EA028686B1

EA028686B1 - Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение

Info

Publication number: EA028686B1
Application number: EA201401195A
Authority: EA
Inventors: Александр Евгеньевич Гущин; Герман Александрович Шипулин
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис"
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2017-12-29
Also published as: RU2014151193A; EA201401195A1; RU2621863C2

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, более конкретно к лабораторной диагностике, и может быть использована для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах методом полимеразной цепной реакции. Предложенный набор реагентов включает по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции, обеспечивающих специфическую амплификацию фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis, лежащего внутри участка криптической плазмиды Chlamydia trachomatis последовательности SEQ ID NO:1. Размер амплифицируемого фрагмента составляет от 70 до 110 пар нуклеотидов. Также предложено применение описанного набора реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis в биологических образцах. Группа изобретений позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара Chlamydia trachomatis с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции.

Description

Группа изобретений относится к медицине, более конкретно к лабораторной диагностике и может быть использована для выявления ДНК СЫатуНа 1гас1юта05 в биологических образцах.

Уровень техники

СЫатуНа 1гас1юта05 - облигатный внутриклеточный бактериальный патоген человека. Инфекция СЫатуЛа 1гас1юта05 (хламидиоз) является самой распространённой бактериальной инфекцией, передаваемой половым путём, инфицируя ежегодно свыше 90 миллионов человек [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап дшбеПпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа РасЬотаН тГесОоп5. 2010].

В настоящее время в пределах вида СЫатуФа 1гас1ютаО5 выделяют 3 биовара и множество сероваров и генотипов: биовар трахома (серовары А-С), урогенитальный биовар (серовары Ό-К) и биовар венерическая лимфогранулема (ЛГВ, серовары Ь1-Ь3) [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап дшбеЬпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуИа 1гас1юта05 1пГес1юп5, 2010]. Представители урогенитального биовара СЫатуНа 1гасйотаЙ5 могут являться причиной воспалительных заболеваний урогенитального тракта у мужчин и женщин, таких как уретриты, цервициты, эпидидимиты. Однако до 90% случаев урогенитального хламидиоза у женщин и более 50% случаев урогенитального хламидиоза у мужчин имеют бессимптомное течение [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап дшбеЬпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа 1гасйота115 1пГес!юп5, 2010]. Инфекции, протекающие бессимптомно, часто остаются не диагностированными и, следовательно, пациентам не назначается адекватная терапия в течение длительного периода времени. В отсутствие лечения хламидийная инфекция приводит к таким серьёзным последствиям, как воспалительные заболевания органов малого таза у женщин, патология беременности, мужское и женское бесплодие, пневмония и конъюнктивит у новорождённых |Ьап]оии Е. е! а1. Еигореап дшбеПпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа !гас1юта05 шРес!юп5, 2010; 1а!оп К. е! а1. А поуе1 геа1-Оте РСК !о бе!ес! СЫатуНа 1гас1юта05 т йг5!-уоН игше ог дет!а1 5\уаЬ5. 1 Меб МюгоЬюР 2006 Оес; 55(Р! 12): 1667-1674].

В связи с затруднённой клинической диагностикой трудно переоценить важность надёжной и эффективной лабораторной диагностики хламидийной инфекции. Традиционные методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций бактериоскопический (микроскопический), бактериологический (культуральный) и иммунологический (серологический) - в настоящее время утратили свое доминирующее положение для диагностики СЫатуНа 1гас1юта05 в развитых странах. Европейское руководство 2010 года по ведению больных с инфекциями, вызванными СЫатуНа !гасйота!15, признает основными методами диагностики современные молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап диЫейпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа !гас1юта05 НГесДопв, 2010]. Наибольшее распространение среди МАНК получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Существует большое количество ш йои5е (домашних) и серийно выпускаемых (коммерческих) наборов реагентов (тест-систем) для выявления ДНК СЫатуНа РасЬотаН методом полимеразной цепной реакции. Наборы различаются генами-мишенями для ПЦР, способами детекции продуктов амплификации, размерами продуктов амплификации, количеством одновременно выявляемых патогенов - от одного до семи [О1тепе5 Р. е! а1. 8еп5Нуе 51ти11апеои5 бе!есбоп оГ 5еуеп 5ехиа11у КапзтИеб адеп!5 ш 5етеп Ьу ти1!1р1ех-РСК апб оГ НРУ Ьу 5тд1е РСК. РЬо8 Опе. 2014 Нп 12; 9(6): е98862. бог 10.1371/)оита1.ропе.0098862. еСойесбоп 2014].

Известен набор реагентов для обнаружения ДНК СЬ1атуб1а !гасЬотаЙ5 методом полимеразной цепной реакции ПОЛИМИК-ХЛ производства ООО НПФ ЛИТЕХ [Регистрационное удостоверение № ФСР 2007/00382 от 16.07.2007]. Детекция продуктов амплификации осуществляется методом гельэлектрофореза.

Известны наборы реагентов для выявления ДНК СЫатуНа !гасЬотаЙ5 методом полимеразной цепной реакции ХЛАМИ-ГЕН производства ООО НПО ДНК-Технология [Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03890 от 26.04.2010]. Наборы производятся в трёх модификациях, различающихся способами детекции продуктов амплификации: детекция методом гель-электрофореза, флуоресцентная детекция по конечной точке и флуоресцентная детекция в режиме реального времени.

В исследовании, посвященном сравнительной оценке тест-систем отечественного производства для выявления ДНК СЬ1атуб1а ЫасЬотаН, сообщается, что в наборе реагентов производства ООО НПФ ЛИТЕХ в качестве мишени для ПЦР используется криптическая плазмида, а в наборах реагентов производства ООО НПО ДНК-Технология в зависимости от способа детекции используются различные мишени: в наборе с детекцией методом гель-электрофореза в качестве мишени используется криптическая плазмида, а в наборе с флуоресцентной детекцией по конечной точке и в режиме реального времени используется ген 168 гКЫА [8ЫрЙ5упа Е. е! а1. Ρίτ5! еуа1иабоп оГ 5ΐχ писШс ааб атрбйсабоп !е5!5 Мбе1у и5еб ш !1е б1адпо515 оГ СЫатуб1а РасЬотаН ш Ки551а. 1 Еиг Асаб ОегтаЮ1 Уепегео1. 2009 Маг; 23(3): 268276]. Однако более детальная информация, касающаяся конкретных фрагментов мишеней, размеров продуктов амплификации, нуклеотидных последовательностей используемых в наборах олигонуклеотидных праймеров и зондов, по сведениям авторов настоящих изобретений, не опубликована в общедоступных источниках информации.

На российском рынке присутствуют наборы реагентов (тест-системы) производства компании

- 1 028686

КосЬе Мо1еси1аг §уз1етз, 1пс. серии СОВА8® ЛМРЫСОК: для выявления ДНК одного патогена - Набор реагентов для детекции ДНК Хламидии Трахоматис (СоЬаз ЛтрЬсог СЫатуЫа !гасЬотайз Эе1ес11оп кЪ), для одновременного выявления двух патогенов - Набор реагентов для амплификации Хламидии Трахоматис и Нейссерии Гонореи (ЛтрЬсог СТ/ΝΟ Атрййсайоп кЬ) [Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2011/09814 25.05.2011]. В наборах реализован принцип флуоресцентной детекции по конечной точке с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя 8УВК ΟΚΕΕΝ. В данных наборах в качестве мишени для выявления СЫатуШа ЙасЬотайз используется криптическая плазмида, и более конкретно фрагмент плазмиды в открытой рамке считывания ОКР1 [ЕР 0420260 В1, ЕР 0630971 В1, ЕР 0875583 В1].

Данные тест-системы были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Рооб апб Огид АбтййзПаЬоп) и были рекомендованы ВОЗ в качестве референсных тест-систем при валидации новых и модифицированных тест-систем [ПРОТОКОЛЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ ВЫЗВАННОЙ СНЬАМУША ТКАСНОМАТ18, (УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ) В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (проект), \у\у\у.сшкугги/П1е5/.\1а1шб1о/.бос|. что свидетельствует об их надёжности. Однако в 2007 году были обнаружены новые мутантные штаммы СЬ1атуб1а ЙасЬотайз (пуСТ), содержащие делецию размером 377 пар нуклеотидов именно в том фрагменте ОКР1 криптической плазмиды, который является мишенью полимеразной цепной реакции в данных диагностических наборах [Кра Т. апб №1ззоп Р.А. А СЬ1атуб1а ЙасЬотайз зйаш \\ЙЬ а 377-Ьр бе1ейоп ш 1Ье сгурйс р1азийб саизшд Га1зе-педайуе пис1ею ааб атрййсайоп 1ез1з. 8е\ Тгапзт Όίδ. 2007 Мау; 34(5): 255-256]. Новые мутантные штаммы получили название шведский вариант по месту их обнаружения. Невозможность обнаружения данных штаммов наборами серии СОВА8® АМРЫСОК и другими наборами со сходной мишенью привело к тысячам ложноотрицательных результатов в диагностике хламидийной инфекции, что, вероятно, способствовало распространению мутантных штаммов [§!еепзе1з Ό. е1 а1. Тоуагбз тиЪЬагде! !езйпд ш то1еси1аг ипсгоЬЫоду. 1п1 1 М1сгоЫо1. 2013; 2013:121057. бог 10.1155/2013/121057. ЕриЬ 2013 №»25. Кеу1ете].

Одним из путей решения проблемы ухода новых шведских вариантов СЬ1атуб1а ЙасЬотайз от обнаружения является введение дополнительной мишени для ПЦР в рамках одной тест-системы. Так, усовершенствованный набор реагентов для выявления СЬ1атуб1а ЙасЬотайз СОВА8® ТацМап® СТ Тез!, ν2.0 [Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2010/07038] компании КосЬе Мо1еси1аг 8уз1етз, 1пс. содержит реагенты для амплификации и детекции в режиме реального времени двух мишеней СЬ1атуб1а ЙасЬотайз: помимо вышеупомянутого фрагмента криптической плазмиды, также хромосомного гена отр-1, кодирующего основной белок внешней мембраны (МОМР). Такой подход, несомненно, повышает надёжность выявления СЬ1атуб1а ЙасЬотайз (снижает количество ложноотрицательных результатов), однако усложняет и удорожает анализ, повышая требования к лабораторному оборудованию (а именно к числу каналов детекции прибора). Кроме того, данный подход - увеличение количества мишеней для выявления одного патогена - снижает возможности одновременного выявления нескольких патогенов в одной пробирке на имеющемся в лаборатории оборудовании, что не вполне отвечает современным потребностям лабораторной диагностики урогенитальных заболеваний, часто протекающих по типу микстинфекций.

Сущность группы изобретений

Задачами настоящей группы изобретений являются: разработка и валидация набора реагентов, позволяющего выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара СЬ1атуб1а ЙасЬотайз (в том числе пуСТ) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции, с возможностью как самостоятельного использования для выявления ДНК одного патогена - СЬ1атуб1а ЙасЬотайз, так и в составе мультиплексного набора для выявления ДНК нескольких патогенов, с возможностью количественного определения ДНК СЬ1атуб1а ЙасЬотайз; расширение арсенала тестсистем для выявления ДНК СЬ1атуб1а ЙасЬотайз.

В рамках настоящих изобретений в качестве мишени для полимеразной цепной реакции была выбрана криптическая плазмида СЬ1атуб1а ЙасЬотайз. Плазмида мультикопийна, то есть содержится в количестве 4-8 копий на клетку, что повышает аналитическую чувствительность тест-систем с данной мишенью по сравнению с тест-системами с однокопийными хромосомными мишенями. Кроме того, последовательность криптической плазмиды высококонсервативна: вариабельность среди представителей различных сероваров внутри одного биовара составляет менее 1% [Сотапбиса М. е! а1. ПИегзЬу оГ !Ье СЬ1атуб1а ЙасЬотайз соттоп р1азт1б т Ьюуагз \\ЙЬ бйТегеп! раФодетсйу. Р1азт1б. 1990 Маг; 23(2): 149154], что делает эту мишень подходящей для выявления всех клинически значимых сероваров урогенитального биовара СЬ1атуб1а ЙасЬотайз при условии выбора фрагмента для амплификации с учётом данных о положении делеции в криптической плазмиде пуСТ.

На основании анализа выравниваний нуклеотидных последовательностей криптических плазмид СЬ1атуб1а ЙасЬотайз из ОепВапк и имеющихся литературных данных о положении делеции в криптической плазмиде пуСТ (шведских вариантов СЬ1атуб1а ЙасЬотайз) был определён высококонсервативный участок внутри открытой рамки считывания 8 (ОКР8) криптической плазмиды, имеющий последо- 2 028686 вательность §ЕЦ ΙΌ N0:1, в качестве оптимальной площадки для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК внутри этой площадки.

Помимо участка для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК криптической плазмиды СЫашуФа 1тасйота118 в рамках настоящих изобретений экспериментальным путём был определён оптимальный размер этого фрагмента (продукта амплификации) от 70 до 110 пар нуклеотидов. Оказалось, что амплификация фрагментов такого размера обладает минимальной восприимчивостью как к примесям-ингибиторам ПЦР, так и к конкуренции со стороны других ПЦР мишеней. Последнее в свою очередь расширяет возможности мультиплексирования ПЦР, то есть одновременного выявления двух и более патогенов в одной реакции (в одной пробирке).

Таким образом поставленные задачи решены созданием набора реагентов для выявления ДНК СЫашуФа ЦасНотайз в образце методом полимеразной цепной реакции, включающего по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции, отличающего тем, что указанные два олигонуклеотидных праймера обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК СЫашуЛа 1тасЬотаЙ8, лежащего внутри участка криптической плазмиды СЫатуЛа 1тасЬотаЙ8 последовательности §ЕЦ ГО N0:1, причём размер фрагмента составляет от 70 до 110 пар нуклеотидов.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности §ЕЦ ГО N0:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности §ЕЦ ГО N0:3.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность §ЕЦ ГО N0:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность §ЕЦ ГО N0:3.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит олигонуклеотидный зонд для детекции фрагмента ДНК СЫатуФа 1гас1ютаО5 в режиме реального времени, где указанный зонд на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на З'-конце содержит гаситель флуоресценции.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что флуоресцентный краситель выбран из группы: ГОЕ, РАМ, К6С, КОХ, Су5, Су5.5, НЕХ.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что гаситель флуоресценции выбран из группы: ВНЦ1, ВНЦ2, ВНЦЗ, КТЦ.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности §ЕЦ ГО N0:4.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность §ЕЦ ГО N0:4.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой (РАМ)-ССССССАССТССТТССАССААССССС-(ВНЦ1).

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой (ГОЕ)-ССССССАССТССТТССАССААССССС-(ВНЦ1).

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит по меньшей мере один калибратор для количественной оценки содержания ДНК СЫашуФа 1гасйотаДз в образце, содержащий известные концентрации фрагмента ДНК СЫашуЛа 1тасйотаЙ8, используемого для выявления ДНК СЫатуФа 1гасЬотаЙ8.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит реагенты для выявления в образце методом мультиплексной полимеразной цепной реакции ДНК по меньшей мере одного дополнительного микроорганизма, выбранного из группы: ХсБзспа допоттйоеае, ТпсНотопаз уадшаПз. Мусор1азта депйайит.

В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что биологический образец для проведения исследования выбран из группы: мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, соскоб из уретры, соскоб из цервикального канала.

Объём притязаний включает также применение вышеописанных наборов реагентов для выявления ДНК СЫашуЛа (гасНотаОз в биологических образцах.

Группа изобретений позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара СЫашуФа 1гас1ютаО5 (в том числе пуСТ) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет определять ДНК СЫашуФа (гасНотайз в количественном формате, что может быть полезно для уточнения диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа. Кроме того, уровень бактериальной нагрузки может иметь патогенетическое и прогностическое значение и оказывать влияние на выбор тактики этиотропной терапии. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет выявлять одновременно несколько возбудителей инфекций, передаваемых половым

- 3 028686 путём, что может быть полезно для диагностики часто встречающихся микст-инфекций урогенитального тракта.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления группы изобретений

Пример 1. Выявление (качественное определение) ДНК СЫатуЛа 1тасЬотаЙ8 в биологических образцах.

В исследование были включены 127 пациентов мужского пола с жалобами на наличие зуда/жжения в области половых органов и/или дизурии. От каждого пациента получали по два биологических образца - соскоба из уретры. Взятые у пациентов уретральные образцы помещали в 1 мл сахарозо-фосфатного буфера. Первый образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием двух референсных наборов реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа 1тасЬотаЙ8 - СОВЛ8® ЛМРЫСОК (КосЬе Мо1еси1аг ЗуЧетч 1пс., США) и ЫдЫ-Μίχ 480 НТ (Т1В МОЬВЮЬ, Германия). Второй образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием набора реагентов по изобретению. Далее проводилось сопоставление результатов, полученных тремя наборами реагентов для выявления ДНК СЬ1атуЛа 1тасЬотаЙ8.

Исследование образцов с использованием двух референсных наборов реагентов.

Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов МадИа Риге ЬС ΌΝΆ ЬоНОоп кй I (КосЬе Мо1еси1аг ВюсЬетюак, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Объем элюции составил 100 мкл, далее образец разводили в 2 раза, добавляя еще 100 мкл буфера. Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 50 мкл полученного элюата. Постановку полимеразной цепной реакции и интерпретацию результатов исследования осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.

Исследование образцов с использованием набора реагентов по изобретению.

Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов ДНКСорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат.№102-22). До выделения ДНК в пробирки вносили по 10 мкл препарата внутреннего контрольного образца (ВКО). Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 10 мкл полученного элюата (объём полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл).

Реакционную смесь для полимеразной цепной реакции готовили следующим образом. Сначала готовили ПЦР-смесь-1, содержащую олигонуклеотидные праймеры, олигонуклеотидные зонды для детекции и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в буфере ТЕ. Состав ПЦР-смеси-1 приведён в табл. 1.

Таблица 1. Состав ПЦР-смеси-1.

Название	Последовательность	Количество (лмоль/реакцию)
Праймеры
СТТ-1 (5ЕР Ю N0:2)	СААОСАОСАСТАСААС СТССААТ	7,5
СТТ-2 (5ЕС2 Ю N0:3)	ССТАООССТТТСТАСТСССТСА	7,5
5ΤΙ-11	ОСОТС С6АТССТСС0 АСТТАТТ	0.4
5ΤΙ-2	СССАСОТАССССААСТТТССТА	0.4
Зонды
σττζ-2 (5Е(5 10 N0:4)	(ЕАМ)-СССС0САС0ТССТТССАССААСССС0-(ВН<Э1)	2.5
νΚΟ-2-КбС	(КбО)-СТАОСТСееСвТСАСбААТСССАСС-(КТСЗ)	0.2
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
6ΝΤΡ ¢4.4 тМ)		4.4

Затем в каждую реакционную пробирку вносили по 10 мкл ПЦР-смеси-1, по 5 мкл ПЦР-смеси-2 геД (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №863), содержащей Тац-полимеразу, и по 10 мкл элюата, полученного при выделении ДНК из биологических образцов.

Амплификацию проводили на приборе КоЮг-Сепе Ц (ΟΙΛΟΕΝ, Германия).

Программа амплификации:

Этап	Температура, °С	Время	Измерение флуоресценции	Количество циклов
НоИ/ Удерж, темп-ры	95	15 мин	-	1
1 СусИпд/ Циклирование	95	5 с
60	20 с	-	5
72	15 с
2 СусНпд/ Циклироаание	95	5 с	-
60	20 с	РАМ, Кб О	40
72	15 с

- 4 028686

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализировались с помощью программного обеспечения прибора Ко!ог-Сепе Р. Сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК СЫатуЛа !гаейотаЙ8, детектировался по каналу Сгееи, ДНК ВКО детектировался по каналу Уе11о\\\ Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла С! в соответствующей графе в таблице результатов.

Результаты интерпретировались следующим образом.

ДНК СЫатуФа 1гаеЬотаЙ8 обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Сгееи определено значение порогового цикла С'Т При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.

ДНК СЫатуФа 1гаеЬотаЙ8 не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Сгееи не определено (отсутствует) значение порогового цикла С! (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу Уе11о\у определено значение порогового цикла С!, не превышающее 33.

Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) или превышает 33 значение порогового цикла С! по каналу для детекции Уе11о\у и не определено (отсутствует) значение порогового цикла С! по каналу Сгееп.

Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов с использованием трех различных наборов реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа !гаейотаЙ8

- 5 028686

Было получено 100%-ное совпадение при тестировании набора по изобретению относительно двух референсных наборов реагентов. Таким образом, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, прогностическое значение положительного результата и прогностическое значение отрицательного результата набора по изобретению составили 100%.

- 7 028686

Также было продемонстрировано, что набор по изобретению позволяет достоверно выявлять наличие ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаЮ в биологических образцах методом мультиплексной полимеразной цепной реакции одновременно с выявлением ДНК других возбудителей инфекций, передаваемых половым путем: №ш5спа допоггйоеае, ТпсНотопах ναβίηαΐίδ. Мусор1а§та депйаПит.

Пример 2. Количественное определение ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаЕш в биологических образцах.

Проводили исследование биологических образцов, описанных в примере 1, с использованием дополнительного набора реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаЕш ХЛАМИ-ГЕН (ООО НПО ДНК-Технология, Россия).

Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в табл. 3. При анализе результатов исследования выявлен дискордантный образец №84.

Таблица 3. Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов с использованием четырех различных наборов реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаШ

- 8 028686

- 9 028686

Далее все образцы, в которых была выявлена ДНК СЫатуФа Тгасйотайк, исследовали методом количественной полимеразной цепной реакции с применением набора по изобретению.

Количественное определение ДНК микроорганизма основывается на существовании линейной зависимости между циклом начала увеличения флуоресценции образца (пороговый цикл, Сус1е Фге8Йо1Д СТ) и исходной концентрацией ДНК-мишени. Для реализации количественного определения в реакции амплификации параллельно используются ДНК-калибраторы - образцы с известной концентрацией ДНК СЫатуФа Тгасйотайк. По результатам амплификации ДНК-калибраторов выстраивается калибровочная прямая, по которой происходит определение концентрации ДНК СЫатуФа Тгасйотайк в образцах.

Калибраторы (К1 и К2) готовили путем разведения стандартного образца производства (СОП) №86 СЫатуФа Тгасйотайк ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, содержащего фрагмент криптической плазмиды СЫатуФа Тгасйотайк, клонированный по сайтам ЕсоК1 в плечи фага λ-λ§Η0. Для разведения исходного СОП используется ДНК-буфер с ро1у(А). Конечная концентрация для калибратора К1 составляет 1-10⁶ ГЭ/мл; для калибратора К2 - 1-10⁴ ГЭ/мл.

Амплификацию проводили на приборе РоЮг-Сепе Ц (ΟΙΑΟΕΝ. Германия). Значения пороговых циклов калибраторов и исследуемых образцов анализировались программой автоматического учета результатов. В соответствии с этими значениями автоматически была построена калибровочная прямая и рассчитаны концентрации ДНК СЫатуФа 1гасйотаЙ8 в исследованных уретральных образцах от 16 пациентов (табл. 4).

- 10 028686

Таблица 4. Результаты количественного определения ДНК СЫатуЛа Часйотабк в исследованных уретральных образцах от 16 пациентов

Установлено, что в дискордантном образце концентрация ДНК СЫатуФа Часйотайк самая низкая из всех исследованных образцов и составляет 6,52Е+02 ГЭ/мл. Данная концентрация ДНК Сбтасйотайк лежит ниже границы аналитической чувствительности набора реагентов ХЛАМИ-ГЕН, что и объясняет получение отрицательного результата при исследовании с использованием этого набора.

Количественное определение ДНК СЫатуЛа йасйотабк может быть полезно для различных клинико-лабораторных и научно-исследовательских целей, таких как уточнение диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа, определении чувствительности различных методов диагностики, мониторинга эффективности терапии. Наконец, количественное определение возбудителя может иметь большое значение в выборе тактики этиотропной терапии, поскольку существуют основания полагать [Нотег Р. Т1е саке £от ГнПНег 1гса1тсп1 ШиШек οί ипсотрПсаЮб депйа1 СЫатуЛа йасйотайк шГесбоп. §ех Тгаикт 1пГес1. 2006 Аид; 82(4): 340-343], что рецидив хламидийной инфекции, не связанный с повторным инфицированием после проведенной антибактериальной терапии, вызван развитием гетеротипической устойчивости в результате высокой бактериальной нагрузки до начала лечения.

Перечень последовательностей <110> ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ ИНТЕРЛАБСЕРВИС <120> НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ΟΗίΑΙΥΥΌΙΑ ТРАСН0МАТ15 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ <160>4 <210> 1 <211 >200 <212> ДНК <213> ΟΗΙΑΜΥΟΙΑ ТКАСНОМАТ15 <400>1 [1сдгаас1с дйссддааа аа!дд|дддд Иааддсааа (сдсссдсас дКсИсаа 60 дсаддайас аадйдсаа! сссИНааг а!аассссдс асд 1дс11сд адсаассдй 120 д1дасддад! асааасдсс! аддд1дс!са дайссдаса 1аа[даадд1 сасгддасас 180 дсаассдсаа ада1да1ай 200 <210? 2 <211 >23 <212>ДНК <213> СНЕАМУО1А ТРАСНОМАТ13 <400>2 саадсаддас 1асаадс(дс аа1 23 <210> 3 <211> 22 <212> ДНК <213> ΟΗίΑΜΥΟΙΑ ТРАСНОМАТ13 <400>3 ссйддсдН (д(ас1ссд( са 22 <210> 4 <211 >26 <212> ДНК <213> ΟΗΕΑΜΥϋΙΑ ТРАСНОМАТ13 <400> 4 ссссдсасд( дсНсдад са ассдод 26

- 11 028686

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Набор реагентов для выявления ДНК СЫатуФа 1гас1ютаН5 в образце, включающий по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции и при необходимости олигонуклеотидный зонд, термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты, отличающийся тем, что первый олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО N0:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО N0:3.
2. Набор реагентов по п.1, характеризующийся тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой олигонуклеотидный зонд для детекции ДНК СЫатуФа 1гас1ютаН5 в режиме реального времени, где указанный зонд на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на З'-конце содержит гаситель флуоресценции.
3. Набор реагентов по п.2, характеризующийся тем, что указанный флуоресцентный краситель выбран из группы: 10Е. РАМ, К6С, КОХ, Су5, Су5.5, НЕХ.
4. Набор реагентов по п.2, характеризующийся тем, что указанный гаситель флуоресценции выбран из группы: ВНЦ1, ВНЦ2, ВНЦЗ, КГЦ.
5. Набор реагентов по п.2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд имеет последовательность §ЕЦ ГО N0:4.
6. Набор реагентов по п.2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд представляет собой (РАМ)-ССССССАССТССТТССАССААССССС-(ВНЦ1).
7. Набор реагентов по п.2, характеризующийся тем, что указанный олигонуклеотидный зонд представляет собой Ц0Е)-ССССССАССТССТТССАССААССССС-(ВНЦ1).
8. Набор реагентов по п.1, характеризующийся тем, что указанный образец выбран из группы: мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, соскоб из уретры, соскоб из цервикального канала.
9. Применение набора реагентов по любому из пп.1-8 для выявления ДНК СЫатуФа 1гас1ютаО5 в образце методом полимеразной цепной реакции.