CN104131112A - 一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淋球菌检测用引物组，述引物组以淋球菌PorA基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID：2～5所示。本发明的引物组灵敏度高、特异性强，可满足淋球菌的快速准确检测的需求。本发明还公开了一种淋球菌检测试剂盒，该试剂盒可快速检测淋球菌，具有检测时间短、成本低、准确率高等优点。

Description

一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。

背景技术

性病传播快，危害大，其中淋病在世界广泛流行，常年居性病发病率之首。其病原体是淋病奈瑟氏菌(简称淋球菌)。人是淋球菌的惟一自然宿主，淋球菌通常寄居于粘膜表面的柱状上皮细胞内，其主要致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，主要通过性接触直接感染泌尿生殖道、口咽部和肛门直肠粘膜，或在分娩时通过产道感染新生儿，临床表现为单纯性淋病、盆腔炎、口咽部和肛门直肠病、淋菌性结膜炎及播散性淋病。若不及时治疗，可引起尿道狭窄、输精管及输卵管狭窄甚或闭锁，继发宫外孕和男女不育不孕症。因此，对淋病的早期诊断和治疗十分重要。

淋球菌感染后约有1％男性无任何症状，75％的女性患者无症状，因此，仅凭有无临床症状作为判断是否感染淋球菌的依据，漏诊率极高，尤其是女性。目前，主要依靠涂片和培养检查，涂片容易漏诊，尤其是在淋病潜伏期，培养检查程序繁琐，耗时长，同样易出假阴性。因此，建立准确可靠的检测方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的淋球菌检测方法程序繁琐、耗时长、准确率较低的问题。

因此，本发明提供了一种淋球菌检测用引物组，所述引物组以淋球菌PorA基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，各引物的核苷酸序列分别为：

外引物F3：(SEQ ID NO：2)

CCATTGATCCTTGGGACAG

外引物B3：(SEQ ID NO：3)

CAGACCGGCATAATACACAT

内引物FIP：(SEQ ID NO：4)

GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG

内引物BIP：(SEQ ID NO：5)

AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA。

在上述技术方案中，对于淋球菌而言，常用于其核酸扩增检测的基因有16SrRNA、cppB、orf1、opa、porA，其中porA基因(其序列如SEQ IDNO：1所示)在临床应用中显示较好的敏感性、特异性和保守性，因此本发明选择porA作为检测淋球菌的靶基因。

在上述技术方案中，环介导等温扩增技术(LAMP)是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，它采用4-6条特异引物(针对基因的6-8个区域)及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行等温扩增，短时间扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个拷贝。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂盒仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。其中，引物是LAMP法实现扩增的关键。

在上述技术方案中，所述引物组是经过对所有淋球菌不同菌株的porA基因进行比对，标出易突变的位点和突变频率，选择最保守的porA600-900bp区域作为引物设计的靶序列，使用软件设计得出的。LAMP引物组至少含有4条引物，包括两个外引物(F3和B3)和两个内引物(FIP和BIP，各约40bp)。其中，内引物FIP包含F1c(与Fl区域互补)和F2序列，内引物BIP包含B1c(与B1区域互补)和B2序列。F3和B3在起始扩增反应时起作用；FIP和BIP在整个扩增过程中都起作用，是最关键的一对引物，导致产生环状的茎环结构无限扩增。本发明的引物组，能够特异结合淋球菌PorA序列上的6个特异区域，进行淋球菌的LAMP检测时，出峰时间早，信号强，灵敏度高、特异性强，本发明的引物组根据是否扩增就能该判断靶标物质存在与否，可满足淋球菌的快速准确检测的需求。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述引物组还包括环引物FLP和环引物BLP，两个环引物的核苷酸序列分别为：

环引物FLP：(SEQ ID NO：6)

ATACCGTCGTGGCGTTTG

环引物BLP：(SEQ ID NO：7)

CGCCTATACGCCTGCTAC。

加入环引物(FLP和BLP)的引物组能够特异结合靶序列上的8个特异区域，它不仅保持了原引物组(未加环引物之前的引物组)信号强、灵敏度高、特异性强的优势，还进一步使得LAMP反应加速，反应时间缩短，大大增加了扩增检测的效率。

本发明还提供了一种淋球菌检测试剂盒，所述淋球菌检测试剂盒包含所述的引物组。引物组可以仅包含所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，还可以进一步包含所述环引物FLP和环引物BLP。为了提高检测效率，优选包含所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物FLP和环引物BLP的引物组。所述淋球菌检测试剂盒可快速检测淋球菌，灵敏性和特异性高、检测时间短、准确率高。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述淋球菌检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、显色液和阳性对照液。Bst DNA聚合酶、反应液、显色液和阳性对照液是除引物组之外LAMP反应所必需的其他试剂，将这些试剂纳入试剂盒中，可便于使用者操作。其中，Bst DNA聚合酶具有5'→3'DNA聚合酶活性，能在恒温下扩增DNA核酸；Bst DNA聚合酶不具有3'→5'外切核酸酶活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成，进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。反应液一般包括LAMP反应时所需的dNTP、buffer、Mg²⁺和甜菜碱；显色液用于核酸检测，通常使用的显色液有SYTO-9、SYBR GreenⅠ、SYBR GreenⅡ、SYBR Gold、GelStar等。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述BstDNA聚合酶的浓度为6-10U/μL；

所述反应液含有：1.4～1.8mmol/LdNTP、15～25mmol/LTris-HCl、9～12mmol/LKCl、9～12mmol/L(NH₄)₂SO₄、5～8mmol/LMgSO₄、0.1～0.12体积％TritonX-100、0.8～1.2mol/L甜菜碱；

所述显色液为SYTO-9或SYBRGreenⅠ；

所述阳性对照为淋球菌PorA基因DNA片段；

所述引物组中各引物的浓度为：所述外引物F3和B3各0.15～0.25μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.4～1.8μmol/L；或

所述外引物F3和B3各0.15～0.25μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.4～1.8μmol/L，所述环引物FLP和BLP各0.7～0.9μmol/L。

上述淋球菌检测试剂盒使用方便，具体使用方法包括以下步骤：(1)准备待测样品DNA；(2)在反应管中加入所述反应液10～14μL，所述BstDNA聚合酶0.8～1.2μL，ddH₂O7～9μL，所述引物组0.8～1.2μL以及所述样品DNA1.5～2.5μL，进行环介导等温扩增反应；(3)在上述反应管和阳性对照组中分别加入所述显色液，混匀，样品组显色与阳性对照组相同则为阳性，否则为阴性。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述BstDNA聚合酶的浓度为8U/μL；

所述反应液含有：1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、6mmol/LMgSO₄、0.1％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；

所述显色液为0.2μmol/L SYTO-9；

所述引物组中各引物的浓度为：所述外引物F3和B3各0.2μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.6μmol/L；或

所述外引物F3和B3各0.2μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，所述环引物FLP和BLP各0.8μmol/L。

为了保证LAMP反应的稳定性，优选地，所述淋球菌检测试剂盒还包括稳定剂，所述稳定剂优选为石蜡油。

本发明还提供了所述的淋球菌检测用引物组或所述的淋球菌检测试剂盒在检测淋球菌中的应用。本发明的引物组和试剂盒均可用于淋球菌的检测，且具有检测灵敏度高、特异性强、效率高、成本低等优点。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述的应用包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行环介导等温扩增反应；

3)检测扩增产物。

所述步骤3)中，扩增产物的检测可通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行，优选扩增产物化学发光检测的方法，即使用荧光染料如SYTO-9、SYBRGreen Ⅰ等直接对产物进行染色，可以通过肉眼直接观察结果。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)中，所述环介导等温扩增反应的起始阶段温度为60～65℃，持续时间为25～35s；扩增循环阶段温度为60～65℃，共进行80～100个循环，每个循环的持续时间为40～60s。

所述环介导等温扩增反应两个阶段的具体反应步骤如下：

1)起始阶段：

1步：当双链DNA处于65℃左右的动态平衡中时，引物组中的BIP引物就能通过互补结合到目标DNA双链上，在Bst DNA聚合酶作用下，启动DNA合成；

2步：从BIP的B2区域3’端开始合成DNA模板的互补链至F3C；

3步：B3引物退火结合到模板DNA的互补区域B3C，启动链取代合成，同时释放由BIP引物引导合成的互补链；

4步：释放的DNA的BIC区域结合B1区域，形成茎环结构；3步释放的DNA链作为FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式启动DNA的合成及链取代，释放的DNA链的FIP端同样形成茎环结构。进而，形成哑铃结构扩增始发物。

2)扩增循环阶段(延伸阶段)：

5步：哑铃结构通过自引导DNA合成迅速转换成茎状结构DNA；

6步：BIP引物与茎环结构的环状单链区域结合并开始新的DNA合成，由于F1及F1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；

7步：FIP引物同样与对应的茎环结构的环状单链区域结合，由于B1及B1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；

8步：如此周而复始，最终形成不同长度(目的片段长度的自然倍数)花椰菜cauliflower状的反向重复序列。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明的引物组，在进行淋球菌的LAMP检测时，出峰时间早，信号强，灵敏度高，检测限可达1pg/μL，阴性的稳定性良好，而且特异性强，对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、无名念珠菌、季页蒙念珠菌、解脂酵母菌、克柔念珠菌、挪威念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、乳酸杆菌、灰色奈瑟氏菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、彭氏变形杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌27种菌均无非特异扩增，可满足淋球菌的快速准确检测的需求。

本发明的淋球菌检测试剂盒，只需一个恒定温度就能进行扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；本发明的淋球菌检测试剂盒利用针对六个区段的四条引物或针对八个区段的六条引物，根据是否扩增即能判断淋球菌存在与否，因此具有高度特异性；本发明的淋球菌检测试剂盒扩增快速且高效，在不到一个小时即可完成扩增，且产率高；本发明的淋球菌检测试剂盒鉴定简便，加入显色液后，阴阳性结构显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

附图说明

图1为本发明LAMP的引物组成及对应区域示意图；

图2为porA1、porA2'、porA3引物的LAMP反应结果图；

图3为porA2'引物引入环引物的LAMP反应结果图；

图4为LAMP引物porA2的灵敏度试验图；

图5为porA2引物扩增28种菌的特异性试验图；

图6为1pg/μL精密度试验图；

图7为阴性精密度试验图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，凡依据本发明内容所作的等同变换，均同理包含在本发明的范围内。实施例中所用淋球菌为标准菌株ATCC49266，购自卫生部临床检验中心，在广州医科大学附属第三医院保存。

实施例1

淋球菌检测用LAMP引物组的设计

设计步骤如下：

①查阅中外文文献，常用于淋球菌核酸扩增检测的基因有16SrRNA、cppB、orf1、opa、porA，其中porA在临床应用中显示较好的敏感性、特异性和保守性，本研究选择porA作为检测淋球菌的靶基因

②在NCBI搜索所有淋球菌不同菌株的porA基因进行比对，标出易突变的位点和突变频率

③选择最保守的porA 600-900bp区域作为引物设计的靶序列

④使用在线设计软件Primer Explorer version4设计特异引物。

本发明LAMP的引物组成及对应区域如图1所示，设计得到的三组引物，其序列分别如下所示：

(1)淋球菌引物组porA1，靶基因：porA

表1-1淋球菌引物组porA1

(2)淋球菌引物组porA2'(未引入环引物)，靶基因：porA

表1-2淋球菌引物组porA2'

(3)淋球菌引物组porA3，靶基因：porA

表1-3淋球菌引物组porA3

实施例2

LAMP引物组筛选及反应体系的建立

为了确定实施例1中引物组是否可用，需要对其进行筛选，具体筛选步骤如下：

1)DNA提取

参照天根生化科技有限公司细菌基因组提取试剂盒说明书操作，用蛋白酶K裂解细胞，RnaseA去除RNA，结合柱吸附DNA，TE洗脱DNA。

取5μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照以下公式计算获得：

C＝A×N×50/1000

式中：

C——DNA浓度(μg/μL)

A——260nm处的吸光值

N——核酸稀释倍数

1OD260nm＝50μg/mL双链DNA

当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于LAMP检测。

2)反应体系

其中，在上表所示的反应体系中，反应液由以下组分组成：

1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、6mmol/LMgSO₄、0.1％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；

引物组为引物组porA1、引物组porA2'或引物组porA3，其中：

引物组porA1中各引物的浓度为：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L；

引物组porA2'中各引物的浓度为：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L；

引物组porA3中各引物的浓度为：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L；

按照表1中的试剂配制LAMP反应体系时，先在冰上分别准备三个引物组(引物组porA1、引物组porA2'和引物组porA3)的LAMP反应混合液，将表中反应体系所需试剂中除DNA模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23μL，再分别加入2μL模板DNA或阴阳性对照模板，在此，采用淋球菌基因组DNA(10pg/μL)作为阳性模板，ddH2O作为阴性对照模板。

3)LAMP反应条件及引物筛选条件

参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为：Holding Stage为63℃30s，1个循环；Cycling Stage为63℃15s，63℃45s，90个循环，于63℃45s处收集荧光信号，根据出峰时间及阴阳性符合率初步筛选引物。

4)引物筛选结果

由图2可知，以porA为靶基因设计的三套引物组(porA1、porA2'、porA3)中，porA1引物组约53min出峰，porA2'引物组约40min出峰，porA3引物组不出峰，阴性对照不出峰。porA3不可用，porA1出峰时间较porA2'晚，综合扩增曲线和出峰时间选择porA2'引物组继续实验，引入环引物进一步缩短反应时间，优化反应体系。

实施例3

引物组优化

在porA2'引物组中引入环引物，得到新的引物组porA2引物组，其序列如下表所示。

表1-4淋球菌引物组porA2

按照实施例2中的DNA提取方法、反应体系和LAMP反应条件进一步测试引物组porA2，其中，反应体系中的引物组porA2中各引物的浓度为：所述外引物F3和B3各0.2μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，所述环引物LF和LB各0.8μmol/L，其余试剂同实施例2，检测结果如图3所示。由图3可知，porA2'引物引入环引物后，出峰时间缩短到了10min，大大缩短了反应时间。

实施例4

LAMP引物组灵敏度测试

将淋球菌基因组DNA(10ng/μl)逐次稀释到1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL6个梯度，每个稀释度分别取2μL进行LAMP实验，以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以porA2(加环引物)作为LAMP引物，进行LAMP扩增(反应体系的其他试剂的用量和配比同实施例2)，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为：Holding Stage为63℃30s，1个循环；Cycling Stage为63℃15s，63℃45s，45个循环，于63℃45s处收集荧光信号，以确定LAMP反应的灵敏度。

从图4中可以看出，将淋球菌基因组DNA稀释至不同浓度梯度，porA2作为LAMP引物进行LAMP扩增，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化，检测灵敏度可达1pg/μL，最低检出限出峰时间约在18min。

实施例5

LAMP引物组特异性试验

用铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、无名念珠菌、季页蒙念珠菌、解脂酵母菌、克柔念珠菌、挪威念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、乳酸杆菌、灰色奈瑟氏菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、彭氏变形杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌的DNA作为LAMP反应的模板，用porA2(加环引物)作为LAMP引物，进行LAMP反应(反应体系的其他试剂的用量和配比同实施例2)，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为：Holding Stage为63℃30s，1个循环；Cycling Stage为63℃15s，63℃45s，45个循环，于63℃45s处收集荧光信号，验证LAMP反应的特异性，利用荧光定量PCR仪观察反应结果。

由图5可以看出，porA2引物只对淋球菌特异性检出，特异性良好。

实施例6

LAMP稳定性实验

1、1pg/μL精密度实验(最低检出度)

将淋球菌基因组DNA(1pg/μL)作为模板，以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以淋球菌基因组DNA(10ng/μl)作为阳性对照，以porA2(加环引物)作为LAMP引物进行LAMP扩增(反应体系的其他试剂的用量和配比同实施例2)，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为：Holding Stage为63℃30s，1个循环；Cycling Stage为63℃15s，63℃45s，45个循环，于63℃45s处收集荧光信号，20个平行样品观察1pg/μL精密度LAMP反应的稳定性。

由图6可以看出，porA2引物的最低检出限1pg/μL的稳定性良好，20份平行样品皆有检出。

2、阴性精密度实验

以ddH2O代替DNA模板作为阴性精密度和阴性对照模板，以淋球菌基因组DNA(10ng/μl)作为阳性对照，以porA2(加环引物)作为LAMP引物进行LAMP扩增(反应体系的其他试剂的用量和配比同实施例2)，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为：Holding Stage为63℃30s，1个循环；Cycling Stage为63℃15s，63℃45s，45个循环，于63℃45s处收集荧光信号，20个平行样品观察阴性精密度LAMP反应的稳定性。

由图7可以看出，porA2引物的阴性稳定性良好，20份平行样品皆无检出。

实施例7

淋球菌检测试剂盒

淋球菌检测试剂盒中包含引物组PorA2，PorA2的核苷酸序列如下：

外引物F3：(SEQ ID NO：2)

CCATTGATCCTTGGGACAG

外引物B3：(SEQ ID NO：3)

CAGACCGGCATAATACACAT

内引物FIP：(SEQ ID NO：4)

GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG

内引物BIP：(SEQ ID NO：5)

AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA

环引物FLP：(SEQ ID NO：6)

ATACCGTCGTGGCGTTTG

环引物BLP：(SEQ ID NO：7)

CGCCTATACGCCTGCTAC。

实施例8

试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3：(SEQ ID NO：2)

CCATTGATCCTTGGGACAG

外引物B3：(SEQ ID NO：3)

CAGACCGGCATAATACACAT

内引物FIP：(SEQ ID NO：4)

GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG

内引物BIP：(SEQ ID NO：5)

AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA。

环引物FLP：(SEQ ID NO：6)

ATACCGTCGTGGCGTTTG

环引物BLP：(SEQ ID NO：7)

CGCCTATACGCCTGCTAC。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；

(3)配制反应液和引物组：

反应液含1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)2SO4、6mmol/LMgSO4、0.1％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物FLP和BLP各0.8μmol/L，将配置好的反应液和引物组置于容器；

(4)购置稳定液：石蜡油，置于容器；

(5)购置显色液：SYTO-9，置于容器；

(6)提取阳性对照：提取淋球菌PorA基因组DNA，置于容器；

(7)将上述6个容器装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

1、将外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、环引物FLP和BLP合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将上述(2)～(3)步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将阳性对照样本分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

Claims (10)

1.一种淋球菌检测用引物组，其特征在于：所述引物组以淋球菌PorA基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，各引物的核苷酸序列分别为：

外引物F3：

CCATTGATCCTTGGGACAG

外引物B3：

CAGACCGGCATAATACACAT

内引物FIP：

GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG

内引物BIP：

AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA。

2.如权利要求1所述的淋球菌检测用引物组，其特征在于：所述引物组还包括环引物FLP和环引物BLP，两个环引物的核苷酸序列分别为：

环引物FLP：

ATACCGTCGTGGCGTTTG

环引物BLP：

CGCCTATACGCCTGCTAC。

3.一种淋球菌检测试剂盒，其特征在于：所述淋球菌检测试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组。

4.如权利要求3所述的淋球菌检测试剂盒，其特征在于：所述淋球菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、反应液、显色液和阳性对照液。

5.如权利要求4所述的淋球菌检测试剂盒，其特征在于：

所述Bst DNA聚合酶的浓度为6-10U/μL；

所述反应液含有：1.4～1.8mmol/LdNTP、15～25mmol/LTris-HCl、9～12mmol/LKCl、9～12mmol/L(NH₄)₂SO₄、5～8mmol/LMgSO₄、0.1～0.12体积％TritonX-100、0.8～1.2mol/L甜菜碱；

所述显色液为SYTO-9或SYBRGreenⅠ；

所述阳性对照为淋球菌porA基因DNA片段；

所述引物组中各引物的浓度为：所述外引物F3和B3各0.15～0.25μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.4～1.8μmol/L；或

所述外引物F3和B3各0.15～0.25μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.4～1.8μmol/L，所述环引物FLP和BLP各0.7～0.9μmol/L。

6.如权利要求5所述的淋球菌检测试剂盒，其特征在于：

所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μL；

所述反应液含有：1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、6mmol/LMgSO₄、0.1％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；

所述显色液为0.2μmol/L SYTO-9；

所述引物组中各引物的浓度为：所述外引物F3和B3各0.2μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.6μmol/L；或

所述外引物F3和B3各0.2μmol/L，所述内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，所述环引物FLP和BLP各0.8μmol/L。

7.如权利要求3～6中任一权利要求所述的淋球菌检测试剂盒，其特征在于：所述淋球菌检测试剂盒还包括稳定剂，所述稳定剂为石蜡油。

8.如权利要求1或2所述的淋球菌检测用引物组或权利要求3～6中任一权利要求所述的淋球菌检测试剂盒在检测淋球菌中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行环介导等温扩增反应；

3)检测扩增产物。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的起始阶段温度为60～65℃，持续时间为25～35s；扩增循环阶段温度为60～65℃，共进行80～100个循环，每个循环的持续时间为40～60s。