CN109825549A - 生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，包括恒温和变温条件下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素预测模型的构建；多环境因子影响下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素可能性模型的构建；金黄色葡萄球菌预测模型和肠毒素模型工程学检验；生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量风险评估研究；快速预警系统开发。本发明的有益效果是能够准确预测生鲜乳中金黄色葡萄球菌生长及产生肠毒素的情况。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，涉及生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统。
背景技术
建立乳品安全预警系统，有利于推动我国奶产品质量安全管理由事后控制转向事前防范，由经验主义转向科学判定，能从根本上提升乳品质量安全总体水平。
金黄色葡萄球菌是威胁人类健康的四大食源性病原菌之一。有报道显示金黄色葡萄球菌是导致乳及乳制品食源性疾病的头号致病微生物，也是生鲜乳中检出率最高的病原菌，受国家及地域差异影响，检出率在12～79％不等。同时，生鲜乳中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高，其产肠毒素率可高达38％。在后续加工过程中，通过巴氏杀菌或者其他杀菌手段可以杀死金黄色葡萄球菌，然而却未必能有效清除耐热的肠毒素，因此在奶粉、酸奶等乳制品及延伸产品中仍有可能携带肠毒素从而对人们的健康造成潜在威胁。可见，针对生鲜乳中金黄色葡萄球菌尤其是肠毒素开展风险评估和快速预警系统研究是相当必要的。
作为风险评估中的核心环节，预测微生物学概念自上世纪八十年代被提出以来，国内外学者在其理论体系完善和实际应用研究上做了大量有益的工作。对于一些产毒素的食源性病原菌，仅针对细菌本身构建预测模型意义不大，无法全面评估该细菌的潜在危害。有学者认为毒素预测模型研究是构建产毒素微生物预测模型和该类微生物风险评估的重要环节。有关金黄色葡萄球菌在各类食品中的预测模型已经有很多，而对肠毒素的研究基本上集中在快速检测领域，针对肠毒素模型构建和与金黄色葡萄球菌浓度关系预测的研究鲜有报道。到目前为止，只有日本学者Fujikawa和Morozumi在灭菌乳中构建了不同温度下金黄色葡萄球菌模型和毒素模型，但并没有考虑更多环境因素对金黄色葡萄球菌和肠毒素的影响。因此，在实际应用中会受到限制，不能全面准确的为风险评估提供有效的信息。
对于生鲜乳及乳制品中金黄色葡萄球菌的风险评估研究，已有相关风险评估体系研究，一定程度上为对乳及乳制品的安全质量监控提供了参考。然而很多风险评估模型只是对金黄色葡萄球菌本身进行预测和评估，没有考虑肠毒素潜在风险或者默认为其设定5log CFU/mL的细菌浓度阈值，即假设金黄色葡萄球菌的浓度在达到5log CFU/mL时会产生肠毒素，而实际上金黄色葡萄球菌在低浓度 (3log CFU/mL)时，仍然可能会有肠毒素产生。因此，在生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量风险评估研究中，合理使用肠毒素模型对肠毒素产生可能性及肠毒素产量变化实施预测，可以使风险评估理论设计更加合理，评估结果更加准确。
发明内容
本发明的目的在于提供生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，本发明的有益效果是能够准确预测生鲜乳中金黄色葡萄球菌生长及产生肠毒素的情况。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
1)恒温和变温条件下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素预测模型的构建；在不同的储藏温度下，记录原料乳中金黄色葡萄球菌的生长数据，并用mini-VIDAS (bioMerieux,France)结合标准曲线检测、计算对应测试点的肠毒素产生情况。将乳源性金黄色葡萄球菌接种到未被污染的生鲜乳样品中，实时监测金黄色葡萄球菌在恒定温度和波动温度下的生长和肠毒素产生动态，应用修正的modified Gompertz、Logistic、Baranyi等常用的模型对金黄色葡萄球菌生长和毒素产量数据进行拟合，并在Ratkowsky公式的基础上构建金黄色葡萄球菌及其肠毒素的动力学模型，重点比较研究恒温和变温条件下金黄色葡萄球菌肠毒素产生的差异规律。
2)多环境因子影响下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素可能性模型的构建；在温度、pH、水分活度和金黄色葡萄球菌初始接种浓度等不同因素的交互影响下，观察金黄色葡萄球菌生长和产生肠毒素的情况，基于Logistic regression模型分别建立其生长和毒素产生可能性模型，并绘制三维生长界限，重点结合不同初始菌浓在同等环境条件下金黄色葡萄球菌的生长限制与毒素产生临界点，分析总结金黄色葡萄球菌初始菌浓对肠毒素产生时间与产量的影响。
3)金黄色葡萄球菌预测模型和肠毒素模型工程学检验；选取合理的检验参数和基本程序，采取内部验证和外部验证相结合的方法对所构建的生鲜乳中金黄色葡萄球菌预测模型和肠毒素模型进行系统的验证。对模型进行实际应用，预测随机选取的样品环境中金黄色葡萄球菌的生长和肠毒素的产生，保证所构建模型的准确性和可靠性。
4)生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量风险评估研究；对原料乳进行采样监测，调查金黄色葡萄球菌的污染情况，同时结合ComBase数据库(www.combase.cc,由英国食品研究所和美国农业部东部研究中心共同创建)和已发表文献中的调研数据，利用@Risk软件中的不同分布对数据进行描述。根据生鲜乳流通模块的参数信息分布，适时对上述预测模型进行参数优化并对生鲜乳中金黄色葡萄球菌的生长和生产毒素进行预测，进一步对风险评估中可能产生的变异性和不确定性评价进行优化，在金黄色葡萄球菌生长到一定阶段且在适宜的环境条件下实行肠毒素预测，同时充分考虑肠毒素在剂量反应模型中的影响，进一步完善生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量风险特征描述的科学体系。
5)快速预警系统开发；在整理风险评估的数据资料，基于所建立生长模型和肠毒素产生边界模型，依托JAVA编程技术，开发生鲜乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素风险快速预警系统。快速预警体系研究主要包括：金黄色葡萄球菌污染率异常预警、金黄色葡萄球菌肠毒素检出预警、金黄色葡萄球菌超标预警、金黄色葡萄球菌肠毒素超标预警及金黄色葡萄球菌移动平均线趋势预警。基于微生物监测和养殖场调研数据，通过所建立的金黄色葡萄球菌生长模型和肠毒素产生边界模型进行计算，并通过蒙特卡罗模拟，该预警系统可以针对特定生鲜乳样品、特定养殖场、特定地区展开风险评估和风险预警，给出相应的风险评估结果及预警信息。该预警系统可为政府食品安全管理部门的快速决策提供科学依据，缩短决策周期；可以降低奶牛养殖场中生鲜乳金黄色葡萄球菌的污染率，有效控制生鲜乳在储运过程交叉污染，从而避免经济损失；减少人力检测，节省人力成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
1)恒温条件下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素预测模型的构建：
①应用Baird-Parker选择性培养基对生鲜乳样品进行金黄色葡萄球菌污染监测。应用modified Gompertz，Logistic，Baranyi等模型对金黄色葡萄球菌的生长和毒素产生进行拟合：
Gompertz模型：
Nt＝N0+(Nmax-N0)*exp{-exp[(2.718μmax/(Nmax-N0))*(λ-t)+1]}
其中Nt为微生物在时间t时菌落浓度(log CFU/mL)，N0是初始微生物计数的菌落浓度，Nmax是t时间内最大菌落浓度，μmax是最大生长速率(log cfu/h)，λ是迟滞期(h)。
Logistic模型：
Nt＝N0+(Nmax-N0)/{1+exp[-2.718μmax/N0*(t-λ+N0/2.718μmax)]}
具有延滞期的Logistic模型：
Baranyi模型：
其中ν是微生物在基质缺乏时的增加速率，假设等于μ。
②选用Akaike准则(AIC)和Sawa's Bayesian准则(BIC)等工程学检验参数对不同初级模型的拟合优度进行评价和比较：
其中n是观察或数据点的数量；SSE模型中的平方和；p模型中参数的数量；q＝ nδ2/SSE；δ2是拟合完整模型的误差方差估计值。
变温条件下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素预测模型的构建：
模拟实际环境中的储运温度情况设定阶段式变温条件，应用Baranyi模型描述波动温度下金黄色葡萄球菌浓度、毒素产量与时间的关系。
Baranyi模型在波动温度下：
其q是与细胞的生理状态相关的无量纲量，q0和N0分别表示q和N的初始值。
2)多环境因子影响下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素可能性模型的构建；
应用中心组合设计法(central composite design，CCD)设计并研究温度、 pH、水分活度和金黄色葡萄球菌初始接种浓度等不同因素对生鲜乳中金黄色葡萄球菌生长及肠毒素产生的影响。
基于Logistic regression模型构建生鲜乳中金黄色葡萄球菌生长和毒素产生可能性模型(growth/no growth model)，确定不同环境条件下金黄色葡萄球菌的生长限制与毒素产生临界点。
Logistic regression模型：
其中p是金黄色葡萄球菌生长或毒素产生的可能性，B0、Bi、Bj是拟合出的系数，xi、xj是变量因子。
3)金黄色葡萄球菌预测模型和肠毒素模型工程学检验；
生鲜乳中金黄色葡萄球菌预测模型和肠毒素模型的内部验证使用偏差因子(Bf)、准确因子(Af)和标准预测误变异系数(％SEP)；外部验证则是重点应用模型对随机选取的样品环境中金黄色葡萄球菌的生长和毒素产生进行预测。检验参数：
其中n是观测值数量，Xo是实验观测值，Xp是模型预测值。
4)生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量风险评估研究；
基于监测数据和构建的预测模型，采用@Risk软件，通过蒙特卡洛模拟，进行风险评估。
①对生鲜乳进行采样监测，应用Beta函数对生鲜乳中金黄色葡萄球菌的汇总数据进行特征描述。采用Jarvis公式来计算阴性样品中的未检出浓度：
M＝-(2.303/V)×log(Z/N)
其中M是样品批次中微生物的真实浓度，V是样品检测的数量，Z是阴性结果样品的数量，N是总的样品检测数量。
Jarvis公式利用阳性样品的最低检出浓度作为阴性样品的最高检出浓度，应用反向偏斜累积概率分布描述生鲜乳阴性样品中的金黄色葡萄球菌浓度。
②根据采集和运输环节中生鲜乳在线温度监控系统收集的大量监测数据，应用Pert函数进行描述；储藏环节的温度以Normal函数进行描述；而时间则通过调查数据的平均值和标准差，采用Normal分布函数表达。
③敏感性分析，分析影响生鲜乳潜在风险的最相关因素，锁定其中核心影响因子，从而可以通过控制主要环境因素有效降低金黄色葡萄球菌及其肠毒素带来的潜在风险。
5)快速预警系统开发；
收集整理风险评估过程中的数据，基于所建立生长模型和肠毒素产生边界模型，依托JAVA编程技术，进行生鲜乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素风险预警系统的开发和调试。预警系统开发包括用户界面设计和后台模型程序的开发，分别采用统计分析系统宏语言和开发模块编程，利用JAVA技术建立用户界面。
本发明总结不同条件下肠毒素产生的差异性规律及与金黄色葡萄球菌浓度变化的内在关系，构建相应的预测模型；基于肠毒素预测模型，开展生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量风险评估研究，更加准确、实际的对潜在风险进行全面评估，同时通过敏感性分析，判定影响肠毒素产生的显著因素，开发生鲜乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素的风险预警系统，为政府食品安全管理部门的快速决策提供科学依据，提高乳制品安全应急处理能力，实现乳制品安全防控从被动应付向主动保障的战略转变，提高公共安全防控水平。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，其特征在于按照以下步骤进行：
1)恒温和变温条件下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素预测模型的构建；
2)多环境因子影响下生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素可能性模型的构建；
3)金黄色葡萄球菌预测模型和肠毒素模型工程学检验；
4)生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量风险评估研究；
5)快速预警系统开发。
2.按照权利要求1所述生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，其特征在于：所述步骤1)在不同的储藏温度下，记录原料乳中金黄色葡萄球菌的生长数据，并用mini-VIDAS结合标准曲线检测、计算对应测试点的肠毒素产生情况，将乳源性金黄色葡萄球菌接种到未被污染的生鲜乳样品中，实时监测金黄色葡萄球菌在恒定温度和波动温度下的生长和肠毒素产生动态，应用modified Gompertz、Logistic、Baranyi的模型对金黄色葡萄球菌生长和毒素产量数据进行拟合，并在Ratkowsky公式的基础上构建金黄色葡萄球菌及其肠毒素的动力学模型，比较研究恒温和变温条件下金黄色葡萄球菌肠毒素产生的差异规律。
3.按照权利要求1所述生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，其特征在于：所述步骤2)在温度、pH、水分活度和金黄色葡萄球菌初始接种浓度不同因素的交互影响下，观察金黄色葡萄球菌生长和产生肠毒素的情况，基于Logistic regression模型分别建立其生长和毒素产生可能性模型，并绘制三维生长界限，重点结合不同初始菌浓在同等环境条件下金黄色葡萄球菌的生长限制与毒素产生临界点，分析总结金黄色葡萄球菌初始菌浓对肠毒素产生时间与产量的影响。
4.按照权利要求1所述生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，其特征在于：所述步骤3)选取合理的检验参数和基本程序，采取内部验证和外部验证相结合的方法对所构建的生鲜乳中金黄色葡萄球菌预测模型和肠毒素模型进行系统的验证，对模型进行实际应用，预测随机选取的样品环境中金黄色葡萄球菌的生长和肠毒素的产生，保证所构建模型的准确性和可靠性。
5.按照权利要求1所述生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，其特征在于：所述步骤4)对原料乳进行采样监测，调查金黄色葡萄球菌的污染情况，同时结合ComBase数据库和已发表文献中的调研数据，利用@Risk软件中的不同分布对数据进行描述，根据生鲜乳流通模块的参数信息分布，适时对上述预测模型进行参数优化并对生鲜乳中金黄色葡萄球菌的生长和生产毒素进行预测，进一步对风险评估中可能产生的变异性和不确定性评价进行优化，在金黄色葡萄球菌生长到一定阶段且在适宜的环境条件下实行肠毒素预测，同时充分考虑肠毒素在剂量反应模型中的影响，进一步完善生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量风险特征描述的科学体系。
6.按照权利要求1所述生鲜乳中金黄色葡萄球菌风险评估及快速预警系统，其特征在于：所述步骤5)在整理风险评估的数据资料，基于所建立生长模型和肠毒素产生边界模型，依托JAVA编程技术，开发生鲜乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素风险快速预警系统，快速预警体系研究包括：金黄色葡萄球菌污染率异常预警、金黄色葡萄球菌肠毒素检出预警、金黄色葡萄球菌超标预警、金黄色葡萄球菌肠毒素超标预警及金黄色葡萄球菌移动平均线趋势预警，基于微生物监测和养殖场调研数据，通过所建立的金黄色葡萄球菌生长模型和肠毒素产生边界模型进行计算，并通过蒙特卡罗模拟，该预警系统可以针对特定生鲜乳样品、特定养殖场、特定地区展开风险评估和风险预警，给出相应的风险评估结果及预警信息。
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