RU2621863C2 - Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение - Google Patents
Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2621863C2 RU2621863C2 RU2014151193A RU2014151193A RU2621863C2 RU 2621863 C2 RU2621863 C2 RU 2621863C2 RU 2014151193 A RU2014151193 A RU 2014151193A RU 2014151193 A RU2014151193 A RU 2014151193A RU 2621863 C2 RU2621863 C2 RU 2621863C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chlamydia trachomatis
- dna
- reagent kit
- oligonucleotide
- seq
- Prior art date
Links
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 title claims abstract description 70
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 title claims abstract description 68
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 23
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 23
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 claims description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 51
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 206010061041 Chlamydial infection Diseases 0.000 description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 11
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 201000000902 chlamydia Diseases 0.000 description 4
- 208000012538 chlamydia trachomatis infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 3
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000025609 Urogenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006374 Uterine Cervicitis Diseases 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 244000000007 bacterial human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010008323 cervicitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000013154 diagnostic monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 206010013990 dysuria Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000143 urethritis Diseases 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящая группа изобретений относится к медицине. Предложен набор реагентов для выявления Chlamydia trachomatis в образце, включающий два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции (ПЦР), и применение указанного набора для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце. Предложенный набор включает первый олигонуклеотидный праймер с последовательностью SEQ ID NO:2, и второй олигонуклеотидный праймер с последовательностью SEQ ID NO:3, а также, при необходимости, включает олигонуклеотидный зонд, термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты. Набор позволяет эффективно выявлять клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара Chlamydia trachomatis с помощью единственной мишени ПЦР при использовании двух олигонуклеотидных праймеров, позволяющих получить продукт амплификации, который имеет размер, входящий в диапазон 70-110 пар нуклеотидов, и обеспечивающих амплификацию фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, лежащего внутри участка критической плазмиды Chlamydia trachomatis с последовательностью SEQ ID NO:1. Группа изобретений может быть использована в лабораторной диагностике Chlamydia trachomatis. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.
Description
Область техники
Группа изобретений относится к медицине, более конкретно к лабораторной диагностике и может быть использована для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.
Уровень техники
Chlamydia trachomatis - облигатный внутриклеточный бактериальный патоген человека. Инфекция Chlamydia trachomatis (хламидиоз) является самой распространенной бактериальной инфекцией, передаваемой половым путем, инфицируя ежегодно свыше 90 миллионов человек [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010].
В настоящее время в пределах вида Chlamydia trachomatis выделяют 3 биовара и множество сероваров и генотипов: биовар трахома (серовары А-С), урогенитальный биовар (серовары D-K) и биовар венерическая лимфогранулема (ЛГВ, серовары L1-L3) [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. Представители урогенитального биовара Chlamydia trachomatis могут являться причиной воспалительных заболеваний урогенитального тракта у мужчин и женщин, таких как уретриты, цервициты, эпидидимиты. Однако до 90% случаев урогенитального хламидиоза у женщин и более 50% случаев урогенитального хламидиоза у мужчин имеют бессимптомное течение [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. Инфекции, протекающие бессимптомно, часто остаются не диагностированными и, следовательно, пациентам не назначается адекватная терапия в течение длительного периода времени. В отсутствие лечения хламидийная инфекция приводит к таким серьезным последствиям, как воспалительные заболевания органов малого таза у женщин, патология беременности, мужское и женское бесплодие, пневмония и конъюнктивит у новорожденных [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010; Jaton K. et al. A novel real-time PCR to detect Chlamydia trachomatis in first-void urine or genital swabs. J Med Microbiol. 2006 Dec; 55(Pt 12): 1667-1674].
В связи с затрудненной клинической диагностикой трудно переоценить важность надежной и эффективной лабораторной диагностики хламидийной инфекции.
Традиционные методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций - бактериоскопический (микроскопический), бактериологический (культуральный) и иммунологический (серологический) - в настоящее время утратили свое доминирующее положение для диагностики Chlamydia trachomatis в развитых странах. Европейское руководство 2010 года по ведению больных с инфекциями, вызванными Chlamydia trachomatis, признает основными методами диагностики современные молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) [Lanjouw Ε. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. Наибольшее распространение среди МАНК получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Существует большое количество «in house» («домашних») и серийно выпускаемых (коммерческих) наборов реагентов (тест-систем) для выявления ДНК Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции. Наборы различаются генами-мишенями для ПЦР, способами детекции продуктов амплификации, размерами продуктов амплификации, количеством одновременно выявляемых патогенов - от одного до семи [Gimenes F. et al. Sensitive simultaneous detection of seven sexually transmitted agents in semen by multiplex-PCR and of HPV by single PCR. PLoS One. 2014 Jun 12; 9(6): e98862. doi: 10.1371/journal.pone.0098862. eCollection 2014].
Известен набор реагентов для обнаружения ДНК Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции ПОЛИМИК-ХЛ производства ООО НПФ «ЛИТЕХ» [Регистрационное удостоверение №ФСР 2007/00382 от 16.07.2007]. Детекция продуктов амплификации осуществляется методом гель-электрофореза.
Известны наборы реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции ХЛАМИ-ГЕН производства ООО «НПО ДНК-Технология» [Регистрационное удостоверение №ФСР 2008/03890 от 26.04.2010]. Наборы производятся в трех модификациях, различающихся способами детекции продуктов амплификации: детекция методом гель-электрофореза, флуоресцентная детекция по конечной точке и флуоресцентная детекция в режиме реального времени.
В исследовании, посвященном сравнительной оценке тест-систем отечественного производства для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, сообщается, что в наборе реагентов производства ООО НПФ «ЛИТЕХ» в качестве мишени для ПЦР используется криптическая плазмида, а в наборах реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология» в зависимости от способа детекции используются различные мишени: в наборе с детекцией методом гель-электрофореза в качестве мишени используется криптическая плазмида, а в наборе с флуоресцентной детекцией по конечной точке и в режиме реального времени используется ген 16S rRNA [Shipitsyna Ε. et al. First evaluation of six nucleic acid amplification tests widely used in the diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2009 Mar; 23(3): 268-276]. Однако более детальная информация, касающаяся конкретных фрагментов мишеней, размеров продуктов амплификации, нуклеотидных последовательностей используемых в наборах олигонуклеотидных праймеров и зондов, по сведениям авторов настоящих изобретений, не опубликована в общедоступных источниках информации.
На российском рынке присутствуют наборы реагентов (тест-системы) производства компании Roche Molecular Systems, Inc. серии COBAS® AMPLICOR: для выявления ДНК одного патогена - Набор реагентов для детекции ДНК Хламидии Трахоматис (Cobas Amplicor Chlamydia trachomatis Detection kit), для одновременного выявления двух патогенов - Набор реагентов для амплификации Хламидии Трахоматис и Нейссерии Гонореи (Amplicor CT/IMG Amplification kit) [Регистрационное удостоверение №ФСЗ 2011/09814 25.05.2011]. В наборах реализован принцип флуоресцентной детекции по конечной точке с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя SYBR GREEN. В данных наборах в качестве мишени для выявления Chlamydia trachomatis используется криптическая плазмида, и более конкретно фрагмент плазмиды в открытой рамке считывания ORF1 [ЕР 0420260 В1, ЕР 0630971 В1, ЕР 0875583 В1].
Данные тест-системы были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration) и были рекомендованы ВОЗ в качестве референсных тест-систем при валидации новых и модифицированных тест-систем [ПРОТОКОЛЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ ВЫЗВАННОЙ CHLAMYDIA TRACHOMATIS, (УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ) В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (проект), www.cnikvi.ru/files/xlamidioz.doc], что свидетельствует об их надежности. Однако в 2007 году были обнаружены новые мутантные штаммы Chlamydia trachomatis (nvCT), содержащие делецию размером 377 пар нуклеотидов именно в том фрагменте ORF1 криптической плазмиды, который является мишенью полимеразной цепной реакции в данных диагностических наборах [Ripa Т. and Nilsson Р.Α. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing false-negative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis. 2007 May; 34(5): 255-256]. Новые мутантные штаммы получили название «шведский вариант» по месту их обнаружения. Невозможность обнаружения данных штаммов наборами серии COBAS® AMPLICOR и другими наборами со сходной мишенью привело к тысячам ложноотрицательных результатов в диагностике хламидийной инфекции, что, вероятно, способствовало распространению мутантных штаммов [Steensels D. et al. Towards multitarget testing in molecular microbiology. Int J Microbiol. 2013; 2013:121057. doi: 10.1155/2013/121057. Epub 2013 Nov 25. Review].
Одним из путей решения проблемы «ухода» новых «шведских вариантов» Chlamydia trachomatis от обнаружения является введение дополнительной мишени для ПЦР в рамках одной тест-системы. Так, усовершенствованный набор реагентов для выявления Chlamydia trachomatis COBAS® TaqMan® CT Test, v2.0 [Регистрационное удостоверение №ФСЗ 2010/07038] компании Roche Molecular Systems, Inc. содержит реагенты для амплификации и детекции в режиме реального времени двух мишеней Chlamydia trachomatis: помимо вышеупомянутого фрагмента криптической плазмиды, также хромосомного гена оmр-1, кодирующего основной белок внешней мембраны (МОМР). Такой подход, несомненно, повышает надежность выявления Chlamydia trachomatis (снижает количество ложноотрицательных результатов), однако усложняет и удорожает анализ, повышая требования к лабораторному оборудованию (а именно к числу каналов детекции прибора). Кроме того, данный подход - увеличение количества мишеней для выявления одного патогена - снижает возможности одновременного выявления нескольких патогенов в одной пробирке на имеющемся в лаборатории оборудовании, что не вполне отвечает современным потребностям лабораторной диагностики урогенитальных заболеваний, часто протекающих по типу микст-инфекций.
Сущность группы изобретений.
Задачами настоящей группы изобретений являются: разработка и валидация набора реагентов, позволяющего выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара Chlamydia trachomatis (в том числе nvCT) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции, с возможностью как самостоятельного использования для выявления ДНК одного патогена - Chlamydia trachomatis, так и в составе мультиплексного набора для выявления ДНК нескольких патогенов, с возможностью количественного определения ДНК Chlamydia trachomatis; расширение арсенала тест-систем для выявления ДНК Chlamydia trachomatis.
В рамках настоящих изобретений в качестве мишени для полимеразной цепной реакции была выбрана криптическая плазмида Chlamydia trachomatis. Плазмида мультикопийна, то есть содержится в количестве 4-8 копий на клетку, что повышает аналитическую чувствительность тест-систем с данной мишенью по сравнению с тест-системами с однокопийными хромосомными мишенями. Кроме того, последовательность криптической плазмиды высококонсервативна: вариабельность среди представителей различных сероваров внутри одного биовара составляет менее 1% [Comanducci м. et al. Diversity of the Chlamydia trachomatis common plasmid in biovars with different pathogenicity. Plasmid. 1990 Mar; 23(2): 149-154], что делает эту мишень подходящей для выявления всех клинически значимых сероваров урогенитального биовара Chlamydia trachomatis при условии выбора фрагмента для амплификации с учетом данных о положении делеции в криптической плазмиде nvCT.
На основании анализа «выравниваний» нуклеотидных последовательностей криптических плазмид Chlamydia trachomatis из GenBank и имеющихся литературных данных о положении делеции в криптической плазмиде nvCT («шведских вариантов» Chlamydia trachomatis) был определен высококонсервативный участок внутри открытой рамки считывания 8 (ORF8) криптической плазмиды, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, в качестве оптимальной «площадки» для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК внутри этой «площадки».
Помимо участка для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis в рамках настоящих изобретений экспериментальным путем был определен оптимальный размер этого фрагмента (продукта амплификации) - от 70 до 110 пар нуклеотидов. Оказалось, что амплификация фрагментов такого размера обладает минимальной восприимчивостью как к примесям-ингибиторам ПЦР, так и к конкуренции со стороны других ПЦР мишеней. Последнее в свою очередь расширяет возможности мультиплексирования ПЦР, то есть одновременного выявления двух и более патогенов в одной реакции (в одной пробирке).
Таким образом поставленные задачи решены созданием набора реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце методом полимеразной цепной реакции, включающего по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции, отличающего тем, что указанные два олигонуклеотидных праймера обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, лежащего внутри участка криптической плазмиды Chlamydia trachomatis последовательности SEQ ID NO:1, причем размер фрагмента составляет от 70 до 110 пар нуклеотидов.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO:3.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO:3.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит олигонуклеотидный зонд для детекции фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis в режиме реального времени, где указанный зонд на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на 3'-конце содержит гаситель флуоресценции.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что флуоресцентный краситель выбран из группы: JOE, FAM, R6G, ROX, Су5, Су5.5, HEX.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что гаситель флуоресценции выбран из группы: BHQ1, BHQ2, BHQ3, RTQ.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO:4.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность SEQ ID NO:4.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит по меньшей мере один калибратор для количественной оценки содержания ДНК Chlamydia trachomatis в образце, содержащий известные концентрации фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, используемого для выявления ДНК Chlamydia trachomatis.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит реагенты для выявления в образце методом мультиплексной полимеразной цепной реакции ДНК по меньшей мере одного дополнительного микроорганизма, выбранного из группы: Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что биологический образец для проведения исследования выбран из группы: мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, соскоб из уретры, соскоб из цервикального канала.
Объем притязаний включает также применение вышеописанных наборов реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.
Группа изобретений позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара Chlamydia trachomatis (в том числе nvCT) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет определять ДНК Chlamydia trachomatis в количественном формате, что может быть полезно для уточнения диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа. Кроме того, уровень бактериальной нагрузки может иметь патогенетическое и прогностическое значение и оказывать влияние на выбор тактики этиотропной терапии. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет выявлять одновременно несколько возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, что может быть полезно для диагностики часто встречающихся микст-инфекций урогенитального тракта.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления группы изобретений
Пример 1. Выявление (качественное определение) ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.
В исследование были включены 127 пациентов мужского пола с жалобами на наличие зуда/жжения в области половых органов и/или дизурии. От каждого пациента получали по два биологических образца - соскоба из уретры. Взятые у пациентов уретральные образцы помещали в 1 мл сахарозо-фосфатного буфера. Первый образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием двух референсных наборов реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis - COBAS® AMPLICOR (Roche Molecular Systems, Inc., США) и Light-Mix 480 HT (TIB MOLBIOL, Германия). Второй образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием набора реагентов по изобретению. Далее проводилось сопоставление результатов, полученных тремя наборами реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis.
Исследование образцов с использованием двух референсных наборов реагентов.
Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов MagNa Pure LC DNA Isolation kit I (Roche Molecular Biochemicals, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Объем элюции составил 100 мкл, далее образец разводили в 2 раза, добавляя еще 100 мкл буфера. Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 50 мкл полученного элюата. Постановку полимеразной цепной реакции и интерпретацию результатов исследования осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.
Исследование образцов с использованием набора реагентов по изобретению.
Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов ДНК-Сорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №102-22). До выделения ДНК в пробирки вносили по 10 мкл препарата внутреннего контрольного образца (ВКО). Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 10 мкл полученного элюата (объем полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл).
Реакционную смесь для полимеразной цепной реакции готовили следующим образом. Сначала готовили ПЦР-смесь-1, содержащую олигонуклеотидные праймеры, олигонуклеотидные зонды для детекции и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в буфере ТЕ. Состав ПЦР-смеси-1 приведен в таблице 1.
Затем в каждую реакционную пробирку вносили по 10 мкл ПЦР-смеси-1, по 5 мкл ПЦР-смеси-2 red (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №863), содержащей Taq-полимеразу, и по 10 мкл элюата, полученного при выделении ДНК из биологических образцов.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» (QIAGEN, Германия).
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализировались с помощью программного обеспечения прибора «Rotor-Gene Q». Сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, детектировался по каналу Green, ДНК ВКО детектировался по каналу Yellow. Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.
Результаты интерпретировались следующим образом:
- ДНК Chlamydia trachomatis обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green определено значение порогового цикла Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
- ДНК Chlamydia trachomatis не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу Yellow определено значение порогового цикла Ct, не превышающее 33.
- Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) или превышает 33 значение порогового цикла Ct по каналу для детекции Yellow и не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу Green.
Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в таблице 2.
Было получено 100%-ное совпадение при тестировании набора по изобретению относительно двух референсных наборов реагентов. Таким образом, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, прогностическое значение положительного результата и прогностическое значение отрицательного результата набора по изобретению составили 100%.
Также было продемонстрировано, что набор по изобретению позволяет достоверно выявлять наличие ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах методом мультиплексной полимеразной цепной реакции одновременно с выявлением ДНК других возбудителей инфекций, передаваемых половым путем: Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.
Пример 2. Количественное определение ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах.
Проводили исследование биологических образцов, описанных в примере 1, с использованием дополнительного набора реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis ХЛАМИ-ГЕН (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в таблице 3. При анализе результатов исследования выявлен дискордантный образец №84.
Далее все образцы, в которых была выявлена ДНК Chlamydia trachomatis, исследовали методом количественной полимеразной цепной реакции с применением набора по изобретению.
Количественное определение ДНК микроорганизма основывается на существовании линейной зависимости между циклом начала увеличения флуоресценции образца (пороговый цикл, Cycle threshold, Ct) и исходной концентрацией ДНК-мишени. Для реализации количественного определения в реакции амплификации параллельно используются ДНК-калибраторы - образцы с известной концентрацией ДНК Chlamydia trachomatis. По результатам амплификации ДНК-калибраторов выстраивается калибровочная прямая, по которой происходит определение концентрации ДНК Chlamydia trachomatis в образцах.
Калибраторы (К1 и К2) готовили путем разведения стандартного образца производства (СОП) №86 Chlamydia trachomatis ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, содержащего фрагмент криптической плазмиды Chlamydia trachomatis, клонированный по сайтам EcoRI в плечи фага λ - λgt10. Для разведения исходного СОП используется ДНК-буфер с poly(A). Конечная концентрация для калибратора К1 составляет 1*106 ГЭ/мл; для калибратора К2 - 1*104 ГЭ/мл.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» (QIAGEN, Германия). Значения пороговых циклов калибраторов и исследуемых образцов анализировались программой автоматического учета результатов. В соответствии с этими значениями автоматически была построена калибровочная прямая и рассчитаны концентрации ДНК Chlamydia trachomatis в исследованных уретральных образцах от 16 пациентов (таблица 4).
Установлено, что в дискордантном образце концентрация ДНК Chlamydia trachomatis самая низкая из всех исследованных образцов и составляет 6,52Е+02 ГЭ/мл. Данная концентрация ДНК С.trachomatis лежит ниже границы аналитической чувствительности набора реагентов ХЛАМИ-ГЕН, что и объясняет получение отрицательного результата при исследовании с использованием этого набора.
Количественное определение ДНК Chlamydia trachomatis может быть полезно для различных клинико-лабораторных и научно-исследовательских целей, таких как уточнение диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа, определении чувствительности различных методов диагностики, мониторинга эффективности терапии. Наконец, количественное определение возбудителя может иметь большое значение в выборе тактики этиотропной терапии, поскольку существуют основания полагать [Horner P. The case for further treatment studies of uncomplicated genital Chlamydia trachomatis infection. Sex Transm Infect. 2006 Aug; 82(4): 340-343], что рецидив хламидийной инфекции, не связанный с повторным инфицированием после проведенной антибактериальной терапии, вызван развитием гетеротипической устойчивости в результате высокой бактериальной нагрузки до начала лечения.
Claims (9)
1. Набор реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце, включающий по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции и, при необходимости, олигонуклеотидный зонд, термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты, отличающийся тем, что первый олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, второй олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
2. Набор реагентов по п. 1, характеризующийся тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой олигонуклеотидный зонд для детекции ДНК Chlamydia trachomatis в режиме реального времени, где указанный зонд на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на 3'-конце содержит гаситель флуоресценции.
3. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный флуоресцентный краситель выбран из группы: JOE, FAM, R6G, ROX, Су5, Су5.5, HEX.
4. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный гаситель флуоресценции выбран из группы: BHQ1, BHQ2, BHQ3, RTQ.
5. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд имеет последовательность SEQ ID NO: 4.
6. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд представляет собой (FAM)-CCCCGCACGTGCTTCGAGCAACCGCG-(BHQ1).
7. Набор реагентов по п. 2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд представляет собой (JOE)-CCCCGCACGTGCTTCGAGCAACCGCG-(BHQ1).
8. Набор реагентов по п. 1, характеризующийся тем, что указанный образец выбран из группы: мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, соскоб из уретры, соскоб из цервикального канала.
9. Применение набора реагентов по любому из пп. 1-8 для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в образце методом полимеразной цепной реакции.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA2014000136 | 2014-11-14 | ||
| EA201401195 | 2014-11-14 | ||
| EA201401195A EA028686B1 (ru) | 2014-11-14 | 2014-11-14 | Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014151193A RU2014151193A (ru) | 2016-07-10 |
| RU2621863C2 true RU2621863C2 (ru) | 2017-06-07 |
Family
ID=56080128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014151193A RU2621863C2 (ru) | 2014-11-14 | 2014-12-18 | Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA028686B1 (ru) |
| RU (1) | RU2621863C2 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110923345B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-06-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种沙眼衣原体检测胶体金层析试剂盒及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0875583A2 (en) * | 1989-09-29 | 1998-11-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Primers and kits for the detection of Chlamydia trachomatis |
| US20070065837A1 (en) * | 2005-09-21 | 2007-03-22 | Qiagen Diagnostics Gmbh | Methods and compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| WO2007056398A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Chlamydia trachomatis specific oligonucleotide sequences |
| RU2385946C1 (ru) * | 2008-12-26 | 2010-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1224253B (it) * | 1988-04-08 | 1990-09-26 | Sclavo Spa | Oligonucleotidi sintetici utili per la determinazione di chlamydia trachomatis in un campione biologico |
| RU2245369C1 (ru) * | 2003-05-05 | 2005-01-27 | Смоленская государственная медицинская академия | Способ дифференциальной диагностики представителей семейства chlamydiaceae |
| RU2385945C1 (ru) * | 2008-12-26 | 2010-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления |
| RU2443782C1 (ru) * | 2010-08-03 | 2012-02-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Способ генотипирования chlamydia trachomatis |
-
2014
- 2014-11-14 EA EA201401195A patent/EA028686B1/ru unknown
- 2014-12-18 RU RU2014151193A patent/RU2621863C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0875583A2 (en) * | 1989-09-29 | 1998-11-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Primers and kits for the detection of Chlamydia trachomatis |
| US20070065837A1 (en) * | 2005-09-21 | 2007-03-22 | Qiagen Diagnostics Gmbh | Methods and compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| WO2007056398A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Chlamydia trachomatis specific oligonucleotide sequences |
| RU2385946C1 (ru) * | 2008-12-26 | 2010-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201401195A1 (ru) | 2016-05-31 |
| EA028686B1 (ru) | 2017-12-29 |
| RU2014151193A (ru) | 2016-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7072385B2 (ja) | ニューモシスチス肺炎を診断、予測又はモニタリングするための手段 | |
| CN103866034A (zh) | 一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| Shipitsyna et al. | Evaluation of polymerase chain reaction assays for the diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia | |
| US20220136046A1 (en) | Detection and antibiotic resistance profiling of microorganisms | |
| CN109825615A (zh) | 沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN103409508A (zh) | 一种淋球菌/解脲支原体/沙眼衣原体三重核酸检测试剂盒 | |
| CN106148506A (zh) | 一种b族链球菌荧光定量pcr产前检测试剂盒及其应用 | |
| Schmitt et al. | Bead-based multiplex sexually transmitted infection profiling | |
| KR101848037B1 (ko) | 질 내 미생물을 포함하는 조성물 | |
| RU2646123C1 (ru) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К РЕЗИСТЕНТНОСТИ У Mycoplasma genitalium И Mycoplasma pneumoniae К МАКРОЛИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ | |
| CN110373485A (zh) | 一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒 | |
| Gal et al. | Application of a polymerase chain reaction to detect Burkholderia pseudomallei in clinical specimens from patients with suspected melioidosis | |
| CN103333903A (zh) | 检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒 | |
| CN108796105A (zh) | 羊贾第虫与隐孢子虫双重pcr检测试剂盒及其方法 | |
| JP2013504319A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ及び／又はクラリスロマイシン抵抗性を検出するためのペプチド核酸プローブ、キット及び方法、及びその使用 | |
| Shipitsyna et al. | Evaluation of six nucleic acid amplification tests used for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia compared with an international strictly validated real-time porA pseudogene polymerase chain reaction. | |
| RU2621863C2 (ru) | Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение | |
| CN102409102A (zh) | 一种鉴别牛分枝杆菌的pcr引物及方法 | |
| Mania‐Pramanik et al. | Diagnosis of Chlamydia trachomatis infection | |
| RU2486255C1 (ru) | ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК БАКТЕРИЙ, ОТНОСЯЩИХСЯ К СЕМЕЙСТВУ Chlamydiaceae | |
| CN102080123A (zh) | 性传播疾病检测试剂盒 | |
| RU2715333C1 (ru) | Набор реагентов для выявления и идентификации днк возбудителей бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции в реальном времени "ом-скрин-бруцеллез-рв" | |
| US20240068058A1 (en) | HPV Detection from urine analyte in male, non-binary and transgender patients | |
| CN104278080A (zh) | 一种快速检测沙眼衣原体的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用 |