CN102108405A - 快速检测淋球菌的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测淋球菌的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，适用于淋球菌定性定量检测。本发明由DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板PMD18-T-NG、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有淋球菌特异性引物对和荧光探针。本发明、定量准确；检测速度快；特异性好，灵敏度高；使用步骤简单，可重复性高。可对淋球菌进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

Description

快速检测淋球菌的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测淋球菌荧光定量PCR(聚合酶链式反应)检测方法及其试剂盒，适用于淋球菌的定性定量检测。

背景技术

性传播疾病((Sexually Transmitted Disease，STD)是多种以性行为性接触为主要传播途径的传染性疾病的统称，严重危害人类的身心健康。其中由淋球菌(Neisseria gonorrheae，NG)引起的淋病(gonorrhea)是最为常见的性传播疾病。淋病主要通过性行为传染，也可能通过接触感染，属于一类泌尿生殖系统感染疾病，临床上主要表现为尿道、生殖器的急慢性化脓性炎症。其发病机制是淋球菌侵入尿道或宫颈粘膜，通过胞饮作用进入细胞后大量繁殖，引起炎症反应，导致局部的水肿，充血，粘膜坏死，脱落，形成尿道脓性分泌物，有疼痛感。男性患者主要引起尿道炎，附睾炎，淋菌性前列腺炎等，女性患者主要引起尿道炎，宫颈炎等，若在患病期间分娩则会使新生儿感染淋菌性结膜炎。近年来随着口-生殖器性行为的增多以及男性同性恋患者的存在，淋菌性咽炎和淋菌性直肠炎也较为常见。鉴于淋球菌的危害性以及在我国的高发病率，对于淋球菌感染者及高危人群的定期检查和早期诊断对于指导临床治疗、评估疾病的发展和预后具有重大意义。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在淋球菌定量检测和临床诊断(Clinical validation of a real-time polymerase chain reaction detectionof Neisseria gonorrheae porA pseudogene versus culture techniques.[J].Sex Transm Dis.2008，35：517-520；A fast real-time polymerase chainreaction method for sensitive and specific detection of the Neisseriagonorrhoeae porA pseudogene.[J].J Mol Diagn.2006，8：574-581；Areal-time PCR assay for the detection of Neisseria gonorrhoeae in genitaland extragenital specimens.[J].Diagn Microbiol Infect Dis.2005，52：1-5)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、淋球菌、支原体、衣原体、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此焏待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测淋球菌的荧光定量PCR试剂盒。

本发明采用以下技术方案：

一、PCR试剂盒

该试剂盒包括DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、NG标准阳性模板PMD18-T-NG和阴性质控标准品；

荧光定量PCR反应液含有淋球菌特异性引物对和荧光探针；

淋球菌：

正向引物为5′-CTGATTTGGGTTCGAAAATCG-3′，

反向引物为5′-CCTTCKTTAGTACCGCTGAC-3′，

其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基；

荧光探针序列为5′-TCAAGAAGACCTCGGCA-3′，该荧光探针序列可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，荧光探针为LNA型Taqman探针，5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记BHQ，可以大大减少背景噪音的干扰，标准阳性模板PMD18-T-NG是含有淋球菌高度保守基因-porA基因的109个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。

具体地说：

a)DNA裂解液

DNA裂解液包含：50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，体积分数为1％Triton X-100，体积分数为1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。

b)荧光定量PCR反应液

荧光定量PCR反应液包含：PCR 10×buffer 5.0μl，10μmol/L的正向引物和反向引物各1.5μl，5μmol/L的荧光探针1.5μl，25mmol/L的MgCl₂12.5μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，2.5U/μl的Taq DNA聚合酶1.0μl，无菌双蒸水26μl。

c)淋球菌标准阳性模板PMD18-T-NG

淋球菌标准阳性模板PMD18-T-NG是含有淋球菌高度保守基因porA基因(膜孔蛋白基因)109个核苷酸片段构成的PMD18-TCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10⁹拷贝/ml，-20℃保存。贮存浓度为10⁹拷贝/ml，使用前进行10倍梯度的系列稀释。

d)阴性质控标准品

阴性质控标准品为无菌双蒸水；

本试剂盒的工作原理：

在本发明提供的快速定量检测淋球菌荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对淋球菌的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供的检测淋球菌荧光定量PCR试剂盒中，针对淋球菌检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于淋球菌定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测淋球菌荧光定量PCR方法，并研制出检测淋球菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速诊断淋球菌的要求。

二、本发明的使用方法包括下列步骤：

a)对贮存浓度为10⁹拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-NG进行10倍的系列稀释，制备阳性标准品，用紫外分光光度计测定A₂₆₀对标准品定量；

b)用DNA裂解液从待测标本中提取NG DNA；

c)分别取b)步中的DNA和同样量的系列稀释的a)步中的两种阳性标准品加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；

d)通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅1.5小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；

3、特异性好，灵敏度高；

4、使用步骤简单，可重复性高。

本试剂盒可对淋球菌进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。

应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1：试剂盒组成与配制

a、DNA提取试剂

DNA裂解液组成：

裂解液I：配制0.01M PBS(28.94g Na₂HPO₄·12H₂O，2.6g KH₂PO₄·2H₂O加入1000ml超净水混匀，调pH到7.4)。

裂解液II：在pH7.4Tris-EDTA缓冲液(pH7.610mM Tris.HCL，pH8.01mMEDTA)中，按照1∶100比例加入NP-40混匀后完成配制。将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透明管)内。分装量5ml/管。

b、荧光PCR 10×Buffer组成：

500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.025℃)、1.0％Triton X-100；

c、荧光定量PCR反应液：PCR 10×buffer 5.0μl，10μmol/L的正向引物和反向引物各1.5μl，5μmol/L的荧光探针1.5μl，25mmol/L的MgCl₂12.5μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，2.5U/μl的Taq DNA聚合酶1.0μl，无菌双蒸水26μl。

d、标准阳性模板贮存液：浓度为10⁹拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-NG。

e、阴性质控标准品：为无菌双蒸水

实施例2：使用试剂盒快速检测淋球菌

a、DNA提取过程：

①将离心管中液体取500μl转移至1.5ml离心管中，12000rpm离心5min；

②弃上清，加入500μl提取液I，12000rpm离心5min；

③弃上清，加入200μl提取液I，12000rpm离心5min；

④弃上清，加入50μl提取液II；

⑤振荡混匀，100℃恒温处理10min；

⑥12000rpm离心5min，取上清液5μl进行PCR扩增。

b、将阳性标准模板(试剂d)系列稀释为10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml。

c、分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各45μl，取第a)步所得NG DNA和第b)步稀释的NG阳性标准模板各5μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃40s，5个循环；94℃30s，58℃40s，35个循环(收集荧光信号)。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，所用荧光为FAM，其吸收波长494nm，发射波长522nm。

循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：NG标准阳性模板10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml的Ct值分别为17.52，20.64，24.43，27.88，30.69，34.42；阴性对照为0或40；

反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左右才能完成，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。

Claims (5)

1.一种快速检测淋球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

由DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板PMD18-T-NG、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有淋球菌特异性引物对和荧光探针；

正向引物为5′-CTGATTTGGGTTCGAAAATCG-3′，

反向引物为5′-CCTTCKTTAGTACCGCTGAC-3′，

其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基；

荧光探针序列为5′-TCAAGAAGACCTCGGCA-3′，该荧光探针序列可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，荧光探针为LNA型Taqman探针，5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记BHQ，可以大大减少背景噪音的干扰，标准阳性模板PMD18-T-NG是含有淋球菌高度保守基因-porA基因的109个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于DNA裂解液包含：

50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，体积分数为1％Triton X-100，体积分数为1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。

3.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应液包含：

PCR 10×buffer 5.0μl，10μmol/L的正向引物和反向引物各1.5μl，5μmol/L的荧光探针1.5μl，25mmol/L的MgCl212.5μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，2.5U/μl的Taq DNA聚合酶1.0μl，无菌双蒸水26μl。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是淋球菌标准阳性模板PMD18-T-NG包含的porA基因的核苷酸序列为：

CTGATTTGGGTTCGAAAATCGGCTTCAAAGGTCAAGAAGACCTCGGCAACGGCCTGAAAGCCATTTGGCAGTTGGAACAAAAAGCCTACGTCAGCGGTACTAACGAAGG。

5.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于阴性质控标准品为：

无菌双蒸水。