KR101848037B1 - 질 내 미생물을 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험성을 예측하거나 진단할 수 있는 마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 검체 시료로부터 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 검출함으로써, 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험성의 예측 또는 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

Description

질 내 미생물을 포함하는 조성물{Compositions of human vaginal microbiota}
본 발명은 질 내 미생물을 활용하여 여성 생식기 관련 질환 또는 비만의 위험도 예측 또는 진단을 위한 바이오 마커 선정 및 이의 이용에 관한 것이다.
전 세계적으로 여성 인구의 3/4이 살아가면서 세균성 질염을 포함한 염증성 여성 질환의 감염을 겪으며, 이 중 50%는 재발을 경험하는 것으로 보고된다. 또한, 여성 질염의 60% 이상이 무증상 감염에 해당하며, 항생제, 스트레스, 폐경기 이후의 호르몬 변화 등을 겪으며 질염에 대한 감수성이 크게 증가하게 된다.
감염에 의한 질염은 크게 3가지 주요 원인으로 나뉘는데, 세균성 질염(Bacterial vaginosis, BV), 칸디다증 (Candida vaginitis, CV), 트리코모나스 질염(Trichomonas vaginalis)이다. 이 중 세균성 질염은 최근 가장 흔한 질염으로 인식되고 있으며, 세균성 질염 환자로부터 분리한 질 분비물에서는 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae), 메가스페라(Megasphaera) 속, 가드네렐라(Gardnerella vaginalis), 에게르텔라(Eggerthella) 속, 클로스트리듐-유사(Clostridium-like) 속, 프리보텔라 비비아(Prevotella bivia), 펩토스트렙토코커스 미크로스(Peptostreptococcus micros) 등이 발견된 것으로 보고된 바 있으며, 특히 가드너렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)는 세균성 질염의 주요 원인균으로 알려져 있다.
여성의 질 내 균총은 인종, 연령, 임신/출산/수유, 병원체 감염 여부, 생활 습관, 면역 및 대사능 이상과 같은 다양한 인자의 영향을 받는다. 특히 질염을 비롯한 대표적 여성 질환을 앓고 있는 경우, 정상 질 내 균총 군집 구조에 유의적인 변화가 나타나며 파괴된 균총 균형의 회복이 여성 질환의 예방과 치료에 필수적이다. 건강한 여성의 질 내 우점균인 락토바실러스 (Lactobacillus) 그룹 유형 (성인 여성 정상 균총을 5개 그룹으로 세분화) 및 질 내 환경의 산성도와 같은 주요 지표들 역시, 인종 및 개인의 유전적 특성에 따라 차이를 보인다.
비만이란 불필요한 과다지방이 축적된 상태를 의미하며, 심혈관계 질환, 당뇨, 관절염, 고지혈증을 아우르는 폭넓은 합병증을 가지고 있다. 비만은 5D(disfigurement, discomfort, disability, disease, death)의 위험이 있으며, 여러 가지 합병증을 유발하고 결국 사망의 원인이 되므로 가능하면 예방하고, 비만하면 치료하여야 한다. 비만인은 여러 가지 증상으로 생산성이 낮아지며 지체부자유한 상태가 되므로 삶의 질에도 악영향을 미치며 비용효과 면에서도 이롭지 못하다.
차세대 염기서열 분석방법을 이용하는 마이크로비옴(또는, 세균) 분석을 통해 비배양성을 포함한 모든 미생물총의 분석으로 미생물의 종을 알아낼 수 있다. 이는 모든 박테리아에 공통적으로 존재하는 보존영역인 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA)과 초가변 영역 (hypervariable region)을 이용하여 미생물의 종을 알아내는 방법으로써 미생물 유전체의 다양성과 질환과의 연관성을 규명하는 연구가 시행되고 있다. 이러한 마이크로비옴 분석은 기존의 박테리아와 질병과의 연관성을 배양가능성이라는 제한에서 해방시켜 전체적인 관점에서 재조명시켰다는데 큰 발전을 가져왔으며 특히 장내 미생물과 비만의 역학관계를 입증시키기도 하였다. 구강 내 특정 박테리아 역시 염증성 장질환, 심혈관계 질환, 폐암 등과 연관성이 보고되어 구강에 한정되지 않는, 전신 질환에 관여될 수 있다는 가능성을 제기한다.
종래 인체 마이크로비옴과 건강과의 연관성 또는 기전에 관한 연구는 주로 장내 미생물을 대상으로 이루어왔다. 여성의 질 내 균총은 여성 생식기 건강에 직접적으로 연관이 있으며 인종별 다른 균총의 군집을 보유하는 것으로 보고되어 유전적인 영향 또한 클 것으로 추측되어 왔다. 현재까지 인체 마이크로비옴에 미치는 질환과 유전적 영향은 장내 마이크로비옴 한정적인 연구만을 이루어져 왔으며 여성 질 내 마이크로비옴에 관한 연구는 아직 보고된 바 없다.
본 발명은 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 여성 생식기 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물, 이를 포함하는 질 내 미생물을 이용한 여성 생식기 질환의 위험도 예측 또는 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 비만의 진단, 예방 또는 치료용 조성물, 이를 포함하는 질 내 미생물을 이용한 비만의 위험도 예측 또는 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
이에 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, 대용량 염기서열 분석을 이용하여 여성의 자궁 경부에 존재하는 균총을 파악하여 여성 생식기 질환 또는 비만과의 관련성을 검토하여, 이를 이용한 질환 또는 비만의 예방/치료용 조성물 또는 키트를 개발하였다.
본 발명의 일 예는 질 내 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 여성 생식기 질환의 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 또는 이를 포함하는 키트, 또는 여성 생식기 질환의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 질 내 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 비만의 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 또는 이를 포함하는 키트, 또는 비만의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에 의하면 여성의 질 내 마이크로비옴 (vaginal microbiome)을 이용하여 여성 생식기 질환 또는 비만을 예측, 예방, 진단, 치료 등에 활용할 수 있는 바이오 마커로 적용할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 여성 생식기 질환의 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물에 적용되는 여성 생식기 질환은 질염, 폐경, 자궁경부염증 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폐경 및/또는 질염이다.
또 다른 예로서, 본 발명은 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 비만의 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
비만이란 신체에 지방조직이 과잉 축적된 상태로, 남은 열량이 지방으로 전환되어 인체 내 피하조직이나 복부장간 막에 축적되는 현상으로서, 상기 본원발명의 조성물은 장 내 균주가 아니라 여성의 생식기에 분포된 균주를 사용하여 비만의 위험도 예측 또는 진단이 가능하다는 특징이 있으며, 특히 질 내의 균주를 사용하여 더욱 우수한 민감도로 비만의 위험도 예측 또는 진단을 할 수 있다.
상기 조성물의 검출 대상 미생물로서 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 가드네렐라 속 균주 및 락토바실러스 속 균주는 모두 여성의 질 내에서 유래한 미생물인 것을 특징으로 하며, 이에 따라 본 발명의 조성물은 여성의 질 내에서 채취된 시료에 적용되는 것을 특징으로 한 여성 생식기 질환의 위험도 예측 또는 진단용 조성물일 수 있다
바람직하게는 락토바실러스는 질내 우점종으로 젖산이나 살균정 물질을 분비함으로써 여성생식기를 유해균으로부터 보호한다. 프리보텔라균은 구강과 생식기 상재균으로 최근 연구에 의하면 질내 염증 반응과 직접적인 관계가 있는 것으로 보고되었다. 스니치아는 초기에 렙토트리키아 (Leptotrichia)와 함께 분류되었으나 따로 스니치아 속 균주로 분리되었으며 유산과 조산, 양막염, 질염 등 생식기 질환과 관련있는 것으로 보고되었다. 가드네렐라는 가드네렐라 배자이날리스 (G. vaginalis)를 유일한 종으로 가지고 있으며 초기에 Haemophilus vaginalis로 분류되었다가 후에 Corynebacterium vaginalis로 분류되었으며 최종적으로 가드네렐라 속으로 분류되었다. 그람음성 또는 그람 양성의 성질을 모두 가지고 있으며 여성 생식기 뿐만이 아닌 혈액, 소변, 인두 (pharynx)에서도 검출된 바 있다.
특히 질 내 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주 및 가드네렐라 속 균주는 여성 생식기 질환 또는 비만에 있어 질 내 균총 구조에서 우점종인 유익균 락토바실러스(Lactobacillus)와 음의 상관관계를 갖는 것으로 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단용 마커 또는 진단 마커"란 여성 생식기 질환 또는 비만인 상태와 그렇지 않은 않은 상태를 구분하는 기준이 되는 물질로, 정상 시료에 비하여 여성 생식기 질환 또는 비만을 가진 환자의 시료에서 증가 또는 감소를 보이는 각종 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 진단 조성물은, 여성 생식기 질환을 가진 환자와 비만인 환자의 시료에서 모두 특이적으로 높은 수준으로 발현되는 프리보텔라 속 균주를 말하며 해당 균주와 양의 상관관계를 가지는 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및/또는 가드네렐라 속 균주 미생물 또는 군집을 말한다.
종래 인체 마이크로비옴과 건강과의 연관성 또는 기전에 관한 연구는 주로 장내 미생물을 대상으로 이루어졌다. 여성의 질 내 균총은 여성 생식기 건강에 직접적으로 연관이 있으며 인종 별 상이한 균총의 군집을 보유하는 것으로 보고되어 유전적인 영향 또한 클 것으로 추측되어 왔다. 현재까지 인체 마이크로비옴에 미치는 질환과 유전적 영향은 장내 마이크로비옴 한정적인 연구만을 이루어져 왔으며 여성 질 내 마이크로비옴에 관한 연구는 아직 보고된 바 없었으나, 본원발명은 질 내에서 유래한 미생물을 시료로 하여 여성 생식기 질환 및 비만을 예측 또는 진단할 수 있다는 장점이 있다.
바람직하게는, 상기 검출할 수 있는 제제는 시료 내에서 여성 생식기 질환 또는 비만의 진단 마커인 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및/또는 가드네렐라 속 균주의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및/또는 가드네렐라 속 균주에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.
본 발명에서 미생물 검출 제제는, 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion),오우크 테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머이고, "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는 본 발명에서 사용되는 프라이머는 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및/또는 가드네렐라 속 균주의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다. 예를 들어 상기 프라이머는 하기 표 1의 프라이머일 수 있다.
구분 서열번호 서열(5'-->3')
505F/806R
정방향 프라이머		 1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA
505F/806R
역박향 프라이머		 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT
상기 16s rRNA 는, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분 상당히 보존되어 있는 한편 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.
상기 위험도 예측이란 피시험자가 여성 생식기 질환의 발병 또는 비만을 발생할 가능성이 있는지를 판별하는 것을 말하고, 여성 생식기 질환의 발병 또는 비만 발생 위험성이 높은 피시험자를 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상, 진단은 여성의 생식기 질환 또는 비만의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예는 질 내 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주, 가드네렐라 속 균주 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물로서, 상기 검출 특이도가 높인 균주를 모두 포함하여 여성 생식기 질환 또는 비만을 현저한 민감도로 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예로서, 본 발명의 상기 미생물 검출 제제를 포함하는 조성물은, 여성 생식기 질환 또는 비만 위험도 예측 또는 진단용 키트 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 해당 미생물들을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및/또는 항체의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
상기 여성 생식기 질환 또는 비만 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관한 사항은 여성 생식기 질환 또는 비만 위험도 예측 또는 진단용 키트에 적용될 수 있다.
구체적인 일례로, 본 발명에서 해당 미생물에 특이적인 프라이머를 포함하는 키트는, PCR 및 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함하는 키트 일 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 피시험자의 질 내에서 채취된 시료에 적용되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 상기 질 내에서 채취된 시료는 질 분비물 또는 양수 시료일 수 있고, 상기 질 분비물은 예를 들어 질 또는 자궁 경부로부터 채취될 수 있다.
상기 키트는 시료의 채취를 위한 질 분비물 또는 양수 시료 채취용 포집 기구를 포함하며, 상기 포집 기구는 브러쉬, 흡수성 패드, 면봉, 스포이드, 스왑, 주사기 및 양수 포집기로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 시료 채취용 포집 기구를 추가로 포함할 수 있으나, 질 내 미생물을 포함하는 시료를 포집할 수 있는 것이라면 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 키트는 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험도 예측 또는 진단을 위하여 피시험자의 시료를 질 내에서 채취할 것을 요구하는 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명은 질 내 미생물을 이용하여 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 질 내 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관하 사항은 상기 미생물을 검출하는 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
바람직하게 상기 방법은 (a) 피시험자의 질 내에서 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 게놈 DNA에 질 내 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주, 가드네렐라 속 균주 및 락토바실러스 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계를 포함하여 구현될 수 있다.
상기 단계 (a) 에서, "피시험자의 시료"란, 여성 생식기 질환 환자, 여성생식기 질환이 예상되는 사람, 비만 환자 또는 비만이 예상되는 사람의 몸에서 채취 된 것으로, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 예를 들어 피시험자의 질, 바람직하게는 질 또는 자궁 경부에서 채취된 조직 시료일 수 있다.
상기 단계 (b) 에서 피시험자의 시료로부터 게놈 DNA의 추출은 당업계에 알려진 일반적인 기술을 적용하여 수행할 수 있으며, 상기 단계 (c)에서 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및/또는 가드네렐라 속 균주에 특이적인 프라이머는 상기 설명한 바와 같다.
상기 단계 (c)에서 반응물을 증폭시키는 방법은 당업계에 알려진 일반적인 증폭 기술들, 예를 들어 중합효소 연쇄반응, SYBR 실시간 PCR, 역전사-중합효소 연쇄반응, 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 벡토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
또한 상기 단계 (c) 증폭 산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계(e)를 추가로 수행할 수 있으며, 피시험자 시료의 증폭 산물이 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하여 유의적으로 증가되거나 감소되었다고 판단될 경우, 해당 피시험자는 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험성이 예측되거나 여성 생식기 질환 또는 비만이 있는 것으로 판단할 수 있다.
바람직하게는, 피시험자 시료의 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및/또는 가드네렐라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 미생물에 대한 증폭산물이 정상 대조군 시료보다 높은 경우, 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 여성 생식기 질환 또는 비만이 있는 것으로 진단할 수 있다.
또한, 여성 생식기 질환 또는 비만에 있어 상기 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및/또는 가드네렐라 속 균주는 질 내 균총 중 유익균인 락토바실러스와 음의 상관관계를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 예로서, 여성 생식기 질환 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질 처리 전 및 처리 후 질 내에서 추출한 시료에서 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주, 가드네렐라 속 균주 및 락토바실러스 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 미생물의 변화를 검출하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 후 상기 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및 가드네렐라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물 검출량이 감소하거나, 상기 락토바실러스 속 균주의 검출량이 증가한 경우 상기 후보 물질을 여성 생식기 질환 예방 또는 치료제인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 여성 생식기 질환 또는 비만의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 포함한다.
상기 조성물에 관한 사항은 치료제 스크리닝 방법에 동일하게 적용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서는 여성 생식기 질환 또는 비만의 예방 또는 치료 후보물질의 존재 및 부재 하에서 질에서 채취된 시료 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주 및/또는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주의 변화를 비교하는 방법으로, 여성 생식기 질환 또는 비만 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는데 적용될 수 있다. 구체적으로, 여성 생식기 질환 또는 비만 예방 또는 치료 후보물질의 존재 및 부재 하에서 시료 내 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주, 가드네렐라 속 균주 및/또는 락토바실러스의 군집 형성 정도를 각각 측정하여 양자를 비교한 후, 후보물질이 존재 할 때 군집 형성이 더 감소하는 경우 해당 후보물질을 여성 생식기 질환 또는 비만의 예방 또는 치료제로 개발할 수 있다.
상기 후보물질이란 여성 생식기 질환 또는 비만의 예방 또는 치료제가 될 수 있는 각종 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 등), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 여성 생식기 질환 또는 비만의 위험성 예측 또는 진단을 위하여 질 내의 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주, 가드네렐라 속 균주 및/또는 락토바실러스를 신규 바이오 마커로 제공하며, 이를 이용하여 장내 미생물 대상으로 이루어지던 종래 연구 대비 더욱 우수한 민감성으로 질 내에 균총과 여성 생식기 건강 또는 비만의 예방 또는 치료용 신약 개발 및 제어의 타겟으로 활용할 수 있으며, 검출 민감도가 높은 균주를 조합하여 사용함으로써 여성 생식기 질환 또는 비만을 더욱 유용하게 예측 또는 진단할 수 있다.
도 1은 16S rRNA에 기반하여 분석된 폐경 여부(Premenopause/ Postmenopause), 질염(BV), 자궁경부염증(Cervicits), 자궁경부암(HPV), 및 비만(BMI≥30)에 따른 질 내 균총의 분포 변화를 나타낸 결과이다.
도 2는 질 내 균총의 구조를 유의하게 변화시킬 수 있는 임상 지표를 NMDS plot을 통해 나타낸 것이다.
도 3은 비만여부 및 폐경 전 후에 따른 질 내 균총의 다양성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 폐경 여부에 따른 특정 질내 균의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 질염 감염 여부에 따른 특정 질내 균의 변화를 나타낸 것이다.
도 6는 비만 여부에 따른 특정 질내 균의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 여성 호르몬 치료 여부에 따른 특정 질내 균의 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 자궁경부암 여부에 따른 특정 질내 균의 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 SparCC 소프트웨어를 이용하여 폐경 전 질 내 균총의 발생패턴을 확인한 결과이다.
도 10는 SparCC 소프트웨어를 이용하여 폐경 후 질 내 균총의 발생패턴을 확인한 결과이다.
도 11은 일반식이를 섭취한 일반쥐와 고지방식이를 섭취한 비만쥐의 질 내 균총 다양성을 분석 한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 식이에 따른 질 내 균총의 단변량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 고지방식이 쥐로부터 질 내 균총을 투여 받은 일반 식이 쥐의 혈액 내 리포다당류의 변화를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 연구대상 및 시료 수집
본 발명을 위해 한국인 쌍둥이 코호트에서 542명의 여성 일란성, 이란성 쌍둥이와 그의 가족들을 대상으로 자궁경부내 시료를 솔(브러쉬)로 채취하여 -80도에 냉동보관하였다. 냉동보관된 시료는 실험실로 옮겨 키트를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다.
실시예 2. 16S rRNA를 이용한 질 내 균총 분석
실시예 1에서 추출된 DNA는 박테리아의 V4 영역을 타깃으로 하는 아래 표1의 515F/806R 프라이머(서열번호 1 및 2) 를 이용하여 증폭된 후 Illumina사의 MiSeq 기기를 이용하여 염기서열 데이터가 생성하였다.
구분 서열번호 서열
정방향 1 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'
역박향 2 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'
생성된 대용량 염기서열 분석은 QIIME pipeline을 사용하여 질 내 세균의 전체 유전정보를 확인하여 질 내 균총의 구조를 파악 후 여러 가지 여성건강 지표와의 연관성을 관찰 하였다.
16S rRNA에 기반하여 분석된 질 내 균총을 폐경 여부, 질염, 자궁경부염증, 자궁경부암, 비만 요인으로 구분 지어 균총의 변화를 확인한 결과를 도 1에 나타내었으며, NMDS plot을 통해 질 내 균총과 건강 요인의 연관성을 분석한 결과 질 내 균총의 구조를 유의하게 변화시킬 수 있는 임상 지표는 폐경과 질염, 비만인 것으로 확인하였다(도 2).
또한, 비만의 경우 질 내 균총의 다양성을 증가시켰음을 확인하였으며(도 3), 이는 유익균인 락토바실러스 (Lactobacillus)가 우점종인 질 내 균총 구조에 비추어볼 때 비만으로 유도된 질 내 유해균 증가로 인한 여성 생식기 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
실시예 3. 질 내 균총과 여성 생식기 질환 또는 비만과의 상관관계 분석
혼란변수를 제어할 수 있는 MaAsLin 소프트웨어를 이용해 다변량 분석을 통한 여성 생식기 질환 또는 비만을 특정할 수 있는 구강박테리아를 규명하였다.
MaAsLin 소프트웨어를 사용하여 쌍둥이와 가족관계를 랜덤변수로, 다른 건강 요인을 보정변수로 지정 후 각각의 건강요인과 질 내 균총의 연관성을 분석하였으며, 그 결과를 도 4 내지 도 8에 나타내었다.
도 4, 도 5 및 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 프리보텔라 균이 여성 생식기 질환, 특히 폐경, 질염 및 자궁경부암 발생에 가장 큰 연관성이 있는 것으로 나타났다. 비만의 경우, 프리보텔라 균의 종 (species) 중 하나인 프리보텔라 코프리 (P. copri)가 비만과 두 번째로 큰 연관성이 있는 것으로 확인하였다(도 6).
NMDS plot에서 나타난 유의 요인인 폐경, 질염, 비만 이외에도 여성호르몬 테라피와 음의 상관관계 (r 상관계수 = -0.004, q-value: 0.18) (도면 7)와 HPV 감염(r 상관계수 = 0.1, q-value: 0.16) 과 유의한 양의 상관관계가 있는 것으로 규명되었다.
실시예 4. 질 내 균총의 네트워크 분석
질 내 균총의 여성 생식기 질환 또는 비만 그룹과 정상 그룹에 따른 발생패턴을 파악하기 위해 Sparse Correlations for Compositional data (SparCC) 소프트웨어를 이용해 네트워크 분석을 실시하였다.
그 결과 추가적인 네트워크 분석을 통해 질 내 균총의 상호관계를 관찰하였으며 폐경 전(도 9)과 폐경 후(도 10) 모두 프리보텔라가 락토바실러스와 가장 강한 음의 상관관계를 가진 것으로 밝혀졌다.
실시예 5. 여성 질 내 균총 및 비만의 관계 확인을 위한 동물 실험
비만과 여성 질 내 균총의 관계를 규명하기 위해 동물실험을 실시하였다. 6주령의 C57BL/6J 쥐에게 12주간 고지방 식이를 먹인 후 일반 식이를 먹인 쥐의 질 내 균총을 분석하였다.
고지방식이를 섭취한 비만 쥐의 질 내 균총을 분석 한 결과 질 내 균총의 다양성이 증가하였음을 확인하였다(도 11). 구체적으로, 식이에 따른 질 내 균총의 단변량 분석 결과 인간 질 내 환경 중 유해군이라고 알려진 그람 음성 균인 프리보텔라, 스니시아, 메가스패라, 및 가드네렐라 속 균주가 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 12).
추가로, 비만으로 변화된 질 내 균총이 숙주에게 미치는 영향을 규명하기 위해 고지방식이를 섭취한 비만 쥐의 질 내 균총을 수득하여 일반식이를 한 쥐의 질 내에 5번 투여하였다. 쥐의 혈액을 수득하여 박테리아의 그람 음성균의 세포벽을 구성하는 리포다당류(lipopolysaccharide)를 측정한 결과를 도 13에 나타내었으며, 고지방식이 쥐로부터 질 내 균총을 투여 받은 일반 식이 쥐의 혈액 내에서 리포다당류가 유의하게 증가함을 확인하였다. 이는 비만에 의해 유도된 그람음성의 유해균이 전체적인 신체에 유해한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Compositioon of Human Vaginal Microbiota <130> DPP20162200 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> 505F/806R forward primer <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atggtaattg tgtgccagcm gccgcggtaa 60 60 <210> 2 <211> 56 <212> DNA <213> 505F/806R reverse primer <400> 2 caagcagaag acggcatacg agatagtcag tcagccggac tachvgggtw tctaat 56

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  16. 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 및 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하며,
    대상 시료 내 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및 가드네렐라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물에 대한 증폭산물의 양이, 정상 대조군 시료내 균주의 증폭산물 보다 많은 경우, 비만의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 비만이 있는 것으로 진단하는 것인,
    비만의 위험도 예측 또는 진단용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체인, 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항의 조성물을 포함하는, 질 내 미생물을 이용한 비만의 위험도 예측 또는 진단용 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 키트는 피 시험자의 질 내에서 채취된 시료에 적용되는 것을 특징으로 하는, 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 질 내에서 채취된 시료는 질 분비물 또는 양수 시료인 것인, 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 질 분비물은 질 또는 자궁 경부로부터 채취하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  22. 제20항에 있어서, 상기 키트는 시료의 채취를 위한 포집 기구를 포함하며, 상기 포집 기구는 흡수성 패드, 면봉, 스포이드, 스왑, 주사기 및 양수포집기로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 시료 채취용 포집 기구를 추가로 포함하는 것인, 키트.
  23. 질 내 미생물을 이용하여 비만의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    채취된 시료에서 질 내 프리보텔라(Prevotella) 속 균주, 스니시아(Sneathia) 속 균주, 메가스패라(Megasphaera) 속 균주, 및 가드네렐라(Gardnerella) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 질 내 미생물을 검출하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    (a) 질 내에서 채취된 시료에서 질 내 미생물을 검출하기 위해 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 게놈 DNA에 질 내 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주, 및 가드네렐라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계;
    (c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계;
    (d) 상기 증폭 산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계; 및
    (e) 시료의 상기 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및 가드네렐라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물에 대한 증폭산물이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 비만의 위험성이 있는 것으로 예측하거나 비만이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 질 내에서 채취된 시료는 피 시험자의 질 내에서 채취된 질 분비물 및 양수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 방법.
  26. 삭제
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  29. 질 내에서 채취된 시료에 비만의 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질 처리 전 및 처리 후 질 내에서 채취된 시료에서 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주, 및 가드네렐라 속로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 미생물의 변화를 검출하는 단계; 및
    상기 후보물질 처리 후 상기 프리보텔라 속 균주, 스니시아 속 균주, 메가스패라 속 균주 및 가드네렐라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물 검출량이 감소하는 경우 상기 후보 물질을 비만 예방 또는 치료제인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 채취된 시료에서 비만 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
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