EA028686B1 - Reagent kit for detection of chlamydia trachomatis dna and application thereof - Google Patents
Reagent kit for detection of chlamydia trachomatis dna and application thereof Download PDFInfo
- Publication number
- EA028686B1 EA028686B1 EA201401195A EA201401195A EA028686B1 EA 028686 B1 EA028686 B1 EA 028686B1 EA 201401195 A EA201401195 A EA 201401195A EA 201401195 A EA201401195 A EA 201401195A EA 028686 B1 EA028686 B1 EA 028686B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- dna
- reagent kit
- kit according
- detection
- chain reaction
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
Description
Группа изобретений относится к медицине, более конкретно к лабораторной диагностике и может быть использована для выявления ДНК СЫатуНа 1гас1юта05 в биологических образцах.The group of inventions relates to medicine, more specifically to laboratory diagnostics and can be used to detect the DNA of Syatun 1 gasslut05 in biological samples.
Уровень техникиState of the art
СЫатуНа 1гас1юта05 - облигатный внутриклеточный бактериальный патоген человека. Инфекция СЫатуЛа 1гас1юта05 (хламидиоз) является самой распространённой бактериальной инфекцией, передаваемой половым путём, инфицируя ежегодно свыше 90 миллионов человек [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап дшбеПпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа РасЬотаН тГесОоп5. 2010].SYATU at 1gas1yut05 - an obligate intracellular bacterial pathogen of man. SyuTula infection 1gas1yut05 (chlamydia) is the most common sexually transmitted bacterial infection, infecting more than 90 million people every year [bai] oi # E. e! a1. Eigoreap dshbePpe Gog Not tapadepet! OG SYATUN ON RACOTAN TGESOOP5. 2010].
В настоящее время в пределах вида СЫатуФа 1гас1ютаО5 выделяют 3 биовара и множество сероваров и генотипов: биовар трахома (серовары А-С), урогенитальный биовар (серовары Ό-К) и биовар венерическая лимфогранулема (ЛГВ, серовары Ь1-Ь3) [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап дшбеЬпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуИа 1гас1юта05 1пГес1юп5, 2010]. Представители урогенитального биовара СЫатуНа 1гасйотаЙ5 могут являться причиной воспалительных заболеваний урогенитального тракта у мужчин и женщин, таких как уретриты, цервициты, эпидидимиты. Однако до 90% случаев урогенитального хламидиоза у женщин и более 50% случаев урогенитального хламидиоза у мужчин имеют бессимптомное течение [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап дшбеЬпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа 1гасйота115 1пГес!юп5, 2010]. Инфекции, протекающие бессимптомно, часто остаются не диагностированными и, следовательно, пациентам не назначается адекватная терапия в течение длительного периода времени. В отсутствие лечения хламидийная инфекция приводит к таким серьёзным последствиям, как воспалительные заболевания органов малого таза у женщин, патология беременности, мужское и женское бесплодие, пневмония и конъюнктивит у новорождённых |Ьап]оии Е. е! а1. Еигореап дшбеПпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа !гас1юта05 шРес!юп5, 2010; 1а!оп К. е! а1. А поуе1 геа1-Оте РСК !о бе!ес! СЫатуНа 1гас1юта05 т йг5!-уоН игше ог дет!а1 5\уаЬ5. 1 Меб МюгоЬюР 2006 Оес; 55(Р! 12): 1667-1674].At present, 3 biovars and many serovars and genotypes are distinguished within the species Syatoupha 1gas1yutO5: biovar trachoma (serovars AC), urogenital biovar (serovars S-K) and biovar venereal lymphogranuloma (LGV, serovars b1-b3) [ua No. E. e! a1. Egoreap dshbe Lope Gog Do not tapadepet! OG SYATUIA 1gas1yut05 1pGes1yup5, 2010]. Representatives of the urogenital biovar Syatuna 1 gasyotaY5 can cause inflammatory diseases of the urogenital tract in men and women, such as urethritis, cervicitis, epididymitis. However, up to 90% of cases of urogenital chlamydia in women and more than 50% of cases of urogenital chlamydia in men have an asymptomatic course [Lai) oi No. E. e! a1. Egoreap dshbe Lope Gog Do not tapadepet! OG SYATU at 1 gasyot115 1nGes! yup5, 2010]. Asymptomatic infections often remain undiagnosed and, therefore, patients are not prescribed adequate therapy for a long period of time. In the absence of treatment, chlamydial infection leads to such serious consequences as inflammatory diseases of the pelvic organs in women, pregnancy pathology, male and female infertility, pneumonia and conjunctivitis in newborns | bap] oi E. e! a1. Eigoreap dshbePpe Gog Not tapadepet! OG SYATUN! Gas1yut05 SHRES! ju5, 2010; 1a! Op K. e! a1. And poey1 gea1-Ote RSK! Oh be! Ec! SYATU At 1gas1yut05 t ng5! -UOn it will be better for you! A1 5 \ ya5. 1 Meb MugoYuR 2006 Oes; 55 (P! 12): 1667-1674].
В связи с затруднённой клинической диагностикой трудно переоценить важность надёжной и эффективной лабораторной диагностики хламидийной инфекции. Традиционные методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций бактериоскопический (микроскопический), бактериологический (культуральный) и иммунологический (серологический) - в настоящее время утратили свое доминирующее положение для диагностики СЫатуНа 1гас1юта05 в развитых странах. Европейское руководство 2010 года по ведению больных с инфекциями, вызванными СЫатуНа !гасйота!15, признает основными методами диагностики современные молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) [Ьаи)ои№ Е. е! а1. Еигореап диЫейпе Гог Не тападетеп! оГ СЫатуНа !гас1юта05 НГесДопв, 2010]. Наибольшее распространение среди МАНК получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).Due to the difficult clinical diagnosis, it is difficult to overestimate the importance of reliable and effective laboratory diagnosis of chlamydial infection. The traditional methods of laboratory diagnosis of bacterial infections, bacterioscopic (microscopic), bacteriological (cultural), and immunological (serological) - have now lost their dominant position for the diagnosis of Syatun 1gaslut05 in developed countries. The 2010 European Guidelines for the Management of Patients with Infections Caused by Syatunas! 15, recognizes modern molecular biological methods based on the amplification of nucleic acids (MAnK) [bai] oi # E. e as the main diagnostic methods. a1. Eigoreap diYeipe Gog Not tapadepet! OG Syatun! Gas1yut05 NGsDopv, 2010]. The polymerase chain reaction (PCR) method was most widely used among IASCs.
Существует большое количество ш йои5е (домашних) и серийно выпускаемых (коммерческих) наборов реагентов (тест-систем) для выявления ДНК СЫатуНа РасЬотаН методом полимеразной цепной реакции. Наборы различаются генами-мишенями для ПЦР, способами детекции продуктов амплификации, размерами продуктов амплификации, количеством одновременно выявляемых патогенов - от одного до семи [О1тепе5 Р. е! а1. 8еп5Нуе 51ти11апеои5 бе!есбоп оГ 5еуеп 5ехиа11у КапзтИеб адеп!5 ш 5етеп Ьу ти1!1р1ех-РСК апб оГ НРУ Ьу 5тд1е РСК. РЬо8 Опе. 2014 Нп 12; 9(6): е98862. бог 10.1371/)оита1.ропе.0098862. еСойесбоп 2014].There are a large number of commercial (home) and commercially available (commercial) reagent kits (test systems) for the detection of Syatun Rasulotan DNA by the polymerase chain reaction. The sets are distinguished by target genes for PCR, methods for detecting amplification products, sizes of amplification products, the number of pathogens simultaneously detected - from one to seven [O1tepe5 R. e! a1. 8ep5Nue 51i11apeoi5 baaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa! PbO8 Opera. 2014 Np 12; 9 (6): e98862. God 10.1371 /) Oita1.rope.0098862. eSoyesbop 2014].
Известен набор реагентов для обнаружения ДНК СЬ1атуб1а !гасЬотаЙ5 методом полимеразной цепной реакции ПОЛИМИК-ХЛ производства ООО НПФ ЛИТЕХ [Регистрационное удостоверение № ФСР 2007/00382 от 16.07.2007]. Детекция продуктов амплификации осуществляется методом гельэлектрофореза.There is a known set of reagents for the detection of CbAtub1a! Quenotai5 DNA by the POLIMIK-HL polymerase chain reaction produced by NPF LITEH LLC [Registration certificate No. FSR 2007/00382 dated July 16, 2007]. Amplification products are detected by gel electrophoresis.
Известны наборы реагентов для выявления ДНК СЫатуНа !гасЬотаЙ5 методом полимеразной цепной реакции ХЛАМИ-ГЕН производства ООО НПО ДНК-Технология [Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03890 от 26.04.2010]. Наборы производятся в трёх модификациях, различающихся способами детекции продуктов амплификации: детекция методом гель-электрофореза, флуоресцентная детекция по конечной точке и флуоресцентная детекция в режиме реального времени.Reagent kits are known for detecting Syatun! GASOTAI5 DNA using the SLAMI-GEN polymerase chain reaction produced by NPO DNA-Technology LLC [Registration certificate No. FSR 2008/03890 of 04/26/2010]. The kits are made in three modifications, differing in the methods of detection of amplification products: detection by gel electrophoresis, fluorescence detection at the end point, and fluorescence detection in real time.
В исследовании, посвященном сравнительной оценке тест-систем отечественного производства для выявления ДНК СЬ1атуб1а ЫасЬотаН, сообщается, что в наборе реагентов производства ООО НПФ ЛИТЕХ в качестве мишени для ПЦР используется криптическая плазмида, а в наборах реагентов производства ООО НПО ДНК-Технология в зависимости от способа детекции используются различные мишени: в наборе с детекцией методом гель-электрофореза в качестве мишени используется криптическая плазмида, а в наборе с флуоресцентной детекцией по конечной точке и в режиме реального времени используется ген 168 гКЫА [8ЫрЙ5упа Е. е! а1. Ρίτ5! еуа1иабоп оГ 5ΐχ писШс ааб атрбйсабоп !е5!5 Мбе1у и5еб ш !1е б1адпо515 оГ СЫатуб1а РасЬотаН ш Ки551а. 1 Еиг Асаб ОегтаЮ1 Уепегео1. 2009 Маг; 23(3): 268276]. Однако более детальная информация, касающаяся конкретных фрагментов мишеней, размеров продуктов амплификации, нуклеотидных последовательностей используемых в наборах олигонуклеотидных праймеров и зондов, по сведениям авторов настоящих изобретений, не опубликована в общедоступных источниках информации.In a study on the comparative evaluation of domestic production test systems for the detection of Cbatub1a LybothotaN DNA, it is reported that a cryptic plasmid is used as a target for PCR in the kit of reagents manufactured by NPF LITECH, and in the kits of reagents manufactured by NPO DNA-Technology, depending on the method different targets are used in the detection: a cryptic plasmid is used as a target in a kit with gel electrophoresis detection, and in a kit with fluorescence detection at the end point and in mode In real time, the 168 hKYA gene is used [8YrY5upa E. e! a1. Ρίτ5! ea1iabop og 5ΐχ писШШ а а aab atrbysabop! e5! 5 Mbe1u and 5eb w! 1e b1adpo515 og Syatub1a Rasotana sh Ki551a. 1 Eig Asab Oegta U1 Upegeo 1. 2009 Mage; 23 (3): 268276]. However, more detailed information regarding specific target fragments, sizes of amplification products, nucleotide sequences used in oligonucleotide primer and probe sets, according to the authors of the present inventions, has not been published in publicly available information sources.
На российском рынке присутствуют наборы реагентов (тест-системы) производства компанииIn the Russian market there are reagent kits (test systems) manufactured by the company
- 1 028686- 1 028686
КосЬе Мо1еси1аг §уз1етз, 1пс. серии СОВА8® ЛМРЫСОК: для выявления ДНК одного патогена - Набор реагентов для детекции ДНК Хламидии Трахоматис (СоЬаз ЛтрЬсог СЫатуЫа !гасЬотайз Эе1ес11оп кЪ), для одновременного выявления двух патогенов - Набор реагентов для амплификации Хламидии Трахоматис и Нейссерии Гонореи (ЛтрЬсог СТ/ΝΟ Атрййсайоп кЬ) [Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2011/09814 25.05.2011]. В наборах реализован принцип флуоресцентной детекции по конечной точке с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя 8УВК ΟΚΕΕΝ. В данных наборах в качестве мишени для выявления СЫатуШа ЙасЬотайз используется криптическая плазмида, и более конкретно фрагмент плазмиды в открытой рамке считывания ОКР1 [ЕР 0420260 В1, ЕР 0630971 В1, ЕР 0875583 В1].Koshe Mo1esi1ag §uz1ets, 1ps. COBA8® LMRISOK series: for the detection of DNA of one pathogen - a reagent kit for Chlamydia Trachomatis DNA detection (Sobaz Lactobacillus echocardiosis), for the simultaneous detection of two pathogens - A set of reagents for the amplification of Chlamydia Trachomatis and Neurysonium pylori ) [Registration certificate No. FSZ 2011/09814 05/25/2011]. In the sets, the principle of fluorescence detection at the end point using the 8UVK лу fluorescent intercalating dye is implemented. In these kits, a cryptic plasmid is used as a target for the detection of Cialis larvae, and more specifically, a fragment of the plasmid in the open reading frame OCR1 [EP 0420260 B1, EP 0630971 B1, EP 0875583 B1].
Данные тест-системы были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Рооб апб Огид АбтййзПаЬоп) и были рекомендованы ВОЗ в качестве референсных тест-систем при валидации новых и модифицированных тест-систем [ПРОТОКОЛЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ ВЫЗВАННОЙ СНЬАМУША ТКАСНОМАТ18, (УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ) В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (проект), \у\у\у.сшкугги/П1е5/.\1а1шб1о/.бос|. что свидетельствует об их надёжности. Однако в 2007 году были обнаружены новые мутантные штаммы СЬ1атуб1а ЙасЬотайз (пуСТ), содержащие делецию размером 377 пар нуклеотидов именно в том фрагменте ОКР1 криптической плазмиды, который является мишенью полимеразной цепной реакции в данных диагностических наборах [Кра Т. апб №1ззоп Р.А. А СЬ1атуб1а ЙасЬотайз зйаш \\ЙЬ а 377-Ьр бе1ейоп ш 1Ье сгурйс р1азийб саизшд Га1зе-педайуе пис1ею ааб атрййсайоп 1ез1з. 8е\ Тгапзт Όίδ. 2007 Мау; 34(5): 255-256]. Новые мутантные штаммы получили название шведский вариант по месту их обнаружения. Невозможность обнаружения данных штаммов наборами серии СОВА8® АМРЫСОК и другими наборами со сходной мишенью привело к тысячам ложноотрицательных результатов в диагностике хламидийной инфекции, что, вероятно, способствовало распространению мутантных штаммов [§!еепзе1з Ό. е1 а1. Тоуагбз тиЪЬагде! !езйпд ш то1еси1аг ипсгоЬЫоду. 1п1 1 М1сгоЫо1. 2013; 2013:121057. бог 10.1155/2013/121057. ЕриЬ 2013 №»25. Кеу1ете].These test systems were approved by the U.S. Food and Drug Administration (Rober apb Ogid AbtijzPaop) and were recommended by WHO as reference test systems for the validation of new and modified test systems (UROGENITAL CHLAMIDIA INFECTION) IN THE RUSSIAN FEDERATION (draft), \ y \ u \ u.shkuggi / P1e5 /. \ 1a1shb1o / .bos |. which indicates their reliability. However, in 2007, new mutant strains of S1atub1a Jabotize (puST) were found containing a deletion of 377 nucleotide sizes in that fragment of the OCP1 cryptic plasmid that is the target of the polymerase chain reaction in these diagnostic kits [Kra T. apb No. 1zop R.A. And S1atub1a Yasotayz zyash \\ Yi a 377-bp beieyop sh 1bе sgurys p1aziyb saizshd G1ze-pedayu pis1eyu aab atryysayop 1es1z. 8e \ Tgapst Όίδ. 2007 Mau; 34 (5): 255-256]. The new mutant strains are called the Swedish variant at the place of their detection. The inability to detect these strains with COBA8® AMRYSOK sets and other sets with a similar target led to thousands of false-negative results in the diagnosis of chlamydial infection, which probably contributed to the spread of mutant strains [§! Ejpze1z Ό. e1 a1. Touaghs tiagh! ! ezpd sh to1esi1ag ipsogodyu. 1n1 1 M1ggoYo1. 2013; 2013: 121057. god 10.1155 / 2013/121057. Episode 2013 No. 25. Keuete].
Одним из путей решения проблемы ухода новых шведских вариантов СЬ1атуб1а ЙасЬотайз от обнаружения является введение дополнительной мишени для ПЦР в рамках одной тест-системы. Так, усовершенствованный набор реагентов для выявления СЬ1атуб1а ЙасЬотайз СОВА8® ТацМап® СТ Тез!, ν2.0 [Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2010/07038] компании КосЬе Мо1еси1аг 8уз1етз, 1пс. содержит реагенты для амплификации и детекции в режиме реального времени двух мишеней СЬ1атуб1а ЙасЬотайз: помимо вышеупомянутого фрагмента криптической плазмиды, также хромосомного гена отр-1, кодирующего основной белок внешней мембраны (МОМР). Такой подход, несомненно, повышает надёжность выявления СЬ1атуб1а ЙасЬотайз (снижает количество ложноотрицательных результатов), однако усложняет и удорожает анализ, повышая требования к лабораторному оборудованию (а именно к числу каналов детекции прибора). Кроме того, данный подход - увеличение количества мишеней для выявления одного патогена - снижает возможности одновременного выявления нескольких патогенов в одной пробирке на имеющемся в лаборатории оборудовании, что не вполне отвечает современным потребностям лабораторной диагностики урогенитальных заболеваний, часто протекающих по типу микстинфекций.One of the ways to solve the problem of avoiding the detection of new Swedish variants of S1atub1a Jabotis is the introduction of an additional target for PCR within the framework of a single test system. Thus, an improved set of reagents for the detection of CI1tub1a Axotis SOVA8® TatMap® CT Tez !, ν2.0 [Registration certificate No. ФЗЗ 2010/07038] of the company Kosye Mo1eci1ag 8uz1ets, 1ps. It contains reagents for the amplification and real-time detection of two targets of Cb1Atub1a Acotaotis: in addition to the aforementioned fragment of the cryptic plasmid, also the chromosomal gene cp-1 encoding the main protein of the outer membrane (MOMP). Such an approach, undoubtedly, increases the reliability of the detection of CI1Tub1a Jabotis (reduces the number of false negative results), but complicates and increases the cost of the analysis, increasing the requirements for laboratory equipment (namely, the number of detection channels of the device). In addition, this approach — an increase in the number of targets for identifying a single pathogen — reduces the possibility of simultaneously identifying several pathogens in a single tube using laboratory equipment, which does not fully meet the modern needs of laboratory diagnostics of urogenital diseases, often occurring as mixtinfection.
Сущность группы изобретенийThe essence of the group of inventions
Задачами настоящей группы изобретений являются: разработка и валидация набора реагентов, позволяющего выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара СЬ1атуб1а ЙасЬотайз (в том числе пуСТ) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции, с возможностью как самостоятельного использования для выявления ДНК одного патогена - СЬ1атуб1а ЙасЬотайз, так и в составе мультиплексного набора для выявления ДНК нескольких патогенов, с возможностью количественного определения ДНК СЬ1атуб1а ЙасЬотайз; расширение арсенала тестсистем для выявления ДНК СЬ1атуб1а ЙасЬотайз.The objectives of this group of inventions are: the development and validation of a reagent kit that allows you to identify all clinically significant strains / genotypes / serovars of the urogenital biovar S1atub1a Jabotayz (including pust) with the help of a single target of the polymerase chain reaction, with the possibility of independent use of one pathogen for DNA detection - S1atub1a Jabotize, and as part of a multiplex kit for the detection of DNA of several pathogens, with the possibility of quantitative determination of the DNA of S1tub1a Jabotize; expanding the arsenal of test systems for the detection of Cb1Atub1a bacillus DNA.
В рамках настоящих изобретений в качестве мишени для полимеразной цепной реакции была выбрана криптическая плазмида СЬ1атуб1а ЙасЬотайз. Плазмида мультикопийна, то есть содержится в количестве 4-8 копий на клетку, что повышает аналитическую чувствительность тест-систем с данной мишенью по сравнению с тест-системами с однокопийными хромосомными мишенями. Кроме того, последовательность криптической плазмиды высококонсервативна: вариабельность среди представителей различных сероваров внутри одного биовара составляет менее 1% [Сотапбиса М. е! а1. ПИегзЬу оГ !Ье СЬ1атуб1а ЙасЬотайз соттоп р1азт1б т Ьюуагз \\ЙЬ бйТегеп! раФодетсйу. Р1азт1б. 1990 Маг; 23(2): 149154], что делает эту мишень подходящей для выявления всех клинически значимых сероваров урогенитального биовара СЬ1атуб1а ЙасЬотайз при условии выбора фрагмента для амплификации с учётом данных о положении делеции в криптической плазмиде пуСТ.In the framework of the present inventions, the cryptic plasmid CIatub1a Jacobotis was chosen as the target for the polymerase chain reaction. The plasmid is multicopy, that is, it is contained in the amount of 4-8 copies per cell, which increases the analytical sensitivity of the test systems with this target in comparison with test systems with single-copy chromosome targets. In addition, the sequence of the cryptic plasmid is highly conserved: the variability among representatives of various serovars within one biovar is less than 1% [Sotapbisa M. e! a1. Piggy wow! Le S1atub1a Ibotayz sotop p1azt1b t Lewuagz \\ bbTegep! raFodetsyu. P1azt1b. 1990 Mage; 23 (2): 149154], which makes this target suitable for the detection of all clinically significant serovars of the urogenital biovar S1atub1a Acotaize, subject to the selection of a fragment for amplification taking into account data on the position of the deletion in the cryptic plasmid pST.
На основании анализа выравниваний нуклеотидных последовательностей криптических плазмид СЬ1атуб1а ЙасЬотайз из ОепВапк и имеющихся литературных данных о положении делеции в криптической плазмиде пуСТ (шведских вариантов СЬ1атуб1а ЙасЬотайз) был определён высококонсервативный участок внутри открытой рамки считывания 8 (ОКР8) криптической плазмиды, имеющий последо- 2 028686 вательность §ЕЦ ΙΌ N0:1, в качестве оптимальной площадки для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК внутри этой площадки.Based on an analysis of the alignment of the nucleotide sequences of the cryptic plasmids CI1tub1a Jabotice from OepWapk and the available literature data on the position of deletion in the cryptic plasmid pST (Swedish versions of Cb1atub1a Jabotize), a highly conserved region was found inside the open reading frame 8 (OCRP8 critical), which has a critical sequence of 8 §EC ΙΌ N0: 1, as an optimal site for the design of oligonucleotide primers for specific amplification of a DNA fragment within this site.
Помимо участка для дизайна олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК криптической плазмиды СЫашуФа 1тасйота118 в рамках настоящих изобретений экспериментальным путём был определён оптимальный размер этого фрагмента (продукта амплификации) от 70 до 110 пар нуклеотидов. Оказалось, что амплификация фрагментов такого размера обладает минимальной восприимчивостью как к примесям-ингибиторам ПЦР, так и к конкуренции со стороны других ПЦР мишеней. Последнее в свою очередь расширяет возможности мультиплексирования ПЦР, то есть одновременного выявления двух и более патогенов в одной реакции (в одной пробирке).In addition to the site for the design of oligonucleotide primers for the specific amplification of the DNA fragment of the cryptic plasmid SyAfuFa118118, within the framework of the present invention, the optimal size of this fragment (amplification product) from 70 to 110 nucleotides was determined experimentally. It turned out that amplification of fragments of this size has minimal susceptibility to both PCR inhibitor impurities and competition from other PCR targets. The latter, in turn, expands the possibilities of multiplexing PCR, that is, the simultaneous detection of two or more pathogens in one reaction (in one tube).
Таким образом поставленные задачи решены созданием набора реагентов для выявления ДНК СЫашуФа ЦасНотайз в образце методом полимеразной цепной реакции, включающего по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции, отличающего тем, что указанные два олигонуклеотидных праймера обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК СЫашуЛа 1тасЬотаЙ8, лежащего внутри участка криптической плазмиды СЫатуЛа 1тасЬотаЙ8 последовательности §ЕЦ ГО N0:1, причём размер фрагмента составляет от 70 до 110 пар нуклеотидов.Thus, the tasks are solved by creating a set of reagents for the detection of DNA of Cyasufac Casnothase in a sample by polymerase chain reaction, which includes at least two oligonucleotide primers for the polymerase chain reaction, characterized in that the two oligonucleotide primers provide specific amplification of the fragment of Cyanoma 1, a portion of the cryptic plasmid SYATUL 1tbot8A8 of the sequence §ETC GO N0: 1, and the fragment size is from 70 to 110 nucleotide pairs.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности §ЕЦ ГО N0:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности §ЕЦ ГО N0:3.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that one oligonucleotide primer has a sequence homologous to at least 80% of the sequence of EEC GO N0: 2, the second oligonucleotide primer has a sequence that is homologous to at least 80% of the sequence of EEC GO N0 : 3.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность §ЕЦ ГО N0:2, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность §ЕЦ ГО N0:3.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that one oligonucleotide primer has the sequence of SEC GO N0: 2, the second oligonucleotide primer has the sequence of SEC GO N0: 3.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит олигонуклеотидный зонд для детекции фрагмента ДНК СЫатуФа 1гас1ютаО5 в режиме реального времени, где указанный зонд на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на З'-конце содержит гаситель флуоресценции.In a particular embodiment, the kit according to the invention is characterized in that it additionally contains an oligonucleotide probe for detecting a DNA fragment of SyatuFa 1gas1yutO5 in real time, where the probe at the 5'-end contains a fluorescent dye, at the 3'-end contains a fluorescence quencher.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что флуоресцентный краситель выбран из группы: ГОЕ, РАМ, К6С, КОХ, Су5, Су5.5, НЕХ.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the fluorescent dye is selected from the group: GO, RAM, K6C, KOH, Su5, Su5.5, HEX.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что гаситель флуоресценции выбран из группы: ВНЦ1, ВНЦ2, ВНЦЗ, КТЦ.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the fluorescence quencher is selected from the group: VNC1, VNC2, VNZZ, KTZ.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности §ЕЦ ГО N0:4.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the oligonucleotide probe has a sequence homologous to at least 80% of the sequence of §EC EC GO N0: 4.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность §ЕЦ ГО N0:4.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the oligonucleotide probe has the sequence §EC EC GO N0: 4.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой (РАМ)-ССССССАССТССТТССАССААССССС-(ВНЦ1).In the particular case of the kit according to the invention is characterized in that the oligonucleotide probe is a (RAM) -SSSSSSASSTSTSTSSASSASSSSS- (VNC1).
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой (ГОЕ)-ССССССАССТССТТССАССААССССС-(ВНЦ1).In the particular case of execution of the kit according to the invention is characterized in that the oligonucleotide probe is a (GOU) -SSSSSSASSTSTSTSSASSASSSSS- (VNC1).
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that it further comprises a thermostable DNA polymerase, a buffer solution for PCR, deoxynucleoside triphosphates.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит по меньшей мере один калибратор для количественной оценки содержания ДНК СЫашуФа 1гасйотаДз в образце, содержащий известные концентрации фрагмента ДНК СЫашуЛа 1тасйотаЙ8, используемого для выявления ДНК СЫатуФа 1гасЬотаЙ8.In the particular case of the kit, the kit according to the invention is characterized in that it further comprises at least one calibrator for quantitatively assessing the content of SyAfuFa1aTiOi8 DNA used for detecting the DNA of SiAfuFaOiotai8.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит реагенты для выявления в образце методом мультиплексной полимеразной цепной реакции ДНК по меньшей мере одного дополнительного микроорганизма, выбранного из группы: ХсБзспа допоттйоеае, ТпсНотопаз уадшаПз. Мусор1азта депйайит.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that it additionally contains reagents for detecting in the sample by the method of multiplex polymerase chain reaction of DNA at least one additional microorganism selected from the group: Chsbzspa dopotnoea, Tpsnotopas wadsha Pz. Garbage 1azta depyayit.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что биологический образец для проведения исследования выбран из группы: мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, соскоб из уретры, соскоб из цервикального канала.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the biological sample for conducting the study is selected from the group: swab from the vagina, urine, seminal fluid, scraping from the urethra, scraping from the cervical canal.
Объём притязаний включает также применение вышеописанных наборов реагентов для выявления ДНК СЫашуЛа (гасНотаОз в биологических образцах.The scope of the claims also includes the use of the above sets of reagents for detecting SyAshuLa DNA (GasNotaOz in biological samples.
Группа изобретений позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять все клинически значимые штаммы/генотипы/серовары урогенитального биовара СЫашуФа 1гас1ютаО5 (в том числе пуСТ) с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет определять ДНК СЫашуФа (гасНотайз в количественном формате, что может быть полезно для уточнения диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа. Кроме того, уровень бактериальной нагрузки может иметь патогенетическое и прогностическое значение и оказывать влияние на выбор тактики этиотропной терапии. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет выявлять одновременно несколько возбудителей инфекций, передаваемых половымThe group of inventions allows with high sensitivity and specificity to identify all clinically significant strains / genotypes / serovars of the urogenital biovar Syashufa 1gas1yuta5 (including pust) with the help of a single target polymerase chain reaction. In the particular case of the invention, the group of inventions allows the determination of SyAfuF DNA (gasNotize in a quantitative format, which may be useful for clarifying the diagnosis with dubious / discordant results of the analysis. In addition, the level of bacterial load can have pathogenetic and prognostic value and influence the choice of etiotropic therapy tactics In the particular case of performing a group of inventions, it is possible to identify simultaneously several pathogens of sexually transmitted infections
- 3 028686 путём, что может быть полезно для диагностики часто встречающихся микст-инфекций урогенитального тракта.- 3 028686 by the way, which may be useful for the diagnosis of frequently occurring mixed infections of the urogenital tract.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления группы изобретенийInformation confirming the possibility of implementing a group of inventions
Пример 1. Выявление (качественное определение) ДНК СЫатуЛа 1тасЬотаЙ8 в биологических образцах.Example 1. Detection (qualitative determination) of the DNA of Syuatula lactobacillus 8 in biological samples.
В исследование были включены 127 пациентов мужского пола с жалобами на наличие зуда/жжения в области половых органов и/или дизурии. От каждого пациента получали по два биологических образца - соскоба из уретры. Взятые у пациентов уретральные образцы помещали в 1 мл сахарозо-фосфатного буфера. Первый образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием двух референсных наборов реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа 1тасЬотаЙ8 - СОВЛ8® ЛМРЫСОК (КосЬе Мо1еси1аг ЗуЧетч 1пс., США) и ЫдЫ-Μίχ 480 НТ (Т1В МОЬВЮЬ, Германия). Второй образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием набора реагентов по изобретению. Далее проводилось сопоставление результатов, полученных тремя наборами реагентов для выявления ДНК СЬ1атуЛа 1тасЬотаЙ8.The study included 127 male patients with complaints of itching / burning in the genital area and / or dysuria. Two biological samples were obtained from each patient — scrapings from the urethra. Urethral samples taken from patients were placed in 1 ml of sucrose-phosphate buffer. The first sample was studied by the polymerase chain reaction using two reference sets of reagents for the detection of DNA of Syatul 1tasotai8 - SOVL8® LMRYSOK (Kosye Mo1esi1ag ZuCHetch 1ps., United States) and Ydydy-Μίχ 480 NT (T1V MOUVYu, Germany). The second sample was investigated by polymerase chain reaction using a kit of reagents according to the invention. Next, a comparison was made of the results obtained with three sets of reagents for the detection of Cb1Atula 1tabotaota8 DNA.
Исследование образцов с использованием двух референсных наборов реагентов.Examination of samples using two reference sets of reagents.
Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов МадИа Риге ЬС ΌΝΆ ЬоНОоп кй I (КосЬе Мо1еси1аг ВюсЬетюак, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Объем элюции составил 100 мкл, далее образец разводили в 2 раза, добавляя еще 100 мкл буфера. Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 50 мкл полученного элюата. Постановку полимеразной цепной реакции и интерпретацию результатов исследования осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.DNA was isolated from biological samples using a set of reagents: Madia Riga Riga LbOnoppy I (Koscie Mo1esiag Vuszjetiuak, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions. The elution volume was 100 μl, then the sample was diluted 2 times, adding another 100 μl of buffer. For amplification of DNA by polymerase chain reaction, 50 μl of the obtained eluate was used. The formulation of the polymerase chain reaction and the interpretation of the research results were carried out in accordance with the manufacturer's instructions.
Исследование образцов с использованием набора реагентов по изобретению.Examination of samples using the reagent kit of the invention.
Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов ДНКСорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат.№102-22). До выделения ДНК в пробирки вносили по 10 мкл препарата внутреннего контрольного образца (ВКО). Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 10 мкл полученного элюата (объём полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл).DNA was isolated from biological samples using the DNASorb-AM reagent kit (Federal State Institution of Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, cat. No. 102-22). Prior to DNA isolation, 10 μl of the preparation of the internal control sample (CTP) was added to the tubes. For amplification of DNA by polymerase chain reaction, 10 μl of the obtained eluate was used (the volume of the obtained eluate after extraction was 100 μl).
Реакционную смесь для полимеразной цепной реакции готовили следующим образом. Сначала готовили ПЦР-смесь-1, содержащую олигонуклеотидные праймеры, олигонуклеотидные зонды для детекции и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в буфере ТЕ. Состав ПЦР-смеси-1 приведён в табл. 1.The reaction mixture for the polymerase chain reaction was prepared as follows. First, a PCR mixture-1 was prepared containing oligonucleotide primers, oligonucleotide probes for detection, and deoxyribonucleoside triphosphates in TE buffer. The composition of the PCR mixture-1 is given in table. one.
Таблица 1. Состав ПЦР-смеси-1.Table 1. Composition of the PCR mixture-1.
Затем в каждую реакционную пробирку вносили по 10 мкл ПЦР-смеси-1, по 5 мкл ПЦР-смеси-2 геД (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №863), содержащей Тац-полимеразу, и по 10 мкл элюата, полученного при выделении ДНК из биологических образцов.Then, 10 μl of PCR mixture-1, 5 μl of PCR mixture-2 heD (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, Cat. No. 863) containing Tatz polymerase, and 10 μl of the eluate obtained when isolating DNA from biological samples.
Амплификацию проводили на приборе КоЮг-Сепе Ц (ΟΙΛΟΕΝ, Германия).Amplification was performed on a CoYug-Sepe Ts instrument (ΟΙΛΟΕΝ, Germany).
Программа амплификации:Amplification program:
- 4 028686- 4,028,686
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализировались с помощью программного обеспечения прибора Ко!ог-Сепе Р. Сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК СЫатуЛа !гаейотаЙ8, детектировался по каналу Сгееи, ДНК ВКО детектировался по каналу Уе11о\\\ Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла С! в соответствующей графе в таблице результатов.The data obtained — the curves of fluorescence signal accumulation over two channels — were analyzed using the Co-Og-Sepe R. software. A signal indicating the accumulation of the amplification product of the DNA fragment of SYATULAHAYOTE8, was detected by the Sgeei channel, the CTP DNA was detected by the Be11o \\ channel \ The results were interpreted on the basis of the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which determines the presence (or absence) of a given daylight sample To the value of the threshold cycle C! in the corresponding column in the results table.
Результаты интерпретировались следующим образом.The results were interpreted as follows.
ДНК СЫатуФа 1гаеЬотаЙ8 обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Сгееи определено значение порогового цикла С'Т При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.The DNA of Syuatopha ligotilla8 was detected if the value of the threshold cycle C'T was determined for a given sample in the results table for the Sgeei channel. In addition, the fluorescence curve of this sample should cross the threshold line at the site of a characteristic exponential increase in fluorescence.
ДНК СЫатуФа 1гаеЬотаЙ8 не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Сгееи не определено (отсутствует) значение порогового цикла С! (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу Уе11о\у определено значение порогового цикла С!, не превышающее 33.The DNA of Syatoupha gaibiota8 is not detected if for this sample in the table of results on the channel Cgeea the value of the threshold cycle C is not defined (absent)! (the fluorescence curve does not cross the threshold line), and the value of the threshold cycle C !, not exceeding 33, is determined in the table of results for the Ue11o \ y channel.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) или превышает 33 значение порогового цикла С! по каналу для детекции Уе11о\у и не определено (отсутствует) значение порогового цикла С! по каналу Сгееп.The result of the analysis is invalid if for this sample it is not determined (absent) or exceeds the value of the threshold cycle C! the value of the threshold cycle C is not determined (absent) through the channel for detecting U11O \ y; on the Sgeep channel.
Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в табл. 2.The results of the study of urethral samples from 127 patients are given in table. 2.
Таблица 2. Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов с использованием трех различных наборов реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа !гаейотаЙ8Table 2. The results of the study of urethral samples from 127 patients using three different sets of reagents for the detection of DNA Syuatula!
- 5 028686- 5,028,686
Было получено 100%-ное совпадение при тестировании набора по изобретению относительно двух референсных наборов реагентов. Таким образом, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, прогностическое значение положительного результата и прогностическое значение отрицательного результата набора по изобретению составили 100%.A 100% match was obtained when testing the kit of the invention with respect to two reference reagent kits. Thus, the diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, prognostic value of a positive result and the prognostic value of a negative result of a kit according to the invention were 100%.
- 7 028686- 7,028,686
Также было продемонстрировано, что набор по изобретению позволяет достоверно выявлять наличие ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаЮ в биологических образцах методом мультиплексной полимеразной цепной реакции одновременно с выявлением ДНК других возбудителей инфекций, передаваемых половым путем: №ш5спа допоггйоеае, ТпсНотопах ναβίηαΐίδ. Мусор1а§та депйаПит.It was also demonstrated that the kit according to the invention allows to reliably detect the presence of Syatul Egasnota DNA in biological samples by the method of multiplex polymerase chain reaction simultaneously with the detection of DNA of other sexually transmitted infection pathogens: No. 5spa additional antioxidants, TpNotopes ναβίηαΐίδ. Garbage 1pta depyaPit.
Пример 2. Количественное определение ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаЕш в биологических образцах.Example 2. Quantitative determination of the DNA of Syatul EgasNotaEs in biological samples.
Проводили исследование биологических образцов, описанных в примере 1, с использованием дополнительного набора реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаЕш ХЛАМИ-ГЕН (ООО НПО ДНК-Технология, Россия).The biological samples described in Example 1 were studied using an additional set of reagents for DNA detection SYATUL EgasNotaESh KHLAMI-GEN (NPO DNA-Technology LLC, Russia).
Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов приведены в табл. 3. При анализе результатов исследования выявлен дискордантный образец №84.The results of the study of urethral samples from 127 patients are given in table. 3. When analyzing the results of the study revealed discordant sample No. 84.
Таблица 3. Результаты исследования уретральных образцов от 127 пациентов с использованием четырех различных наборов реагентов для выявления ДНК СЫатуЛа ЕгасНотаШTable 3. The results of the study of urethral samples from 127 patients using four different sets of reagents for DNA detection SYATUL EgasNotaSh
- 8 028686- 8 028686
- 9 028686- 9,028,686
Далее все образцы, в которых была выявлена ДНК СЫатуФа Тгасйотайк, исследовали методом количественной полимеразной цепной реакции с применением набора по изобретению.Further, all samples in which the DNA of Syatuf Tgasyotike was detected were investigated by the method of quantitative polymerase chain reaction using the kit according to the invention.
Количественное определение ДНК микроорганизма основывается на существовании линейной зависимости между циклом начала увеличения флуоресценции образца (пороговый цикл, Сус1е Фге8Йо1Д СТ) и исходной концентрацией ДНК-мишени. Для реализации количественного определения в реакции амплификации параллельно используются ДНК-калибраторы - образцы с известной концентрацией ДНК СЫатуФа Тгасйотайк. По результатам амплификации ДНК-калибраторов выстраивается калибровочная прямая, по которой происходит определение концентрации ДНК СЫатуФа Тгасйотайк в образцах.The quantitative determination of the microorganism's DNA is based on the existence of a linear relationship between the cycle of the onset of increase in fluorescence of the sample (threshold cycle, Cus1e Phge8Jo1D ST) and the initial concentration of the target DNA. In order to implement a quantitative determination in the amplification reaction, DNA calibrators are used in parallel - samples with a known concentration of DNA of Syatuf Tgasyotayk. According to the results of amplification of DNA calibrators, a calibration line is built, according to which the concentration of DNA of Syatuf Tgasyotayk in the samples is determined.
Калибраторы (К1 и К2) готовили путем разведения стандартного образца производства (СОП) №86 СЫатуФа Тгасйотайк ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, содержащего фрагмент криптической плазмиды СЫатуФа Тгасйотайк, клонированный по сайтам ЕсоК1 в плечи фага λ-λ§Η0. Для разведения исходного СОП используется ДНК-буфер с ро1у(А). Конечная концентрация для калибратора К1 составляет 1-106 ГЭ/мл; для калибратора К2 - 1-104 ГЭ/мл.Calibrators (K1 and K2) were prepared by diluting a production standard sample (SOP) No. 86 of SYATuF Tgasyotayk Federal Research Institute of Epidemiology of the Federal Service for Supervision of Human Welfare, containing a fragment of the cryptic plasmid SYATuFa Tgasyotayk cloned from the EcoK1 sites into the shoulders of λ0 phage λ-phage. For dilution of the initial SOP, a DNA buffer with po1u (A) is used. The final concentration for the K1 calibrator is 1-10 6 GE / ml; for K2 calibrator - 1-10 4 GE / ml.
Амплификацию проводили на приборе РоЮг-Сепе Ц (ΟΙΑΟΕΝ. Германия). Значения пороговых циклов калибраторов и исследуемых образцов анализировались программой автоматического учета результатов. В соответствии с этими значениями автоматически была построена калибровочная прямая и рассчитаны концентрации ДНК СЫатуФа 1гасйотаЙ8 в исследованных уретральных образцах от 16 пациентов (табл. 4).Amplification was carried out on a RoYug-Sepe Ts device (). Germany). The values of the threshold cycles of calibrators and test samples were analyzed by the program of automatic calculation of results. In accordance with these values, a calibration line was automatically constructed and the concentration of DNA of Syatufa 1 gaotaota 8 in the studied urethral samples from 16 patients was calculated (Table 4).
- 10 028686- 10,028,686
Таблица 4. Результаты количественного определения ДНК СЫатуЛа Часйотабк в исследованных уретральных образцах от 16 пациентовTable 4. Results of quantitative determination of Syatul Chasotabc DNA in the studied urethral samples from 16 patients
Установлено, что в дискордантном образце концентрация ДНК СЫатуФа Часйотайк самая низкая из всех исследованных образцов и составляет 6,52Е+02 ГЭ/мл. Данная концентрация ДНК Сбтасйотайк лежит ниже границы аналитической чувствительности набора реагентов ХЛАМИ-ГЕН, что и объясняет получение отрицательного результата при исследовании с использованием этого набора.It was found that in the discordant sample, the concentration of SyatuFa Chasotayk DNA is the lowest of all the studied samples and is 6.52E + 02 GE / ml. This concentration of Sbtasyotike DNA lies below the analytical sensitivity of the KLAMI-GEN reagent kit, which explains the negative result when tested using this kit.
Количественное определение ДНК СЫатуЛа йасйотабк может быть полезно для различных клинико-лабораторных и научно-исследовательских целей, таких как уточнение диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа, определении чувствительности различных методов диагностики, мониторинга эффективности терапии. Наконец, количественное определение возбудителя может иметь большое значение в выборе тактики этиотропной терапии, поскольку существуют основания полагать [Нотег Р. Т1е саке £от ГнПНег 1гса1тсп1 ШиШек οί ипсотрПсаЮб депйа1 СЫатуЛа йасйотайк шГесбоп. §ех Тгаикт 1пГес1. 2006 Аид; 82(4): 340-343], что рецидив хламидийной инфекции, не связанный с повторным инфицированием после проведенной антибактериальной терапии, вызван развитием гетеротипической устойчивости в результате высокой бактериальной нагрузки до начала лечения.Quantitative determination of Syatula DNA can be useful for various clinical, laboratory and research purposes, such as clarifying the diagnosis for questionable / discordant analysis results, determining the sensitivity of various diagnostic methods, and monitoring the effectiveness of therapy. Finally, the quantification of the causative agent can be of great importance in the choice of etiotropic therapy tactics, since there are reasons to believe [Noteg R. T1e sake Г GNPNeg 1gsa1tsp1 ShiShek ίί псотсотПрП деп деп деп деп депйййй11ЫЫатуЛЛ ЛатуЛЛопопопопопопопопопопопопопопопопопопоп §Ex Tgaikt 1nGes1. 2006 Hades; 82 (4): 340-343], that the recurrence of chlamydial infection, not associated with reinfection after antibiotic therapy, is caused by the development of heterotypic resistance as a result of high bacterial load before treatment.
Перечень последовательностей <110> ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ ИНТЕРЛАБСЕРВИС <120> НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ΟΗίΑΙΥΥΌΙΑ ТРАСН0МАТ15 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ <160>4 <210> 1 <211 >200 <212> ДНК <213> ΟΗΙΑΜΥΟΙΑ ТКАСНОМАТ15 <400>1 [1сдгаас1с дйссддааа аа!дд|дддд Иааддсааа (сдсссдсас дКсИсаа 60 дсаддайас аадйдсаа! сссИНааг а!аассссдс асд 1дс11сд адсаассдй 120 д1дасддад! асааасдсс! аддд1дс!са дайссдаса 1аа[даадд1 сасгддасас 180 дсаассдсаа ада1да1ай 200 <210? 2 <211 >23 <212>ДНК <213> СНЕАМУО1А ТРАСНОМАТ13 <400>2 саадсаддас 1асаадс(дс аа1 23 <210> 3 <211> 22 <212> ДНК <213> ΟΗίΑΜΥΟΙΑ ТРАСНОМАТ13 <400>3 ссйддсдН (д(ас1ссд( са 22 <210> 4 <211 >26 <212> ДНК <213> ΟΗΕΑΜΥϋΙΑ ТРАСНОМАТ13 <400> 4 ссссдсасд( дсНсдад са ассдод 26List of sequences <110> SOCIETY WITH LIMITED LIABILITY INTERLABSERVICE <120> REAGENT SET FOR IDENTIFICATION OF DNA ΟΗίΑΙΥΥΌΙΑ TRACH0MAT15 AND ITS APPLICATION <160> 4 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> ATc 1 Tca dyssddaaaaa! dd | ddddd Iaaddsaaa (sdsssdsas dKsIsaa 60 dsaddyas aadydsaa! sssINaag a! aasssdsds asd 1dds11sdd <! <213> SNEAMUOA TRACNOMAT13 <400> 2 saadsaddas 1asaads (ds aa1 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> ΟΗίΑΜΥΟΙΑ TRASNOMAT13 <4 00> 3 ssiddsdN (d (as1ssd (sa 22 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> ΟΗΕΑΜΥϋΙΑ TRASNOMAT13 <400> 4 ssssdsdas (dsnsdas sa assdod 26
- 11 028686- 11 028686
Claims (9)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201401195A EA028686B1 (en) | 2014-11-14 | 2014-11-14 | Reagent kit for detection of chlamydia trachomatis dna and application thereof |
| RU2014151193A RU2621863C2 (en) | 2014-11-14 | 2014-12-18 | Reagent kit for chlamydia trachomatis dna detection and its application |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201401195A EA028686B1 (en) | 2014-11-14 | 2014-11-14 | Reagent kit for detection of chlamydia trachomatis dna and application thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201401195A1 EA201401195A1 (en) | 2016-05-31 |
| EA028686B1 true EA028686B1 (en) | 2017-12-29 |
Family
ID=56080128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201401195A EA028686B1 (en) | 2014-11-14 | 2014-11-14 | Reagent kit for detection of chlamydia trachomatis dna and application thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA028686B1 (en) |
| RU (1) | RU2621863C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110923345B (en) * | 2019-12-19 | 2023-06-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | Colloidal gold chromatography kit for chlamydia trachomatis detection and application thereof |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0336412A2 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-11 | SCLAVO S.p.A. | Synthetic oligonucleotides useful for the determination of Chlamydia trachomatis in a biological sample |
| RU2245369C1 (en) * | 2003-05-05 | 2005-01-27 | Смоленская государственная медицинская академия | Method for differential diagnosis of representatives of family chlamydiaceae |
| WO2007056398A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Chlamydia trachomatis specific oligonucleotide sequences |
| RU2385946C1 (en) * | 2008-12-26 | 2010-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Diagnostic technique for human or simian chlamidia infection and kit for implementation thereof |
| RU2385945C1 (en) * | 2008-12-26 | 2010-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Method for prediction of human or simian manifested or obliterated chlamidia infection and kit for implementation thereof |
| RU2443782C1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Method for chlamydia trachomatis genotyping |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US20070065837A1 (en) * | 2005-09-21 | 2007-03-22 | Qiagen Diagnostics Gmbh | Methods and compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
-
2014
- 2014-11-14 EA EA201401195A patent/EA028686B1/en unknown
- 2014-12-18 RU RU2014151193A patent/RU2621863C2/en active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0336412A2 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-11 | SCLAVO S.p.A. | Synthetic oligonucleotides useful for the determination of Chlamydia trachomatis in a biological sample |
| RU2245369C1 (en) * | 2003-05-05 | 2005-01-27 | Смоленская государственная медицинская академия | Method for differential diagnosis of representatives of family chlamydiaceae |
| WO2007056398A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Chlamydia trachomatis specific oligonucleotide sequences |
| RU2385946C1 (en) * | 2008-12-26 | 2010-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Diagnostic technique for human or simian chlamidia infection and kit for implementation thereof |
| RU2385945C1 (en) * | 2008-12-26 | 2010-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Method for prediction of human or simian manifested or obliterated chlamidia infection and kit for implementation thereof |
| RU2443782C1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Method for chlamydia trachomatis genotyping |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2621863C2 (en) | 2017-06-07 |
| EA201401195A1 (en) | 2016-05-31 |
| RU2014151193A (en) | 2016-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2020146052A (en) | Method, primers and kits for diagnosing colorectal cancer from human fecal samples by quantitative pcr | |
| Shipitsyna et al. | Evaluation of polymerase chain reaction assays for the diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia | |
| KR101848037B1 (en) | Compositions of human vaginal microbiota | |
| Polo et al. | Evaluation of PCR assays for Campylobacter fetus detection and discrimination between C. fetus subspecies in bovine preputial wash samples | |
| JP2017524943A (en) | S. Predicting Aureus disease | |
| KR101739749B1 (en) | Method and kit for diagnosing vaginitis using real-time PCR | |
| RU2646123C1 (en) | Method for identification of mutations resistant to resistance in mycoplasma genitalium and mycoplasma pneumoniae to macrolid antibiotics | |
| CN108866164A (en) | The streptococcic detection method of B race and kit | |
| Mania‐Pramanik et al. | Diagnosis of Chlamydia trachomatis infection | |
| Mascellino et al. | Chlamydia trachomatis detection in a population of asymptomatic and symptomatic women: correlation with the presence of serological markers for this infection | |
| Okuda et al. | Detection of Chlamydophila psittaci by using SYBR green real-time PCR | |
| Högdahl et al. | Leucocyte esterase testing of first-voided urine and urethral and cervical smears to identify Mycoplasma genitalium-infected men and women | |
| EA028686B1 (en) | Reagent kit for detection of chlamydia trachomatis dna and application thereof | |
| RU2715333C1 (en) | Kit of reagents for detection and identification of dna of brucellosis agents by real-time polymerase chain reaction om-screen-brucellosis-rv | |
| Krkalić et al. | Chlamydophila abortus infection in a flock of goats in Bosnia and Herzegovina. | |
| Sarker et al. | Seroprevalence and Molecular Diagnosis of Brucella abortus and Brucella melitensis in Bangladesh. | |
| JP2013504319A (en) | Peptide nucleic acid probe, kit and method for detecting Helicobacter pylori and / or clarithromycin resistance, and use thereof | |
| US11898210B2 (en) | Tools for assessing FimH blockers therapeutic efficiency | |
| RU2595398C1 (en) | Kit of reagents for detection of neisseria gonorrhoeae dna and use thereof | |
| JP2004057207A (en) | Method for detecting human adenovirus | |
| Riyadh et al. | Detection of Brucella abortus in Cows Suffering From Some Reproductive Disorders | |
| WO2020218802A1 (en) | Use of p44 as marker for diagnosing anaplasmosis | |
| KR101742016B1 (en) | Oligonucleotide for detecting Chlamydia trachomatis and/or Neisseria gonorrhoeae, and kit using the same | |
| Gullsby et al. | Comparison of three real-time PCR methods for detection of macrolide-resistant Mycoplasma genitalium in Sweden | |
| ES2375141T3 (en) | SPECIFIC DETECTION OF THE GENOTYPE OF CHLAMYDOPHILA PSITTACI. |