KR102444179B1 - Hpv 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 hpv 감염 진단을 위한 정보제공방법 - Google Patents

Hpv 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 hpv 감염 진단을 위한 정보제공방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중중합효소연쇄반응을 이용한 HPV 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법으로, 자궁경부암에서 높은 빈도로 발견되는 35종의 HPV 유전자형의 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 제공하고 이를 통해 HPV 감염 진단을 위한 상기의 HPV 유전자형의 유전자를 통상적인 PCR을 통해서 효과적으로 신속하게 검출할 수 있다.

Description

HPV 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법{PRIMER SET FOR DIAGNOSING HPV INFECTION, DIAGNOSTIC COMPOSITION, AND METHOD OF PROVIDING INFORMATION FOR DIAGNOSING HPV INFECTION USING THE SAME}
본 발명은 다중중합효소연쇄반응을 이용한 HPV 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물 및 이를 이용한 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
자궁경부암(Cervical cancer)은 자궁경부에서 발생하는 악성 종양으로 전체 자궁암 발생 빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전 세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생 빈도가 높아 연간 약 44만 건 정도의 자궁경부암 환자가 신규로 보고되고 있다. 여성암에 있어서, 자궁경부암 발생 빈도는 10.6%로서, 10대 암의 발생 빈도상 위 암(15.8%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있는 실정이다. 특히, 최근에는 20~30대 여성의 자궁경부암 감염률이 크게 증가하여 전체 환자의 32%를 차지하는 등 국민 보건상 심각한 문제로 대두되고 있다. 자궁경부암은 주로 성관계를 통한 인유두종 바이러스(human papilloma virus, HPV) 감염에 의해 생긴다.
HPV는 Parvovavirus 과에 분류되는 약 45~55 ㎚ 직경의 작은 DNA 바이러스로, 자궁경부 조직에 감염하여 종양원성 단백질인 E6 와 E7을 만들며 이들은 각각 숙주세포의 종양억제 단백질인 p53 과 pRb와 결합하여 무력화하고, 결과적으로 감염 세포의 형질 전환에 따른 종양형성으로 발전하는 것으로 규명되고 있다.
HPV가 자궁경부암의 발생에 주요한 역할을 하는 것으로 확인되고, 또한 HPV 검사가 자궁경부 세포진 검사(pap smear) 보다 자궁경부암의 선별 정확도가 더 높은 것으로 보고(Cox JT, et al., Obstet Gynecol 80:389, 1992)된 이후 최근 약 10년 사이에 자궁경부 세포 검체에서 HPV의 감염 유무뿐만 아니라 더 나아가 그 유전자형 또는 감염된 HPV의 부하를 정량하여 고 위험군 HPV의 감염 여부를 확인하여 자궁경부암의 발병위험을 예측하려는 시도가 이루어져 왔다. 그러나, HPV에 지속적으로 감염되어 있더라도 육안 또는 현미경으로는 관찰할 수 없는 잠복감염이 대부분이다. 따라서, 세포 검사를 통한 HPV DNA의 존재를 확인하는 것이 필요하다.
HPV 감염의 진단에는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 하이브리드 캡처(Hybrid Capture, HC)-2 및 HPV 유전자형 검사(HPV genotyping)가 가능한 HPV DNA 칩 테스트 등이 이용된다.
HC-2는 미국 식약청의 허가를 받았으며, 표준화 또는 공인된 HPV 진단 검사법으로 인식되어 널리 사용되고 있다. 이는 여러 아형의 HPV DNA에 대해 화학적 발광제(chemiluminescent)를 이용한 샌드위치 캡처 혼성화법(sandwich capture hybridization)으로서, HPV 16/18/31/33/39/45/51/52/56/58/59/68형의 13개 고위험군의 감염에 대해 90% 이상의 민감도를 나타낸다. 그러나, 대량의 검사물을 처리하지 못하며, HPV 유전자형 검사를 할 수 없으며, 저위험군 HPV와 교차반응이 보고되고 있으며, 고가의 발광측정기(luminometer)를 사용해야 하는 단점이 있다. 한편, HPV DNA 칩 테스트는 PCR 후 DNA 칩 상에서 교잡시켜 발현을 스캐너로 검색하는 방법이다. 이는 HPV 감염 여부뿐만 아니라, 고위험군 HPV에 대해 아형별로 진단이 가능하므로 암 발생 예측 및 HPV 예방백신 접종 등에 유용하다. 또한 대량의 검체를 처리할 수 있으며, HPV 유전자형 검사(HPV genotyping)가 가능하다. 그러나, 고가의 스캐너가 필요하며, 한국 식품의약품안전처 외에는 검사의 정확도 면에서 국제적인 인증을 받지 못하였다. HPV DNA 칩 테스트는 고위험군 HPV에 대해 HC-2법에 비에 민감도가 낮은 것으로 알려져 있다. 또한, HPV DNA 칩 검사키트 제품 간 민감도 및 위음성도가 다양하게 나타나고, 실험자에 따라 위양성이 나타나거나 재현성의 문제가 있다고 알려져 있다. 따라서, 정확한 HPV 진단을 위하여 여러 HPV DNA 칩 검사 결과에 대한 정확성을 측정할 수 있는 HPV 표준물질이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 자궁경부암에서 높은 빈도로 발견되는 35 종의 HPV 유전자형을 자궁경부암의 조기에 다중중합효소연쇄반응을 이용하여 효과적으로 검출하고 진단할 수 있는 HPV 감염 진단용 프라이머 세트를 개발하고자 예의 노력한 결과, 기존의 HPV 검사방법보다 정확하고 효율적으로 HPV의 유전자형을 검사할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
한국 공개특허 10-2011-0093392 (공개일자: 2011.08.18)
상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 자궁경부암에서 높은 빈도로 발견되는 35 종의 HPV 유전자형을 자궁경부암의 조기에 효과적으로 검출하고 진단할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명은 별도의 고가의 장비 없이 통상의 PCR 수행으로 35 종의 HPV 유전자형을 동시에 효과적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV 감염 진단용 HPV A 프라이머 세트를 제공한다: (a1) 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 HPV 73 증폭 프라이머 쌍; (a2) 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 HPV 16 증폭 프라이머 쌍; (a3) 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 HPV 26 증폭 프라이머 쌍; (a4) 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 HPV 59 증폭 프라이머 쌍; (a5) 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 HPV 39 증폭 프라이머 쌍; (a6) 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 HPV 45 증폭 프라이머 쌍; 및 (a7) 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 HPV 52 증폭 프라이머 쌍.
본 발명에서, 상기 "HPV A 프라이머 세트"는 HPV 73, HPV 16, HPV 26, HPV 59, HPV 39, HPV 45 및/또는 HPV 52를 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함함을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 HPV 감염 진단용 HPV A 프라이머 세트에, 다음의 HPV B, HPV C, HPV D 및 HPV E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함하는 프라이머 세트를 제공한다:
1) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV 감염 진단용 HPV B 프라이머 세트: (b1) 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 HPV 31 증폭 프라이머 쌍; (b2) 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 HPV 70 증폭 프라이머 쌍; (b3) 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 HPV 33 증폭 프라이머 쌍; (b4) 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 HPV 67 증폭 프라이머 쌍; (b5) 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 HPV 69 증폭 프라이머 쌍; (b6) 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 HPV 56 증폭 프라이머 쌍; 및 (b7) 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 HPV 53 증폭 프라이머 쌍,
2) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV 감염 진단용 HPV C 프라이머 세트: (c1) 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 HPV 51 증폭 프라이머 쌍; (c2) 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어진 HPV 68 증폭 프라이머 쌍; (c3) 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 HPV 35 증폭 프라이머 쌍; (c4) 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 HPV 58 증폭 프라이머 쌍; (c5) 서열번호 37 및 서열번호 38로 이루어진 HPV 61 증폭 프라이머 쌍; (c6) 서열번호 39 및 서열번호 40으로 이루어진 HPV 30 증폭 프라이머 쌍; 및 (c7) 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 HPV 18 증폭 프라이머 쌍,
3) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV 감염 진단용 HPV D 프라이머 세트: (d1) 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 HPV 11 증폭 프라이머 쌍; (d2) 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 HPV 44 증폭 프라이머 쌍; (d3) 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 HPV 32 증폭 프라이머 쌍; (d4) 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 HPV 43 증폭 프라이머 쌍; (d5) 서열번호 51 및 서열번호 52로 이루어진 HPV 34 증폭 프라이머 쌍; (d6) 서열번호 53 및 서열번호 54로 이루어진 HPV 40 증폭 프라이머 쌍; 및 (d7) 서열번호 55 및 서열번호 56으로 이루어진 HPV 6 증폭 프라이머 쌍,
및
4) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV 감염 진단용 HPV E 프라이머 세트: (e1) 서열번호 57 및 서열번호 58로 이루어진 HPV 66 증폭 프라이머 쌍; (e2) 서열번호 59 및 서열번호 60으로 이루어진 HPV 83 증폭 프라이머 쌍; (e3) 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 HPV 82 증폭 프라이머 쌍; (e4) 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 HPV 90 증폭 프라이머 쌍; (e5) 서열번호 65 및 서열번호 66으로 이루어진 HPV 62 증폭 프라이머 쌍; (e6) 서열번호 67 및 서열번호 68로 이루어진 HPV 54 증폭 프라이머 쌍; 및 (e7) 서열번호 69 및 서열번호 70으로 이루어진 HPV 81 증폭 프라이머 쌍.
본 발명에서, 상기 “HPV B 프라이머 세트”는 HPV 31, HPV 70, HPV 33, HPV 67, HPV 69, HPV 56 및/또는 HPV 53을 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함함을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “HPV C 프라이머 세트”는 HPV 51, HPV 68, HPV 35, HPV 58, HPV 61, HPV 30 및/또는 HPV 18을 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함함을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “HPV D 프라이머 세트”는 HPV 11, HPV 44, HPV 32, HPV 43, HPV 34, HPV 40 및/또는 HPV 6을 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함함을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “HPV E 프라이머 세트”는 HPV 66, HPV 83, HPV 82, HPV 90, HPV 62, HPV 54 및/또는 HPV 81을 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함함을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 HPV 감염 진단용 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및/또는 HPV E 프라이머 세트를 포함하는 HPV 감염 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 통상적으로 사용될 수 있는 성분, 예를 들면 완충액 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 HPV 감염 진단용 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및/또는 HPV E 프라이머 세트를 포함하는 HPV 감염 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 DNA 중합효소를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 DNA 중합효소는 Hot Start Taq일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 HPV 감염 진단용 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및/또는 HPV E 프라이머 세트를 사용하여 분리된 생물학적 샘플의 DNA를 표적으로 하는 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 HPV 감염 진단은 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 생물학적 샘플로부터 자궁경부암 발병 관련 HPV 유전자형을 검출하는 것이다.
본 발명에서 용어 "생물학적 샘플"이란 HPV로 감염되거나, 감염을 의심받는 개체 또는 자궁경부암 초기 증상 또는 징후가 있는 것으로 의심되는 개체의 자궁경부 및 질의 스왑(swab) 검체, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 질 도말 검체이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 정보제공방법은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 32, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 62, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 83 및 HPV 90으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 HPV 유전자형을 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 HPV 감염 진단용 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및/또는 HPV E 프라이머 세트를 사용하여 분리된 생물학적 샘플의 DNA를 표적으로 하는 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법으로, 상기 방법은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 32, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 62, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 83 및 HPV 90 유전자형을 동시에 검출하는 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명은 자궁경부암에서 높은 빈도로 발견되는 35 종의 HPV 유전자형을 효율적이고 미량의 샘플로 분석가능하며, 조기 발견이 어려운 자궁경부암 환자의 진단을 위해서도 용이하게 적용할 수 있으므로 유용한 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법이라고 할 수 있다. 또한, 본 발명은 별도의 고가의 장비 없이 통상의 PCR 수행으로 35 종의 HPV 유전자형 검출이 가능하여 높은 민감도와 특이도를 가지면서도 동시에 효과적으로 HPV 감염을 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트(A, B, C, D 및 E)를 포함하는 HPV 감염 진단 키트의 특이성 시험 결과를 나타낸 것으로, HPV 유전자형(총 35종) 증폭 결과물의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다중중합효소연쇄반응(multiplex-PCR, M-PCR)을 이용하여 총 35종의 HPV 유전자형(고위험군: 16, 18, 26, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 73 및 82(22종)와, 저위험군: 6, 11, 32, 34, 40, 43, 44, 54, 61, 62, 81, 83 및 90(13종))을 신속 정확하게 검출해 내는 것으로, 상기 HPV 유전자형의 특이적 염기서열의 프라이머를 이용하여 HPV 감염을 진단해내는 키트 및 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명에서 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 타깃 핵산에 인접해 있는 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명에서 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
특히, 본 발명은 총 35종의 HPV 유전자형(고위험군: 16, 18, 26, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 73 및 82(22종)와, 저위험군: 6, 11, 32, 34, 40, 43, 44, 54, 61, 62, 81, 83 및 90(13종))을 특이적으로 검출할 수 있다.
일반적으로, 하나의 유전자를 검출하는 PCR에는 1쌍의 프라이머가 이용되며, 따라서 총 35종류의 표적을 목적으로 PCR을 수행하기 위해서는 35쌍, 즉 70개의 프라이머가 필요하다. 이들을 1번에 확인할 수 있도록 공통의 PCR 반응조건을 갖는 프라이머 개발에 주력하였다. 그 결과 35쌍의 프라이머를 이용하여 이들을 PCR 반응에 적용하여 상기 35종의 HPV 유전자형을 검출할 수 있게 되었다.
본 발명에 따른 PCR 프라이머를 제작할 때는 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머의 복합체(dimmer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복 금지 등 여러 가지 제약이 따르고, 그 외에 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA 양, 프라이머 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다. 이에 본 발명에 의해 상기 35종의 HPV 유전자형의 검출이 적합하도록 개발된 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 HPV 감염 진단용 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및 HPV E 프라이머 세트는 총 5 set로 각 set별 7종의 HPV 유전자형 검출이 가능하도록 구성(각 set별 7쌍의 프라이머 포함)되었으며, 이는 각 set별 다량의 primer 쌍을 포함할 경우, PCR 증폭산물크기의 차이가 크지 않게되므로 전기영동후 밴드 양성판독이 어려울 뿐만 아니라 각 primer별로 복합체(dimmer)를 형성할 확률이 높아지므로, 각 set별로 최선의 primer 쌍의 개수인 7쌍으로 한정하여 총 35쌍의 프라이머를 5 set로 나누어 구성하였다.
특히, 본원발명은 35쌍의 프라이머 중 i) 서열번호 1 내지 14로 이루어진 7쌍의 프라이머 쌍을 세트로 포함하여 HPV 73, HPV 16, HPV 26, HPV 59, HPV 39, HPV 45 및 HPV 52 감염여부를 동시에 검출할 수 있고, ii) 서열번호 15 내지 28로 이루어진 7쌍의 프라이머 쌍을 세트로 포함하여 HPV 31, HPV 70, HPV 33, HPV 67, HPV 69, HPV 56 및 HPV 53 감염여부를 동시에 검출할 수 있고, iii) 서열번호 29 내지 42로 이루어진 7쌍의 프라이머 쌍을 세트로 포함하여 HPV 51, HPV 68, HPV 35, HPV 58, HPV 61, HPV 30 및 HPV 18 감염여부를 동시에 검출할 수 있고, iv) 서열번호 43 내지 56으로 이루어진 7쌍의 프라이머 쌍을 세트로 포함하여 HPV 11, HPV 44, HPV 32, HPV 43, HPV 34, HPV 40 및 HPV 6 감염여부를 동시에 검출할 수 있고, v) 서열번호 57 내지 70으로 이루어진 7쌍의 프라이머 쌍을 세트로 포함하여 HPV 66, HPV 83, HPV 82, HPV 90, HPV 62, HPV 54 및 HPV 81 감염여부를 동시에 검출할 수 있는 효과를 발휘한다.
본원발명에서 제공하는 프라이머는 상기 35종의 HPV 유전자형을 간단한 PCR을 통해 높은 특이도 및 민감도로 신속하게 검출할 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한, 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
[실시예1] 프라이머 제작
자궁경부암에서 높은 빈도로 발견되는 35종의 HPV 유전자형 검출을 위하여 다음의 프라이머를 디자인하였다.
Target
유전자 		구분 서열(5'→3') 서열번호
HPV 73 Forward CCC AAT TCA GAA GAA CGA CCA TAC AAG CTA CAA GC 1
Reverse GTT GGG GCA CAC AAT ACC TAG TGT ACC CAT AAG C 2
HPV 16 Forward GCA TCC TTA TAT AAT CCA GAA ACA CAG CGG CTG GT 3
Reverse TGC AGT AGA CCC AGA GCC TTT AAT GTA TAA ATC G 4
HPV 26 Forward CTG AGG TAA TGG GAG GAA CCT TAG GTG GTG TC 5
Reverse CAT TTC GGT TAC ATA CAC ACC TGT GTT TAA CTA TGG 6
HPV 59 Forward CAT GGC ACG CTT TGA GGA TCC TAC ACA ACG AC 7
Reverse GTG TCT TGC TCG GGT CCG ACA CCC ACG ACA CTG 8
HPV 39 Forward GTG GGT ATG AAT GGT GGT CGC AAG CAG GAC A 9
Reverse AGG ACA GTC CCC CGT AGA TAC ATT ATT GGG C 10
HPV 45 Forward GTG CCT TGT GGC ATG TAT GGT GTT ACT G 11
Reverse GGC TTG TAA ATG TGC CAG TTT AGG TAT TAT GTT 12
HPV 52 Forward TTG AGG ATC CAG CAA CAC GAC CCC GGA C 13
Reverse GCG TAG GCA CAT AAT ACA CAC GCC ATA T 14
HPV 31 Forward GAG GCA AGT ATA CCT ATT AGA CCA CCA GTT AGC 15
Reverse GGC AGG TGT ATC CAC AGT AAA ATC AGT GTC TGC 16
HPV 70 Forward CGA CGG CAC CAG TGT TGT GGT GAC ACT ACA CCT 17
Reverse TGT CTG TTG CAG ATG CAC GCT TAC TCC TGG ACG CAC 18
HPV 33 Forward CTG TTC TGT GCA GAC CCC GCC TTG GAC AAT AGA ACA GC 19
Reverse GGA GAT CCC ACA AAC ACC CAA AGC AGC AAT ACC AAC 20
HPV 67 Forward GTC CAC CTA CAG TGC AAG AAA TAT GTT TCA GGA CAC AGA CG 21
Reverse CCT GGG TCT GCG TTC GTT GAG GTC TCC AAC ACA CTG AAC 22
HPV 69 Forward GTG CCC AGG GTC ATA ATA ATG GCA TTT GTT GG 23
Reverse CCT ATA TGC ATC TTC CAA ACT AGC AGT AGG AGG C 24
HPV 56 Forward GCA TGG TAA AGT ACC AAC GCT GCA AGA CGT TGT AT 25
Reverse ACT CTG AAT GTC CAA CTG CAC CAC AAA CTT ACA C 26
HPV 53 Forward GGT TGC ATA AAC TAA GGC GCG GTG GTG TC 27
Reverse CAA GGC AAA ATG GAG GGT ACC AAA AAG GC 28
HPV 51 Forward AGA CTG AAA TTG ACT TGC AAT GCT ACG AGC AAT TTG ACA G 29
Reverse TCC GGA TAA CTG TCC AGT AAT CTC CTT TTA ACT TGT GAC TCG 30
HPV 68 Forward GTC GTG TGG CAG GGC CAC GTT TAT ATA GTA GGG C 31
Reverse GCT GTA GAC GCT AAT GAA GGA ACA GAT ATA TGG GAA CGG 32
HPV 35 Forward AGG TGC GGT ATG TTT CAG GAC CCA GCT GAA AGA CC 33
Reverse CCT CGG TTT CTC TAC GTG TTG GTT TCC AAC AGG AC 34
HPV 58 Forward TAC CTG ATC CCA ATA AAT TTG GTT TTC CTG ATA CAT C 35
Reverse CAA AGT CCA TGC ATC CAA ACC CTG TAT CTA CCA TGT CA 36
HPV 61 Forward CCG TAG GGT CAG CAA AGC ACA CTC ATC TAT GGG ACC G 37
Reverse CCT GTA TAC TTA ACG GTT TGC TGC ATG CAT GGC ACC G 38
HPV 30 Forward GGT AGC AAT TTA GGT GGC GTC CCT ATG TCC TCC AC 39
Reverse CAG GAA ACG GCA CCA TGC CAG TGG ATT AAG 40
HPV 18 Forward CGC GCC TCT TTG GCG CAT ATA AGG CGC ACC TGG 41
Reverse GGG TAG ACA GAA TGT TGG ACA TGA AAG TAG TTG TAC AAG 42
HPV 11 Forward GTA AAG ATG CCT CCA CGT CTG CAA CAT C 43
Reverse GTA GTT GTC TGA TGT CTC CGT CTG TGC ACT C 44
HPV 44 Forward CAG TAG GGC ACG TAG ACG TAA ACG TGC ATC TG 45
Reverse GCT TCA ACA GCA GGC TGC GAC TGT ACA AC 46
HPV 32 Forward AGG CAG AAT GGC AAG TAC TTC TGC CTC ATC ACA G 47
Reverse CCT TTA GCG TTG GTG CGT TTC CAC GCA TTA TTC 48
HPV 43 Forward GTG TGA TGA GTG TAA CAT AAC TTT GCC TAC TCT GC 49
Reverse TGC ATG ATT TCC AGC AAT GTA GGC AGT ATC C 50
HPV 34 Forward GTT AGA TAT GAC TGT GAC AAG GAC AAC ACC ATG C 51
Reverse GGG TCT AAC AAT TTC AGG AGT GGA TAC TTC ACA CGG 52
HPV 40 Forward GGT CCG ACC GAA AGC GGT ACA TAT AAA TTC CAA C 53
Reverse TGG AAA GTC GTC GCG CCA CAC AAC ATA TAA CTC 54
HPV 6 Forward GAC CCT GTA GGG TTA CAT TGC TAT GAG CAA TTA G 55
Reverse CCA ACA GAA GCT GTT GCA CTT CTC TGA TGT C 56
HPV 66 Forward CCA TAT TCA GCA ATA CAC AGG AAC GTC CAC GAA GC 57
Reverse CGT AGC TCC TCT TTG GTA CTC TGA ATG TCC AAC TGC 58
HPV 83 Forward GTT ATT GGC CGG GAC GAA GTG GGA TTA CTG 59
Reverse GGT TGT AGT GGA GGA ACT AGT AAC CTC AAA GCC 60
HPV 82 Forward CAC GGA CTG GGT ATG TGC CTT ATT TGG GGT ATC G 61
Reverse CTG CTG CAT TGC TAT CTG TAT CAG CCA ATT GTG C 62
HPV 90 Forward ATG CAT CGC TCT AAA CGT CGC AAG CGT GCC TCC 63
Reverse TGC AGG GGT TGT GGT AGA GGC TGT TGT AAC CTC 64
HPV 62 Forward CTG TAA ACC ACA ACC AGC CAA CCA CTG CTG CTA T 65
Reverse CTT GCG ACG ATG CAG TAC CTT GGG CAT ATT GAA AG 66
HPV 54 Forward CTA TTG GAA GGG TAG GTG TCT ACA TTG CTG GAA GC 67
Reverse ACA CAT AGC CGT ACT GTC TTA CAA CAC ACA CCT CC 68
HPV 81 Forward ACG GAG GCT GAT ATT GAG CTA CAG CCC TTG CTG C 69
Reverse GGC CAC AGA GGT AGC AGA TAA AGT GGC AGA GC 70
Internal control Forward CCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCC 71
Reverse GCAGAATCCAGATGCTCAAGGCCCTTCATAATATCC 72
[실시예2] 프라이머의 민감도
상기에서 제조한 프라이머에 대하여 표준검체를 희석하여 95% 이상 검출되는 농도를 확인한 결과, 각각 검출한계(LoD (단위 copies/ml))는 다음과 같다.
HPV A
프라이머 세트		 HPV 73 HPV 16 HPV 26 HPV 59 HPV 39 HPV 45 HPV 52
2.5x10⁴ 2.5x10³ 2.5x10⁴ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³
HPV B
프라이머 세트		 HPV 31 HPV 70 HPV 33 HPV 67 HPV 69 HPV 56 HPV 53
2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³
HPV C
프라이머 세트		 HPV 51 HPV 68 HPV 35 HPV 58 HPV 61 HPV 30 HPV 18
2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³
HPV D
프라이머 세트		 HPV 11 HPV 44 HPV 32 HPV 43 HPV 34 HPV 40 HPV 6
2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10⁴ 2.5x10⁴ 2.5x10³ 2.5x10³
HPV E
프라이머 세트		 HPV 66 HPV 83 HPV 82 HPV 90 HPV 62 HPV 54 HPV 81
2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³ 2.5x10³
[실시예3] 프라이머의 교차반응 여부
교차 반응성을 확인하고자 총 25종(Ureaplasma urealytium, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma parvum, Mycoplasma genitalium, Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhea, Streptococcus agalactiae, Candida albicans, Herpes simplex virus 1, Herpes simplex virus 2, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis, Cytomegalovirus, Treponema pallidum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, E.Coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Veillonella parvula, Cytomegarovirus, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus)를 대상으로 실험을 수행하였다.
실험한 결과, 모두 교차 반응이 없음을 확인하였다.
[실시예4] 프라이머의 반복성 검증
1) 반복성 시험
반복성 시험을 위해 동일한 시험자가 동일한 검체를 사용하여 20일간 매일 2회씩 검사마다 2회 반복 시험을 실시하였다. 양성 표준물질 저농도 2.5×101, 중농도 2.5×102, 고농도 2.5×103 copies/ml와 음성 표준물질을 이용하여 모두 동일한 결과를 보였다.
2) Lot 간 재현성
동일 시험자가 동일한 검체로 3개의 다른 Lot을 사용하여 5일 동안 매일 2회씩 검사마다 2회 반복 시험을 실시하였다. 양성 표준물질 저농도 2.5×101, 중농도 2.5×102, 고농도 2.5×103 copies/ml와 음성 표준물질을 이용하여 모두 동일한 결과를 보였다.
3) 시험자간 재현성
3명의 시험자가 동일한 검체로 동일한 Lot을 사용하여 3일동안 매일 1회씩 검사마다 2회 반복 시험을 실시하였다. 양성 표준물질 저농도 2.5×101, 중농도 2.5×102, 고농도 2.5×103 copies/ml와 음성 표준물질을 이용하여 모두 동일한 결과를 보였다.
[실시예5] 프라이머의 임상적 성능
병원에서 HPV 검사로 의뢰된 잔여검체를 이용하여 타사의 기허가 대조시약 제품으로 1433개의 익명화된 질 도말 검체로 분석되었다. 다음의 표 3은 임상적 성능에 대한 판정항목을 나타낸 것이고, 표 4는 본 발명의 임상적 성능을 나타낸 것이다.
항목 내용 판정법
민감도
(Sensitivity)		 양성이 양성으로 나오는 비율
Figure 112021127565317-pat00001
특이도
(Specificity)		 음성이 음성으로 나오는 비율
Figure 112021127565317-pat00002
정확도
(Accuracy)		 양성이 양성으로 나오고 음성이 음성으로 나오는 비율
Figure 112021127565317-pat00003
*TP : true positive, TN : true negative, FP : false positive, FN : false negative
Type 진양성 위양성 진음성 위음성 민감도 특이도 정확도
HPV 6 131 6 1293 3 97.76% 99.54% 99.37%
HPV 11 98 2 1330 3 97.03% 99.85% 99.65%
HPV 16 178 2 1250 3 98.34% 99.84% 99.65%
HPV 18 131 1 1297 4 97.04% 99.92% 99.65%
HPV 26 43 0 1390 0 100% 100% 100%
HPV 30 69 5 1359 0 100% 99.63% 99.65%
HPV 31 57 1 1375 0 100% 99.93% 99.93%
HPV 32 53 0 1379 1 98.15% 100% 99.93%
HPV 33 54 1 1378 0 100% 99.93% 99.93%
HPV 34 87 3 1341 2 97.75% 99.78% 99.65%
HPV 35 81 4 1347 1 98.78% 99.70% 99.65%
HPV 39 88 3 1340 2 97.78% 99.78% 99.65%
HPV 40 73 2 1357 1 98.65% 99.85% 99.79%
HPV 43 69 2 1361 1 98.57% 99.85% 99.79%
HPV 44 88 3 1341 1 98.88% 99.78% 99.72%
HPV 45 64 2 1365 2 96.97% 99.85% 99.72%
HPV 51 93 4 1335 1 98.94% 99.70% 99.65%
HPV 52 151 6 1276 0 100% 99.53% 99.58%
HPV 53 138 6 1289 0 100% 99.54% 99.58%
HPV 54 91 3 1338 1 98.91% 99.78% 99.72%
HPV 56 88 2 1343 0 100% 99.85% 99.86%
HPV 58 84 1 1348 0 100% 99.93% 99.93%
HPV 59 77 2 1352 2 97.47% 99.85% 99.72%
HPV 61 69 0 1363 1 98.57% 100% 99.93%
HPV 62 120 1 1310 2 98.36% 99.92% 99.79%
HPV 66 40 0 1393 0 100% 100% 100%
HPV 67 91 4 1337 1 98.91% 99.70% 99.65%
HPV 68 43 1 1388 1 97.73% 99.93% 99.86%
HPV 69 41 0 1392 0 100% 100% 100%
HPV 70 94 2 1336 1 98.95% 99.85% 99.79%
HPV 73 61 0 1371 1 98.39% 100% 99.93%
HPV 81 87 3 1343 0 100% 99.78% 99.79%
HPV 82 70 3 1359 1 98.59% 99.78% 99.72%
HPV 83 58 2 1372 1 98.31% 99.85% 99.79%
HPV 90 102 5 1322 4 96.23% 99.62% 99.37%
그 결과, 높은 수준의 민감도, 특이도를 확인할 수 있었다.
[실시예6] HPV 감염 진단 키트 제작
다음과 같은 구성으로 HPV 감염 진단 키트를 제작하였다.
구분 명칭 원재료 및 성분명
1 Hot Taq Master mix Hot Start Taq (1,000U/Λ)*(2.5unit/λ), Tris-HCl(pH9.0), (NH4)2SO4,MgCl2, BSA, DMSO, 25mM MgCl2, 100% glycerol, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP), 0.4% Bromophenol Blue
2 HPV Primer set A HPV 73 Forward Primer (서열번호:1)
HPV 73 Reverse Primer (서열번호:2)
HPV 16 Forward Primer (서열번호:3)
HPV 16 Reverse Primer (서열번호:4)
HPV 26 Forward Primer (서열번호:5)
HPV 26 Reverse Primer (서열번호:6)
HPV 59 Forward Primer (서열번호:7)
HPV 59 Reverse Primer (서열번호:8)
HPV 39 Forward Primer (서열번호:9)
HPV 39 Reverse Primer (서열번호:10)
HPV 45 Forward Primer (서열번호:11)
HPV 45 Reverse Primer (서열번호:12)
HPV 52 Forward Primer (서열번호:13)
HPV 52 Reverse Primer (서열번호:14)
I.C(internal control) Forward Primer (서열번호:71)
I.C(internal control) Reverse Primer (서열번호:72)
TE buffer (1M Tris-HCl(pH8.0), 0.1M EDTA)
3 HPV Primer set B HPV 31 Forward Primer (서열번호:15)
HPV 31 Reverse Primer (서열번호:16)
HPV 70 Forward Primer (서열번호:17)
HPV 70 Reverse Primer (서열번호:18)
HPV 33 Forward Primer (서열번호:19)
HPV 33 Reverse Primer (서열번호:20)
HPV 67 Forward Primer (서열번호:21)
HPV 67 Reverse Primer (서열번호:22)
HPV 69 Forward Primer (서열번호:23)
HPV 69 Reverse Primer (서열번호:24)
HPV 56 Forward Primer (서열번호:25)
HPV 56 Reverse Primer (서열번호:26)
HPV 53 Forward Primer (서열번호:27)
HPV 53 Reverse Primer (서열번호:28)
I.C(internal control) Forward Primer (서열번호:71)
I.C(internal control) Reverse Primer (서열번호:72)
TE buffer (1M Tris-HCl(pH8.0), 0.1M EDTA)
4 HPV Primer set C HPV 51 Forward Primer (서열번호:29)
HPV 51 Reverse Primer (서열번호:30)
HPV 68 Forward Primer (서열번호:31)
HPV 68 Reverse Primer (서열번호:32)
HPV 35 Forward Primer (서열번호:33)
HPV 35 Reverse Primer (서열번호:34)
HPV 58 Forward Primer (서열번호:35)
HPV 58 Reverse Primer (서열번호:36)
HPV 61 Forward Primer (서열번호:37)
HPV 61 Reverse Primer (서열번호:38)
HPV 30 Forward Primer (서열번호:39)
HPV 30 Reverse Primer (서열번호:40)
HPV 18 Forward Primer (서열번호:41)
HPV 18 Reverse Primer (서열번호:42)
I.C(internal control) Forward Primer (서열번호:71)
I.C(internal control) Reverse Primer (서열번호:72)
TE buffer (1M Tris-HCl(pH8.0), 0.1M EDTA)
5 HPV Primer set D HPV 11 Forward Primer (서열번호:43)
HPV 11 Reverse Primer (서열번호:44)
HPV 44 Forward Primer (서열번호:45)
HPV 44 Reverse Primer (서열번호:46)
HPV 32 Forward Primer (서열번호:47)
HPV 32 Reverse Primer (서열번호:48)
HPV 43 Forward Primer (서열번호:49)
HPV 43 Reverse Primer (서열번호:50)
HPV 34 Forward Primer (서열번호:51)
HPV 34 Reverse Primer (서열번호:52)
HPV 40 Forward Primer (서열번호:53)
HPV 40 Reverse Primer (서열번호:54)
HPV 6 Forward Primer (서열번호:55)
HPV 6 Reverse Primer (서열번호:56)
I.C(internal control) Forward Primer (서열번호:71)
I.C(internal control) Reverse Primer (서열번호:72)
TE buffer (1M Tris-HCl(pH8.0), 0.1M EDTA)
6 HPV Primer set E HPV 66 Forward Primer (서열번호:57)
HPV 66 Reverse Primer (서열번호:58)
HPV 83 Forward Primer (서열번호:59)
HPV 83 Reverse Primer (서열번호:60)
HPV 82 Forward Primer (서열번호:61)
HPV 82 Reverse Primer (서열번호:62)
HPV 90 Forward Primer (서열번호:63)
HPV 90 Reverse Primer (서열번호:64)
HPV 62 Forward Primer (서열번호:65)
HPV 62 Reverse Primer (서열번호:66)
HPV 54 Forward Primer (서열번호:67)
HPV 54 Reverse Primer (서열번호:68)
HPV 81 Forward Primer (서열번호:69)
HPV 81 Reverse Primer (서열번호:70)
I.C(internal control) Forward Primer (서열번호:71)
I.C(internal control) Reverse Primer (서열번호:72)
TE buffer (1M Tris-HCl(pH8.0), 0.1M EDTA)
7 HPV 양성
대조군		 HPV 6 DNA
HPV 11 DNA
HPV 16 DNA
HPV 18 DNA
HPV 26 DNA
HPV 30 DNA
HPV 31 DNA
HPV 32 DNA
HPV 33 DNA
HPV 34 DNA
HPV 35 DNA
HPV 39 DNA
HPV 40 DNA
HPV 43 DNA
HPV 44 DNA
HPV 45 DNA
HPV 51 DNA
HPV 52 DNA
HPV 53 DNA
HPV 54 DNA
HPV 56 DNA
HPV 58 DNA
HPV 59 DNA
HPV 61 DNA
HPV 62 DNA
HPV 66 DNA
HPV 67 DNA
HPV 68 DNA
HPV 69 DNA
HPV 70 DNA
HPV 73 DNA
HPV 81 DNA
HPV 82 DNA
HPV 83 DNA
HPV 90 DNA
TE buffer (1M Tris-HCl(pH8.0), 0.1M EDTA)
8 HPV 음성
대조군		 RNase-free water
[실시예7] 진단 키트의 특이성 시험
상기에서 제조한 진단 키트의 양성 대조군을 사용하여 PCR 반응시켜 총 35종의 HPV 유전자형의 유전자를 증폭하였다. 구체적으로, 다음과 같이 5 셋트로 실험을 진행하였다.
Set A Set B Set C Set D Set E
Template DNA 4㎕ Template DNA 4㎕ Template DNA 4㎕ Template DNA 4㎕ Template DNA 4㎕
HPV Primer
A set		 1㎕ HPV Primer
B set		 1㎕ HPV Primer
C set		 1㎕ HPV Primer
D set		 1㎕ HPV Primer
E set		 1㎕
Hot Taq Mastermix 5㎕ Hot Taq Mastermix 5㎕ Hot Taq Mastermix 5㎕ Hot Taq Mastermix 5㎕ Hot Taq Mastermix 5㎕
Total Volume 10㎕ Total Volume 10㎕ Total Volume 10㎕ Total Volume 10㎕ Total Volume 10㎕
PCR 조건으로는 충분히 변성시키기 위해 다음의 조건으로 수행하였다.
Segment Cycles Temperature Duration
1 1 94℃ 10.0min
2 35 94℃ 0.5min
65℃ 1.0min
72℃ 1.0min
3 1 72℃ 5.0min
반응 후 증폭된 유전자 산물을 2~3% 아가로스 겔상에서 로딩한 후 전기영동(0.5X TBE Buffer에서 110~250V로 30~50분)한 후, HPV 유전자형별 유전자 증폭 유무를 확인하였다. 실험 결과, HPV 유전자형별 특이 프라이머만이 증폭된 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
[실시예 8] 결과 판정
다음의 표 8은 양성 대조군을 이용한 PCR 증폭산물의 크기(bp)를 나타낸 것이다.
Set A Set B Set C Set D Set E
Target 크기 Target 크기 Target 크기 Target 크기 Target 크기
HPV 73 715 bp HPV 31 850 bp HPV 51 640 bp HPV 11 710 bp HPV 66 710 bp
HPV 16 590 bp HPV 70 620 bp HPV 68 505 bp HPV 44 531 bp HPV 83 656 bp
HPV 26 490 bp HPV 33 520 bp HPV 35 450 bp HPV 32 463 bp HPV 82 480 bp
HPV 59 450 bp HPV 67 450 bp HPV 58 400 bp HPV 43 388 bp HPV 90 400 bp
HPV 39 400 bp HPV 69 320 bp HPV 61 350 bp HPV 34 280 bp HPV 62 350 bp
HPV 45 286 bp HPV 56 235 bp HPV 30 260 bp HPV 40 230 bp HPV 54 230 bp
HPV 52 200 bp HPV 53 200 bp HPV 18 200 bp HPV 6 200 bp HPV 81 180 bp
I.C 120 bp I.C 120 bp I.C 120 bp I.C 120 bp I.C 120 bp
각 사이즈에서 최소 1개 이상 발현 시, HPV 유전자형 양성/음성과 무관하게 I.C (internal control) 양성 판정 기준값은 반드시 2.0 ng/ml 이상(밴드 유) 되어야 하며, HPV 유전자형 양성은 4.0 ng/ml 이상(밴드 유)인 경우이다. 판정 기준은 다음의 표 9에 나타냈다.
판정기준 결과해석
내부 대조물질 해당 HPV 유전자형
밴드 유 밴드 유 해당 HPV 유전자형 양성
밴드 유 밴드 무 해당 HPV 유전자형 음성
밴드 무 밴드 무 유효하지 않음(재시험)
이상, 첨부된 도면을 참조로 하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 제한적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 자궁경부암에서 높은 빈도로 발견되는 35 종의 HPV 유전자형을 자궁경부암의 조기에 효과적으로 검출하고 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공할 수 있다. 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 HPV 감염 진단용 조성물 및 이를 이용한 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다. 이를 통해 자궁경부암 발병과 관련된 HPV 유전자형을 신속하고 효과적으로 검출하는데 사용될 수 있다.
<110> JH bioholdings <120> PRIMER SET FOR DIAGNOSING HPV INFECTION, DIAGNOSTIC COMPOSITION, AND METHOD OF PROVIDING INFORMATION FOR DIAGNOSING HPV INFECTION USING THE SAME <130> APP2021-0591KR <160> 72 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 73 gene <400> 1 cccaattcag aagaacgacc atacaagcta caagc 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 73 gene <400> 2 gttggggcac acaataccta gtgtacccat aagc 34 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 16 gene <400> 3 gcatccttat ataatccaga aacacagcgg ctggt 35 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 16 gene <400> 4 tgcagtagac ccagagcctt taatgtataa atcg 34 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 26 gene <400> 5 ctgaggtaat gggaggaacc ttaggtggtg tc 32 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 26 gene <400> 6 catttcggtt acatacacac ctgtgtttaa ctatgg 36 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 59 gene <400> 7 catggcacgc tttgaggatc ctacacaacg ac 32 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 59 gene <400> 8 gtgtcttgct cgggtccgac acccacgaca ctg 33 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 39 gene <400> 9 gtgggtatga atggtggtcg caagcaggac a 31 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 39 gene <400> 10 aggacagtcc cccgtagata cattattggg c 31 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 45 gene <400> 11 gtgccttgtg gcatgtatgg tgttactg 28 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 45 gene <400> 12 ggcttgtaaa tgtgccagtt taggtattat gtt 33 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 52 gene <400> 13 ttgaggatcc agcaacacga ccccggac 28 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 52 gene <400> 14 gcgtaggcac ataatacaca cgccatat 28 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 31 gene <400> 15 gaggcaagta tacctattag accaccagtt agc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 31 gene <400> 16 ggcaggtgta tccacagtaa aatcagtgtc tgc 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 70 gene <400> 17 cgacggcacc agtgttgtgg tgacactaca cct 33 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 70 gene <400> 18 tgtctgttgc agatgcacgc ttactcctgg acgcac 36 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 33 gene <400> 19 ctgttctgtg cagaccccgc cttggacaat agaacagc 38 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 33 gene <400> 20 ggagatccca caaacaccca aagcagcaat accaac 36 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 67 gene <400> 21 gtccacctac agtgcaagaa atatgtttca ggacacagac g 41 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 67 gene <400> 22 cctgggtctg cgttcgttga ggtctccaac acactgaac 39 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 69 gene <400> 23 gtgcccaggg tcataataat ggcatttgtt gg 32 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 69 gene <400> 24 cctatatgca tcttccaaac tagcagtagg aggc 34 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 56 gene <400> 25 gcatggtaaa gtaccaacgc tgcaagacgt tgtat 35 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 56 gene <400> 26 actctgaatg tccaactgca ccacaaactt acac 34 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 53 gene <400> 27 ggttgcataa actaaggcgc ggtggtgtc 29 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 53 gene <400> 28 caaggcaaaa tggagggtac caaaaaggc 29 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 51 gene <400> 29 agactgaaat tgacttgcaa tgctacgagc aatttgacag 40 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 51 gene <400> 30 tccggataac tgtccagtaa tctcctttta acttgtgact cg 42 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 68 gene <400> 31 gtcgtgtggc agggccacgt ttatatagta gggc 34 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 68 gene <400> 32 gctgtagacg ctaatgaagg aacagatata tgggaacgg 39 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 35 gene <400> 33 aggtgcggta tgtttcagga cccagctgaa agacc 35 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 35 gene <400> 34 cctcggtttc tctacgtgtt ggtttccaac aggac 35 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 58 gene <400> 35 tacctgatcc caataaattt ggttttcctg atacatc 37 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 58 gene <400> 36 caaagtccat gcatccaaac cctgtatcta ccatgtca 38 <210> 37 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 61 gene <400> 37 ccgtagggtc agcaaagcac actcatctat gggaccg 37 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 61 gene <400> 38 cctgtatact taacggtttg ctgcatgcat ggcaccg 37 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 30 gene <400> 39 ggtagcaatt taggtggcgt ccctatgtcc tccac 35 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 30 gene <400> 40 caggaaacgg caccatgcca gtggattaag 30 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 18 gene <400> 41 cgcgcctctt tggcgcatat aaggcgcacc tgg 33 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 18 gene <400> 42 gggtagacag aatgttggac atgaaagtag ttgtacaag 39 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 11 gene <400> 43 gtaaagatgc ctccacgtct gcaacatc 28 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 11 gene <400> 44 gtagttgtct gatgtctccg tctgtgcact c 31 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 44 gene <400> 45 cagtagggca cgtagacgta aacgtgcatc tg 32 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 44 gene <400> 46 gcttcaacag caggctgcga ctgtacaac 29 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 32 gene <400> 47 aggcagaatg gcaagtactt ctgcctcatc acag 34 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 32 gene <400> 48 cctttagcgt tggtgcgttt ccacgcatta ttc 33 <210> 49 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 43 gene <400> 49 gtgtgatgag tgtaacataa ctttgcctac tctgc 35 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 43 gene <400> 50 tgcatgattt ccagcaatgt aggcagtatc c 31 <210> 51 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 34 gene <400> 51 gttagatatg actgtgacaa ggacaacacc atgc 34 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 34 gene <400> 52 gggtctaaca atttcaggag tggatacttc acacgg 36 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 40 gene <400> 53 ggtccgaccg aaagcggtac atataaattc caac 34 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 40 gene <400> 54 tggaaagtcg tcgcgccaca caacatataa ctc 33 <210> 55 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 6 gene <400> 55 gaccctgtag ggttacattg ctatgagcaa ttag 34 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 6 gene <400> 56 ccaacagaag ctgttgcact tctctgatgt c 31 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 66 gene <400> 57 ccatattcag caatacacag gaacgtccac gaagc 35 <210> 58 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 66 gene <400> 58 cgtagctcct ctttggtact ctgaatgtcc aactgc 36 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 83 gene <400> 59 gttattggcc gggacgaagt gggattactg 30 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 83 gene <400> 60 ggttgtagtg gaggaactag taacctcaaa gcc 33 <210> 61 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 82 gene <400> 61 cacggactgg gtatgtgcct tatttggggt atcg 34 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 82 gene <400> 62 ctgctgcatt gctatctgta tcagccaatt gtgc 34 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 90 gene <400> 63 atgcatcgct ctaaacgtcg caagcgtgcc tcc 33 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 90 gene <400> 64 tgcaggggtt gtggtagagg ctgttgtaac ctc 33 <210> 65 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 62 gene <400> 65 ctgtaaacca caaccagcca accactgctg ctat 34 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 62 gene <400> 66 cttgcgacga tgcagtacct tgggcatatt gaaag 35 <210> 67 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 54 gene <400> 67 ctattggaag ggtaggtgtc tacattgctg gaagc 35 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 54 gene <400> 68 acacatagcc gtactgtctt acaacacaca cctcc 35 <210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for HPV 81 gene <400> 69 acggaggctg atattgagct acagcccttg ctgc 34 <210> 70 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for HPV 81 gene <400> 70 ggccacagag gtagcagata aagtggcaga gc 32 <210> 71 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for internal control gene <400> 71 cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtcc 36 <210> 72 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for internal control gene <400> 72 gcagaatcca gatgctcaag gcccttcata atatcc 36

Claims (8)

  1. 다음의 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및 HPV E 프라이머 세트로 이루어진 HPV 감염 진단용 프라이머 세트:
    1) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV A 프라이머 세트:
    (a1) 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 HPV 73 증폭 프라이머 쌍;
    (a2) 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 HPV 16 증폭 프라이머 쌍;
    (a3) 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 HPV 26 증폭 프라이머 쌍;
    (a4) 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 HPV 59 증폭 프라이머 쌍;
    (a5) 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 HPV 39 증폭 프라이머 쌍;
    (a6) 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 HPV 45 증폭 프라이머 쌍;
    및
    (a7) 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 HPV 52 증폭 프라이머 쌍.
    2) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV B 프라이머 세트:
    (b1) 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 HPV 31 증폭 프라이머 쌍;
    (b2) 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 HPV 70 증폭 프라이머 쌍;
    (b3) 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 HPV 33 증폭 프라이머 쌍;
    (b4) 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 HPV 67 증폭 프라이머 쌍;
    (b5) 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 HPV 69 증폭 프라이머 쌍;
    (b6) 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 HPV 56 증폭 프라이머 쌍;
    및
    (b7) 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 HPV 53 증폭 프라이머 쌍,
    3) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV C 프라이머 세트:
    (c1) 서열번호 29 및 서열번호 30으로 이루어진 HPV 51 증폭 프라이머 쌍;
    (c2) 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어진 HPV 68 증폭 프라이머 쌍;
    (c3) 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 HPV 35 증폭 프라이머 쌍;
    (c4) 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 HPV 58 증폭 프라이머 쌍;
    (c5) 서열번호 37 및 서열번호 38로 이루어진 HPV 61 증폭 프라이머 쌍;
    (c6) 서열번호 39 및 서열번호 40으로 이루어진 HPV 30 증폭 프라이머 쌍; 및
    (c7) 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 HPV 18 증폭 프라이머 쌍,
    4) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV D 프라이머 세트:
    (d1) 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 HPV 11 증폭 프라이머 쌍;
    (d2) 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 HPV 44 증폭 프라이머 쌍;
    (d3) 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 HPV 32 증폭 프라이머 쌍;
    (d4) 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 HPV 43 증폭 프라이머 쌍;
    (d5) 서열번호 51 및 서열번호 52로 이루어진 HPV 34 증폭 프라이머 쌍;
    (d6) 서열번호 53 및 서열번호 54로 이루어진 HPV 40 증폭 프라이머 쌍;
    및
    (d7) 서열번호 55 및 서열번호 56으로 이루어진 HPV 6 증폭 프라이머 쌍,
    및
    5) 다음 군의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV E 프라이머 세트:
    (e1) 서열번호 57 및 서열번호 58로 이루어진 HPV 66 증폭 프라이머 쌍;
    (e2) 서열번호 59 및 서열번호 60으로 이루어진 HPV 83 증폭 프라이머 쌍;
    (e3) 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 HPV 82 증폭 프라이머 쌍;
    (e4) 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 HPV 90 증폭 프라이머 쌍;
    (e5) 서열번호 65 및 서열번호 66으로 이루어진 HPV 62 증폭 프라이머 쌍;
    (e6) 서열번호 67 및 서열번호 68로 이루어진 HPV 54 증폭 프라이머 쌍;
    및
    (e7) 서열번호 69 및 서열번호 70으로 이루어진 HPV 81 증폭 프라이머 쌍.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및 HPV E 프라이머 세트로 이루어진 HPV 감염 진단용 프라이머 세트를 포함하는 HPV 감염 진단용 조성물.
  4. 제1항에 따른 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및 HPV E 프라이머 세트로 이루어진 HPV 감염 진단용 프라이머 세트를 포함하는 HPV 감염 진단 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소를 더 포함하는 HPV 감염 진단 키트.
  6. 제1항에 따른 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및 HPV E 프라이머 세트로 이루어진 HPV 감염 진단용 프라이머 세트를 사용하여 분리된 생물학적 샘플의 DNA를 표적으로 하는 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 32, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 62, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 83 및 HPV 90으로 이루어진 군의 HPV 유전자형을 검출하는 것을 특징으로 하는 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제1항에 따른 HPV A, HPV B, HPV C, HPV D 및 HPV E 프라이머 세트로 이루어진 HPV 감염 진단용 프라이머 세트를 사용하여 분리된 생물학적 샘플의 DNA를 표적으로 하는 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법으로, 상기 방법은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 32, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 62, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 83 및 HPV 90 유전자형을 동시에 검출하는 HPV 감염 진단을 위한 정보제공방법.
KR1020210150994A 2021-11-05 2021-11-05 Hpv 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 hpv 감염 진단을 위한 정보제공방법 KR102444179B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20110093392A (ko) 2010-02-12 2011-08-18 엠앤디 (주) Ｈｐｖ 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법
KR20130125046A (ko) * 2012-05-08 2013-11-18 (주)진매트릭스 고위험군 인유두종바이러스 유전자 분석용 키트 및 그 분석방법
KR20140064035A (ko) * 2012-11-19 2014-05-28 (주)다이오진 리퀴드 비드 어레이와 다중중합효소연쇄반응법을 이용한 종양원성 인유두종바이러스 검출 방법

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