CN101363041A - 一种检测沙眼衣原体的质控物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测沙眼衣原体的质控物，属于临床检验学和生物技术领域。一种检测沙眼衣原体的质控物，含有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或其互补序列。本发明的优点是：(1)利用重叠PCR与双酶切的方法，建立了一种将多间隔片段连接并构建入同一载体的简便有效的方法，定向克隆避免了长距离PCR效率较低的可能，二者联用可取长补短。(2)成功地得到了无生物传染危险性可模拟临床标本、可以大量生产、稳定保存的沙眼衣原体聚合酶链反应检测质控物，且具有较好的适用性。

Description

一种检测沙眼衣原体的质控物

技术领域

本发明涉及一种检测沙眼衣原体的质控物，属于临床检验学和生物技术领域。

背景技术

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)是重要的性传播疾病的病原体之一，它不仅会导致阴道、尿道感染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆腔结构，也能导致盆腔炎、输卵管损伤直至不孕。此外，此种病原体还与人乳头瘤病毒(HPV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染有关。

衣原体为革兰氏阴性病原体，是一种专性细胞内寄生的微生物，没有合成高能化合物ATP的能力，必须由宿主细胞提供，因而是能量寄生物。衣原体是一类能通过细胞滤器，有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。沙眼衣原体是一种比病毒大、比细菌小的原核微生物，呈球形，直径只有沙眼衣原体0.3～0.5mm。Ct的基因组为1.5kb左右的双链DNA，属于基因组最小的原核生物之一，仅为大肠杆菌的1/3。其RNA的主要成分是21、16、4srRNA。所有的Ct都含有7.5kb的隐蔽性质粒，并且发现这种质粒与其它生物间没有同源序列。

传统检测方法包括：

(一)细胞培养方法：由于Ct的专性细胞寄生性，一般培养法不能使其生长，只有在活的细胞内才能增殖、复制。组织细胞培养法分离Ct多采用McCoy细胞或Hela细胞。细胞培养方法被认为是评价其他方法的“金标准”，也是WHO推荐的主要法之一。但是由于各个实验室操作步骤有所不同，没有标准化，且培养法对样品的预处理要求高，敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大、但敏感性一般较低；而分离培养操作复杂，技术及设备要求高，所需时间长，加上国内很多医院不具备细胞培养条件，因而不适于临床应用大规模检查多用于科研和疑难病例的终鉴定。

(二)非培养的诊断方法

1.直接荧光抗体测定(DFA)：将针对Ct的单克隆抗体用荧光标记，与标本中的Ct结合后，荧光显微镜检查就能见到发荧光的原体(Ebs)。DFA不象培养法必须存在有活力的Ct，但其敏感性受人群感染率的影响，且有判定结果带有主观性，荧光易淬灭，不适于检测大量标本等缺点。其与细胞培养方法相比其敏感度和特异性相似，敏感度可达到75％～85％，特异性也高于98-99％，但是与核酸扩增方法相比敏感度要低。

2.酶免检测(EIAs)：有多种应有EIAs检测临床样本中衣原体抗原的商品试剂盒应用单克隆或多克隆抗体检测衣原体的脂多糖(LPS)，其可溶性比外膜主蛋白(MOMP)好。酶免疫试剂法的主要优点是结果准确、快速易行，但与其他常见微生物产生交叉反应，如金黄色葡萄球菌、A群及B群链球菌、淋病奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰阴性细菌。

3.核酸杂交技术(NAH)：应用特异性探针与模板中的特定序列进行杂交，大大增加了检测的敏感性。

4.核酸扩增(NAA)：目前，可以用于沙眼衣原体检测的NAA方法一共有5种，分别是PCR扩增法、LCR法、转换介导的扩增AMP-CT、APTIMA Combo 2、链置换扩增的探针技术(strand displacement amplification Probe Tec)。其中最常用的是聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增法，该技术具有耗时少、扩增效率高、特异性强的特点，显示出了其在CT感染临床诊断中的优越性。

传统的样本采集方法为“直接采集分泌物标本”：细胞标本应在患处采用拭子或刮片的方法获取。(1)由于沙眼衣原体易感染柱状上皮细胞，所以宫颈标本的采集应在宫颈口或移行处进行，操作时，应先用1个拭子将宫颈口揩干净，然后再用一个拭子伸到宫颈管内转动或用一个刮勺(Pap刮勺取细胞)。(2)由于此种病原体还可以感染尿道，男性尿道炎患者，拭子应深入尿道2-4cm，并转动，以获取细胞。(3)阴道标本不适用于此项检查。(4)对于女性的输卵管炎的样本采集，需要在输卵管处进行针刺吸取。(5)此外，子宫内膜标本也可用于衣原体的检测。(6)脓性排除物由于其缺少感染的上皮细胞而不适用于此项检测，应该在对患处进行清洗后采取标本。

病原体检测的质量保证机制有两点：(1)需要室内质控样本对检测的可靠性；(2)实验室参加室间质评。Verkooyen等人，应用冻干的尿液标本进行了22个国家的96个实验室的CT的临床实验室室间质评工作，其中包括3个阴性，2个强阳性和5个弱阳性标本。结果显示检测弱阳性出错的情况为强阳性的三倍，突现了检测敏感性的问题。Chalker的研究详述了用检测相同宫颈内拭子标本沙眼衣原体的分子生物学和EIA方法的结果。发现只有在检测低浓度的沙眼衣原体时各种特异方法之间存在差异。在Sally的研究中评价了NAA方法在低浓度样本的检测效率。

曾有学者应用冻干的尿液标本做为核酸扩增技术检测沙眼衣原体的质控物。还有研究曾将不同浓度的尿液以在干冰上运送的方式开展了澳大利亚57家应用roche或abbott检测沙眼衣原体的实验室的室间质量评价工作。不论以上哪种方法均需要对样本进行特殊处理、增加了操作复杂性和制作成本并具有一定的生物传染危险性，不适于大规模临床检测质量控制工作的开展，从而无形中限制了病原体检测的质量保证体制的完善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种稳定性强、适用于各种实验室的沙眼衣原体的质控物。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测沙眼衣原体的质控物，含有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或其互补序列。

所述质控物为pTARGETTM-CT重组载体，采用以下方法构建：

(1)重组载体pTARGETTM-123的构建：将片段123克隆入pTARGET^TM载体，形成重组pTARGETTM-123载体；

(2)重组载体

 Easy-45的构建：将片段45克隆入 Easy，形成重组载体

 Easy-45；

(3)重组载体pTARGET^TM-CT的构建：以限制性内切酶Not I和Sal I对重组载体pTARGET^TM-123和

 Easy-45进行双酶切；T4 DNA连接酶，4℃连接过夜，构建pTARGET^TM-CT重组载体；

(4)应用脂质体转染试剂盒Lipofectamion^TM2000，转染真核细胞。

所述重组载体pTARGET^TM-123从T7方向测序，为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；从SP6方向测序，为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

所述重组载体

 Easy-45载体从T7方向测序，为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；从SP6方向测序，为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

所述真核细胞为宫颈上皮细胞(HTB-Siha细胞)。

本发明的最终目的是将构建入真核细胞、含有所有常见检测目的基因的聚合酶链反应的质控物应用于临床实验室的室内质量控制和室间质量评价工作中。

在第一部分中，我们针对沙眼衣原体隐蔽性质粒的历年常用检测序列分片段(表1)进行引物设计，并联合应用Overlap PCR和双酶切等分子生物学手段，构建一个包含了所有常见目的基因的重组载体、能够涵盖所有针对隐蔽性质粒进行检测的商品试剂和实验室自己建立的检测方法；并将此载体转染入宫颈上皮细胞中模拟临床样本的核酸提取过程，实现了质控物全程监控的要求。

在第二部分的研究中，我们对该质控品进行稳定性研究，并在证实其稳定性的前提下进行了全国临床诊断实验室沙眼衣原体PCR项目的室间质量评价工作。针对通常实验室对于病毒基因含量高的样本检测符合率比较高，而对于低含量样本会出现漏检、甚至产生假阴性的情况。在本次室间质评研究中，着重考察各临床实验室对弱阳性样本的检测能力、发现临床工作中存在的问题，提高全国各实验室的诊断水平。同时证明此质控物具有较好的实用性，完全满足临床诊断实验室该项目室间质量评价的需求。

表1：常见检测目的区域

注：？表示未找到与GeneBank X07547匹配的序列

本发明不仅将历年来所有针对沙眼衣原体隐蔽性质粒为靶序列进行诊断的目的基因应用各种分子生物学手段进行连接、构建入一载体，并将此真核表达载体转染入宫颈上皮细胞(HTB-siha)中，实现了真正的全程监控。经商品试剂鉴定转染后的真核细胞中能够检测到目的基因。

本发明的优点是：(1)利用重叠PCR与双酶切的方法，建立了一种将多间隔片段连接并构建入同一载体的简便有效的方法：通过Overlap PCR将多个间隔片断成功重组为一个长目的基因，与以往的在每个片段两端均增加酶切位点、经双酶切后连接将目的片段构建入载体的方法相比，减少了酶切位点的生成，为多片段插入同一重组载体提供了便利条件，方法切实可行。定向克隆避免了长距离PCR效率较低的可能，二者联用可取长补短。(2)成功地得到了无生物传染危险性可模拟临床标本、可以大量生产、稳定保存的沙眼衣原体聚合酶链反应检测质控物，且具有较好的适用性：含检测目的基因的转染细胞无病原体活性、可以模拟临床标本的核酸提取过程、所有检测常见序列使此样本具有较广泛的适用性，因此此样本与曾出现的几种类型的质控物相比，更适于临床实验室CT PCR检测质控工作。

下面结合具体附图和实施方式对本发明发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为pTARGETTM载体多克隆位点示意图、本研究所选限制性内切酶为Not I和Sal I。

图2为五段目的基因电泳示意图：S1、S2、S3、S4、S5分别为片段1、片段2、片段3、片段4、片段5扩增后的电泳图。

图3为长片段目的基因电泳示意图：S1为重叠扩增后的片段12条带、S2为重叠扩增后的片段45条带、S3为重叠扩增后的片段123条带。

图4为pTARGET^TM-123重组载体电泳示意图：其中S1为自连的真核表达载体pTARGET^TM；S2为pTARGET^TM-123。

图5为

 Easy-45重组载体电泳示意图：其中S1、S2、S3、S4为

Easy-45重组载体。

图6为S1为pTARGET^TM-123经酶切后电泳示意图：S2为

 Easy-45双酶切后示意电泳图。

图7为S1为pTARGET^TM-CT重组载体双酶切后的电泳图：S2为未经双酶切的重组pTARGETTM-CT载体。

图8为PCR验证重组pTARGET^TM-CT载体电泳示意图：S1为阴性对照；S2、S3、S4、S5为片断45的扩增产物。

图9为传代培养的HTB-siha细胞。

图10为转染细胞荧光PCR扩增曲线：图10A为深圳匹基商品试剂对样本原液进行荧光PCR检测曲线图；图10B为广州达安公司商品试剂对样本原液进行荧光PCR检测曲线图。图中黄色曲线为样本原液检测曲线，红色曲线为试剂盒中附带阴性对照，棕色、蓝色、粉色、绿色扩增曲线分别代表试剂盒中附带标准品1-标准品4，浓度分别为107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ml以及104拷贝/ml。

图11为转染细胞荧光PCR扩增曲线图：各颜色曲线对应表5中不同成分样本。

图12为百倍稀释样本扩增曲线图。

图13为样本稳定性示意图：*为4℃保存样本稳定性曲线；■为37℃保存样本稳定性曲线；▲为室温保存样本稳定性曲线。所有结果均用循环阈值表示。

图14为千倍稀释样本扩增曲线图。

图15为样本稳定性示意图：*为4℃保存样本稳定性曲线；■为37℃保存样本稳定性曲线；▲为室温保存样本稳定性曲线。所有结果均用循环阈值表示。

图16为万倍稀释样本扩增曲线图。

图17为样本稳定性示意图：*为4℃保存样本稳定性曲线；■为37℃保存样本稳定性曲线；▲为室温保存样本稳定性曲线。所有结果均用循环阈值表示。

具体实施方式

实施例1：含CT隐蔽性质粒片段的重组载体的构建

一.实验材料：

1.标本来源：沙眼衣原体细胞培养物为本室保存、宫颈上皮细胞(HTB-Siha细胞)购自中科院上海细胞库。

2.主要试剂：

细菌DNA提取试剂盒天根生化  中国

离心柱型普通凝胶DNA回收Kit  天根生化  中国

Taq聚合酶  Promega公司  美国

DNA电泳Marker：DL2000   Takara  日本

DNA电泳Marker：DL15000  Takara  日本

TA克隆试剂盒(T-Easy载体)  Promega公司  美国

质粒(小量)抽提试剂盒  Promega公司  美国

限制性内切酶Sal INew England Biology  美国

限制性内切酶Not I  New England Biology  美国

T4DNA连接酶  Promega公司  美国

菌株：DH5 α E.Coli.BL21-DE3 E.Coli.本室保存(均为常规菌株)

pTARGET^TM真核表达载体  Promega公司  美国

真核细胞转染试剂Lipofectamion^TM 2000  Invitrogen公司  美国

细胞培养基DMEM(高糖)  Hyclone公司  美国

0.25％胰酶Hyclone  公司  美国

沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂  广州达安公司  中国

沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂  深圳匹基公司  中国

3.实验仪器：

梯度PCR仪(PTC-200 Peltier thermal Cycler)  MJ Reasearch  美国

梯度PCR仪(Mastercycler ep PCR仪)  Eppendorf公司　德国

PCR仪(GeneAmp PCR System 2400)　美国生物应用系统　美国

实时荧光PCR仪(7500 Real Time PCR System)　美国生物应用系统　美国

实时荧光PCR仪(Lightcycler)　Roche公司　美国

实时荧光PCR仪(Line-gene PCR仪)　杭州博日科技有限公司　中国

琼脂糖水平电泳槽(DYCP34A型)　北京六一仪器厂　中国

双稳定时电泳仪(DYY-6C型)　北京六一仪器厂　中国

凝胶成像分析系统(ChemiDoc XRS)　Bio-Rad公司　美国

恒温摇床(C24 INCUBATOE SHAKER)　New Branswick Scientific公司　美国

台式高速离心机　Heraeus　公司　德国

高速低温离心机(BECKMAN Microfuge)　BECKMAN公司　美国

超速低温离心机(SIGMA 3K30 Laboratory Microfuge)　SIGMA公司　德国

D-型超纯水机　USFELGA RESERVOIR 75L　美国

恒温水浴箱　武汉WZ-I型智能无级温控仪　中国

微量恒温器(CHB-202)　杭州博日科技有限公司　中国

AE160电子天平　Mettler　公司　美国

恒温磁力搅拌器　IKA公司　德国

MS2型旋涡混悬器　IKA公司　德国

深低温冰箱　SANYO　日本

荧光倒置显微镜　OLYMPUS　美国

CO2孵箱　SANYO　日本

Eppendorf系列微量加样器　Eppendorf公司　德国

4.主要耗材：

一次性培养皿　90mm　中国

AXYGEN螺口离心管　0.5ml　美国

Eppendorf离心管　1.5ml　德国

AXYGEN带虑芯加样器吸头　0.5-10μl，10-100μl，20-200μl，100-1000μl　美国

Corning公司离心管　15ml，50ml　美国

AXYGEN扩增管　0.2ml　美国

Corning公司移液管　5ml　美国

Corning 公司细胞培养瓶　25cm2、75cm2　美国

Corning 公司细胞培养板　6孔、24孔　美国

二.实验方法

1.引物设计：

由于对沙眼衣原体质粒进行扩增后检测敏感性最高，因此本发明对以CT隐蔽性质粒为靶序列的文献进行统计后发现，对其进行扩增检测的序列较为分散，在文献中出现过的检测引物范围大致分为5个区域，分别是设计引物178-610、1219-1993、2471-3260、5239-5864、6722-7499以上位点均以NCBI/BLAST中C.trachomatis plasmidDNA for growth within mammalian cells(GeneBank X07547)位点为准进行证实。

表2：扩增CT隐蔽性质粒各片段的五对引物

注：P4.1下划线含SalI位点，P5.2下划线含NotI位点

本发明根据表1所示检测基因设计五对引物(见表2)，对CT隐蔽性质粒的常用检测区域进行扩增，所述位点均以NCBI/BLAST中C.trachomatis plasmid DNA forgrowth within mammalian cells位点为准进行证实，GeneBank X07547。

2.病原体核酸提取：

应用天为时代细菌提取试剂盒进行CT核酸提取，操作步骤如下：取细菌培养液1-5ml，10,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。加入220μl缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl去蛋白液GD，12,000离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(确定已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心30秒。离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟。(洗脱缓冲液体积最好不少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存-20℃，以防DNA降解)。

3.五段模板的制备：

应用5对引物分别进行扩增。反应体系：50μl反应体系中含10mmol/L Tris2HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，每种dNTP 200μmol/L，两条引物浓度各为0.2μmol/L，1.5U TaqDNA聚合酶。

50μl反应体系：P1                1.0μl

              P2                1.0μl

              dNTP              1.0μl

              Mg2+              3.0μl

              模板              5.0μl

              buffer            5.0μl

              DEPC水            33.6μl

              Taq酶             0.4μl

循环参数：94℃                  5min

72℃                7min

4.PCR产物的回收纯化

将PCR产物进行电泳，用干净的刀片切取含目的条带的胶块，胶块要尽量小并尽量多含目的片段，放入1.5ml离心管中。称量该胶的重量，尽量不超过150mg。不足100mg的加入ddH2O补至100mg。按1mg相当于1μl换算，以溶胶液：胶重量比为3：1的比例加入溶胶液。置50℃水浴10min，每隔2min振摇一次，使胶完全溶化。将混合液转移至套在干净接液管上的离心柱内，12,000g，离心1min。弃去接液管中的液体，重新插入离心柱。在离心柱上加洗柱液750μl，12,000g，离心30s。加洗柱液250μl，重复步骤4。将离心柱转移到干净的接液管上，空柱离心12,000g，2min。将离心柱转移到干净的接液管上，加入60℃-70℃预热的ddH2O 30μl室温放置1min，离心1min。所得溶液为回收的DNA溶液。

5.T-A克隆：

(1)采用 Easy载体以及2×快速连接缓冲液进行连接反应：短暂离心

 Easy载体及DNA插入对照管，使内容物汇集到管底；按表3方法建立连接反应。注意使用低DNA结合力的0.5ml离心管；每次使用2×快速连接缓冲液时要充分混匀；用移液器吹打连接反应使之混匀后，4℃孵育过夜。

表3：采用

 Easy载体以及2×快速连接缓冲液进行连接反应的反应体系

(2)优化插入片段和载体的摩尔比：

 Easy载体系统优化的插入DNA对照片段和载体的摩尔比为1:1，采用8:1到1:8的连接比例也可成功进行连接。如果PCR产物连接的不理想，则有必要优化连接比例。一般开始采用3:1到1:3的连接比例。

PCR产物的浓度可通过凝胶电泳上的DNA分子量标准进行估计或采用荧光定量。 Easy载体大概3kb大小，系统提供的载体浓度为50ng/μl。

计算连接反应中需要的PCR产物的量可采用以下公式：

6.转化：

使用高效率的感受态细胞进行转化，在LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板筛选转化子。LB平板(含有氨苄/IPTG/X-Gal)；每个连接反应准备1个LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板，涂板前将平板平衡至室温。离心使连接反应内容物汇集到管底，取2μl连接反应产物加到置于冰上的1.5ml离心管中。将冻存的JM109高效率感受态细胞从—70℃冰箱中取出，放置在冰浴直至融化(大概5分钟)，轻轻振动离心管使之混匀。向前述步骤准备好的每个转化管中加入50μl感受态细胞。轻轻振动小管混匀，冰浴20分钟。在精确的42℃水浴中热击45—50秒。迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的950μlLB培养基。在37℃振荡培养(150rpm)1.5小时。将每个转化培养基100μl涂到LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上。将平板于37℃过夜培养(16—24小时)。长时间孵育或将平板37℃过夜培养后贮存在4℃，有助于蓝白斑筛选。白色克隆菌一般包括插入子。

7.质粒提取：

(1)获得澄清裂解液：将1-5ml(高拷贝的质粒)或10ml(低拷贝的质粒)的细菌培养物用台式离心机10,000xg离心5分钟。弃去上清并将试管倒置于纸巾上吸去剩余的培养液。加入250μl细胞悬浮液并旋涡震荡或吹打以充分悬浮细胞。加入250μl细胞裂解液并颠倒离心管4次以充分混合。孵育至细胞悬浮液澄清，大约需要1-5分钟。加入10μl碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混合。于室温孵育5分钟。碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。加入350μl 

 Plus SV中和溶液并迅速颠倒离心管4次以充分混合。于室温将细胞裂解液以最大速度离心10分钟。

(2)质粒DNA的分离及纯化：

将澄清裂解液(大约850μl)转移至准备好的离心柱中。不要搅动或将任何白色沉淀与上清液一同转移。于室温用离心机以最大速度离心上清液1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。加入750μl先前用95％酒精稀释过的柱清洗液。于室温用离心机以最大速度离心1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。用250μl柱清洗液重复清洗步骤。于室温用离心机以最大速度离心2分钟。将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中，操作时需小心，不要将任何柱清洗液与离心柱一同转移。如果离心柱上粘有柱清洗液，则重新以最大速度离心1分钟。将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中。将100μl无核酸酶的水加入离心柱以洗脱质粒DNA。于室温用离心机以最大速度离心1分钟。洗脱质粒DNA后，将离心柱从1.5ml消毒离心管中取出并弃去离心柱。不加缓冲液的DNA水溶液在-20℃及以下是稳定的。TE缓冲液中的DNA在4℃是稳定的。如果需要将DNA存放于TE缓冲液中，将11μl 10XTE缓冲液加入100μl洗脱的DNA中。将离心管盖好并将纯化后的质粒DNA存放于-20℃或以下。

8.重叠(Overlap)PCR获得长片段目的基因：

在进行重叠(Overlap)扩增时，将各段纯化后产物进行OD260测定，按照摩尔比1：1的关系加样，使扩增能够平衡进行。此步骤在片段大小相差悬殊时尤为重要。

(1)合成片段12、片段45：

反应体系：50μl反应体系中含10mmol/L Tris 2HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，3.0mmol/L MgCl2，每种dNTP 200μmol/L，两条外端引物浓度各为0.2μmol/L，1.5UTaqDNA聚合酶。

50μl反应体系：P1.1/4.1              1.0μl

              P2.2/5.2              1.0μl

              dNTP                  2.0μl

              Mg2+                  6.0μl

              片段“1”/片段“4”   2.5μl

              片段“2”/片段“5”   2.5μl

              buffer                5.0μl

              DEPC水                29.6μl

              Taq酶                 0.4μl

循环参数：94℃                      5min

94℃                 5:00min           —加(P1.1和P2.2)或(P4.1和P5.2)

72℃                 7:00min

(2)合成片段“123”：

反应体系：50μl反应体系中含10mmol/L Tris 2HCl(pH8.3)，50mmol/LKCl，3.0mmol/L MgCl2，每种dNTP 200μmol/L，两条引物浓度各为0.2μmol/L，1.5U TaqDNA聚合酶。

由实验结果得知：片段“12”回收纯化：OD260＝0.020μg/ml约1200bp

片段“3”回收纯化：OD260＝0.029μg/ml约800bp

若使“1+2”与“3”的摩尔比为1:1，

x≈3.5μl，y≈1.5μl

50μl反应体系：P1.1          1μl

              P3.2          1μl

              dNTP          2μl

              Mg2+          6.0μl

              片段“1+2”   3.5μl

              片段“3”     1.5μl

              buffer        5.0μl

              DEPC水        29.6μl

              Taq酶         0.4μl

循环参数：94℃              5min

94℃                 5:00min     加P1.1和P3.2和酶(2U/50μl)

58℃                  30s                    30

72℃                  2:00min

72℃                  7:00min

9.构建重组载体pTARGETTM-123：

由实验结果得知：片段“123”回收纯化：OD260＝0.132μg/μl  约2000bp

已知pTARGETTM全长5670bp

以插入片段与载体摩尔比＝1：8设计实验：

y＝1.40

连接反应体系：T4 DNA连接酶的2×快速连接缓冲液  5μl

pTARGET^TM载体                                  1μl

PCR产物                                        1.4μl

T4DNA连接酶                                    1μl

补加去离子水至终体积                           10μl

4℃连接过夜。

10.构建重组载体

 Easy-45：

连接反应体系：T4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液  5μl

pTARGET^TM载体                                 1μl

PCR产物                                       3μl

T4DNA连接酶                                   1μl

4℃连接过夜。

11.限制性内切酶消化质粒DNA

图1为pTARGET^TM载体多克隆位点示意图、本研究所选限制性内切酶为Not I和Sal I。

限制性内切酶反应体系(50μl)：

10*NEB缓冲液  5μl

DNA           ≤2μg

100*BSA       0.5μl

内切酶        1μl(进行双酶切时各加1μl)

灭菌双蒸水       至50μl

(1)获得开环重组载体pTARGET^TM-123：

由实验结果得知：pTARGET^TM-123   OD260＝0.219μg/μl

2μg/0.219≌9μl

反应体系：10*NEB缓冲液    5μl

DNA                      9μl

100*BSA                  0.5μl

Not I                    1μl

Sal I                    1μl

灭菌双蒸水               33.5μl

37℃过夜。

(2)获得具有粘性末端的片段“45”：

由实验结果得知：

 Easy-45  OD260＝0.135μg/μl

2μg/0.135≌14.8μl

反应体系：10*NEB缓冲液  5μl

DNA                     14μl

100*BSA                 0.5μl

Not I                   1μl

Sal I                   1μl

灭菌双蒸水              28.5μl

37℃过夜。

12.构建重组载体pTARGET^TM-CT：

依《分子克隆》连接反应体系：载体＝100ng，片段＝10ng，按摩尔比1：3—3：1的关系进行实验。

由实验结果得知：pTARGET^TM-123   OD260＝0.0260μg/μl

片段“45”  OD260＝0.018μg/μl

连接反应：  T4DNA连接酶  1μl

10*buffer                1μl

pTARGET^TM-123            4μl

片段“45”               4μl

4℃连接过夜。

13.细胞培养：

(1)胰酶消化，传代：取出冻存的液态0.25％胰酶置于冷水中溶化；待溶化后置于超净台中，以75％酒精消毒；取出培养瓶，置于超净台中75％酒精消毒；将旧培养基倒入废液缸，尽量倒净；吸取少量胰酶于培养瓶中，迅速、轻轻转动培养瓶，将其倒入废液缸；加入约3ml胰酶消化4分钟；加入含血清培养基终止消化；反复吹打细胞，使其从壁上脱离；将吹打后的培养液倒入离心管中，以800转/分钟离心10分钟；倒出上清，加8ml培养基于管中重悬细胞；将培养基分装于两个新的细胞培养瓶中、拧紧盖子；置于37℃、5％C0₂细胞培养箱中，拧松瓶盖、进行培养。

(2)细胞换液：取出培养瓶，置于超净台中，以75％酒精消毒；将旧培养液倒入废液缸中；取3ml含10％小牛血清的新鲜细胞培养液于培养瓶中，拧紧盖子；置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，拧松瓶盖、进行培养。

14.转染真核细胞：应用脂质体转染试剂盒Lipofectamion^TM2000进行实验

(1)质粒DNA的转染：按照下述步骤将质粒DNA转染入24孔培养板生长的哺乳动物细胞中。不同型号培养板每孔所需细胞数量及溶液体积见表4。大部分细胞系需要DNA(μg)与Lipofectamine^TM2000(μl)混合物的比值在1:2至1:3之间。转染前一天，在无抗生素的培养液中以0.5-2x10⁵/500μl的细胞浓度进行铺板，使其在转染时细胞密度达到90-95％。

每孔转染样本均按照下列说明准备：将DNA加至50μl无血清的Opti-MEM I培养基中进行稀释，轻柔混匀。用之前，先将Mix Lipofectamine^TM2000轻柔混匀，加适当的量于50μl Opti-MEMI培养基中、混匀。室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，将稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine^TM2000进行混合(总体积100μl)。轻柔混匀并在室温下孵育20分钟；加100μl混合液于孔中，前后晃动轻柔混匀。转染后于37℃、5％CO₂孵箱温育18-48小时，孵育至4-6小时需要更换培养基。

(2)转染的优化：为了得到高转染效率和低细胞毒性，通过改变DNA与Lipofectamine^TM2000浓度来优化转染条件。确保细胞融合大于90％，并改变DNA(μg)：Lipofectamine^TM2000(μl)在1:0.5至1:5之间。

表4：各类型培养板所需样本量一览表

15.转染细胞的鉴定：

将转染后细胞进行增殖、收获，应用深圳匹基和中山达安沙眼衣原体PCR检测试剂盒进行鉴定、研究其适用性。

(1)应用深圳匹基商品试剂盒进行鉴定：

A.样本处理：充分振荡混匀样本取出100μl，加入100μl DNA提取液1，振荡混匀；13,000rpm离心15min，吸弃上清；加入50μl DNA提取液2，振荡混匀；100℃沸水浴/干浴10min，13,000rpm离心10min，保留上清待用。

B.扩增试剂准备：从试剂盒中取出CT&NG反应液、CT PCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec；设所需要的PCR反应管管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下：

试剂   CT&NG反应    CT PCR反应液   Taq酶      UNG

用量   18.8μl       18.8μl         0.4μl     0.06μl

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR反应管中分别加入38μl，转移至样本处理区。

C.加样：若样本裂解产物保存在-20℃，置室温解冻，13,000rpm离心5min；在所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的样本上清及试剂盒中的阴性对照和阳性对照各2μl，盖紧管盖，转移至检测区。将PCR反应管排放好放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。

D.PCR扩增：循环条件设置：37℃ 5min；94℃ 1min；95℃ 5sec，60℃ 30sec，40个循环。反应体系设为40μl。

仪器检测通道的选择：荧光信号收集时设定为Fam荧光素；荧光信号收集设在60℃。

(2)应用中山达安公司商品试剂盒进行鉴定：

A.DNA提取：取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10分钟；12,000rpm离心5分钟，备用。

B.标本处理：充分振荡混匀样本取出100μl，12,000离心5分钟；去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10分钟；12,000rpm离心5分钟，备用。

CT临界阳性质控品处理、CT强阳性质控品处理：同阴性质控品。

CT阳性定量参考处理：8,000rpm离心数秒，备用。

C.PCR扩增：①试剂准备：按比例(CT-PCR反应液40μl/人份+Taq酶3μl/人份)取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/0.2ml加样于离心管中，备用。②加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品(包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品)上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8,000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。③循环条件设置：

93℃ 2分钟

93℃ 45秒——55℃ 60秒   10个循环

93℃ 30秒——55℃ 45秒   30个循环

保存文件，运行。

16.质控物检测下限的研究：

(1)获得系列稀释浓度样本：将阳性质控物原液进行倍比稀释，稀释浓度分别为1：100、1：1000、1：10000、1：100000、1：1000000、1：10000000。

(2)应用商品检测试剂进行检测：应用沙眼衣原体商品检测试剂盒(深圳匹基生物技术公司)在同一人员操作、同一仪器、耗材、同时进行检测，对比结果、探讨质控物的检测下限。

三.实验结果

1.获得五段目的基因：

分别应用上述5对引物对沙眼衣原体核酸提取物进行扩增，获得目的片段长度分别为433+25bp(图2A)、775+45bp(图2B)、790+24bp(图2C)、626+32bp(图2D)、778+41bp(图2E)，如图1所示、所有结果均与预期一致。

2.获得长片段目的基因：

将片段1与片段2进行Overlap PCR得到片段12，产物长度为1231bp，比片段1与片段2实际大小相加小46bp，结果见图3A；将片段4与片段5进行Overlap PCR得到片段45，产物长度为1432bp，比片段4与片段5实际大小相加小45bp，结果见图3B；图3C所示为片段123的条带，产物长度为1998bp，比片段12与片段3实际大小相加小48bp。上述结果均与预期一致。

(1)构建

 Easy-45载体，测序结果如下：T7方向(序列表SEQ ID No.3)：

TGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTAAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTTCCCCAGAACAAT

AAGAACACACACTTTGTCTCGATGAAAGACAGGAAATACGCATGATTTCCTCATCTTTTAATCCTATTTGC

TTTAAATGAATCAAAGCGCTTGCACGAAGTACTCTAGGAGTAACTTTTTTTCATAGCACTATAGAACTCTG

CAAGCCTAAAATTATGCGCAACCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCCTATTTTAGAAACAAATACTCTCCCA

TTTCTCCCACAAGTGTATTTTTGCAACTCCTCCATTAAGCTGATAGGAAATGTGATTAGAATTTTGGTTTC

TTTATTCTGTCTTTTTTTAATGCGAAAGGAAATCTGATTGGATGCAAAAAATAGATCGTCTGTGCGCAAAG

ACAAAATTTCGTCTAACTTACGGATCCCTTGTACAATCAATTTACCGATTAAATAGTCTCTATAATTCACT

ATCCGGAGCGCTTCAAAAAAACTGTCCATTCCTGCTTAGAAATCGATTCTGTTTTGATTTTGTCTCGGATT

TTAAAAAATGTAGTGTTTCCAAAATCTTTCAATGGAATAGCGGGTTTAATATATCCCTTGGTCAATCTATA

CAAAAACTTTGTGAAAGATATGTAGCATGCCGCTCTAGCCTGTTTAGAGGCCTCTGAAACGACTTTTCCAT

TAAAAACATCTAGAGACTTGATTTTAAACAAAGATTCGCTGTGGTCAAGAGAAATAGCCTTTATCAAGGTT

TCCGATAAATCCAGAATCTCTAAAGAAACAAGAAAGTTAATCCCAGACGCCAGTAAGCAGTTTTACCGCTA

GGATGTCTTCTTGATAAAATTCTTCATCCGAATAGTTTTGGAACTCTGATAAAAATAATTGATCCAAACTC

TGACTTTCCTCAGAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCGTCTTCTTAAAATCTAAAGA

AGCGGCAGTTTGATTTTTTTAAAAAGACATTCGCTTCTTTTTTAGTTTGTCACGTTGTCCTCTGAGAGTAA

TCTCGTTCATATTCGATATGCAAAATATTTGCTATTTCATGCGTTAACTTCAGAATATCTTCTGCGGCCCT

AGAATTTGGATAGACATTAGCTACAGAATCTTCTTAAGAAGAGAACCGGCTGAAAA

SP6反向互补(序列表SEQ ID No.4)：

TGCAACTCCTCCATAGCTGATAGGAATGTGATTAGAATTTGCTCCTTATCCGTCCTTTTTTATGCGAAAGT

AATCTGAATGATGCAAAAATAGATCGTCTGTGCGCAAAGACAAATTTCGTCTACTACGATGTGTACAATCA

ATTTACGATAAATAGTCTCTATAATCACTATCGAGCGCTCAAAAAAACTGTCCATCTGCTAGAATCGATCT

GTTTGATTTTGTCTCGGATTTTAAAAAATGTAGTGTTTCCCAAAATCTTTCAATGGAATAGCGGGTTTAAT

ATATCCCTTTGGTCAATCTATACAAAAACTTTGTGAAAGATATGTAGCATGCCGCTCTAGCCTGTTTAGAG

GCCTCTGAAACGACTTTTCCATTAAAAACATCTAGAGACTTGATTTTAAACAAAGATTCGCTGTGGTCAAG

AGAAATAGCCTTTATCAAGGTTTCCGATAAATCCAGAATCTCTAAAGAAACAAGAAAGTTAATCCCAGACG

CCAGTAAGCAGTTTTACCGCTAGGATGTCTTCTTGATAAAATTCTTCATCCGAATAGTTTTGGAACTCTGA

TAAAAATAATTGATCCAAACTCTGACTTTCCTCAGAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAA

GCGTCTTCTTAAAATCTAAAGAAGCGGCAGTTTGATTTTTTTTAAAAAAGACATTCGCTTCTTTTTTTAGT

TTGTTCACGTTGTCCTCTGAGAGTAATCTCGTTCATATTCGATATGCAAAATATTTGCTATTTCATGCGTT

AACTTCAGAATATCTTCTGCGGCCCTAGAATTTGGATAGACATTAGCTACAGAATCTTCTTTAAGAAGAGA

ACGGCTGAGAGAAATATCTCGACGAATTTTTGTTGAAAAAAGCTTGTTTTTGTAAATAGACTCGATAATGT

CTATATACATTTGGTTAGTCGAGTTACGATCATCCCAAAAAGACAAAGCTATTCCAAGAATGTGTTCTTCT

TCAGGTTTTCCGACCGAACTTAAGAATTCACGTATCTTTTGTAACCCTAGAATAGAAAAAGGTTCTGGAGT

TAAACAAGCAATTAATTTGTCTCCTACAACAAAAGCTTCTTTCGTTAACCCTCCTAGGCGTCGACGCGTAA

TCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCG

(2)构建pTARGET^TM-123，测序结果如下：T7方向(序列表SEQ ID No.1)：

ARKKWKKKWASTTCWCTGCTCTGGCCGYCRTGGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCCTGTAATCACCCAGTCG

ATAAATGTGTAAGCATACTTTGATGCATTTGGGAAGTGCATTTTTATTTCTTGGTATACATTTGCAGGCTT

GATTACAAAGTAGGATTCTATTTGATCTACCAAGATAGGACATGGCTCTACAACGAACCCTTTATGTTTCC

GTGTAKATGGTGAATTAAAAGGTGTTAAGTCTATATCTATATTTTCTTCGTCAGTTAAACCTTCCCATCCT

TCGTAAATCCTAATGATCGGAGAAAGAGTTTGGTAACGGTCTACTATTTGTGTTCCATTAGTCCATCGAGT

TCTAGTTGCCACTATTAAAAACGGTTGATGTCCTAAATGGTATAAGGCTTCTAAAGCAGTTTCAGCTTCTT

TTCCACTAAACTCATACTTATTTCTGGATGTTTTATACCGCTTAACTCCATAAGCCTCTAAGAATTCAGTT

TTTGTAAAACGGATTCTTGGTATCCATCCTTCAAATTGAAAACTATTTGATTCTCTGGATAAAACAACCCC

TTTTGTGTTCCCCTTGTAATTCGTTGCAGTCAGCAATCTTTGGATAGCTGCTAATGCATGGTAATGAGATG

AAAGAAAATCAAGACCTATAACTTCTACCATCCCATTTTGAGCCAATTTGGGAGATATCTTAATAGATTGA

CCAGGTCTTCTTCCAAACTTCTGATTTTCAAGGTGGATAGGACTTTTGATGAAGTGGCAGTTACTATAATT

TACCATACTTTTTTAATAGCGGAGAATTTACTAATTTTTGGACGAAATGTAATACCGAAGAGYCTGTTAAA

TTAGCAATAATCCGCTCAACAATTTGACCTGCGCTCATTTCTAGAGATAGGAAACCAACTCTACGCTGTTG

AGTAACCACAAGATTTATCGCCATGTCTATAGCTAAAGCAGTTTTCCCTATAGATGGGCCTAGCTGCTATA

ATCACGAAATTACCTTTAGCTAAGATGACTCCTTTATCATCAATATCCTTGTATCCTGTTGGGAAGGCATC

AAKAAAGAATTTTGAATCTCAGAGAACGTTGCTCGTCTTTTTTTAWACGAGCCAGCACTCCAATTTCTGAC

TGYGAGAATATATCATAAATAGACGGCCTCTAGCGCCTGCGAATAGAAAAGTCWTGCTAGCACT

SP6方向(序列表SEQ ID No.2)：

GGRRCTWGMTCAYGCGTTGGGAGCTCTCCYKGTGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTC

CGCTCGAGCTTCATTATGTCGGAGTCTGAGCACCCTAGGCGTTTGTACTCCGTCACAGCGGTTGCTCGAAG

CACGTGCGGGGTTATCTTAAAAGGGATTGCAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGAGAACGTGCGGGCGATTTGCC

TTAACCCCACCATTTTTCCGGAGCGAGTTACGAAGACAAAACCTCTTCGTTGACCGATGTACTCTTGTAGA

AAGTGCACAAACTTCTGGGGATAAGTTATAATAATCCTCTTTTCTGTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAGAA

AGAAATGGTAGCTTGTTGGAAACAAATCTGACTAATCTCCAAGCTTAAGACTTCAGAGGAGCGTTTACCTC

CTTGGAGCATTGTCTGGGCGATCAACCAATCCCGGGCATTGATTTTTTTTAGCTCTTTTAGAAAGGACGCT

GTTTGCAAACTGTTCGAGTATGCGTTGTTAGGTAAAGCTCTGATATTTGAAGACTCTACTGAGTATATTCT

GAGGCAGCTTGCTAATTATGAGTTTAAGTGTTCTCATCATAAAAACATATTCATAGTATTTAAATACTTAA

AAGACAATGGATTACCTATAACTGTAGACTCGGCTTGGGAAGAGCTTTTGCGGCGTCGTATCAAAGATATG

GACAAATCGTATCTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTATCAAATGACAAGCTTAGATCCGTTTCTCATAC

GGTTTTCCTCGATGATTTGAGCGTGTGTAGCGCTGAAGAAAATTTGAGTAATTTCATTTTCCGCTCGTTTA

ATGAGTACAATGAAAATCCATTGCGTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGAGCGTATAAAGGGAAAGGCTTGA

CAGTGCTATAGCAAAGACTTTTTCTATTCGCAGCGCTAGAGGCCGGTCTATTTATGATATATTCTCACAGT

CAGAAATTGGAGTGCTGGCTCGTATAAAAAAGACGAGCACGTTCTCTGAGATCAAAGTCTTTCTTTGATGC

CTTCYCAACAGATACAAGATATGATGATAAGAGTCATCTTAGCTAAGTATTCGTGATTATAGCAGCTAGCA

TCTATAGGAAACTGCTTAGCTAGACATGGCGATTAATCTTGTGTTACTCACCAGGCGTAAAAGC

3.重组载体的构建：

(1)重组载体pTARGET^TM-123的构建：

将片段123首先克隆入pTARGET^TM载体，形成重组pTARGET^TM-123载体，如图4-S2所示、已知pTARGET^TM的大小为5670bp、重组pTARGET^TM-123载体的大小约为7670bp，但是超螺旋结构的质粒在琼脂糖凝胶电泳上的泳动速度快于其线性结构，所以电泳位置要小于实际载体大小。

(2)重组载体 Easy-45的构建：

将片段45克隆入-T Easy，形成重组载体-T Easy-45，大小应在4400bp左右，但由于质粒的超螺旋结构造成泳动速度较快、条带位置更接近于2500bp，如图5所示。

(3)重组载体pTARGETTM-CT的构建：

以限制性内切酶Not I和Sal I对上述重组载体进行双酶切，图6为其电泳示意图。图6-S1所示为线性重组载体pTARGETTM-123经酶切后电泳条带，位于Marker7500左右，与预期结果一致。图6-S2所示为

-T Easy-45经双酶切后电泳条带，其中泳动速度较快的是具有粘性末端的片段45、约1400bp，与预期结果一致。

以限制性内切酶Not I和Sal I对已构建的pTARGET^TM-CT重组载体进行酶切验证，见图7。图7-S1为经双酶切验证的pTARGET^TM-CT重组载体电泳示意图，其中泳动速度较快的为片段45、约1400bp，泳动速度较慢的为线性pTARGET^TM-123重组载体、位于Marker7500左右。由此我们判定重组载体pTARGETTM-CT构建成功。图7-S2为未经酶切的重组pTARGET^TM-CT载体、约9000bp，由于载体本身的超螺旋结构造成其泳动速度较快。

以引物P4.1/P5.2对重组载体pTARGET^TM-CT进行PCR验证，结果见图8。扩增产物约1400bp、大小与片段45相同，而阴性对照无扩增产物，排除了产物污染引起的假阳性可能，认为重组pTARGET^TM-CT载体中确含有片段45。

将该样本送菌测序，回报结果为：测序反应信号弱。经咨询，高度怀疑此重组载体形成空间结构影响其测序反应的正常进行。由于该载体大小已经高达9000bp，其形成空间结构的几率明显大于长度相对较小的载体。本实验中，PCR验证可得到目的条带，且阴性对照无任何特异性条带产生，因此判定此重组载体中存在目的基因，即pTARGETTM-CT重组载体构建成功。且双酶切验证显示两条产物位置均与理论位置一致，再次验证此载体构建成功。

4.细胞培养：

图9所示为传代培养的HTB-siha细胞。

5.转染细胞的鉴定：

将转染后细胞进行增殖、收获后，应用不同沙眼衣原体PCR检测试剂在相同荧光定量PCR仪(杭州博日公司Line-gene)上对样本原液进行鉴定。深圳匹基生物技术公司商品试剂盒检测结果见图10A；图10B显示结果为中山达安生物技术公司所产商品试剂的检测结果。样本原液在不同商品试剂检测过程中曲线均呈S型扩增，检测结果呈强阳性。

6.质控物检测下限的研究：

应用深圳匹基商品试剂对倍比稀释后的样本在荧光定量PCR仪(杭州博日公司Line-gene)上进行检测，具体结果见表5；图11为检测曲线图。由此可见，倍比稀释后的高浓度样本检测结果变化呈梯度下降趋势，即每稀释10倍其循环阈值增加3.3左右，符合PCR指数扩增规律；倍比稀释后的低浓度样本不遵循此规律。

表5：各样本检测结果、以CT值表示，各样本所对应的颜色与图10所示颜色一致

本质控品检测下限值为10⁴-10⁵左右，为临床诊断试剂盒检测下限，已能满足临床检测需要。

Overlap PCR方法在过去的研究中是一种构建定点突变体常见的技术方法，在本次研究中，我们应用这一技术进行多间隔片段的连接，并取得了良好的效果。此外，以Overlap PCR技术进行片段的连接与以往的在每个片段两端均增加酶切位点、经双酶切后连接将多个目的片段构建入同一载体的方法相比，减少了酶切位点的生成，为重组载体的构建提供了便利条件。

实施例2：质控物的稳定性研究及应用于临床实验室的CT PCR检测室间质量评价

一.实验材料

1.标本来源：实施例1构建的沙眼衣原体PCR检测质量控制物

2.主要试剂：

细胞培养基DMEM(高糖)　Hyclone公司　美国

沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂　广州达安公司　中国

沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂　深圳匹基公司　中国

3.主要仪器：

实时荧光PCR仪(7500Real Time PCR System)　美国生物应用系统　美国

实时荧光PCR仪(Lightcycler)　Roche公司　美国

实时荧光PCR仪(Line-gene PCR仪)　杭州博日科技有限公司　中国

台式高速离心机　Heraeus公司　德国

高速低温离心机(BECKMAN Microfuge)　BECKMAN公司　美国

超速低温离心机(SIGMA 3K30 Laboratory Microfuge)　SIGMA公司　德国

CO2孵箱　SANYO　日本

Eppendorf系列微量加样器　Eppendorf公司　德国

4.主要耗材

ABI扩增板　96孔　美国

Eppendorf离心管　1.5ml　德国

AXYGEN带虑芯加样器吸头  0.5-10μl，10-100μl，20-200μl，100-1000μl  美国

Corning公司离心管　15ml，50ml　美国

Corning公司移液管　5ml　美国

Corning公司细胞培养瓶　25cm2、75cm2　美国

Corning公司细胞培养板　6孔、24孔　美国

二.实验方法

1.样品稳定性研究

将阳性样本原液进行1：100、1：1000、1：10000、1：10000稀释、放置于各条件下、保存不同时间后应用沙眼衣原体商品检测试剂盒(深圳匹基生物技术公司)进行检测，具体条件见表9。

(1)倍比稀释原液

稀释液成分：含20％小牛血清的稀释液(含防腐剂)

倍比稀释：以阳性样本原液进行1：100、1：1000、1：10000、1：100000稀释

1：100稀释取2ml至200ml稀释液中；

1：1000稀释从1：100稀释的200ml中充分震荡混匀、取出20ml加入180ml的20％小牛血清稀释液中进行稀释；

1：10000稀释从1：1000稀释的200ml中充分震荡混匀取20ml，加入180ml的20％小牛血清稀释液中进行稀释；

1：100000稀释从1：10000稀释的200ml中充分震荡混匀取20ml，加入180ml的20％小牛血清稀释液中进行稀释。

(2)具体条件：本实验将研究样本在37℃、室温、4℃、-20℃以及-70℃至室温反复冻融3次的样本稳定性。具体条件见表6。

表6：稳定性研究

(3)样本分装

分装前将生物安全柜清洁消毒，紫外照射30分钟；选用DNAse的螺口离心管(盖子有密封圈)，在生物安全柜内分装液体制备物，分装量为每支0.5ml。

2.鉴定：

应用深圳匹基商品试剂对各浓度、不同温度保存样本进行荧光PCR检测，观察其稳定性。实验中使用同一批次试剂，同一仪器、相同耗材并经同一人员操作、严格按操作说明进行。

(1)样本处理：充分振荡混匀样本取出100μl，加入100μl DNA提取液1，振荡混匀；13,000rpm离心15min，吸弃上清；加入50μl DNA提取液2，振荡混匀；100℃沸水浴/干浴10min，13,000rpm离心10min，保留上清待用。

(2)扩增试剂准备：从试剂盒中取出CT&NG反应液、CT PCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec；设所需要的PCR反应管管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下：

试剂  CT&NG反应液 CT PCR反应液  Taq酶  UNG

用量  18.8μl  18.8μl  0.4μl  0.06μl

(3)加样：若样本裂解产物保存在-20℃，置室温解冻，13,000rpm离心5min。

在所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的样本上清及试剂盒中的阴性对照和阳性对照各2μl，盖紧管盖，转移至检测区。将PCR反应管排放好放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。

(4)PCR扩增：循环条件设置：37℃ 5min；94℃ 1min；95℃ 5sec，60℃ 30sec，40个循环。反应体系设为40μl；仪器检测通道的选择：荧光信号收集时设定为Fam荧光素。荧光信号收集设在60℃。

3.统计学分析：

应用SPSS 11.5统计分析软件对所得数据进行分析。本实验应用随机区组的多因素方差分析对实验数据进行统计学检验。检验显著性取α＝0.05，P<0.05有显著性差异。

4.临床实验室室间质量评价：

(1)样本组成

将质控物按照原液1：100、1：1000、1：10000倍稀释，样本组成为：

1：1001：10001：10000阴性质控

1个 1个2个1个

(2)全国室间质量评价

每个实验室发放5份样本同时附带相同的操作说明及结果报表，由于临床检测一般为定性检测，因此回报表中填报项目为：检测日期，检测结果(填写阴性或阳性)，所用仪器及试剂，操作者等重要项目。

三.实验结果

1.稳定性研究：

本实验对保存4周内的样本稳定性进行阶段性研究，为下一步的室间质量评价做前期准备工作。经同一批次沙眼衣原体检测试剂盒(深圳匹基公司)检测，具体数据如下：

(1)倍稀释样本稳定性研究：见图12、图13和表7。

表7：百倍稀释样本检测结果

注：所有结果均用循环阈值表示。

上述三个图表分别用不同的方式直观地反映出将百倍稀释样本的稳定性。我们认为该样本在37℃、室温以及4℃保存情况下其性能并无明显改变、应用商品试剂盒检测结果比较稳定。应用SPSS统计分析软件对检测结果进行统计学分析：P>0.05证明不同温度之间的检测结果无统计学意义，说明百倍稀释样本在不同温度条件下至少可以稳定保存一个月。

(2)千倍稀释样本稳定性研究：见图14、图15和表8。

表8：千倍稀释样本检测结果

注：所有结果均用循环阈值表示。

上述三个图表分别用不同的方式直观地反映出将千倍稀释样本的稳定性。我们认为该样本在37℃、室温以及4℃保存情况下其性能并无明显改变、应用商品试剂盒检测结果比较稳定。应用SPSS统计分析软件对检测结果进行统计学分析：P>0.05证明不同温度之间的检测结果无统计学意义，说明千倍稀释样本在不同温度条件下至少可以稳定保存一个月。

(3)倍稀释样本稳定性研究：见图16、图17和表9。

表9：万倍稀释样本检测结果

注：所有结果均用循环阈值表示。

上述三个图表分别用不同的方式直观地反映出将万倍稀释样本的稳定性。我们认为该样本在37℃、室温以及4℃保存情况下其性能并无明显改变、应用商品试剂盒检测结果比较稳定。应用SPSS统计分析软件对检测结果进行统计学分析：P>0.05证明不同温度之间的检测结果无统计学意义，说明万倍稀释样本在不同温度条件下至少可以稳定保存一个月。

2.室间质量评价结果

将各种浓度分装编号后发往全国160余家PCR实验室，对已回报88家实验室检测结果进行整理，见表10。对1：100倍稀释的样本的检测符合率平均为100％，对1：1000和1：10000的样本的检测符合率为98.9％。阴性样本的符合率为100％。

表10：全国各家实验室测定结果统计表

对各家实验室所用试剂进行统计，结果见表11。

表11：各种试剂测定结果统计表

对各家实验室所用仪器进行统计，结果见表12。

表12：不同仪器测定结果统计表

我们将含有目的基因的样本进行倍比稀释，随后将分装后1：100至1：100000倍稀释的样本放置于不同温度下保存，经过一定时间后用深圳匹基公司沙眼衣原体聚合酶链反应检测试剂盒对其进行验证。从检测结果我们可以看出在一定条件下1：100至1：10000倍稀释的样本在室温、37℃和4℃条件下均能稳定保存，循环阈值的变化不明显。分别用SPSS软件对检测结果进行随即区组设计的两因素方差分析，P值均>0.05说明样本之间的结果变异无统计学意义，可以认为该样本在各个条件下均可稳定保存。

本研究由同一人应用同一批次检测试剂、在同一时间、应用ABI 7500荧光定量PCR仪对所有样本进行统一检测。排除了由于不同批次商品试剂或仪器稳定性能以及人为操作因素对检测结果产生的影响，公正客观地反映出各样本的变化趋势、更具说服力。

全国各医院临床PCR实验室室间质评结果显示此质控物具有较好的适用性。且各实验室的检测准确性较高，对1：100倍稀释的样本的检测符合率平均为100％，对1：1000和1：10000的样本的检测符合率为98.9％。在回报表中无假阳性结果的出现，说明临床工作中在CT PCR检测方面准确性较好。同时也证明本质控品完全满足临床实验室室间质量评价要求。

序列表

<110>卫生部北京医院

<120>一种检测沙眼衣原体的质控物

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1200

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

<210>2

<211>1200

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

<210>3

<211>1192

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

<210>4

<211>1193

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

Claims (5)

1.一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于：含有序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列或其互补序列。

2.根据权利要求1所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于：所述质控物为pTARGETTM-CT重组载体，采用以下方法构建：

(1)重组载体pTARGETTM-123的构建：将片段123克隆入pTARGET^TM载体，形成重组pTARGETTM-123载体；

(2)重组载体pGEM

-T Easy-45的构建：将片段45克隆入

 Easy，形成重组载体

 Easy-45；

(3)重组载体pTARGET^TM-CT的构建：以限制性内切酶Not I和Sal I对重组载体pTARGET^TM-123和pGEM

-T Easy-45进行双酶切；T4 DNA连接酶，4℃连接过夜，构建pTARGET^TM-CT重组载体；

(4)应用脂质体转染试剂盒Lipofectamion^TM 2000，转染真核细胞。

3.根据权利要求2所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于：所述重组载体pTARGET^TM-123从T7方向测序，为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；从SP6方向测序，为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于：所述重组载体pGEM

-T Easy-45载体从T7方向测序，为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；从SP6方向测序，为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于：所述真核细胞为宫颈上皮细胞(HTB-Siha细胞)。

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