KR101522398B1 - 인유두종바이러스 감염 및 자궁경부암 진단용 조성물 - Google Patents

인유두종바이러스 감염 및 자궁경부암 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV) 감염 또는 이로 인한 자궁경부암을 진단할 수 있는 마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 검체 시료로부터 스니치아(Sneathia), 다이아리스터(Dialister), 및 메가스페라(Megasphaera) 중 하나 이상의 미생물을 검출함으로써, HPV의 감염 또는 이로 인한 자궁경부암을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

Description

인유두종바이러스 감염 및 자궁경부암 진단용 조성물 {Composition for diagnosing human papillomavirus infection and cervical cancer}
본 발명은 인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV) 감염 또는 이로 인한 자궁경부암을 진단할 수 있는 마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 검체 시료로부터 스니치아(Sneathia), 다이아리스터(Dialister), 및 메가스페라(Megasphaera) 중 하나 이상의 미생물을 검출함으로써, HPV의 감염 또는 이로 인한 자궁경부암을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
자궁경부암은 자궁경부에서 발생하는 악성종양을 의미한다. 자궁경부암은 전체 자궁암 발생빈도의 95%를 차지하고 있으며, 전세계의 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생 빈도가 높다. HPV 는 자궁경부 상피내 종양(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)과 자궁경부 선암(cervical adenocarcinoma)을 발생시키는 중요한 성 매개 유발 인자인데, 특히 자궁경부암 여성의 대다수가 고위험성 HPV 와 밀접한 관련성이 있고 자궁경부암의 여성의 99%에서 HPV 가 검출된다. 여성에서 HPV의 유병률(Prevalence rate)은 유럽에서 8.1%부터 아프리카의 22.1%에 이르기까지 10.4% 정도로 추정된다.
이러한 자궁경부암의 치료에는 장기간이 소요되고 단계적으로 발생하기 때문에, 발병 중간 단계인 전암 단계 병변을 조기에 효과적으로 진단하면 암으로 완전히 발생되기 전에 치료가 가능하여 자궁경부암을 예방할 수 있다. 따라서, 자궁경부암을 야기하는 HPV를 효과적으로 검출하는 진단 기술이 질병의 진단, 예방 및 치료를 위해 매우 중요하다.
자궁경부암 및 HPV 감염 진단을 위해 현재 가장 많이 쓰이는 방법으로는 자궁세포진 검사(Papnicolaou Smear, Pap) 방법이 있다. 그러나, 이 검사법은 검사자의 경험과 숙련도에 많은 의존을 해야 하고, 그 때문에 정확도가 떨어진다는 단점을 가지고 있다. 또한, 질확대경을 이용한 검사 방법도 사용되고 있으나, 숙련된 기술자와 고가의 장비가 필요하며, HPV의 유전자형을 구별할 수 없다는 단점이 있다. 이러한 종래 진단 기술의 단점을 보완하기 위하여 PCR, HC, DNA chip 등을 이용한 HPV 특이적 DNA 증폭을 통해 자궁경부암 전암 단계를 진단하고 유전자형을 확인하는 방법들의 연구가 계속 진행되고 있다.
또한, HPV 감염 및 자궁경부암 진단에 관한 종래의 특허 기술로, 국내공개출원 제2010-0037710호는 자궁경부암 세포에서 특정 유전자의 CpG섬 부위가 특이적으로 메틸화되는 것을 검출하여 자궁경부암 진단을 위한 정보를 제공하고 있고, 국내등록특허 제10-1152840-00-00호는 HPV 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법에 관한 정보를 제공하며, 국내등록특허 제10-0741370호는 HPV DNA를 검출하는 진단용 키트의 표준 양성 물질에 관한 정보를 제공하고 있다.
그러나, HPV 감염 및 자궁경부암 진단 기술에 대한 지속적인 연구에도 불구하고, 아직 뚜렷한 결과물은 없는 실정이다. 아울러, 지금까지의 진단 기술은 HPV 관련 유전자들의 분자생물학적 검출에 대한 것이 대부분이며, 질내 미생물 군집(vaginal microbiota)과 HPV 감염 간의 관련성을 규명하고 이를 자궁경부암 진단에 활용하고자 하는 목적의 연구는 거의 전무한 실정이다.
여성의 질내 미생물 군집은 여성의 건강에 중요한 역할을 하고, 미생물 군집의 생화학적 및 면역학적 프로파일은 질내 환경의 건강 지표가 될 수 있다. 정상적인 미생물 군집은 효모 감염, 성 매개 감염증, 요로 감염증 및 인체 면역 결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV) 감염과 같은 비뇨 생식기 질환으로부터 여성을 보호할 수 있다. 세균성 질염(bacterial vaginosis, BV)에서 관찰되는 비정상적인 미생물 군집은 상부 성기도의 건강 문제, 유산, 반복 유산, 조기 분만, 성 매개 감염의 위험성 증가 등과 관련된 것으로 보고되기도 하였다. 최근 유전자 서열분석 기술이 발달하면서, 인체 내 다양한 부위에서 인간 마이크로바이옴(Microbiome)의 조사가 가능해졌으나, 지금까지 질내 미생물 군집에 관한 대부분의 연구는 건강한 여성 또는 세균성 질염인 여성에 대한 질내 미생물 군집의 구성에 초점을 맞추고 있었다.
본 발명자들은 질내 미생물 군집과 HPV 감염 간의 관련성에 대하여 연구하던 중, 고위험성 HPV 감염 여성에게서 스니치아(Snethia), 다이아리스터(Dialister), 메가스페라(Megasphaera) 및 푸소박테리아 (Fusobacteria) 군집이 특이적으로 증가하는 것을 확인하게 되었다. 보다 상세하게, 본 발명자들은 인간의 유전적 영향 및 다양한 환경적 요인들을 고려하여 여성의 질내 미생물 군집과 HPV 감염과의 관련성을 보다 객관적으로 조사하기 위하여, 쌍둥이 코호트를 연구 대상으로 선택하였으며, 나아가 폐경 상태와 호르몬 대체 요법의 영향을 모두 고려하여 질내 미생물 군집과 HPV 감염 간의 관련성을 조사하였다. 그 결과, 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아 군집이 HPV 감염 및 자궁경부암 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 스니치아(Snethia), 다이아리스터(Dialister), 및 메가스페라(Megasphaera) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV) 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 HPV 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 HPV 감염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 자궁경부암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 자궁경부암 치료제 후보물질을 처리한 후 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물 군집의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 스니치아 (Sneathia), 다이아리스터 (Dialister) 및 메가스페라 (Megasphaera) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, HPV 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명은 상기에 푸소박테리아 (Fusobacteria)를 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함하는, HPV 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 HPV 감염 진단용 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 HPV 감염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 자궁경부암 진단용 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명은 상기에 푸소박테리아를 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함하는, 자궁경부암 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 자궁경부암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 자궁경부암 치료제 후보물질을 투여한 후 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물 군집의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명에서 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 프라이머 일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 프라이머는 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명에서 상기 HPV는 고위험군 HPV 일 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명에서 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출하는 방법은,
(a) 환자의 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계,
(b) 상기 추출된 게놈 DNA 에 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계, 및
(c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 단계(c)는 중합효소반응을 통해 수행되는 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 단계(c)는 증폭산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 시료는 자궁경부질 시료 일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 HPV 감염 여성의 질내에서 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및 푸소박테리아 군집이 특이적으로 증가한다는 발견에 기초한 것으로, 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 HPV의 감염 또는 이로 인한 자궁경부암을 진단하기 위한 바이오마커로 제공함을 특징으로 한다. 또한, 보다 바람직한 양태로서 푸조박테리아를 추가적인 바이오마커로 제공함을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 인간의 유전적, 생리적 요인이 질내 미생물 군집에 미치는 영향을 배제하고 질내 미생물 군집과 HPV 감염과의 관계를 알아보기 위해 쌍둥이 및 이들의 가족을 대상으로 연구를 진행하였다. 이를 위하여, 세균 16S rRNA 유전자의 가변 영역(V2-V3)에 대한 454 파이로시퀀싱 분석을 통하여, HPV 에 감염되었거나 감염되지 않은 68 명의 쌍둥이 및 이들 가족들의 질내 미생물 군집에 관하여 조사하였다.
그 결과, HPV-양성 여성이 HPV-음성 여성에 비해 락토바실러스 속(Lactobacillus spp)의 비율은 낮고, 미생물 다양성은 유의적으로 높게 나타났으며, 특히, 스니치아 (Sneathia), 다이아리스터 (Dialister), 메가스페라 (Megasphaera) 및 푸소박테리아(Fusobacteria)가 HPV 감염 상태에서 높게 검출되는 것을 확인하였다 (도 2(d) 참조).
따라서, 본 발명에서는 검체 시료로부터 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아 미생물을 검출함으로써, HPV의 감염 또는 이로 인한 자궁경부암을 진단할 수 있으며, 이를 위하여 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아 미생물을 검출하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.
본원에서 용어, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 HPV 감염 또는 자궁경부암 발병 여부를 확인하는 것이다. 여기에서, 상기 HPV 는 고위험군 HPV 인 것이 바람직하다. 고위험군 HPV 란, HPV 중 자궁경부 상피내 종양과 자궁경부암을 유발하는 위험이 높은 HPV를 의미하는데, 구체적으로 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-57, HPV-58, HPV-59, HPV-67, HPV-68, HPV-73 및 HPV-74 등을 예시할 수 있다.
본원에서 용어, "진단용 마커, 또는 진단 마커"란 HPV 에 감염된 상태와 감염되지 않은 상태, 또는 자궁경부암이 발병한 상태와 발병하지 않은 상태를 구분하는 기준이 되는 물질로, 정상 시료에 비하여 HPV 감염 또는 자궁경부암을 가진 시료에서 증가 또는 감소를 보이는 각종 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 진단 마커는, HPV 감염에 의해 자궁경부암을 가진 여성의 시료에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및 푸소박테리아로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물 또는 군집을 말한다.
본원에서 "스니치아"란, 분류학적으로 스니치아 속에 속하는 종(Species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 스니치아는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 스니치아와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에서 "다이아리스터"란, 분류학적으로 다이아리스터 속에 속하는 종들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 다이아리스터는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 다이아리스터와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에서 "메가스페라"란, 분류학적으로 메가스페라 속에 속하는 종들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 메가스페라는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 메가스페라와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에서 "푸소박테리아"란, 분류학적으로 푸소박테리아 문에 속하는 종들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 푸소박테리아는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 푸소박테리아와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게, 푸소박테리아에는 푸소박테리알레스(fusobacteriales), 푸소박테리아세아에(fusobacteriaceae), 스니치아(sneathia) 등이 포함되며, 본 발명에서는 스니치아 이외의 다른 푸소박테리아들도 함께 HPV 감염 또는 자궁경부암 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.
본원에서 용어, "검출할 수 있는 제제"란, 시료 내에서 HPV 감염 및 자궁경부암의 진단 마커인 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 등이 될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 검출할 수 있는 제제는 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아를 검출할 수 있는 프라이머 일 수 있다. 상기 프라이머는 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아의 게놈 서열을 특이적으로 검출하고 다른 미생물의 게놈 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및 푸소박테리아로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다. 구체적인 일예로, 스니치아에 특이적인 프라이머 쌍을 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내었고, 메가스페라에 특이적인 프라이머 쌍을 서열번호 3 및 서열번호 4로 나타내었으며, 다이아리스터에 특이적인 프라이머 쌍을 서열번호 5 및 서열번호 6으로 나타내었다.
본원에서 용어, "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 스니치아의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
본원에서 용어, "16s rRNA "란, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분 상당히 보존되어 있는 한편 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.
바람직한 일구현예로, 본 발명에서 상기 프라이머는 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아에 보존된 16S rRNA 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있으며, 서열 증폭 결과 원하는 생성물의 생성 여부를 통하여 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아의 존재를 검출할 수 있다. 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물 검출 제제를 포함하는 진단용 조성물은, 진단 키트 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 푸소박테리아를 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트는 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아를 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로, 본 발명에서 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아에 특이적인 프라이머를 포함하는 키트는, PCR 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함하는 키트 일 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 환자의 시료로부터 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물를 검출함으로써, HPV 감염 여부 또는 자궁경부암을 진단하는 방법을 제공한다. 보다 바람직하게, 상기 진단 방법은 푸소박테리아를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
달리 말하면, 본 발명은 HPV 감염 또는 자궁경부암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아를 검출하는 방법을 제공한다.
바람직한 일례로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하여 구현될 수 있다:
(a) 환자의 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계,
(b) 상기 추출된 게놈 DNA 에 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계, 및
(c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계.
상기 단계 (a) 에서, "환자의 시료"란, HPV 감염 또는 자궁경부암 여부를 진단하고자 하는 여성의 몸에서 채취 된 것으로, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 바람직하게는, 환자의 자궁경부질에서 채취된 조직 시료일 수 있다.
상기 단계 (b) 에서 환자의 시료로부터 게놈 DNA의 추출은 당업계에 알려진 일반적인 기술을 적용하여 수행할 수 있으며, 스니치아에 특이적인 프라이머는 위에서 설명한 바와 같다.
상기 단계 (c)에서 반응물을 증폭시키는 방법은 당업계에 알려진 일반적인 증폭 기술들, 예를 들어 중합효소 연쇄반응, 역전사-중합효소 연쇄반응, 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 벡토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
상기 단계 (c)에서, 반응물의 증폭 산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 환자 시료의 증폭 산물이 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하여 유의적으로 증가되었다고 판단될 경우, 해당 환자는 HPV 에 감염된 것으로 판단할 수 있다. 또는, HPV 감염에 의하여 자궁경부암 전암의 상태이거나 자궁경부암이 발병한 상태인 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 HPV 감염 여성의 질내에서 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아 군집이 특이적으로 증가한다는 것을 처음 규명하였으므로, 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아 군집의 변화와 질병 상태의 관련성을 이용하여, 자궁경부암 치료를 위한 신약 개발에도 활용될 수 있다.
바람직한 일구현예로, 본 발명은 자궁경부암 치료제 후보물질을 처리한 후 스니치아, 다이아리스터 및 메가스페라로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물 군집의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 보다 바람직하게, 상기 미생물 군집은 푸소박테리아 미생물 군집을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서는 자궁경부암 치료 후보물질의 존재 및 부재 하에서 시료 내 스니치아 군집의 변화를 비교하는 방법으로, 자궁경부암 치료제를 스크리닝하는데 적용될 수 있다. 다시 말해, 자궁경부암 치료 후보물질의 존재 및 부재 하에서 시료 내 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 군집 형성 정도를 각각 측정하여 양자를 비교한 후, 후보물질이 존재 할 때 군집 형성이 더 감소하는 경우 해당 후보물질을 자궁경부암 치료제로 개발할 수 있다.
본원에서, 상기 후보물질이란 자궁경부암 치료제가 될 수 있는 각종 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 등), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 조성물은 HPV 감염 여부 또는 이로 인한 자궁경부암의 진단을 위하여 스니치아, 다이아리스터, 메가스페라 및/또는 푸소박테리아를 신규 바이오마커를 제공하며, 이를 이용하면 간단한 시료 채취를 통하여 HPV 감염 또는 자궁경부암의 신속 검출이 가능하고, 암의 예방, 진단을 위한 신속 진단 키트의 개발이 가능하다. 또한, 여성 질내 건강을 위한 신약 개발 및 제어의 타겟으로도 상기 바이오마커의 활용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1a는 연구대상 사이의 질내 미생물 군집을 문 수준에서 비교한 것이다. 왼쪽부터 차례대로, CIN이 없는 HPV 음성 여성(N=26), CIN이 없는 HPV 양성 여성(N=19), CIN을 가지고 있는 여성(N=5), 및 HPV 음성 폐경 후 여성(N=18)에서의 결과를 나타낸다.
도 1b는 연구대상 사이의 질내 미생물 군집을 속 수준에서 비교하여 상대적으로 가장 풍부한 50개의 속을 나타낸 것이다. HPV(-)는 CIN이 없는 HPV 음성 여성(N=26), HPV(+)는 CIN이 없는 HPV 양성 여성(N=19), CIN은 CIN을 가지고 있는 여성(N=5), postmenopausal은 HPV 음성 폐경 후 여성(N=18)을 나타낸다.
도 1c는 HPV 음성(N=26)과 CIN이 없는 고위험성 HPV 유형에 감염된 여성(N=13)의 질내 미생물 군집을 비교한 것으로, 각각의 속은 다른 색깔로 표현하였고 실선은 평균을 나타낸다.
도 2a는 HPV 감염 불일치 일란성 쌍둥이(N=18)의 질내 미생물 군집을 문과 속 수준에서 비교한 것으로, HPV(-)는 HPV 음성 여성(N=9), HPV(+)는 HPV 양성 여성(N=9)를 나타낸다.
도 2b는 HPV 감염 불일치 일란성 쌍둥이(N=18)의 질내 미생물 군집에 대한 희박 곡선(평균 ± 95% 신뢰 구간)이다.
도 2c는 HPV 감염 불일치 일란성 쌍둥이(N=18) 사이의 평균 가중 UniFrac 거리를 나타낸다(***P <10-8).
도 2d는 HPV 불일치 쌍둥이(N=18)에서 HPV 음성 여성과 HPV 양성 여성의 질내 미생물 군집을 비교한 것이다.
도 3a는 UniFrac 거리의 가중 평균을 비교한 것으로, Unrelated는 관계없는 사람과 일란성 쌍둥이, MZ_mother은 일란성 쌍둥이의 모친과 일란성 쌍둥이, sister_MZ는 일란성 쌍둥이의 자매와 일란성 쌍둥이, MZ_MZ는 일란성 쌍둥이 사이의 UniFrac 거리의 가중 평균을 나타낸다. (Student's t-test; 평균 ± SEM; *P <0.05, **P <10-4,; 일란성 쌍둥이=13 쌍 (N=26), 일란성 쌍둥이의 모친=8, 일란성 쌍둥이의 자매=8).
도 3b는 UniFrac 거리의 비가중 평균을 비교한 것으로, Unrelated는 관계없는 사람과 일란성 쌍둥이, MZ_mother은 일란성 쌍둥이의 모친과 일란성 쌍둥이, sister_MZ는 일란성 쌍둥이의 자매와 일란성 쌍둥이, MZ_MZ는 일란성 쌍둥이 사이의 UniFrac 거리의 비가중 평균을 나타낸다. (Student's t-test; 평균 ± SEM; *P <0.05, **P <10-4,; 일란성 쌍둥이=13 쌍 (N=26), 일란성 쌍둥이의 모친=8, 일란성 쌍둥이의 자매=8).
도 4a는 호르몬 대체 요법을 받은 폐경 후 여성(N=3) 과 호르몬 대체 요법을 받지 않은 폐경 후 여성(N=15), 그리고 HPV 감염 및 자궁경부 상피 내 종양 이 없는 폐경 전 여성(N=26)에 대한 희박 곡선을 나타낸다.
도 4b는 HPV 감염 및 자궁경부 상피 내 종양이 없는 폐경 후와 폐경 전 여성(N=26)의 LEfSe에 의한 미생물학 마커를 나타낸다.
도 4c는 호르몬 대체 요법을 받은 폐경 후 여성(N=3)과 호르몬 대체 요법을 받지 않은 폐경 후 여성(N=15)의 LEfSe에 의한 LDA 수치와 마커를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 연구 집단
본 연구는 한국인유전체역학조사사업(Korean Genome Epidemiology Study)의 일부인 쌍둥이 연구(Healthy Twin Study)에 참여한 912명의 여성의 자궁경부질 샘플(cervicovaginal sample)을 이용하여 수행하였다. 쌍둥이의 67% 에 대해서는, 16개의 STR(short tandem repeat) 마커 (15개의 상염색체 STR 마커 및 1 개의 성-결정 마커) 및 AmpFlSTR Identifier 키트 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 쌍둥이의 접합형식(zygosity)을 조사하였고, 나머지 33%에 대해서는, 90% 를 넘는 유효 정확성을 가지는 설문지를 사용하여 접합형식을 조사하였다. 모든 연구는 31세부터 73세를 대상으로 하였다. 각각의 참가자에게 서면으로 사전동의를 얻었다. 연구 프로토콜을 한국 질병관리본부 및 세 참여 기관(상성의료원, 인제대학교 부산 백병원, 서울대학교)의 기관감사위원회에 의해 승인받았다 (임상시험심사위원회(Institutional Review Board, IRB) No. 144-2011-07-11).
실시예 2. 샘플 수집 및 HPV 스크리닝
2005년부터 2009년 사이 대한민국에서, 쌍둥이 연구를 위한 건강 검사의 일부로 자궁경부암 검사(Pap smear test)를 받은 912명의 여성을 대상으로 샘플을 수집하였다. 쌍둥이들 및 자매들의 평균 나이는 43세이고, 이들 모친의 평균 나이는 65세였다. 각 자궁경부질 샘플은 독립된 자궁경부 브러시(endocervical brush)를 이용하여 수집하였다. 자궁경부질 샘플을 수집하기 위하여, 제조자의 지시(ThinPrep®and SurepathTM)에 따라 액상세포검사법(liquid-based preparation method)을 수행하였고, 수집된 샘플은 이후의 분석 때까지 보존하였다. 912명의 쌍둥이, 자매, 및 이들의 모친으로부터 수집한 980개의 면봉채취 샘플(sample swab) 각각에서 전체 게놈 DNA 를 추출하였고, HPV 감염의 존재를 판정하기 위해, 이전 연구[Qu W, Jiang G, Cruz Y, Chang CJ, Ho G, et al. (1997) J Clin Microbiol 35: 1304-1310]에서 알려진 두 개의 프라이머 세트(MY09/MY11 및 GP5+/GP6+)를 이용하여 912명에 대하여 HPV 검사를 수행하였다. HPV 유형(고위험성 vs. 저위험성)을 확인하기 위하여 450 bp와 150 bp의 PCR 앰플리콘에 대한 서열을 분석하였다. HPV 유전자형 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 66은 고위험성으로 동정하였고, 나머지는 저위험성으로 동정하였다. 912 명 중에서, 72명(7.9%)은 HPV 감염에 대해 양성을 나타내었다. 이들 72명 중 검체 샘플링을 하기 전 6개월 내에 항생제를 투여받은 사람들은 제외하였다.
또한, 임상시험에 의해 염증이 있거나, 질트리코모나스증(Trichomonas vaginalis)이거나, 의미미결정비정형편평세포(atypical cells of undetermined significance, ASCUS)인 것으로 확인된 환자들 역시 제외하였다. 결과적으로, 23명의 HPV-양성과 45명의 HPV-음성 개체들을 선별하였다. 23명의 HPV-양성 개체에는, 10명의 HPV-불일치 일란성 쌍둥이(CIN이 없으며, HPV 양성, [N=9]; CIN 이 있으며, HPV 양성[N=1]), 2쌍의 HPV-양성 일치 일란성 쌍둥이(일란성 쌍둥이의 양쪽 모두 HPV 양성임, N=4), 5명의 HPV-양성의 짝없는 일란성 쌍둥이 또는 이란성 쌍둥이(이들의 짝인 쌍둥이는 위에서 설명한 기준에 따라 제외됨; N=5) 및 4명의 자매(N=4)가 포함되었다. 45명의 HPV-음성 개체에는 HPV-불일치 일란성 쌍둥이 (N=10), HPV-음성 일치 일란성 쌍둥이 (N=2), 짝 있는 이란성 쌍둥이 (N=2), HPV-음성 짝 없는 일란성 쌍둥이 (N=6), 자매 (N=15) 및 모친 (N=10)이 포함되었다. 본 연구 대상의 역학 정보 및 임상 정보는 다음과 같다(표 1).
샘플 가족ID 나이 폐경여부 HRT 임상시험 접합형식 HPV감염 HPV 유전자형
1 1000053 71 O X 정상 어머니 (-)
2 1000053 43 X 정상 DZ ** 고위험성 39
3 1000053 43 X 정상 DZ ** (-)
4 1000098 35 X 정상 MZ ** (-)
5 1000098 35 X CIN MZ ** (-)
6 1000102 47 X CIN MZ # 고위험성 59
7 1000128 48 X 정상 자매 고위험성 56
8 1000128 45 X 정상 자매 (-)
9 1000128 42 X 정상 자매 (-)
10 1000135 63 O X 정상 어머니 (-)
11 1000135 40 X 정상 자매 고위험성 52
12 1000142 42 X CIN 자매 고위험성 16
13 1000142 47 X 정상 MZ # (-)
14 1000152 50 O X 정상 MZ # (-)
15 1000182 48 X 정상 MZ ┓ ** 저위험성 70
16 1000182 48 X 정상 MZ ┓ ** (-)
17 1000195 66 O X 정상 어머니 (-)
18 1000195 42 X 정상 MZ ┓ ** (-)
19 1000195 42 X 정상 MZ ┓ ** 고위험성 39
20 1000196 66 O X 정상 어머니 (-)
21 1000196 40 X 정상 자매 (-)
22 1000196 34 X 정상 자매 (-)
23 1000196 31 X 정상 MZ ┓ ** (-)
24 1000196 31 X 정상 MZ ┓ ** 고위험성 18
25 1000215 58 O O 정상 어머니 (-)
26 1000215 35 X 정상 MZ ┓ ** 고위험성 16
27 1000215 35 X 정상 MZ ┓ ** (-)
28 1000219 49 O O 정상 MZ # (-)
29 1000285 73 O X 정상 MZ # (-)
30 1000297 60 O X 정상 자매 (-)
31 1000297 54 O X 정상 자매 (-)
32 1000306 36 X 정상 MZ # (-)
33 1000312 66 O X 정상 어머니 (-)
34 1000312 46 X CIN MZ ** 고위험성 56
35 1000312 46 X 정상 MZ ** (-)
36 1000313 61 O X 정상 어머니 (-)
37 1000313 37 X 정상 MZ # 고위험성
추정		 66
38 1000338 40 X 정상 MZ ┓ ** (-)
39 1000338 40 X 정상 MZ ┓ ** 고위험성 45
40 1000372 55 O O 정상 어머니 (-)
41 1000372 35 X 정상 MZ ┓ ** (-)
42 1000372 35 X 정상 MZ ┓ ** 고위험성 39
43 1000372 31 X 정상 자매 (-)
44 1000376 73 O X 정상 어머니 (-)
45 1000376 52 X 정상 자매 (-)
46 1000376 49 X 정상 MZ ┓ ** 미결정 67
47 1000376 49 X 정상 MZ ┓ ** (-)
48 1000376 47 X 정상 자매 (-)
49 1000391 32 X 정상 MZ # (-)
50 1000396 34 X 정상 MZ ** 고위험성 56
51 1000396 34 X 정상 MZ ** 고위험성 52
52 2000013 52 X 정상 자매 (-)
53 2000013 49 O X 정상 DZ ** (-)
54 2000013 49 X 정상 DZ ** 고위험성 18
55 2000025 44 X CIN 자매 미결정 90
56 2000025 41 X 정상 자매 (-)
57 2000079 47 X 정상 자매 (-)
58 2000079 51 O X 정상 자매 (-)
59 2000088 73 O X 정상 어머니 (-)
60 2000088 42 X 정상 MZ ** 저위험성 70
61 2000088 42 X 정상 MZ ** 저위험성 70
62 2000116 36 X 정상 MZ # 고위험성 16
63 2000117 37 X 정상 MZ ┓ ** (-)
64 2000117 37 X 정상 MZ ┓ ** 미결정 74
65 2000117 43 X 정상 자매 (-)
66 3000014 58 O X 정상 자매 (-)
67 3000014 45 X 정상 MZ ┓ ** 고위험성 59
68 3000014 45 X 정상 MZ ┓ ** (-)
DZ ** : 짝 있는 이란성 쌍둥이
MZ ** : 짝 있는 일란성 쌍둥이
MZ # : 짝 없는 일란성 쌍둥이
MZ ┓ HPV 불일치 일란성 쌍둥이
연구대상(N=68) 가운데, 폐경 전 여성은 50명, 폐경 후의 여성 18명이었다. 폐경 후의 여성에는 쌍둥이(N=4)와 그들의 자매(N=4), 쌍둥이들의 모친 전부(N=10)가 포함되었다. 18명의 폐경 후 여성들 가운데, 3명은 호르몬 대체 요법을 받은 경험이 있었다. HPV 감염이 질내 미생물 군집과 여성의 건강에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 세 그룹(HPV 음성 및 CIN 음성 (N=26), HPV 양성 및 CIN 음성 (N=19), 및 CIN 양성 (N=5; HPV-양성 4명과 HPV-음성 1명)의 50명을 선별하였다. 폐경 후 여성과 신체검사에서 뚜렷한 감염을 보인 여성은 본 연구에서 제외하였다. 본 연구에서는 HPV, 다른 뚜렷한 감염증, 또는 CIN을 가지는 개체를 제외한 50명의 폐경 전 여성들 중에는 HPV-음성 대조군 26명이 포함되어있다. CIN을 가지는 5명의 여성 중 4명은 HPV 양성으로 확인되었다. HPV-불일치 쌍둥이 분석을 위해, 31세~49세 사이의, CIN 이 아닌 9쌍의 일란성 쌍둥이 (N=18)만을 선별하였다. CIN 을 가지는 한 쌍의 불일치 쌍둥이는 임상적 증상에서 혼란을 일으킬 수 있어 분석에서 제외하였다. 본 연구의 연구집단(N=68)을 다음의 표 2에 요약하였다.
폐경 전 여성
(N=50) 		폐경 후 여성
(N=18)		 합
HPV(-)
(N=27) 		HPV(+)
(N=23)		 HPV(-)
(N=18)		 HPV(+)
(N=0)
HPV-불일치 일란성 쌍둥이
HPV-일치 일란성 쌍둥이
짝이 없는 일란성 쌍둥이
이란성 쌍둥이
자매
모친		 10
2(1)†
3
1
11
0		 10(1)†
4
3(1)†
2
4(2)†
0		 0
0
3
1
4
10		 0
0
0
0
0
0		 20
6
9
4
19
10
합 27 23 18 0 68
†자궁경부 상피 내 종양(CIN)을 가진 숫자
실시예 3. DNA 추출, 16S rRNA 의 PCR 증폭, 및 정제
전체 게놈 DNA는 추출 키트를 이용하여 각각의 면봉채취 샘플로부터 추출하였다. 게놈 DNA는 바이러스 DNA/RNA 키트를 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 세포채집솔(cytobrush)로부터 추출하였고, 추출된 DNA는 -70℃에 보관하였다. 16S rRNA 유전자의 V2 영역과 V3 영역은 표 2에 기재된 바코드화된 범용 프라이머(universal primer)를 이용한 PCR을 통해 전체적으로 증폭시켰고, 454 Life Sciences FLX Titanium machine을 이용하여 파이로시퀀싱 하였다. 각 샘플에 대해, 정방향 프라이머 8과 역방향 프라이머 534의 프라이머 세트를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. 정방향 프라이머는 454 Life Sciences (Roche) 사의 티타늄 호환의 어댑터 서열 (5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-3'), 4-염기 링커 서열 ("TCAG") 및 대략 보존된 박테리아 프라이머 8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')를 포함하였다. 역방향 프라이머는 454 Life Sciences (Roche) 사의 티타늄 호환의 어댑터 시퀀스 (5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-3'), 4-염기 링커 서열 ("TCAG") 및 각 PCR 산물을 태그하는 9- 또는 10-염기 다중 확인자 (MID), 박테리아 프라이머 534R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')을 포함하였다(표 3). PCR 반응액은 정방향과 역방향 프라이머 각각 0.5 ㎕, 약 50 ng/㎕ 의 주형 DNA, 1×PCR 반응 버퍼, 400μM의 dNTP 혼합액, 및 2.5U G-Taq 중합효소(Cosmo, Seoul, Korea)로 구성되었다. 샘플은 최초로 94℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃에서 45초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 90초로 35 회 반복하여 증폭하였다. 목표 영역을 완전한 증폭하기 위해 72 ℃서 10분간의 최종 연장 단계를 추가하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 정제하였다. 결과 샘플은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX Titanium machine에서 파이로시퀀싱을 하였다. 필터링 후의 68개 샘플에 대한 다중 파이로시퀀싱 결과, 샘플 당 평균 길이 474 bp 및 5,741 read를 가지는 고품질의 16S rRNA 서열 390,444개를 생성하였다.
프라이머
이름		 454 B 어댑터 서열
 링커 정방향 16S rRNA 서열
454_8F CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC
 TCAG AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
프라이머
이름		 바코드
ID		 454 A 어댑터 서열 링커 바코드 서열 역방향 16S rRNA 서열
454_534R_1 MID1 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACGAGTGCGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_2 MID2 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACGCTCGACA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_3 MID3 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGACGCACTC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_4 MID4 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ATATCGCGAG ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_5 MID5 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGTGTCTCTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_6 MID6 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TAGCTCTATC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_7 MID7 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TGATACGTCT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_8 MID8 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TATAGACATC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_9 MID9 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CATAGTAGTG ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_10 MID10 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TCACGTACTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_11 MID11 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGTCTAGTAC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_12 MID12 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACGACTACAG ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_13 MID13 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGTAGACTAG ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_14 MID14 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TACTCTCGTG ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_15 MID15 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TAGAGACGAG ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_16 MID16 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TCGTCGCTCG ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_17 MID17 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACATACGCGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_18 MID18 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACGCGAGTAT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_19 MID19 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACTACTATGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_20 MID20 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACTGTACAGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_21 MID21 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGACTATACT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_22 MID22 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGCGTCGTCT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_23 MID23 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGTACGCTAT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_24 MID24 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ATAGAGTACT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_25 MID25 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CACGCTACGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_26 MID26 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CAGTAGACGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_27 MID27 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGACGTGACT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_28 MID28 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TACACGTGAT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_29 MID29 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TACGCTGTCT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_30 MID30 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TCGATCACGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_31 MID31 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TCGCACTAGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_32 MID32 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TGACGTATGT ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_33 MID33 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACAGTATATA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_34 MID34 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACGCGATCGA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_35 MID35 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACTAGCAGTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_36 MID36 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGCTCACGTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_37 MID37 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGTATACATA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_38 MID38 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGTGCTACGA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_39 MID39 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGATCGTATA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_40 MID40 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGCAGTACGA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_41 MID41 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGCGTATACA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_42 MID42 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGTACAGTCA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_43 MID43 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGTACTCAGA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_44 MID44 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CTACGCTCTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_45 MID45 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CTATAGCGTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_46 MID46 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TACGTCATCA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_47 MID47 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TAGTCGCATA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_48 MID48 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ATATATACA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_49 MID49 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CACGCGAGA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_50 MID50 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TCGATAGTGA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_51 MID51 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TCGCTGCGTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_52 MID52 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TCTGACGTCA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_53 MID53 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TGAGTCAGTA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_54 MID54 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG TGTAGTGTGA ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_55 MID55 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACACATACGC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_56 MID56 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACAGTCGTGC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_57 MID57 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACATGACGAC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_58 MID58 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ACGTCTCATC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_59 MID59 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGAGCGTCAC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_60 MID60 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGCGACTAGC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_61 MID61 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG AGTAGTGATC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_62 MID62 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ATAGATAGAC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_63 MID63 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ATATAGTCGC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_64 MID64 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG ATCTACTGAC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_65 MID65 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CACGTAGATC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_66 MID66 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CATACTCTAC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_67 MID67 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGACACTATC ATTACCGCGGCTGCTGG
454_534R_68 MID68 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG CGAGACGCGC ATTACCGCGGCTGCTGG
실시예4 . QIIME 을 이용한 서열 분석
QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) 1.2.0 (http://qiime.sourceforge.net)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 서열 분석 전에, 서열 데이터세트의 노이즈 제거를 수행하였다. 200 bp 미만의 저품질 서열은 제거하였고, 샘플에 대한 서열를 지정하기 위하여 9- 또는 10-bp의 바코드를 시험하였다. 파이로시퀀싱 데이터는 QIIME pipeline을 이용하여 처리하였다. 계통형은 UCLUST을 이용하여 동정하였고, 97%의 서열 유사 수준에서 정의하였다. 각 계통형에서 대표적인 서열은 PyNAST를 이용하여 정렬하였으며, 각 계통형의 분류학적 동정은 RDP classifier를 이용하여 결정하였다. 각 샘플 쌍 사이의 차이는 가중치를 둔 UniFrac을 이용한 neighbor-joining tree로 결정하였다.
실시예 5. LEfSe 분석에 의한 질내 미생물 군집 및 표현형의 관련성
HPV 감염과 관련있는 미생물 군집의 바이오 마커를 확인하기 위해, mothur, 다량의 조작분류단위(Operational Taxonomic Unit, OTU) 및 PERL scripts의 파이로시퀀싱 파이프라인을 이용하여 서열 분석을 수행하였다. 분석의 질을 높이기 위해, 서열은 최소 200bp 초과 600bp미만의 길이로 하였고, read quality score 가 25 를 초과하고, 일치된 바코드를 갖도록 하였다. 처리된 각각의 서열을 할당하고, 바코드와 프라이머 서열을 잘라냈다. 처리된 모든 서열은 SILVA alignment를 기반으로 NAST-기반의 서열 배열기를 이용하여 custom references 에 대하여 배열하였다. ChimeraSlayer 알고리즘의 mothur package를 사용하여 키메라 서열을 확인하였다. 서열 확인 후, 서열을 abundant OTU 를 이용하여 OTU로 클러스터하였다. 리보솜 Ribosomal Database Project (RDP 10 database, v6)에서 유지된 MSU RDP classifier v2.2를 이용하여 OTU 당 대표적인 서열들을 분류하였다. 마지막으로, 특정 질환 표현형을 나타내는 미생물 OTU 마커를 특정하기 위해, abundant OTU를 LEfSe (linear discriminant analysis [LDA] coupled with effect size measurements)에 사용하였다. t-test 또는 Wilcoxon signed-rank test 를 수행하기 위해 SPSS(ver. 19.0; Armonk, NY, USA)를 사용하였다.
실험결과
1. 쌍둥이 코호트에서 질내 미생물 군집의 구성
건강한 개체 및 HPV-양성 개체의 미생물 군집 구성 간의 조성 차이를 알아보기 위해, 대한민국 쌍둥이 연구 저장소(South Korean Healthy Twin Study repository)에서 68개의 샘플을 선별하여, 16S rRNA 유전자 서열분석을 수행하였다 (표 1). 본 연구자들은 암의 진행과정을 검출하기 위한 Babes-Papanicolaou 선별 검사와 PCR 기반의 HPV 선별 검사를 수행한 912명의 여성 중 68명을 선택하였고, HPV-양성인 23 명(두 쌍의 일치 및 10명의 불일치 쌍둥이)을 포함시켰다. 또한, 가족 내 비교를 위해 이들의 건강한 모친(N=10)와 자매들(N=19)의 샘플을 포함하였다. V2와 V3 영역을 포함하는 16s rRNA window를 454 FLX Titanium platform에서 서열분석하여, 샘플 당 평균 길이 474bp와 5,741 read의 16S RNA 총합 390,444개의 고품질의 정제된 서열을 생성하였다. 질내 미생물 군집의 대다수는 다음의 여섯개의 주요 문(phyla) 중 하나가 차지하였다 : 피르미쿠트(Firmicutes), 박테로이데트(Bacteroidetes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 악티노박테리아(Actinobacteria), 테네리쿠트(Tenericutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria). 이들 중, 락토바실러스(Lactobacillus)가 속해 있는 피르미쿠트가 정상 폐경 전 여성에서 가장 많은 것으로(>77%) 나타났다. 그러나, 폐경 후의 여성은 피르미쿠트의 비율이 훨씬 낮았고(<57%), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 아나에로코커스(Anaerococcus)에 더하여 엔테로박테리아(Enterobacteriaceae) 및 카울로박테리아(Caulobacteraceae)에 속하는 많은 종들을 포함하는 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 비율이 유의적으로 더 높게 나타났다. 이러한 결과는 폐경 전 여성에 비해 폐경 후 여성에서 질내 프로테오박테리아 (i.e., Escherichia coli)가 높은 비율을 나타낸다고 보고한 이전의 연구 결과와 일치한다.
폐경 상태가 질내 미생물 군집과 강한 관련성이 있기 때문에, 질내 미생물 군집과 HPV 감염간의 관계 조사에서 폐경 후 여성의 샘플을 제외하였다. 18명의 폐경 후 여성을 제외한 다음, 23명의 HPV-양성 및 27명의 HPV-음성의 폐경 전 여성의 질내 미생물 군집을 비교하였다. 23명의 HPV-양성인 폐경 전 여성 가운데, 4명은 자궁경부암의 잠재적인 전구체라고 할 수 있는 CIN을 가지고 있었다. 대조적으로, 27명의 HPV-음성인 폐경 전 여성 가운데 오직 한명만 CIN 을 가지고 있었다. 폐경 전 대조군에 비해 HPV 에 감염된 그룹 또는 CIN 을 가진 그룹에서 락토바실러스(Lactobacillus)의 비율이 훨씬 낮았다. CIN 을 가지고 있는 군은 라크노스피라(Lachnospiraceae) 및 베일로넬라(Veillonella)의 비율이 더 높았다 (표 3). 한편, 푸소박테리아(Fusobacteria)는 HPV에 감염된 군이 감염되지 않은 군과 폐경 후 군에 비해 더 널리 퍼져 있었다 (P<0.05, t-test) (도 1a 및 1b). 프레보텔라(Prevotella) (Bacteroidetes), 스니치아(Sneathiap) (Fusobacteria), 및 클로스트리디아 (Clostridiales) (Firmicutes)을 포함하는 다른 미생물은 HPV 감염 군 사이에서 유의적으로 증가된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 HPV 감염이 질내 미생물 군집의 변화와 관련되어 있음을 나타낸다.
HPV 감염군과 CIN 이 없는 고위험성 HPV 감염군의 잠재적인 미생물학적 예측인자를 확인하기 위해, HPV를 갖고 있거나 갖고 있지 않은 폐경 전의 건강한 여성 모두에 대해 LEfSe 분석을 수행하였다(도 1c). HPV 감염은 푸소박테리아(Fusobacteria) 문의 종들과 강하게 관련성을 나타내었으며, 푸소박테리아 뿐 아니라 스니치아(Sneathia), 다이아리스터 (Dialister) 또는 메가스페라 (Megasphaera)가 HPV 감염의 미생물학적 마커로 확인되었다. 또한, HPV의 바이러스 유형에 기반한 질내 미생물 군집을 추가분석한 결과, 스니치아(Sneathia), 다이아리스터 (Dialister) 및 메가스페라 (Megasphaera)가 고위험성 HPV 감염에 대한 미생물학적 마커로 확인되었다(도 1c 및 표 5). 스니치아(Sneathia)는 고위험성 HPV 감염군의 여성 사이에 가장 많이 존재하고 세 배 이상 빈번히 나타나는 속이다. 표 4는 질내 미생물 군집을 나타내며, 표 5는 상위 가장 풍부한 50개 속의 상대적인 양을 나타낸다.
문 폐경 전 폐경 후 HPV 불일치 일란성 쌍둥이
HPV 음성 (%) HPV 양성 (%) CIN (%) (%) HPV 음성 (%) HPV 양성 (%)
Firmicutes 77.4(32.0) 69.9(33.4) 85.7(27.0) 56.9(35.2) 90.5(10.0) 62.3(36.0)
Bacteroidetes 10.1(19.5) 10.9(15.4) 7.4(15.9) 10.6(12.7) 2.2(3.9) 13.2(16.4)
Fusobacteria 1.7(3.9) 8.9(14.7) 2.7(5.6) 0.1(0.1) 0.1(0.2) 13.4(19.9)
Actinobacteria 3.4(6.7) 6.3(10.8) 1.4(2.0) 6.3(7.5) 1.6(3.1) 8.8(13.1)
Tenericutes 3.7(10.3) 2.7(6.3) 1.4(2.5) 2.4(5.1) 4.7(7.7) 1.3(2.6)
Proteobacteria 1.2(4.3) 0.2(0.3) 0.3(0.4) 17.4(23.9) 0.5(0.9) 0.3(0.4)
기타 2.5(5.7) 1.1(1.1) 1.1(1.5) 6.3(11.4) 0.4(0.4) 0.9(0.8)
속
 폐경 전
 폐경 후 HPV 불일치 쌍둥이
HPV 음성(%) HPV 양성(%) CIN (%) (%) HPV 음성(%) HPV
양성(%)
Lactobacillus 63.6(39.6) 55.4(41.0) 57.6(52.1) 16.9(36.7) 76.8(28.3) 47.2(46.9)
Prevotella 8.6(17.9) 10.0(14.5) 6.9(15.1) 6.7(8.8) 1.0(2.6) 12.3(15.5)
Sneathia 1.7(3.9) 8.91(4.7) 2.7(5.6) 0.1(0.1) 0.1(0.2) 13.3(19.9)
Clostridiales 1.8(7.4) 3.71(0.7) 0.1(0.3) 0.5(0.8) 4.3(12.6) 6.315.0)
Lactobacillaceae 0.1(0.2) <0.1(0.1) <0.1(<0.1) 15.8(33.7) 0.1(0.2) <0.1(0.1)
Lachnospiraceae 0.5(1.9) 1.5(5.1) 4.8(10.7) 1.9(7.6) <0.1(<0.1) 0.7(1.9)
Veillonella 2.2(7.8) 1.7(6.9) 9.5(21.1) 0.9(3.1) 2.6(7.5) 0.1(0.1)
Streptococcus 2.0(8.1) 0.1(0.4) 4.4(9.9) 4.6(10.7) 0.7(2.1) <0.1(<0.1)
Megasphaera 1.5(4.8) 2.1(3.7) 1.4(3.1) 0.4(1.6) 2.7(7.9) 3.8(4.9)
Atopobium 1.1(2.9) 3.4(8.5) 0.1(0.2) 1.0(3.3) 0.9(2.6) 4.9(11.1)
Ureaplasma 2.8(9.8) 1.3(2.4) 0.2(0.2) 2.2(5.1) 2.5(5.3) 1.2(2.6)
Dialister 0.9(2.2) 1.1(1.5) 3.3(5.5) 1.4(1.9) 0.1(0.1) 1.6(1.7)
Lactobacillales 2.2(2.0) 2.4(2.5) 1.5(1.1) 0.9(1.2) 1.1(0.6) 0.9(0.9)
Eggerthella 1.2(3.4) 2.3(4.3) 0.7(1.5) 0.3 (1.3) <0.1(<0.1) 2.9(5.0)
Anaerococcus 0.6(2.6) 0.1(0.1) 0.7(1.5) 4.2 (6.6) <0.1(0.1) 0.1(0.1)
Enterobacteriaceae <0.1(0.2) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 5.01 (2.3) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Caulobacteraceae 0.1(0.1) <0.1(0.1) 0.1(0.1) 4.1 (11.6) 0.1(0.2) <0.1(<0.1)
Bacilli 0.7(0.7) 0.7(0.6) 0.5(0.5) 0.3 (0.8) 1.1(0.8) 0.3(0.4)
Porphyromonas 0.2(0.7) 0.1(0.3) <0.1(<0.1) 1.7 (3.4) <0.1(0.1) 0.2(0.4)
Peptoniphilus 0.1(0.6) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 2.4 (3.2) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Prevotellaceae 0.3(0.5) 0.4(0.6) 0.2(0.4) 0.6 (0.9) 0.1(0.2) 0.6(0.8)
Campylobacter 0.1(0.2) <0.1(0.2) <0.1(<0.1) 2.6 (5.1) <0.1(<0.1) 0.1(0.3)
Sphingomonas 0.1(0.3) <0.1(0.1) 0.1(0.1) 2.3 (4.9) <0.1(0.1) <0.1(<0.1)
Mycoplasma 0.9(4.0) 1.4(6.1) 1.2(2.6) 0.1 (0.2) 2.2(6.5) <0.1(<0.1)
Aerococcus 0.1(0.5) 0.1(0.4) 1.2(2.7) 0.4 (1.5) 0.3(0.9) 0.3(0.5)
Gardnerella 0.5(1.7) 0.1(0.3) 0.3(0.7) 0.4 (1.1) 0.6(1.3) 0.2(0.4)
Bacillus <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Sphingobacteriales 0.4(1.9) <0.1(<0.1) <0.1(0.1) 0.1 (0.1) 0.2(0.6) <0.1(<0.1)
Bradyrhizobium 0.1(0.4) <0.1(0.1) <0.1(0.1) 1.1 (2.1) 0.2(0.6) 0.1(0.2)
Coriobacteriaceae 0.2(0.5) 0.4(0.6) 0.2(0.3) 0.1 (0.2) 0.1(0.1) 0.6(0.8)
Veillonellaceae 0.1(0.2) 0.2(0.3) 0.1(0.3) 0.2 (0.3) 0.1(0.3) 0.3(0.4)
Finegoldia 0.1(0.3) <0.1(0.1) <0.1(<0.1) 0.6 (1.4) <0.1(0.1) <0.1(<0.1)
Ruminococcaceae 0.2(1.0) 0.1(0.2) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(0.1) 0.2(0.3)
Parvimonas 0.1(0.2) 0.2(0.4) <0.1(0.1) <0.1(0.1) <0.1(0.1) 0.2(0.5)
Agrococcus <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Alphaproteobacteria <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 0.1(0.2) 0.2 (0.3) <0.1(0.1) <0.1(<0.1)
Streptococcaceae <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 0.1(0.2) 0.1 (0.4) 0.1(0.3) <0.1(<0.1)
Propionibacterium <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 0.2 (0.5) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
GpI <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Bacillaceae <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Mobiluncus 0.3(1.1) 0.1(0.3) 0.1(0.2) 1.3 (3.9) <0.1(<0.1) 0.1(0.2)
Staphylococcus <0.1(0.1) <0.1(0.1) <0.1(<0.1) 0.1 (0.2) 0.1(0.2) 0.1(0.2)
Corynebacterium <0.1(0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 1.6 (2.7) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Sphingomonadaceae <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 0.8 (1.4) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Moryella 0.1(0.4) <0.1(0.2) <0.1(<0.1) 0.1 (0.2) <0.1(<0.1) 0.1(0.2)
Shigella <0.1(0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 0.5 (0.9) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Planctomycetaceae <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) < 0.1 (0.1)
Gemella <0.1(<0.1) <0.1(0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Porphyromonadaceae <0.1(0.1) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1) 1.3 (2.6) <0.1(<0.1) <0.1(<0.1)
Bacteria, other 4.4(5.7) 2.0(0.9) 1.7(1.5) 13.9 (7.3) 0.7 (0.4) 1.3(0.7)
2. HPV 감염 불일치 일란성 쌍둥이의 미생물 군집 비교
대부분의 유전적 및 환경적 혼란변수를 보정하기 위하여, 본 발명자들은 CIN(N=18)이 없는 9쌍의 HPV 감염-불일치 일란성 쌍둥이를 이용하여 HPV 감염과 질내 미생물 군집 사이의 관련성을 분석하였다. 작은 표본 크기에도 불구하고, 9쌍의 불일치 일란성 쌍둥이들의 데이터는 HPV 양성 및 음성 개체 간의 질내 미생물 군집의 차이를 명백히 보여주었다(도 2a). HPV 감염의 발생은 락토바실러스 (Lactobacillus) 및 다른 통성 또는 혐기성 종의 감소와 강하게 관련되어 있었다. 락토바실러스(Lactobacillus)의 비율은 감염되지 않은 집단(평균 77%)보다 HPV 감염 집단(평균 47%)에서 유의적으로 낮게 나타났다(도 2a) (표 5). 락토바실러스 (Lactobacillus)는 질내에 우세하게 존재하여, 대사 활성을 통해 질내 낮은 pH를 유지하는 역할을 한다. 따라서, 락토바실러스(Lactobacillus)는 병원체의 군체 형성 또는 잠재적인 병원성 종의 우세에 대한 보호 작용뿐 아니라, HPV 감염에 저항성을 부여할 것으로 예상된다. 예를 들어, HPV 유전자형 16의 E5 단백질은 낮은 pH에 매우 민감하다.
본 연구에서, HPV 음성 불일치 일란성 쌍둥이보다 HPV 감염된 군에서 프레보텔라(Prevotella), 스니치아(Sneathia), 다이아리스터(Dialister), 메가스페라(Megasphera) 및 바실러스(Bacillus) 종들이 높은 비율로 발견되었다(도 2a). HPV 양성 집단의 질내 미생물 군집은 HPV 음성 집단에서보다 훨씬 더 다양하게 나타났다(도 2b). 증가된 미생물의 풍부함(종 다양성의 요소)은 또한 HPV 양성 쌍둥이들과 음성 불일치 통제 사이의 UniFrac 거리의 평균으로 확인되었다(P<10-8; 도 2c). 이러한 결과는, 일란성 쌍둥이의 유전적 및 환경적 요소를 조정한 후에도 HPV 감염 상태에 따라 질내 미생물 군집이 유의적인 차이를 나타낸다는 것을 제시한다.
본 발명자들은 HPV 불일치 쌍둥이(N=18)를 이용하여 LEfSe 분석을 수행하였다(도 2d). 스니치아(Sneathia)와 메가스페라(Megasphaera)는 HPV 감염에 대한 미생물학적 마커로 사용하였다. 본 연구에서, 우리는 질 미생물 군집을 분석하기 위하여 두 개의 다른 생물정보학 도구(QIIME와 LEfSe)를 사용하였다. QIIME는 연구 소집단의 전체 미생물 구조를 비교하기 위하여 사용한 반면, LEfSe는 질병 표현형의 특정한 미생물학적 관계를 식별하기 위하여 사용하였다. 두 분석 결과를 통하여, HPV 감염과 질 미생물 군집의 평균 프로파일이 강력하게 관련되어 있음을 확인할 수 있었다.
3. 일란성 쌍둥이와 그들의 가족의 질내 미생물 군집의 비교
쌍둥이들, 자매들, 그리고 그들의 모친들의 질 미생물 군집은 가중치를 둔 및 두지 않은 UniFrac 거리에 의해서 비교하였다(도 3a 및 3b). 가중치를 둔 및 두지 않은 UniFrac 거리의 평균에 기초하였을 때, 일란성 쌍둥이 간의 질 미생물 군집은 다른 개인들 간에 비하여 유사성 수준이 유의적으로 높게 분석되었다 (P<0.05). 쌍둥이 간 질내 미생물 군집의 유사성은 공유 OTU(비가중)와 공유 OTU 집단 분포(가중) 때문이다. 또한 일란성 쌍둥이 간 질내 미생물 군집은 그들의 자매와 모친의 질내 미생물 군집보다 훨씬 더 유사했다. 쌍둥이 질내 미생물 군집의 공유 OTU의 분포는 그들 자매의 질내 미생물 군집과 유의적인 차이를 나타내었다. 그러나, 공유 OTU는 비가중 UniFrac 결과와 크게 다르지 않았다. 가중 (P<0.05) 및 비가중 UniFrac (P<10-4)로 분석했을 때 일란성 쌍둥이의 미생물 군집은 그들의 모친의 미생물 군집과 유의적인 차이를 나타내었다. 모든 모친은 55세~73세이고 폐경기였다. 쌍둥이와 그들의 양친 사이에 많은 요인들이 달랐다. 폐경 상태가 같은 가족 내 질내 미생물 군집의 차이에 영향을 미쳤는지 판단하기 위해 추가 분석하였다. 이상의 결과는 한 가족 내 독특한 유전적, 생리학적, 환경 요인이 질내 미생물 군집의 독특한 존재 및 분포에 크게 기여한다는 것을 나타낸다.
4. 질내 미생물 군집의 비교: 폐경과 호르몬 대체 요법의 효과
도 4a의 희박 곡선에서 나타난 바와 같이, 전반적으로 폐경 후 여성은 폐경 전 여성에 비해 미생물 다양성 및 미생물 종의 풍부함이 매우 높게 나타났다. 본 발명에서는 LEfSe 방법을 사용하여, 이들 마이크로비옴들 중 특정 분류군이 특이적으로 존재하거나 많은지를 확인하였다. 그 결과 락토바실러스 (Lactobacillus)이 폐경 전 여성에 많이 나타났고, 폐경 후 여성에서는 포르피로모나스(Porphyromonas), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스핑고모나스(Sphingomonas), 캠플릴로박터 (Camplylobacte) 및 펩토니필러스(Peptoniphilus)의 종들을 포함하는 다양한 미생물이 나타났다.
또한, 호르몬 대체 요법을 받은 폐경 후 여성 질내 미생물 군집은 폐경 전 여성 질내 미생물 군집과 매우 유사하게 나타났다. 이러한 결과는, 폐경 후 질내 미생물 군집의 변화가 호르몬 변화에 의해 영향을 받고 호르몬 대체 요법에 의해 역전될 수 있다는 것을 나타낸다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition for diagnosing human papillomavirus infection and cervical cancer <130> DPP20125409KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lepto-395F primer <400> 1 caattctgtg tgtgtgaaga ag 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lepto-646R primer <400> 2 acagttttgt aggcaagcct at 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mega-142F primer <400> 3 gatggggaca acagctgga 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mega-X primer <400> 4 gactctgttt ttggggttt 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27f primer <400> 5 agagtttgat ymtggctcag 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dial649r primer <400> 6 ctctccgata ctccagct 18

Claims (23)

  1. 스니치아 (Sneathia) 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV) 감염 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프라이머는 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내는 프라이머 쌍인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 HPV는 고위험군 HPV인 조성물.
  7. 제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, HPV 감염 진단용 키트.
  8. HPV 감염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 스니치아 미생물을 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    (a) 환자의 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계,
    (b) 상기 추출된 게놈 DNA 에 스니치아 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계, 및
    (c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단계(c)는 중합효소반응을 통해 수행되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 단계(c)의 증폭산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 시료는 자궁경부질 시료인 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
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  20. 삭제
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