemplo se propone solamente para ilustrar la práctica de la presente invención y no se proporciona a manera de limitación.

EJEMPLO Ejemplo 1. Polimorfismos genéticos en CFH, HTRAl y C5 y su asociación con la ocurrencia de AMD y resultados del tratamiento Polimorfismos Se probó una variedad de polimorfismos para la variación asociada con un resultado favorable durante la terapia anti-VEGF utilizando ranibizumab. Se examinaron estos polimorfismos que se seleccionaron debido a que son ocho alelos de 5 sitios previamente reportados por estar asociados con la susceptibilidad a AMD (Tabla 1) . Específicamente, dos alelos provenientes del factor H del complemento (CFH), serina peptidasa HTRa/susceptibilidad 2 de maculopatía relacionada con la edad (HTRAl/ARMS2) , Factor 2 del Complemento/preproteína del Factor B del Complemento (C2/BF) , y un solo alelo del Factor 3 del Complemento (C ), y el receptor 1 de quimiocina (motivo C-X3-C) (CX3CR1) se sometieron a genotipo en 352 muestras de AMD de la prueba DAWN utilizando PCR cuantitativa a través del sistema TaqMan®. Además, se probaron dos alelos para el componente 5 > del complemento ( C5 ) (Tabla 2 ) . El protocolo experimental estándar proporcionado por ABI se utilizó para el genotipo de todos los ensayos en la Tabla 1. En resumen los ensayos se corrieron en una máquina ABI 7500 , utilizando las siguientes condiciones de ciclo: 2 minutos a 50 °C , 10 minutos a 95 °C , seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 92 °C y 1 minuto a 60 °C .

Tabla 1. Polimorfismos de Nucleótido Único (SNPs) Probados Posición en pares de bases del ensamble del genoma humano de Mayo del 2004 .

Tabla 2. Polimorfismos de ucleótido Único (SNPs) Probados para C5 * Posición en pares de bases del ensamble del genoma humano de Mayo del 2004 .

Muestras Se recolectaron muestras de sangre periférica de 352 sujetos no identificados de estudios esenciales de Lucentis® (MARINA, ANCHOR, y FOCUS) quienes participaron en el sub-estudio genético DAWN de la prueba de extensión HORIZON y se aisló el ADN genómico. Todas las muestras tuvieron un diagnóstico confirmado de AMD neo-vascular, 60% fueron pacientes femeninas y la edad promedio en la línea basal fue de 75 . 0 años de edad para Sham/PDT y 75 . 6 años de edad para los tratados con ranibizumab. Se obtuvo el informe de consentimiento informado por escrito de todos los individuos en el estudio y los protocolos del estudio se aprobaron por los consejos de revisión institucionales. El ADN se extrajo utilizando el equipo DNeasy®Tissue (Qiagen, Valencia, CA) . Los SNP's se sometieron a genotipo con PCR en Tiempo Real en base a TaqMan®. Para dos de los SNPs se utilizaron iniciadores acostumbrados (Tabla 4) y para los otros seis se utilizaron iniciadores propiedad de ABI (Tabla 3) . Los SNPs 2 C5 (oligonucleótidos mostrados en la Tabla 5) se tipificaron como parte de un panel de ensayo acostumbrado de 96 SNP utilizando la plataforma de Illumina®GoldenGate.

Tabla 3. Ensayos Utilizados para el Genotipo SNPs *Ensayos de Genotipo SNP TaqMan® pre-diseñados (Applied Biosystems, Foster City, CA) estuvieron disponibles para 6 de los alelos . La ID del ensayo ABI se muestra para los ensayos pre-diseñados, ya que las secuencias iniciadoras son de su propiedad. Los ensayos TaqMan® acostumbrados se diseñaron para los dos alelos restantes, y los iniciadores se encuentran en la Tabla 4.

Tabla 4. Iniciadores Utilizados para el Genotipo rsl061170 y rs 11200638 Tabla 5. Iniciadores Utilizados para el Genotipo C5 SNPs rsl7216529 y rsl7611 Información Clínica Se examinó la información clínica proveniente de las pruebas Lucentis MARINA, ANCHOR y FOCUS. Específicamente, la información se relaciona con la Raza, Sexo Edad auto-identificados en la línea basal del estudio inicial, el grupo de tratamiento del estudio inicial, la Dosis Lucentis, el Cruce para el brazo de tratamiento en el año 2, la Presencia de Error de la Dosificación, puntuación de la agudeza visual (VA) corregida del mejor ojo de estudio en la línea basal (BL) en letras, puntuación VA del Ojo Par en BL (letras) , puntuación VA del ojo de Estudio a los 12 Meses (letras) , puntuación VA del ojo Par a los 12 Meses (letras), presencia de AMD Neovascular en el ojo par en BL, y clasificación C V en BL del ojo de Estudio.

Asociación al Análisis de Susceptibilidad Se examinaron los ocho alelos para una asociación con la susceptibilidad a la enfermedad al comparar la frecuencia del alelo en los casos DAWN en relación a las muestras de control obtenidas de fuentes públicamente disponibles. Para rsl0490924, rsl410996, rs9332739 y rs3732378, se obtuvo la información sobre la frecuencia del alelo de control de las estadísticas del sumario libremente disponibles del consorcio Wellcome Trust Case Control (WTCCC (2007) Nature 447:661-78) . Las frecuencias del alelo de control y los conteos del genotipo para los SNPs restantes se tomaron de un documento que reporta la asociación de rsll200638 3, rs2230199 6, rs547154 1. Se calcularon las estadísticas dé asociación utilizando las tablas de resultados 2x2 estándar.

Asociación del genotipo a las características clínicas de la línea basal La asociación de los 8 alelos con la agudeza visual (VA) de la linea basal se condujo utilizando la VA (letras) en el ojo de estudio en la línea basal como una característica cuantitativa con o sin la edad el la línea basal agregada como una co-variante. Las 3 clases de genotipo se probaron para las diferencias significativas en la VA de línea basal media. El análisis se condujo utilizando software PLINK (Purcell et al. (2007) Am. J. Hum. Genet. 81:559-75). Se probó la asociación de los 8 alelos con la presencia de AMD Neovascular en el ojo par, y la clasificación de la enfermedad Neovascular (mínimamente clásica, predominantemente clásica u oculta no clásica) del ojo de estudio en la línea basal. La frecuencia de la característica clínica se estratificó por el genotipo y el significado determinado por una prueba-t.

Enríguecimiento de los alelos de riesgo AMD en DAWN Confirmando las observaciones publicadas anteriores, los alelos provenientes de todos los 8 sitios se asociaron con el riesgo de AMD neovascular con un P<0.05. Sin embargo, solo el alelo proveniente del sitio CX3CR1 no mostró asociación consistente con el reporte original. En las muestras DAWN el sitio CX3CR1 tuvo una proporción de disparidad de 1.12, en contraste con las proporciones de disparidad >3 en el reporte original . Se observó una asociación significativa entre rsl7216529 (C5 I145V) y la ocurrencia de la neovascularización coroidal (CNV) en los ojos pares de individuos con AMD (Tabla 6) . Además, se observó una asociación entre rsl7611 (C5 I802V) y la ocurrencia de AMD húmeda, seca con GA AMD o ambas (Tabla 7) . Esta asociación fue más fuerte en los casos con AMD (p=0,0014) que en los casos secos con GA AMD.

Tabla 6. Asociación del genotipo en rsl7216529 (C5 I145V) con CNV Tabla 7. Asociación del genotipo en rsl7611 (C5 I802V) con AMD húmeda; seca con GA AMD; y ya sea AMD húmeda. seca con GA AMD o ambas.

Asociación de alelos a las características clínicas de la línea basal No se observó asociación significativa de los 8 alelos a la agudeza visual en la línea basal. El número de alelos de riesgo del alelo CFH Y402H y el alelo HTRAl A69S se asoció con la prevalencia de AMD neovascular en el ojo par en las muestras, sugiriendo un enlace entre el genotipo en estos sitios y la severidad de la enfermedad. El alelo CFH Y402H se asoció con el subtipo "predominantemente clásico" del AMD neovascular y el ojo de estudio en la línea basal. El alelo CFH intriónico rsl410996 se asoció con el área de la lesión en CNV y CNV Clásico y el alelo C5 I802V se asoció con el área de la lesión en CNV Clásico.

Asociación del genotipo con la respuesta a la terapia con ranibizumab Las muestras DAWN se separaron en 3 grupos en base al estado del tratamiento durante las pruebas MARINA, ANCHOR y FOCUS . El grupo tratado con ranibizumab incluyó individuos que recibieron dosis de 0.3 mg, 0.5 mg o 0.5 mg+PDT. El grupo SHAM/PDT consistió de individuos que recibieron una inyección falsa (SHAM) o solo terapia fotodimámica (PDT) . Se probó la asociación del cambio en la agudeza visual (VA, medida en letras) después de 12 meses de tratamiento para la asociación con el genotipo para cada uno de los 8 alelos . Se asociaron diferencias significativas en la respuesta del tratamiento con el genotipo en los alelos CFH Y402H, C5 I802V, y los alelos HTRA1 A69S (Tablas 8, 9 y 10) . Estas variantes se asociaron con cambios en VA en pacientes tratados mensualmente con ranibizumab: El cambio promedio de VA a los 12 meses fue +14.5, +10.8 y +7.0 letras para los genotipos Y402H CC, CT y TT, respectivamente; +15.6, +12.2 y +8.8 letras para los genotipos I802V AA, AG y GG respectivamente; y +9.3, +14.1 y +10.5 para los genotipos A69S GG, GT y TT, respectivamente. Para los alelos CFH Y402H, se observó una tendencia correspondiente inversa en los grupos de control (SHAM/PDT) con un cambio promedio en BCVA a los 12 meses de -4.8, -10.2 y -11.5 para los genotipos Y402H CC, CT y TT respectivamente. La diferencia en los resultados de BCVA promedio a los 12 meses entre los grupos de tratamiento de control y de ranibizumab fue la misma a través de todos los genotipos de riesgo Y402H.

Tabla 8. Asociación del genotipo en CFH Y402H con la respuesta a la terapia con ranibizumab.

Tabla 9. Asociación del genotipo en C5 I802V con respuesta para la terapia con ranibizumab.

Tabla 10. Asociación del genotipo en HTRAl A69S con respuesta para la terapia con ranibizumab.

I802V C5 GG GT TT Cambio promedio en SHAM O PDT VA -8.0 -9.0 -4.4 N de individuos 24 60 14 Tratado con Cambio promedio en ranibizumab VA 9.3 14.1 10.5 (0.3mg+0.5mg) N de individuos 68 80 49

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo Y402H del gen del factor H del complemento (CFH) que corresponde a rsl061170, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse de dicho tratamiento si el genotipo correspondiente comprende CC o CT.

2. Un método para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo I802V del gen del componente del complemento C5 (C5) que corresponde a rsl7611, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse de dicho tratamiento si el genotipo correspondiente comprende AA o AG.

3. Un método para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo de HTRAl A69S que corresponde a rsl0490924, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada, de beneficiarse de dicho tratamiento si el genotipo correspondiente comprende GT.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF se une al mismo epítope que el anticuerpo A4..6.1 anti-VEGF monoclonal producido por el hibridoma ATCC® HB 10709.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada: CDRHl (GYDFTHYGMN; SEQ ID NO:l), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEQ ID NO : 2) y CDRH3 (YPYYYGTSHWYFDV; SEQ. ID NO: 3) y un dominio variable de cadena ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de la CDR de cadena ligera: CDRL1 ( SASQDISNYLN; SEQ ID NO:4), CDRL2 (FTSSLHS; SEQ ID NO: 5) y CDRL3 (QQYSTVPWT; SEQ ID NO: 6) .

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF tiene el dominio variable de cadena pesada y. el dominio variable de cadena ligera de Y0317.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF es ranibizumab.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el genotipo correspondiente comprende CC .

9. El método de la reivindicación 1, en donde el genotipo correspondiente comprende CT.

10. El método de la reivindicación 2, .en donde el genotipo correspondiente comprende AA.

11. El método de la reivindicación 2, en donde el genotipo correspondiente comprende AG.

12. Un equipo para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con ranibizumab que comprende un primer oligonucleótido y segundos oligonucleótidos específicos para un polimorfismo C/T en el alelo CFH Y402H que corresponde a rsl061170.

13. El equipo de la reivindicación 12, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido pueden utilizarse para amplificar una parte del gen CFH que comprende un polimorfismo C/T en el alelo CFH Y402H.

14. Un equipo para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido específicos para un polimorfismo A/G en el alelo C5 I802V que corresponde a rsl7216529.

15. El equipo de la reivindicación 14, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido puede utilizarse para amplificar una parte del gen CFH que comprende un polimorfismo A/G en el alelo I802V C5.

16. Un equipo para predecir si un paciente con AMD húmeda tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido específicos para un polimorfismo G/T en el alelo HTRAl A69S que corresponde a rsl0490924.

17. El equipo de la reivindicación 16, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido puede utilizarse para amplificar una parte del gen CFH que comprende un polimorfismo A/G en el alelo HTRAl A69S.

18. Un método para predecir si un individuo tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD, que comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo C5 I145V que corresponde a rsl7216529, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD si el genotipo correspondiente comprende GG o AG.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el genotipo correspondiente comprende GG.

20. El método de la reivindicación 18, en donde el genotipo correspondiente comprende AG.

21. Un método para predecir si un individuo tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD húmeda o seca con GA AMD, qüe comprende la detección sistemática de una muestra aislada de dicho paciente para un polimorfismo genómico en el alelo C5 I802V que corresponde a rsl7611, en donde el paciente tiene una probabilidad incrementada de desarrollar AMD si el genotipo correspondiente comprende el alelo T (ile) .