CN110904269A

CN110904269A - 用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN110904269A
Application number: CN201911154175.7A
Authority: CN
Inventors: 黄盈; 云振宇; 李文静; 韩嘉钰; 周航; 谢长江; 黄卫建
Original assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明公开了一种用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组、试剂盒和检测方法，涉及膜芯片检测技术领域。本发明公开的核酸组包括第一引物对至第七引物对中的至少一种，第一引物对至第七引物对的序列如SEQ ID NO.3‑16所示。该核酸组可以同时对孕产妇宫内感染的病原微生物例如B族链球菌、淋球菌、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、沙眼衣原体、解脲脲原体以及生殖支原体等微生物进行检测，使用本发明提供的核酸组和检测方法进行检测时，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、通量高以及操作便捷等特点。

Description

用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及膜芯片检测技术领域，具体而言，涉及一种用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组、试剂盒和检测方法。

背景技术

据国内外调查显示，每年约有3％-8％的新生儿发生母源性细菌、病毒或原虫的感染，这也是导致新生儿先天性缺陷或残疾的主要原因。大量临床研究指出，新生儿感染与宫内感染有紧密联系，主要感染途径有生殖道的上行以及血行感染，可导致胎儿各器官系统病理表现或胎儿宫内生长受限、胎儿宫内窘迫甚至死胎，造成新生儿疾病发生率增加，也是发生早产儿脑瘫的主要危险因素。因此，掌握孕期宫内感染的具体情况对降低围生婴儿残疾率和病死率、提高人口素质具有重要意义。孕产妇宫内感染的主要临床研究表明，引起胎儿宫内先天性感染的病原微生物较多，包括B族链球菌、淋球菌、疱疹病毒、人巨细胞病毒、沙眼衣原体、支原体等。

目前，由于孕产妇生殖道微生物菌群种类繁多，环境复杂，传统的细菌检测方法特异性不高，且灵敏度较低。现有技术中针对细菌的检测方法主要是微生物培养法、血清学方法、定性PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)法等，均有相应的不足。

微生物分离培养鉴定是细菌和病毒检测的金标准，但是整个过程耗时约2-3天甚至更长，且操作繁琐，假阴性率高，培养结果易受外界环境影响。血清学方法用于检测血清中的抗体，适用于潜伏期、无症状病人及流行病学调查，包括型特异性血清抗体检测、免疫印迹法、ELISA等方法，该方法操作简单，缺点是无统一的标准。定性PCR用于检测微生物中靶基因序列，一般采用凝胶电泳分析，耗时短，但具有一定的局限性，在目的片段产量较低时无法检测到，灵敏度较低。实时荧光定量PCR通过检测荧光信号的强弱从而实时检测PCR产物扩增量，可以对微生物中靶基因进行定量分析，检测结果准确，重复性高，但是只能做单重或最高3-4重，无法提高其通量。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供用于一种用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组、试剂盒和检测方法。本发明提供的核酸组可以同时对孕产妇宫内感染的病原微生物例如B族链球菌(GBS)、淋球菌(NG)、单纯疱疹病毒II型(HSVII)、人巨细胞病毒(HCMV)、沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)以及生殖支原体(MG)等微生物进行检测，使用本发明提供的核酸组和检测方法进行检测时，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、通量高以及操作便捷等特点。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组，其包括如下引物对中的至少一种：

检测B族链球菌的第一引物对：其包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ IDNO.4所示的下游引物；

检测淋球菌的第二引物对：其包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；

检测单纯疱疹病毒II型的第三引物对：其包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQID NO.8所示的下游引物；

检测人巨细胞病毒的第四引物对：其包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ IDNO.10所示的下游引物；

检测沙眼衣原体的第五引物对：其包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ IDNO.12所示的下游引物；

检测解脲脲原体的第六引物对：其包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ IDNO.14所示的下游引物；

检测生殖支原体的第七引物对：其包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ IDNO.16所示的下游引物。

在可选的实施方式中，上述核酸组包括上述引物对中的至少二种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种。

本发明实施例提供的上述引物对通过合理的科学设计，可以使得上述的7种引物对在同一PCR反应体系进行多重PCR，避免非特异性扩增，提高检测的灵敏度和特异性，能够同时对B族链球菌(GBS)、淋球菌(NG)、单纯疱疹病毒II型(HSVII)、人巨细胞病毒(HCMV)、沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)以及生殖支原体(MG)等孕产妇宫内感染的病原微生物进行检测，可用于孕产妇宫内微生物检测或鉴定，提高检测灵敏度和特异性等。

需要说明的是，使用上述引物对进行检测的方法可以是：以待测样品的总DNA为模板，以上述7对特异性引物组合进行PCR扩增，各对引物的目标序列分别对应各微生物的特异性靶序列，最后将扩增产物与特异性探针杂交后酶标并使用显色液显色，通过肉眼或成像仪观察检测结果。如果样品中有相应的微生物则扩增出的PCR产物与对应的探针杂交，通过酶标、显色反应出现肉眼可见的斑点，实现检出效果。

在可选的实施方式中，所述核酸组还包括如下引物对：

检测人β-actin基因的第八引物对：其包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ IDNO.2所示的下游引物。

在可选的实施方式中，所述核酸组还包括如SEQ ID NO.17-24所示的检测探针中的一种或多种。

各检测探针对应的可特异性杂交结合的扩增产物分别如下：

SEQ ID NO.17为β-actin探针，可与第八引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.18为B族链球菌探针，可与第一引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.19为淋球菌探针，可与第二引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.20为单纯疱疹病毒II型探针，可与第三引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.21为人巨细胞病毒探针，可与第四引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.22为沙眼衣原体探针，可与第五引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.23为解脲脲原体探针，可与第六引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.24为生殖支原体探针，可与第七引物对的PCR产物杂交。

本发明实施例所提供的检测探针与对应扩增产物结合的特异性更好，灵敏度更高，有利于提高整体检测的特异性和灵敏度。

在可选的实施方式中，所述核酸组还包括如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

所述阳性对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；

所述阴性对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

在可选的实施方式中，所述核酸组还包括：用于与所述阳性对照探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO.27所示。

阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性对照探针结合，而不与阴性对照探针结合。因此，检测时，在膜芯片上的阳性对照探针位置有斑点而阴性对照探针位置没有斑点说明杂交结果可靠，检测结果更可信。

在可选的实施方式中，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

存在于上游引物的5’端或下游引物的5’端的标记物可以使得扩增产物带有相应的标记物，当PCR产物与探针结合后，通过该标记物扩增产物易于与带有对应标记物的催化酶相结合，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应探针位置是否有相应的扩增产物，进而可判断样本中的是否存在B族链球菌、淋球菌、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、沙眼衣原体、解脲脲原体以及生殖支原体感染情况。

当引物的5’端的标记物为生物素时，则可采用由碱性磷酸酶标记的催化酶(Streptavidin，SA)来进行显色反应。生物素与链霉亲和素具有极高的亲和力，反应呈高度专一性。每个链霉亲和素分子具有4个生物素分子结合位点，因此，链霉亲和素可同时以多价形式结合生物素。生物素标记的引物与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素联合使用，将检测信号级联放大，最后通过显色反应或化学发光可检测。

相应的，当引物的5’端的标记物为异硫氰酸荧光素时，则可采用由异硫氰酸荧光素抗体标记的催化酶来进行显色反应。当引物的5’端的标记物为地高辛，则可采用由地高辛抗体标记的催化酶来进行显色反应。

第二方面，实施例提供一种检测孕产妇宫内微生物的试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的核酸组。

在可选的实施方式中，所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有上述检测探针和上述对照探针。

在可选的实施方式中，所述膜芯片的材质选自硝酸纤维素膜、尼龙膜和具有三维孔径结构的薄膜中的任意一种。

在可选的实施方式中，所述试剂盒的检测样品为生殖道分泌物。

在可选的实施方式中，该检测试剂盒还包括PCR反应组分和配液；

其中，PCR反应组分包括UNG酶、dNTPs(含dUTP)、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR缓冲液中的至少一种。

使用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)移除DNA中的尿嘧啶，在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNG酶敏感，所以可以在PCR前对新配制的反应体系用UNG酶处理，一定程度上杜绝气溶胶污染。dNTPs作为PCR反应的原料，应用于以原DNA为模板合成新的DNA序列；通过Taq DNA聚合酶的作用，DNA链更容易打开，使反应更容易进行；Mg²⁺作为Taq DNA聚合酶的活化剂，可以激活Taq DNA聚合酶的功能；PCR反应缓冲液，使反应在一个稳定的环境中反应，避免影响Taq DNA聚合酶的活性，进而影响反应的进行。PCR反应缓冲液使得反应顺利的进行。

另外，配液包括去活化液、去活化清洗液、杂交液、杂交清洗液、催化酶液、酶标液、酶标清洗液1、酶标清洗液2、显色液和显色清洗液。

其中，去活化液包括100mmol/L的NaOH，去活化清洗液包括2×SSPE和0.1％SDS；杂交液包括2×SSPE和0.1％SDS；杂交清洗液包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标液包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标清洗液1包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标清洗液2包括：1M Tris-HCl、pH 9.5，5M NaCl，1M MgCl₂。

催化酶液为含有碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶，其用链霉亲和素、异硫氰酸荧光素抗体或地高辛抗体标记。在使用时，将催化酶液以合适比例加入到酶标液混合。

SSPE(Saline sodium phosphate EDTA，SSPE)缓冲液是一种常见的核酸杂交缓冲液；SSPE缓冲液包括NaCl、NaH₂PO₄·H₂O(或NaH₂PO₄·2H₂O)和EDTA-Na2。

配制1L的SSPE缓冲液的方法如下：用800mL蒸馏水溶解17.53g的NaCl，27.6g的NaH₂PO₄·H₂O(或31.2g的NaH₂PO₄·2H₂O)和7.4g的EDTA-Na2，再用10M的NaOH大约6mL调节pH值至7.4，然后定容至1L，过滤后高压蒸汽灭菌。

通过使用上述的各种配液，清除杂质，排除干扰，使结果更准确、清晰可靠。

显色液含有被催化酶催化反应进而显色的底物。

当催化酶是碱性磷酸酶时，显色液为碱性磷酸酶的化学显色底物NBT/BCIP，含0.15mg/mL BCIP，0.30mg/mL NBT，100mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl₂，pH9.5)；显色清洗液为双蒸水。

需要说明的是，在其他的一些实施例方案中，碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶代替。

当催化酶为辣根过氧化物酶时，显色液含有的底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应，使得检测结果可视化。

或者用，葡萄糖氧化酶代替碱性磷酸酶，底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢，后者可通过辣根过氧化物酶-TMB显色系统进行检测。

第三方面，实施例提供一种检测孕产妇宫内微生物的方法，其采用前述实施方式任一项所述的核酸组，或者采用前述实施方式任一项所述的试剂盒进行检测。

在可选的实施方式中，上述检测方法是以非疾病的诊断为目的。

该检测方法能够同时对常见的引起胎儿宫内先天性感染的病原微生物例如B族链球菌、淋球菌、单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、沙眼衣原体以及生殖支原体等成分进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量、结果易于观察等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中的膜芯片上的各探针的固定位置示意图。

图2为实施例3中的各种微生物的检测后的在膜芯片上的显色结果。

图3为实施例4中的各种微生物检测报告结果在膜芯片上的显色模式图。

图4为实验例1中的不同引物对扩增B族链球菌(GBS)的结果。

图5为实验例1中的不同引物对扩增淋球菌(NG)的结果。

图6为实验例1中的不同引物对扩增单纯疱疹病毒II型(HSV)的结果。

图7为实验例1中的不同引物对扩增人巨细胞病毒(HCMV)的结果。

图8为实验例1中的不同引物对扩增沙眼衣原体(CT)的结果。

图9为实验例1中的不同引物对扩增解脲脲原体(UU)的结果。

图10为实验例1中的不同引物对扩增生殖支原体(MG)的结果。

图11为实验例1中的不同引物对扩增β-actin的结果。

图12为实验例2中的不同探针在膜芯片上的固定位置示意图。

图13为实验例2中的不同探针在膜芯片上的显色结果。

图14为实施例3中的针对非靶标核酸样本检测后的膜芯片显色结果。

图15为实施例3中的针对不同浓度的靶标核酸检测后的膜芯片显色结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的用于检测孕产妇宫内微生物的核酸组，其包括如下引物对、探针和阳性寡核苷酸单链DNA：

检测单纯疱疹病毒II型的第三引物：其包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQID NO.8所示的下游引物；

检测解脲脲原体的第六引物对：其包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ IDNO.14所示的下游引物

检测生殖支原体的第七引物对：其包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ IDNO.16所示的下游引物；

检测人β-actin基因的第八引物对：其包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ IDNO.2所示的下游引物，作为内参使用。

每个引物对中的下游引物的5’端带有生物素标记。

上述各引物对的序列见下表1。

表1

探针包括与上述各引物对扩增产物特异性结合的检测探针、阳性对照探针和阴性对照，各探针序列见下表2。

表2

探针名称	核苷酸序列(5’-3’)	SEQ ID NO
			β-actin探针	GCCGACAGGATGCAGAAGGAGATC	17
B族链球菌探针	CAACTCAACATTTAGCAAATAAGGTTAGTCAA	18
			淋球菌探针	CGCATATCGGCTTCCTTTTGTAAATTTGCT	19
单纯疱疹病毒II型探针	CTGTTCTGGTTCCTAACGGCCTCCCC	20
			人巨细胞病毒探针	TTAGAGGAGACTAGTGTGATGCTGG	21
沙眼衣原体探针	TAGTGGAAAAGAAGCTGAAACTGCTTTAGA	22
			解脲脲原体探针	CTGATGGAGTAGACATGGTTGTTGG	23
生殖支原体探针	CCCTAGTAGTCCACACCGTAAACGATA	24
			阳性对照探针	GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGC	25
阴性对照探针	CCCTCGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACG	26

阳性寡核苷酸单链DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.27)如下：

GCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC。

阳性寡核苷酸单链DNA的5’端带有生物素标记。

使用本实施例的核酸组检测时，可提前上述10种探针按图1所示的位置顺序地分别固定在膜芯片上的相应的检测位置。在其他的实施例中，探针的固定顺序可与本实施例有所不同。

图1中：β-actin表示人内源基因对照，GBS表示B族链球菌，NG表示淋球菌，HSV表示单纯疱疹病毒II型，HCMV表示人巨细胞病毒，CT表示沙眼衣原体，UU表示解脲脲原体，MG表示生殖支原体，PC表示阳性对照(Positive control)，NC表示阴性对照(Negativecontrol)。

探针固定在膜芯片上的方法参考如下进行：

用打印机在膜上打印出表格后把尼龙膜(当然，在其他的实施例中，尼龙膜可以用硝酸纤维素膜或其他的具有三维孔径结构的薄膜)浸泡于50mL含有0.5％-5％(体积：体积)戊二醛的PBS溶液中，摇床缓慢摆动孵育2小时；随后在PBS中洗膜4次，一次50mL，每次5分钟；最后将膜放在空气中室温干燥并密封保存。

用0.5M NaHCO₃，pH8.4调整探针(其5’端用氨基修饰)浓度至10μM，将阳性对照探针和阴性对照探针分别稀释到5μM；并将各检测探针、阳性对照探针和阴性对照探针依次点样在尼龙膜上。点好探针的膜芯片放入烘箱中，80℃烘烤2小时备用。

实施例2

本实施例提供了采用实施例1的核酸组检测孕产妇宫内微生物的方法，操作如下：

(1)提取待测样本的基因组DNA

采用棉签试子取生殖道分泌物，采用细菌/病毒DNA提取试剂盒提取样本总核酸备用。

提取后的总核酸用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定浓度及质量后进行多重PCR。

(2)多重PCR体系和条件

2×Multiplex PCR Master Mix(含UNG酶)：10μL；

引物：终浓度为0.2μM(上游引物)/0.3μM(下游引物)；

提取的样品基因组DNA：2-100ng；

内对照即人β-actin基因片段重组质粒DNA：2ng；

阳性寡核苷酸单链DNA(20μM):0.01μL；

ddH₂O：补足至总体积20μL；

反应体系中，第一至第八引物对均加入到反应体系中，其中每对引物的修饰引物(生物素标记，下游引物)与非修饰引物(上游引物)的比例为3:2，对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由UNG酶消化，Taq DNA聚合酶反应，经过预变性、变性、退火和延伸，条件分别为：

UNG酶消化反应：温度50℃，时间2分钟；

多重PCR：

预变性：温度95℃，时间3分钟；PCR循环：35个循环组成：变性：温度95℃，时间15秒；退火：温度55℃，时间30秒；延伸：温度72℃，时间15秒；最后延伸：温度72℃，时间3分钟；保存：温度4℃。

(3)膜芯片杂交：

探针按实施例1中描述的方法预先固定在膜芯片上。

反应结束后，将PCR产物95℃热变性5分钟，冰浴5min以上。取冷却后的PCR产物20μL加入杂交液中，进行膜芯片斑点杂交检测，依次自动完成去活化、去活化清洗、杂交、杂交清洗、酶标、酶标清洗、显色、显色清洗等步骤，进行膜芯片杂交检测。杂交过程如下：

(1)将固定有探针的膜芯片放入杂交盒中，芯片标签正面朝上，加入去活化液(100mmol/L NaOH)1mL，37℃孵育8min；

(2)加入去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)1mL，60℃孵育5min；

(3)吸除去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)，加入杂交体系液(将PCR后产物变性后加入杂交液(2×SSPE，0.1％SDS)中混合)1mL，45℃水平摇床90rpm孵育45min；

(4)吸除杂交体系液，加入预热好的杂交清洗液(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，52℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(5)吸除杂交清洗液，加入预热好的酶标液(链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(1mg/mL)，按1:2000的比例加入到999.5μL的酶标液(2×SSPE，0.5％SDS)中)，42℃水平摇床90rpm，震荡孵育30min；

(6)吸除酶标液，加入预热好的酶标清洗液1(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，42℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(7)吸除酶标清洗液1，加入预热好的酶标清洗液2(含：0.3mol/L NaCl，20mmol/LNaH₂PO₄，20mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.4)1mL，37℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(8)吸除酶标清洗液2，加入显色液(含BCIP/NBT的混合物，即5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰)1mL，室温静置显色15min。

(9)吸除显色液，加入去离子水1mL室温洗涤2次，待膜芯片干燥后进行结果判读。具体杂交流程如表3。

表3自动杂交仪检测过程

其中：去活化液包括100mmol/L的NaOH，去活化清洗液包括2×SSPE和0.1％SDS；杂交液包括2×SSPE和0.1％SDS；杂交清洗液包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标液包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标清洗液1包括2×SSPE和0.5％SDS；酶标清洗液2包括:1M Tris-HCl,pH9.5，5M NaCl，1M MgCl₂。

配制1L的SSPE缓冲液的方法如下：用800mL蒸馏水溶解17.53g的NaCl，27.6g的NaH₂PO₄·H₂O和7.4g的EDTA-Na2，再用10M的NaOH大约6mL调节pH值至7.4±0.2，然后定容至1L，过滤后高压蒸汽灭菌。

显色液为碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP，含0.15mg/mL BCIP，0.30mg/mLNBT，100mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl₂，pH9.5)；显色清洗液为双蒸水。

(4)结果分析：

实验完成后，根据杂交点显色情况参照图1进行结果判读，或用膜芯片成像仪自动判读。检测结果中，PCR内对照即β-actin点应显色，阳性对照即PC点应显色，阴性对照即NC点应不显色，在此基础上，根据其他位置显色结果判断待测样本是否含有相应的致病微生物，如相应位置有显色，则判断该样本中具有相应的致病微生物感染，如相应位置无显色，则判断该样本中不含有相应的致病微生物。

实施例3

(1)特异性检测

采用商品化的细菌/病毒DNA提取试剂盒提取GBS、NG、HSVII、HCMV、CT、UU、MG七种微生物的总核酸作为测试对象。同时，提取了人基因组DNA作为对照，内对照采用人β-actin基因片段重组质粒DNA，阴性对照品为提取的未感染此七种微生物的人全基因组DNA。提取后的DNA用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定浓度及质量后进行PCR扩增。

采用实施例1的核酸组，以及按照实施例2的方法进行检测，结果如图2所示。

阴性对照品含有人基因组DNA，不含有此方法检测范围内的任何微生物DNA，因此，除β-actin，PC显色以外，其它点都不应显色，实际检测结果如图2阴性对照所示，符合预期。以提取的GBS进行检测，除β-actin，GBS，PC点显色以外，其它点都不应显色，实际检测结果如图2中GBS检测结果所示，符合预期。同样的，NG、HSVII、HCMV、CT、UU、MG等微生物DNA的检测结果也与预期相符，结果见图2。

上述检测结果显示，各微生物DNA对应的特异性检测探针有信号反应，而其它探针则没有信号反应，可见7条探针没有交叉反应，具有良好的特异性，不容易出现假阴性结果。

(2)特异性检测

选取非靶标核酸样本(沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特氏菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、腊样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、肠集聚性大肠埃希氏菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌)进行测试，采用实施例1的核酸组，以及按照实施例2的方法进行，测试结果如图14所示。

根据图14的结果可以看出，膜芯片上各靶标核酸的位置没有显色，说明说明实施例1的核酸组和实施例2的方法检测特异性非常好，没有假阳性的结果出现。

(3)灵敏度检测

取GBS、HCMV及MG总核酸进行灵敏度测试，用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定每种核酸浓度，再用TE将各核酸分别进行梯度稀释至10ng/μL，1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，稀释后在24h内测试，以免核酸降解导致检测结果不准确。取1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL三个梯度核酸进行测试，采用实施例1的核酸组，以及按照实施例2的方法进行检测，测试结果如图14所示。

根据图15的结果可以看出，采用实施例1的核酸组和按照实施例2的方法可以实现对浓度低至0.01ng/μL的核酸样品的检出效果，具有很好的灵敏度。

实施例4

本实施例提供了一种基于膜芯片法的孕产妇宫内七种微生物检测试剂盒

本实施例试剂盒采用基因芯片检测技术，该技术基于反向斑点杂交原理开发。采用生物素标记的引物进行靶基因的扩增，将扩增产物同固定在膜芯片上的探针进行杂交，经化学显色后可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号，单次反应即可同时筛检多种靶标。通过膜芯片成像仪自动采集图像并分析和报告检测结果。

本实施例的试剂盒由膜芯片检测试剂盒和多重PCR扩增试剂盒组成，如表4所示；膜芯片检测试剂盒包括7种杂交显色相关组份，多重PCR扩增试剂盒包括4种PCR相关组份。

表4试剂盒主要组成成份

储存条件及有效期：

1.储存条件

检测试剂盒Ⅰ和Ⅲ常温保存，检测试剂盒Ⅱ2-8℃保存，多重PCR扩增试剂盒-20℃保存。

检测试剂盒Ⅱ内的显色液应避光保存，多重PCR扩增试剂盒组份应避免反复冻融。

2.有效期

未开封产品有效期为12个月。

已开封产品建议1个月内用完。

适用仪器：

普通PCR扩增仪，基因膜芯片检测工作站。

样本要求：

标本类型：生殖道分泌物。

将采样棉拭子浸入盛有1mL无菌生理盐水的样本管中，充分漂洗。将棉拭子贴壁挤干后丢弃，立即送检。

标本保存采集的标本应尽快送检，建议标本4℃保存不超过24小时，-20℃保存不超过6个月，需要长期保存的标本应置于-70℃以下保存，避免反复冻融。

已经提取好的样本DNA，可直接进入如下2.1的步骤进行PCR扩增。

检验方法：

1.样本处理

1.1标本预处理

取出待处理标本，振荡混匀；置离心机中以13 000rpm离心5分钟；弃上清，保留沉淀物。-20℃保存的标本，应置室温自然解冻后再使用。

1.2 DNA提取

建议使用商品化的细菌/病毒DNA提取试剂盒。

1.3DNA样品保存

建议DNA样品立即用于PCR检测，否则4℃保存；当天不检测的样品，-20℃保存。

2.PCR扩增

2.1 PCR反应体系配制按照下表进行。

组分	加入量/20μL反应体系
		2×Multiplex PCR Master Mix	10μL
样品DNA	2-100ng
		Nuclease-Free Water	up to 20μL

注：a.在无法确认核酸浓度及质量时，样品DNA建议加入量为2-5μL；

b.实验若需要设置阳性质控对照，可使用试剂盒中提供的阳性质控DNA，加入量为5μL/反应。

c.试剂使用前，短暂离心，避免试剂附着于管壁。

2.2 PCR扩增需严格按照下表所示的程序设定，反应后不立即进行杂交实验的PCR产物请放置于-20℃保存。

3.膜芯片杂交

3.1产物变性：将PCR产物95℃变性5min后立即置于冰上放置备用。

3.2杂交仪准备：开机前确认蒸馏水瓶中蒸馏水充足(≥瓶身的2/3体积)且废液瓶为空，然后先打开MFS-24仪器电源和控制面板开关，后打开软件，待仪器自检成功后，点击确定按钮。

3.3杂交试剂、耗材准备(使用前检查B，C，D，E中液体，若有结晶，请置于37℃水浴溶解完全后使用)；

3.3.1杂交试剂分装：根据检测样品数准备杂交管，向每个杂交管中加入200μLBuffer B；

3.3.2 Buffer D(酶标液)配制，配比关系参照下表。根据实验样品数量吸取相应体积(V)Buffer D至Buffer D备用瓶中，并加入相应体积AP-Streptavidin(W,使用前，短暂离心，避免试剂附着于管壁)，须现配现用。配比公式如下：V＝2000μL+200*nμL；V为吸取的酶标液体积；n为所检测样品数；W＝V/250μL；W为AP-Streptavidin加入的体积；

检测样品数	1-4	5-8	9-12	13-16	17-20	21-24
							Buffer D体积(mL)	2.8	3.6	4.4	5.2	6	6.8
AP-Streptavidin体积(μL)	11.2	14.4	17.6	20.8	24	27.2

3.3.3将3.1中已变性的产物(20μL)依次加入3.3.1中准备好的杂交管中。

3.4加载芯片、试剂及样品：将准备好的试剂瓶(Buffer C～Buffer J)开盖后和已加入样品的杂交管、膜芯片放入仪器指定位置，盖好试剂盘和反应盘的上盖，关闭仪器仓门。芯片与杂交管需一一对应；实验前将双蒸水加至成像缓冲液Ⅰ(Buffer I)和成像缓冲液Ⅱ(Buffer J)瓶口位置。

3.5运行实验流程：加载“MFS-24标准杂交流程”杂交程序，根据检测样品放置的位置选中相应的样品仓按钮，点击“运行”开始实验。

4.结果判读

4.1质控品检测结果

a.试剂盒阴性对照品检测结果应为β-actin点和PC点显色，NC点及其它点不显色；

b.试剂盒阳性对照品检测结果应为HCMV阳性，β-actin点和PC点显色，NC点及其它点不显色；

如果检测结果不符合上述要求，则本次检测结果无效。

4.2结果判断

基因膜芯片工作站可自动检测靶点信号值，并分析和报告结果，报告结果示意图见图3。

实验例1

(1)比较不同引物对扩增B族链球菌(GBS)的结果

设置引物对：

引物1(实施例1中的第一引物对)

上游引物1：CGTGCCAACCCTGAGACAGT；

下游引物1：GCTTAGTTATCCCAAATCCC；

产物大小：154bp。

引物2：

上游引物2：AATCTGGAATACACGCTTTA；

下游引物2：GTTGTACCGTAACATTTGGA；

产物大小：154bp。

引物3：

上游引物3：GTAATAATCAAGCCCAGCAA；

下游引物3：AGTTATCCCAAATCCCATAT；

产物大小：296bp

各引物对经PCR后电泳，结果如附图4所示。引物1条带明亮单一，引物2和引物3无条带，可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第一引物对扩增效果更好。

(2)比较不同引物对扩增淋球菌(NG)的结果

设置引物对：

引物1：

上游引物1：ATAAACGAGCCGAAATCACTG；

下游引物1：TTAAATCATGTTGCGGGAAA；

产物大小：411bp。

引物2：

上游引物2：AGTGCGGACAATACGAGGGC；

下游引物2：TAATTGGAGACTGATTGGGTGT；

产物大小：100bp。

引物3(实施例1提供的第二引物对)：

上游引物3：GCAGTGCGGACAATACGAGG；

下游引物3：TAATTGGAGACTGATTGGGTGT；

产物大小：102bp。

引物对经PCR后电泳，结果如附图5所示。引物1无条带，引物2除主带外有非特异条带，引物3有明亮单一的主带且无非特异条带，可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第二引物对扩增效果更好。

(3)比较不同引物对扩增单纯疱疹病毒II型(HSVII)的结果

设置引物对：

引物1：

上游引物1：TGGCGCACCCAACGCAACGT；

下游引物1：CGGCACCAGCAGGGAAGCATTTA；

产物大小：208bp。

引物2(实施例1的第三引物对)：

上游引物2：CCCACCCAAGCTCCCGCTAA；

下游引物2：GCTGCCAAGGCGACCAGACAAA；

产物大小：215bp。

引物3：

上游引物3：CCCCAACGGACCCAAAGACG；

下游引物3：CCAAGGCGACCAGACAAACGAA；

产物大小：420bp。

引物对经PCR后电泳，结果如附图6所示。引物1除主带外有非特异条带，引物2有明亮单一的主带且无非特异条带，引物3无条带可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第三引物对扩增效果更好。

(4)比较不同引物对扩增人巨细胞病毒(HCMV)的结果

设置引物对：

引物1：

上游引物1：CCTTCCCTAAGACCACCAAT；

下游引物1：TCTAAGACATAGCAGCACAGC；

产物大小：295bp。

引物2：

上游引物2：GTGCGGCATAGAATCAAGGA；

下游引物2：CTCTGCATAGTTAGCCCAATA；

产物大小：170bp。

引物3(实施例1的第四引物对)：

上游引物3：GTGCTGTGCTGCTATGTCTT；

下游引物3：GAATGTACTGGGCAAAGACC；

产物大小：136bp。

引物对经PCR后电泳，结果如附图7所示。引物1和引物2无条带，引物3有明亮单一的主带且无非特异条带，可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第四引物对扩增效果更好。

(5)比较不同引物对扩增沙眼衣原体(CT)的结果

设置引物对：

引物1(实施例1提供的第五引物对)：

上游引物1：TCTTAGAGGCTTATGGAGTT；

下游引物1：ATCCTAATGATCGGAGAAAG；

产物大小：199bp。

引物2：

上游引物2：TCTCCGATCATTAGGATTTA；

下游引物2：CCCTTTATGTTTCCGTGTAG；

产物大小：108bp。

引物3：

上游引物3：TGCTTTCAGATTTGCGAGAC；

下游引物3：TTGAGCCAATTTGGGAGATA；

产物大小：295bp。

引物对经PCR后电泳，结果如附图8所示。引物1有明亮单一的主带且无非特异条带，引物2和引物3无条带，可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第五引物对扩增效果更好。

(6)比较不同引物对扩增解脲脲原体(UU)的结果

设置引物对：

引物1：

上游引物1：GTTAGACGACAAGTTAGGGA；

下游引物1：AAGAAACCTGCGTTAATTGG；

产物大小：417bp。

引物2：

上游引物2：CAGGATTTGTTGAACATACAAT；

下游引物2：ATCGTTAAATTCGCTATCCC；

产物大小：431bp。

引物3(实施例1提供的第六引物对)：

上游引物3：TTAGACGACAAGTTAGGGAATG；

下游引物3：AAACCTGCGTTAATTGGTAA；

产物大小：413bp。

引物对经PCR后电泳，结果如附图9所示。引物1、2和3均有单一主带，但引物3的主带最亮，可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第六引物对扩增效果更好。

(7)比较不同引物对扩增生殖支原体(MG)的结果

设置引物对：

引物1：

上游引物1：GTTCGTTATTTGATGAGGGTG；

下游引物1：TGCTGGCACATAGTTAGTCG；

产物大小：310bp。

引物2(实施例1提供的第七引物对)：

上游引物2：TACTGACGCTTAGGCTTGAA；

下游引物2：TGTACTACCCAGGCGAGATA；

产物大小：144bp。

引物3：

上游引物3：CGGGGACCCGCACAAGT；

下游引物3：ATCTCACGACACGAGCTGAC；

产物大小：156bp。

引物对经PCR后电泳，结果如附图10所示。引物1、2和3均有明显主带，但引物1有非特异条带，引物3的主带较暗，可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第七引物对扩增效果更好。

(8)比较不同引物对扩增β-actin的结果

设置引物对：

引物1(实施例1提供的第八引物对)：

上游引物1：CTGTGGCATCCACGAAACTAC；

下游引物1：CGGACTCGTCATACTCCTGCT；

产物大小：284bp。

引物2：

上游引物2：GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC；

下游引物2：TGCTGTCACCTTCACCGTTC；

产物大小：160bp。

引物3：

上游引物3：GTCCTGTGGCATCCACGAAAC；

下游引物3：GGCCGGACTCGTCATACTCCT；

产物大小：290bp。

引物对经PCR后电泳，结果如附图11所示。引物1和3均有明显主带，引物2无条带，但引物1主带亮度稍强于引物3，可见，相较于其他引物对，实施例1提供的第八引物对扩增效果更好。

实验例2

比较不同探针的杂交显色结果

(1)设置不同探针，如下：

β-actin探针1(对应实施例1提供的探针)：

GCCGACAGGATGCAGAAGGAGATC；

β-actin探针2：

ACACAGTGCTGTCTGGCGGCACCACC。

B族链球菌(GBS)探针1(对应实施例1提供的探针)：

CAACTCAACATTTAGCAAATAAGGTTAGTCAA；

B族链球菌(GBS)探针2：

ACAGTTTATGATTTGAATTCTATTGGTAGTC。

淋球菌(NG)探针1：CCGCAAACGGCAGTGCGGACAATACGAGG。

淋球菌(NG)探针2(对应实施例1提供的探针)：

CGCATATCGGCTTCCTTTTGTAAATTTGCT。

单纯疱疹病毒II型(HSVII)探针1(对应实施例1提供的探针)：

CTGTTCTGGTTCCTAACGGCCTCCCC。

单纯疱疹病毒II型(HSVII)探针2：

ACCCAAGCTCCCGCTAAGGACATGCCC。

人巨细胞病毒(HCMV)探针1：

TGAGTTCTGTCGGGTGCTGTGCTGCTAT。

人巨细胞病毒(HCMV)探针2(对应实施例1提供的探针)：

TTAGAGGAGACTAGTGTGATGCTGG。

沙眼衣原体(CT)探针1(对应实施例1提供的探针)：

TAGTGGAAAAGAAGCTGAAACTGCTTTAGA.

沙眼衣原体(CT)探针2：

AGAGGCTTATGGAGTTAAGCGGTATAAAACAT。

解脲脲原体(UU)探针1(对应实施例1提供的探针)：

CTGATGGAGTAGACATGGTTGTTGG；

解脲脲原体(UU)探针2：

TTAGACGACAAGTTAGGGAATGCTGAAGTA。

生殖支原体(MG)探针1(对应实施例1提供的探针)：CCCTAGTAGTCCACACCGTAAACGATA；

生殖支原体(MG)探针2：TTAGGCCATTACTGACGCTTAGGCTTGA。

(2)将上述合成的各检测探针按图12的示意图形式点制在膜芯片上。

(3)杂交结果

单独取各微生物的DNA模板经过PCR后(引物对采用实施例1提供的引物对)，然后膜芯片杂交，相关方法参考实施例2，显色结果如附图13所示，可以看出，整体上有实施例1提供的检测探针在显色上具有深的颜色，可见，相较于其他探针，说明实施例1提供的各检测探针结合能力更好。

现有技术中针对细菌的检测方法主要是微生物培养法、血清学方法、定性PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)法等，其中微生物分离培养鉴定是细菌和病毒检测的金标准，但是整个过程耗时约2-3天甚至更长，且操作繁琐，假阴性率高，培养结果易受外界环境影响。血清学方法用于检测血清中的抗体，适用于潜伏期、无症状病人及流行病学调查，包括型特异性血清抗体检测、免疫印迹法、ELISA等方法，该方法操作简单，缺点是无统一的标准。定性PCR用于检测微生物中靶基因序列，一般采用凝胶电泳分析，耗时短，但具有一定的局限性，只能检测到10ng以上的DNA条带，因此在目的片段产量较低时无法检测到，灵敏度较低。实时荧光定量PCR通过检测荧光信号的强弱从而实时检测PCR产物扩增量，可以对微生物中靶基因进行定量分析，检测结果准确，重复性高，但是只能做单重或最高3-4重，无法提高其通量。

相较于微生物培养法需要前期培养耗费时间长，血清学方法敏感性不够，膜芯片方法中的多重PCR扩增不需要前期培养，并且经过多轮扩增，目标片段已非常丰富，利于后期检测，提高检测灵敏度。同时，相较于定性PCR需要做凝胶电泳分析，分辨率较低的方法，膜芯片利用多重PCR与反向斑点杂交技术结合，将PCR结果利用杂交显色方式直观的显示，分辨率大大高于定性PCR，且经过探针杂交的二次特异结合，检测特异性也高于定性PCR。而目前使用率较高的实时荧光定量PCR，检测结果准确，重复性高，但是只能做单重或最高3-4重，如果要同时检测多种微生物，不仅需要较大的样本量，而且操作繁琐，对实验人员的要求较高，膜芯片法相较于实时荧光定量PCR，在需要检测多种微生物的情况下，不仅操作简单，对实验人员的要求不高，且耗时短，结果直观易分析。

本发明将多重PCR与膜芯片杂交技术结合，利用8对特异引物对，可同时对多达8种特异基因片段进行检测，并通过PCR产物与膜芯片上探针的杂交进一步保证检测结果的特异性与准确率，较普通定性PCR和荧光定量PCR的检测效率和准确性有所提高。膜芯片杂交中使用的反向斑点杂交技术，可使PCR产物与膜芯片上探针的杂交特异性的结合，而生物素的酶联放大作用则大大提高了PCR产物的检测灵敏度。膜芯片技术最后通过碱性磷酸酶与BCIP/NBT的显色作用，将杂交结果直观的显示在膜芯片上，不需借助额外的仪器，肉眼即可判断检测结果，大大简化了检测步骤。

综上所述，本发明可对7种孕产妇宫内微生物同时检测，并且具有检测灵敏度、特异性和检测通量高的特点，结果直观可见，可大大提高检测效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川华汉三创生物科技有限公司

<120> 用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组、试剂盒和检测方法

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgtggcatc cacgaaacta c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggactcgtc atactcctgc t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtgccaacc ctgagacagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcttagttat cccaaatccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcagtgcgga caatacgagg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taattggaga ctgattgggt gt 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccacccaag ctcccgctaa 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctgccaagg cgaccagaca aa 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgctgtgct gctatgtctt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaatgtactg ggcaaagacc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcttagaggc ttatggagtt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atcctaatga tcggagaaag 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttagacgaca agttagggaa tg 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaacctgcgt taattggtaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tactgacgct taggcttgaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgtactaccc aggcgagata 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gccgacagga tgcagaagga gatc 24

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caactcaaca tttagcaaat aaggttagtc aa 32

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cgcatatcgg cttccttttg taaatttgct 30

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctgttctggt tcctaacggc ctcccc 26

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttagaggaga ctagtgtgat gctgg 25

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tagtggaaaa gaagctgaaa ctgctttaga 30

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctgatggagt agacatggtt gttgg 25

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ccctagtagt ccacaccgta aacgata 27

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcatccagat cagaagcaat aatgagcagt gc 32

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccctcgggtt aatgcgcgat tgtcaccaca cg 32

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gcactgctca ttattgcttc tgatctggat gc 32

Claims

1.一种用于孕产妇宫内微生物检测检测的核酸组，其特征在于，其包括如下引物对中的至少一种：

检测B族链球菌的第一引物对：其包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；

检测单纯疱疹病毒II型的第三引物：其包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ IDNO.8所示的下游引物；

检测沙眼衣原体的第五引物对：其包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；

检测解脲脲原体的第六引物对：其包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；

检测生殖支原体的第七引物对：其包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物。

2.根据权利要求1所述的用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组，其特征在于，所述核酸组还包括如下引物对：

3.根据权利要求2所述的用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组，其特征在于，所述核酸组还包括如SEQ ID NO.17-24所示的检测探针中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组，其特征在于，所述核酸组还包括如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

所述阳性对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；

所述阴性对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

5.根据权利要求4所述的用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组，其特征在于，所述核酸组还包括：用于与所述阳性对照探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO.27所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于孕产妇宫内微生物检测的核酸组，其特征在于，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

7.一种检测孕产妇宫内微生物的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的核酸组。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有检测探针和对照探针；

优选地，所述膜芯片的材质选自硝酸纤维素膜、尼龙膜和具有三维孔径结构的薄膜中的任意一种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样品为生殖道分泌物。

10.一种检测孕产妇宫内微生物的方法，其特征在于，其采用权利要求1-6任一项所述的核酸组，或者采用权利要求7-9任一项所述的试剂盒进行检测。