JP2017524943A - S.アウレウス疾患の予測 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明によれば、S.アウレウスにより重度にコロニー形成されているがS.アウレウス疾患の症状を一切示していない対象におけるS.アウレウス疾患の予測のための方法が提供され、前記の方法は、標準または参照対照と比較した前記の対象の生物学的試料中のアルファ溶血素のレベルを決定する工程を含み、ここで、高められたアルファ溶血素のレベルは、S.アウレウス疾患の発症、特に、疾患または疾患の進行の診断につながる症状の速い出現を示している。
具体的には、対象は、鼻または鼻咽頭においてコロニー形成されており、そして対象は挿管を受けている。本明細書で記載されるアルファ溶血素レベルの決定に基づいて、高度に溶血性の株が、挿管の前に鼻または鼻咽頭において検出されることができ、それは、疾患進行のリスク評価および挿管の際の下気道におけるコロニー形成を予防する特異的な前処置手段を可能にする。そのようなコロニー形成は、通常は無症候性に鼻または鼻咽頭にコロニー形成しているであろうが、細菌は、挿管の際に下気道中に持ち込まれて対象を重度の下気道コロニー形成および関連疾患を発症するリスクに晒す可能性がある。同様に、本方法は、既に挿管されている対象の鼻または鼻咽頭における本明細書で記載されるアルファ溶血素レベルの決定および高度に溶血性の株の検出を提供し、疾患進行のリスク評価を可能にする。
具体的には、参照または対照は、予め決定されたアルファ溶血素のレベルであるか、または参照もしくは対照値(例えばカットオフ値または閾値または参照値)を、生物学的物質、例えば予め決定されたS.アウレウス疾患のリスクを有する対象の比較可能な生物学的試料から得られた、もしくは特定のレベルのアルファ溶血素を発現するS.アウレウス株から得られた予め決定されたアルファ溶血素のレベルに対して較正することにより得られる。
具体的には、前記の少なくとも1種類の追加のマーカーの測定は、アルファ溶血素以外のいずれかのS.アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはいずれかのS.アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物の決定を含み、それは好ましくは以下:
i)S.アウレウスプロテインA;
ii)S.アウレウスの抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともPBP2a、mecA遺伝子またはmecA遺伝子の発現産物のいずれか;
iii)S.アウレウスの細胞毒、好ましくはパントン・バレンタインロイコシジン(PVL/LukSF)、LukGH(LukAB)、ガンマ溶血素、LukEDを含むあらゆる他のS.アウレウス抗原;S.アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質;またはあらゆるS.アウレウス特異的化合物、例えばリポテイコ酸、ならびに
iii)好ましくは追加のマーカーとして少なくともS.アウレウスプロテインAおよびPBP2aを決定する、i)、ii)および/またはiii)の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ;
からなる群より選択される。
a)疾患バイオマーカー、特にアルファ溶血素;ならびに
b)S.アウレウスの検出(プロテインA)および耐性マーカー(例えばPBP2a);ならびに場合によりさらなるマーカー;
に関する試験を含む。
本発明によれば、貯蔵安定形態である新規のアルファ溶血素診断キットがさらに提供される。そのようなキットは、好ましくは生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定するための全ての必須の構成要素を、場合により一般的または非特異的な物質または構成要素、例えば水、緩衝剤または賦形剤を除いて含む。貯蔵安定なキットは、好ましくは少なくとも6ヵ月間、より好ましくは少なくとも1または2年間貯蔵されることができる。それは、乾燥した(例えば凍結乾燥された)構成要素で構成されていることができ、および/または保存剤を含むことができる。
別の特定の側面によれば、本発明はさらに、生物学的試料中のアルファ溶血素レベルの決定のための診断キットを提供し、それは、前記の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを定量化するためにアルファ溶血素特異的検出分子およびアルファ溶血素参照物質、例えば標準アルファ溶血素調製物を含む。
−基質を含む反応混合物を提供し、ここで、その基質は、少なくとも1種類のアルファ溶血素結合剤を含み;
−生物学的試料を反応混合物と接触させ;そして
−結合剤により認識されたアルファ溶血素の量に対応する検出信号を検出する。
a)S.アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる1種類以上の試薬および/またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的な検出分子を含むキット;ならびに
b)好ましくは以下:
i)S.アウレウスプロテインA;
ii)S.アウレウス抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともPBP2a、mecA遺伝子またはmecA遺伝子の発現産物のいずれか;
iii)S.アウレウス細胞毒、好ましくはPVL/LukSF、LukGH(LukAB)、ガンマ溶血素、LukED;S.アウレウス病毒性因子、分泌および表面タンパク質;またはあらゆるS.アウレウス特異的化合物、例えばリポテイコ酸を含むあらゆる他のS.アウレウス抗原、ならびに
iii)好ましくは追加のマーカーとして少なくともS.アウレウスプロテインAおよびPBP2aを決定する、i)、ii)および/またはiii)の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ;
からなる群より選択される、アルファ溶血素以外のS.アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはS.アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物を決定するのに適した試薬および/または特異的な検出分子を含むキット。
SEQ ID 2:USA300 TCH1516株のHlaアミノ酸配列。
一度分離株が得られたら、細菌は、例えばMSSAまたはMRSAのタイプ、および発現されるアルファ溶血素のレベルを決定するために、生化学的および/または血清学的試験によりさらに調べられることができる。いくつかのタイピング法が、S.アウレウス株を研究するために利用可能である。これらの方法は、典型的には、血清型分類、毒素型分類、多座位配列タイピング(MLST)、spaタイピング、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を含む遺伝的関係/系統発生に関する標準的なタイピングを含む。他のタイピング法は、病毒性因子および他の重要なブドウ球菌性因子の、例えばPCR、多重PCR、マイクロアレイ、ノーザン/サザンブロッティングによる遺伝子型分類、ならびにタンパク質ベースの方法、例えばELISA、ウェスタンブロットおよび質量分析を含む。典型的には、抗生物質耐性プロフィールは、アンチバイオグラムを用いて調べられる。
一態様において、結合剤は、検出分子である。
用語“診断キット”は、本明細書で用いられる際、キットまたは部分のセットを指し、それは、組み合わせまたは混合物で、1種類以上の分析物もしくはマーカーの測定/検出を実施して疾患もしくは疾患状態を決定する、または疾患および特に疾患の発症もしくは疾患の進行を予測するために用いられることができる。特に、キットは、少なくとも検出分子および/または結合剤を含有し、ここで、検出分子および/または結合剤は、分析物もしくはマーカーまたはそのような分析物もしくはマーカーの反応産物を特異的に認識する。加えて、様々な試薬またはツールが、キット中に含まれることができる。診断キットは、マイクロビーズまたは平面状のアレイもしくはウェルのような支持体、バイオマーカーの単離のための試薬、特異的な標的に向けられた検出分子、核酸の配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒または緩衝剤等、様々なリンカー、様々なアッセイ構成要素、ブロッキング剤等を含め、対象の方法を実施するためのあらゆる有用な試薬を含むことができる。
具体的には、処置は、病気の起因としてのS.アウレウスの病態形成を妨げることによることができ、ここで、発病は、対象の細胞膜上に例えば特定の病毒性因子または毒素により孔を形成する工程を含む。
1.S.アウレウスにより重度にコロニー形成されているがS.アウレウス疾患の症状を一切示していない対象におけるS.アウレウス疾患の予測のための方法であって、前記の方法が、標準または参照対照と比較して前記の対象の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定する工程を含み、ここで、高められたアルファ溶血素レベルが、S.アウレウス疾患の発症を示す、上記方法。
6.定義1〜5のいずれかの方法であって、該生物学的試料が、好ましくは血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸気管標本、例えば気管内吸引物、胸膜液、肺タップ、鼻スワブまたは痰からなる群より選択される体液または組織試料である方法。
8.定義1〜7のいずれかの方法であって、アルファ溶血素のレベルが、免疫アッセイ、好ましくはELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ(例えばディプスティックアッセイ)およびウェスタンブロットのいずれか、質量分析、NMR、またはアルファ溶血素を示す対応するDNAもしくはRNAを好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いて決定する方法により決定される方法。
12.定義11の方法であって、前記の少なくとも1種類の追加のマーカーの測定が、アルファ溶血素以外のいずれかのS.アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはいずれかのS.アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物の決定を含み、それが好ましくは以下:
i)S.アウレウスプロテインA;
ii)S.アウレウスの抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともPBP2a、mecA遺伝子またはmecA遺伝子の発現産物のいずれか;
iii)S.アウレウスの細胞毒、好ましくはPVL/LukSF、LukGH(LukAB)、ガンマ溶血素、LukEDを含むあらゆる他のS.アウレウス抗原;S.アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質;またはあらゆるS.アウレウス特異的化合物、例えばリポテイコ酸、ならびに
iii)好ましくは追加のマーカーとして少なくともS.アウレウスプロテインAおよびPBP2aを決定する、i)、ii)および/またはiii)の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ;
からなる群より選択される方法。
17.S.アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる1種類以上の試薬および/またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的検出分子を含むアルファ溶血素診断キットであって、貯蔵安定形態で、好ましくは包装された単位として提供されるアルファ溶血素診断キット。
hla発現を欠く同質遺伝子的S.アウレウス遺伝子欠失変異体の生成
同質遺伝子的S.アウレウスhla遺伝子欠失変異体が、配列決定されたUSA300 CA−MRSA株TCH1516(ATCC(登録商標)BAA1717(商標)、LGC Standards、テディントン、英国)において、以前に公開された方法[15]に基づく相同組み換えにより、表1において列挙されているプライマー対および以前に報告された大腸菌およびS.アウレウスに関するシャトルベクターであるpKFT遺伝子欠失ベクター[16]を用いて生成された。
S.アウレウス分離株を、5%ヒツジ血液を含有するコロンビア寒天(COS、bioMerieux、マルシーレトワール、フランス)上で37℃において16時間培養した。溶血プロフィールを、その後の4℃において24時間のインキュベーション後に評価した。この試験は、同じ分離株の3つの異なるクローンを用いて実施され、結果は異なる3人により評価された。
細胞毒性アッセイを、ヒト肺胞上皮細胞株(A549 ATCC(登録商標)CCL−185(商標)、LGC Standards、テディントン、英国)およびトリプチックソイブロス(TSB、Sigma−Aldrich、シュタインハイム、ドイツ)中で一夜増殖させた細菌の細菌培養上清を用いて実施した。
S.アウレウス分離株をヒツジ血液寒天上で培養した際、我々は、広い範囲の溶血活性を検出した(図1)。分離株の大部分は、ベータ溶血を引き起こすアルファ溶血素(Hla)に特徴的な溶血パターンおよびヒツジ血液寒天プレート上での透明なハローを示した。少数の分離株は、濁ったハローを伴う溶血を示し、それはS.アウレウスのベータ溶血素(Hlb)産生に典型的である。これらの分離株における機能するhlb遺伝子の存在は、PCRにより確証された(データは示していない)。報告されたヒツジ血液寒天溶血試験は、アルファ溶血素活性を測定するためにルーチン的な微生物学実験室において実施されることができる簡単なアッセイである。
Hlaのインビトロ活性を決定するため、我々は、Hlaに関するA549細胞毒性アッセイの特異性を評価した。これは、以下:(i)hla遺伝子欠失変異体S.アウレウス株(TCH1516、USA300)による細胞溶解の喪失により(図2A)、および(ii)ヒツジ血液寒天アッセイにより決定されるような種々の強くベータ溶解性のS.アウレウスクローンの培養上清を用いてHla中和モノクローナル抗体の存在下で(図2B);の2つの方法で実証された。
ヒツジ血液寒天上でのベータ溶血プロフィールをアルファ溶血素活性と相互に関連付けるため、我々は、系列希釈されたS.アウレウス分離株からの一夜培養上清の細胞溶解能力を、ヒト肺胞上皮細胞株(A549)を用いて決定した。
VAPの診断は、VATと明確に区別されていない。特にVAPの診断(VATに加えて胸部X線写真上の新規または進行性の浸潤の診断)は困難である可能性があり、時々強固な診断を見出すために数人の専門家による胸部X線写真の解釈を必要とする。さらに、それぞれのVAPまたはVATの診断に関するデータの提供において地域差が存在する。従って、本発明の主題は、VAPおよび/またはVATに言及する。
患者から得られた痰または気管内吸引物試料の評価の前に、試料をN−アセチルシステインを含有する緩衝液中で安定化してムコイドを低減する。ヒトの血液および血清試料は、標準的な採血手順により、場合により抗凝固剤、例えばLi−ヘパリンまたはK2−EDTAが補われた無菌の採取チューブ中に得られる。尿および便試料は、それらが患者から採取されたままで直接用いられることができる。アルファ溶血素の検出のため、試料は、下流の適用、例えばタンパク質検出および/またはヌクレオチド検出法に適した緩衝液中で希釈されることができる。
アルファ溶血素タンパク質のELISAベースの検出
この手順は、細菌試料、例えば培養物(上清)および/またはヒトの生物学的試料、例えば気管内吸引物からのタンパク質(Hla)としてのアルファ溶血素のELISAベースの検出を例示する。
hla(遺伝子および/または転写産物)の(定量的リアルタイムRT−)PCRベースの検出のための鋳型として、DNAまたはRNAを、S.アウレウスから単離する(コロニーPCRを直接適用するか、または高品質精製法を適用した後鋳型をPCRにかけることによる)。遺伝子特異的プライマー(当該技術で既知であるような分子生物学技法を用いて設計された、hla遺伝子およびハウスキーピング遺伝子、例えば16S RNAを増幅するためのプライマー)をPCRベースの増幅反応において用いて、hla遺伝子が増幅されることができ、アンプリコンが(例えば反応をアガロースゲル上で進ませてインターカレートするDNA色素で染色することにより)可視化されることができる。定量的(q)−PCRに関して、hlaの転写産物(RNA)が転写されてcDNAになり(逆転写、RT)、続いて増幅される。q−PCR工程における定量化のため、蛍光プローブ(例えばSYBRグリーン、TaqManプローブ)が用いられ、ここで、指数関数的増幅の間に得られる蛍光信号は、リアルタイムで増幅されているDNAの量と相関している。この定量化は、異なる生物学的試料中のhla遺伝子の特異的発現プロファイリングを可能にするが、試験される可能性のあるS.アウレウスの異なる増殖相および異なる増殖条件におけるhla遺伝子の特異的発現プロファイリングも可能にする。
Hlaの発現を識別および半定量化する機能アッセイ試験は、血液寒天溶血の決定の詳細な記載に則している。このアッセイにおいて、Hla活性が容易に測定されることができ、2+、3+、または4+の読み出し(図1)は、高いHla活性を示しており、疾患進行に相互に関連付けられることができる。
診断組み合わせキットは、S.アウレウス感染および疾患と関係するタンパク質性および非タンパク質性細菌因子の検出のために用いられることができる。この診断キットは、例えば、以下のように例示されるラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ(例えばディップスティック試験)形式において用いられることができる。
参考文献
Claims (19)
- S.アウレウスにより重度にコロニー形成されているがS.アウレウス疾患の症状を一切示していない対象におけるS.アウレウス疾患の予測のための方法であって、該方法が、標準または参照対照と比較して該対象の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定する工程を含み、ここで、高められたアルファ溶血素レベルがS.アウレウス疾患の発症を示す、上記方法。
- 対象が、気管支炎、特に人工呼吸器関連気管気管支炎(VAT)、肺炎、特に人工呼吸器関連肺炎(VAP)、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症の診断につながる臨床症状のいずれかであるS.アウレウス疾患の症状を一切示していない、請求項1に記載の方法。
- アルファ溶血素レベルが、気管支炎、特にVAT、肺炎、特にVAP、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症からなる群より選択されるS.アウレウス疾患の発症を示す、請求項1又は2に記載の方法。
- 対象が、S.アウレウスを示す細菌もしくは細菌マーカーの存在を決定する方法により、好ましくは該マーカーを発現している遺伝子、該遺伝子の発現産物を決定する方法により、または標準的な微生物学的技法の使用により決定されるように、S.アウレウスによりコロニー形成されている、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 対象が鼻または鼻咽頭においてコロニー形成されており、かつ対象が挿管を受けている、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 対象が、機械式人工呼吸されている患者であり、かつ下気道においてS.アウレウスにより重度にコロニー形成されている、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 生物学的試料が、好ましくは、血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および、気管内吸引物、胸膜液、肺タップ、鼻スワブまたは痰のような呼吸気管標本からなる群より選択される体液または組織試料である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- アルファ溶血素レベルの決定が、アルファ溶血素の発現または活性の半定量的または定量的測定を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- アルファ溶血素のレベルが、免疫アッセイ、好ましくは、ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、好ましくは、ディプスティック検査のようなラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ、およびウェスタンブロットのいずれか、質量分析、NMR、またはアルファ溶血素を示す対応するDNAもしくはRNAを好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いて決定する方法により決定される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 標準または参照対照が、S.アウレウス疾患の発症もしくは疾患進行を示す予め決定されたアルファ溶血素レベル、または、低い、中程度のもしくは高いアルファ溶血素を発現するS.アウレウス株から得られた予め決定されたアルファ溶血素レベルである、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 標準または参照対照が、アルファ溶血素を発現していない、または低レベルのアルファ溶血素を発現しているS.アウレウスにより発現されるアルファ溶血素レベルよりも高い予め決定されたアルファ溶血素の量または活性である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- S.アウレウスのコロニー形成を示す少なくとも1種類の追加のマーカーの測定をさらに含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1種類の追加のマーカーの測定が、アルファ溶血素以外のいずれかのS.アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはいずれかのS.アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物の決定を含み、それが好ましくは以下:
i)S.アウレウスプロテインA;
ii)S.アウレウス抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともPBP2a、mecA遺伝子またはmecA遺伝子の発現産物のいずれか;
iii)S.アウレウスの細胞毒、好ましくはPVL/LukSF、LukGH、ガンマ溶血素、LukED、を含むあらゆる他のS.アウレウス抗原;S.アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質;またはリポテイコ酸のようなあらゆるS.アウレウス特異的化合物、ならびに
iii)好ましくは追加のマーカーとして少なくともS.アウレウスプロテインAおよびPBP2aを決定する、i)、ii)および/またはiii)の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ;
からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。 - S.アウレウスにより重度にコロニー形成されているがS.アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の発症に関するインビトロマーカーとしてのアルファ溶血素の使用。
- S.アウレウスにより重度にコロニー形成されているがS.アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の疾患発症を決定するためのアルファ溶血素に関する特異的検出分子を含む診断組成物の使用。
- 検出分子が、抗体、抗体断片、細胞受容体もしくはリガンド、またはアルファ溶血素遺伝子もしくは前記の遺伝子の発現産物にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる群より選択されるアルファ溶血素結合剤である、請求項15に記載の使用。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の方法におけるアルファ溶血素診断キットの使用であって、該キットがアルファ溶血素に関する特異的検出分子を含む、上記使用。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の方法におけるアルファ溶血素診断キットの使用であって、該診断キットがS.アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる1種類以上の試薬および/またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的検出分子を含み、それが貯蔵安定形態で、好ましくは包装された単位として提供される、上記使用。
- 診断キットが、以下:
a)S.アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる1種類以上の試薬および/またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的検出分子を含むキット;ならびに
b)アルファ溶血素以外のS.アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはS.アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物を決定するのに適した試薬および/または特異的検出分子を含むキットであって、それが好ましくは以下:
i)S.アウレウスプロテインA;
ii)S.アウレウス抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともPBP2a、mecA遺伝子またはmecA遺伝子の発現産物のいずれか;
iii)S.アウレウスの細胞毒、好ましくはPVL/LukSF、LukGH、ガンマ溶血素、LukEDを含むあらゆる他のS.アウレウス抗原;S.アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質;またはリポテイコ酸のようなあらゆるS.アウレウス特異的化合物、ならびに
iii)好ましくは追加のマーカーとして少なくともS.アウレウスプロテインAおよびPBP2aを決定する、i)、ii)および/またはiii)の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ;
からなる群より選択されるキット;
を含む診断組み合わせキットである、請求項18に記載の使用。
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