CN110938709A - 基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒及方法。本发明提供的试剂盒包括如SEQ ID NO.1～3所示的引物和探针。本发明提供的方法能实现肠道病毒的快速准确检测；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，且结果直接肉眼观察，实验操作简捷，利用本发明所述方法能够实现对粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清或疱疹液中的肠道病毒的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种肠道病毒的检测试剂盒，特别涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒及方法。
背景技术
肠道病毒(Enterovirus,EV)是一种来自小RNA病毒科肠道病毒属的小单正链RNA病毒，为一种常见儿童传染性病原体，其主要通过粪口和呼吸道途径传播。目前，已发现100多种EV血清型，根据其遗传特点，可将其分为EV-A、EV-B、EV-C、EV-D四大类。其中EV-A类的柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A，CA)2-8、10、16和肠道病毒(Enterovirus)A71常引起手足口病(hand,foot,and mouth disease，HFMD)。自1957年首次对HFMD报道以来，已多次在世界范围内引起大规模的流行，其中，中国亦是主要受影响的国家。我国于2008年5月将其纳入丙类传染病管理系统，至2017年已报告HFMD约1600万例，死亡3500例，HFMD已成为严重危害儿童健康的急性传染病之一。除HFMD外，EV感染所致的无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹、脑炎、心肺衰竭甚至死亡也可发生在某些患儿身上。目前，尚无特异的针对EV感染的抗病毒药物，唯一的商业化EV71疫苗不能预防除EV71以外的肠道病毒感染。因此，早诊断早治疗是减少EV感染所致重症的重要手段。
病毒分离培养是诊断EV感染的“金标准”，常用方法有细胞培养和乳鼠培养，通过采集患者粪便、肛拭子、咽拭子、咽喉洗液或疱疹液等制成悬液后接种于敏感细胞中进行培养。虽然培养法可以精确的诊断EV感染，但存在灵敏度低、培养时间长、对技术人员要求过高等缺点，限制其在临床上的应用，无法满足对疾病的早期诊断及病毒流行期大规模使用。常用的血清型检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和抗体检测、补体结合试验(CF)等，通过对单份血或急性期和恢复期双份血样本进行抗体检测从而做出诊断。该方法具有操作简便、对实验室和技术人员对要求不高等优点，适合在基层实验室开展，但EV血清型众多且容易产生抗原漂移现象进而产生交叉免疫反应使其临床运用价值有限，且机体产生抗体需要一定时间，不利于疾病的早期诊断。
由于传统的培养法和血清学方法存在耗时、费力和灵敏度低等问题，目前已不适合运用于临床的日常检测中。但PCR技术的迅猛发展为检测各种临床标本中的病原体提供了快速、敏感、特异、有力的工具，近年来在检测EV感染方面也得到了广泛的应用，亦有少数的商业化荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)已投入临床使用。但是，目前仍缺乏更为快速、灵敏、简便、不依赖于精密仪器的新型检测方法。
因此，有必要研究一种更为快速、易于操作的肠道病毒的检测方法。
发明内容
本申请的首要目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒。
本申请的另一目的在于提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测方法。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，包括引物PanEV-F-1、引物PanEV-R-1和探针PanEV-P-1；
引物PanEV-F-1：
5’-Biotin-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’(SEQ ID NO.1)；
引物PanEV-R-1：
5’-GGATGGCCAATCCAATAGCTATATGGTAACAA-3’(SEQ ID NO.2)；
探针PanEV-P-1：
5’-FAM-GGAAACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC/idSp/GCTGCAGAGTTRCCC-C3Spacer-3’(SEQ ID NO.3)。
所述的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒还包括用于逆转录过程的逆转录预混液A和逆转录预混液B，用于RPA扩增的RPA扩增预混液和乙酸镁中的至少一种，以及用于RPA扩增的水、试纸条和试纸条检测缓冲液中的至少一种。
所述的用于逆转录过程的逆转录预混液A包括随机引物(Random 6mers)和dNTP混合物。
所述的逆转录预混液B包括逆转录酶、逆转录缓冲液和RNA酶抑制剂。
所述的RPA扩增预混液包括用于RPA扩增的酶、用于RPA扩增的缓冲液、引物PanEV-F、引物PanEV-R和探针PanEV-P。
上述预混液中，所述的引物和探针的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物PanEV-F 0.42μM，引物PanEV-R 0.42μM，探针PanEV-P 0.12μM。
所述的用于RPA扩增的酶为能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种。
所述的试纸条为侧流层析试纸条。
所述的用于RPA扩增的水优选为双蒸水或超纯水。
一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测方法，应用上述试剂盒实现，包括如下步骤：
(1)对待检测样本提取总RNA；
(2)逆转录合成cDNA预混反应体系：
逆转录预混液A：每5μL反应体系的组成如下：随机引物50μM 0.5μL，dNTP混合物10mM 0.5μL，用于逆转录扩增的水补足至2.5μL；
逆转录预混液B：每10μL反应体系的组成如下：逆转录缓冲液2μL，逆转录酶0.5μL，RNA酶抑制剂0.25μL，用于逆转录扩增的水补足至5μL；
将2.5μL总RNA加入到逆转录预混液A中后，首先在65℃保温5min，随后冰上迅速冷却；取上一步产物5μL全部转移至逆转录预混液B中后缓慢混匀，42℃反应30min后95℃保温5min使酶失活，最后冰上放置备用；
(3)RPA扩增反应体系：
配制RPA预混液，然后将37.5μL RPA预混液与步骤(2)得到的10μL逆转录反应产物混合，再加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即于39℃条件下进行RPA扩增反应30min；
其中，RPA预混液：1管
nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物PanEV-F和PanEV-R各2.1μL、浓度为10μM的探针PanEV-P 0.6μL、用于RPA扩增的水补足至37.5μL；
(4)试纸条检测：
取5μL RPA扩增产物，加入100μL试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5～15min，最后判读结果；
(5)结果判读：
每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；
a)若只是试纸条的对照(Control)条带显色，检测结果为阴性；
b)若试纸条的对照(Control)条带和检测条带同时显色，检测结果为阳性。
c)若试纸条的对照(Control)条带不显色，重复进行试验。
步骤(1)中，所述的待检测样本包括粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清或疱疹液中的至少一种。
所述的检测方法在非诊断目的领域中的应用，如实验研究领域中。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明通过引物和探针的设计、优化，采用RPA等温扩增技术并将反应试剂做成预混体系精简操作步骤，对肠道病毒的检测时间快速，灵敏度高，不需要特殊仪器设备。
(2)本发明的检测结果采用试纸条显色的方法，操作简便快捷，检测灵敏度高，检测限在低至5×100个拷贝的肠道病毒核酸均可以被检测出来。
(3)利用本发明所述方法能够实现对粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清或疱疹液中的肠道病毒的检测。
附图说明
图1是PanEV RPA在不同温度下的扩增效果图；其中，扩增成功时电泳产生两条目的条带：123bp和195bp；泳道BC为空白对照，泳道M为DL1000bp DNA Marker。
图2是PanEV RPA在不同时间下的扩增效果图；其中，扩增成功时电泳产生两条目的条带：123bp和195bp，泳道BC为空白对照，泳道M为DL1000bp DNA Marker。
图3是PanEV RPA扩增灵敏性的检测结果图；1～6分别对应的DNA拷贝数为：5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105，BC为空白对照。
图4是PanEV RPA扩增特异性的检测结果图；其中，图A为多种肠道病毒亚型经试纸条检测结果图，泳道1为CA2、泳道2为CA4、泳道3为CA5、泳道4为CA6、泳道5为CA9、泳道6为CA10、泳道7为CA16、泳道8为CB2、泳道9为CB4、泳道10为CB5、泳道11为EV71、泳道12为E6、泳道13为E11、泳道14为E18；图B为多种肠道病毒亚型经电泳检测结果图，泳道1为CA2、泳道2为CA4、泳道3为CA5、泳道4为CA6、泳道5为CA9、泳道6为CA10、泳道7为CA16、泳道8为CB2、泳道9为CB4、泳道10为CB5、泳道11为EV71、泳道12为E6、泳道13为E11、泳道14为E18；图C为多种非肠道病毒病原体经电泳检测结果图，泳道1为甲型流感病毒、泳道2为乙型流感病毒、泳道3为呼吸道合胞病毒、泳道4为腺病毒、泳道5为轮状病毒、泳道6为人双埃柯病毒、泳道7为巨细胞病毒、泳道8为人鼻病毒、泳道9为大肠埃希氏杆菌、泳道10为金黄色葡萄球菌、泳道11为肺炎链球菌、泳道12为流感嗜血杆菌、泳道13为白色念珠菌、泳道14为阳性对照；泳道BC为空白对照，泳道M为DL1000bp DNA Marker。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本发明建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术可视化的肠道病毒(EV)核酸检测方法，具体地，本发明利用RPA等温扩增技术结合免疫层析技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对EV基因组序列进行分析，设计出了用于RPA扩增的特异性引物和探针，并对引物探针进行了优选，同时对RPA扩增反应条件进行了优化。
本发明中所使用的基因组模板为从肛拭子提取基因组得到。
(一)引物设计和优选
RPA技术中，引物和探针的设计不是常规的技术。本发明发明人通过查阅大量关于RPA技术的文献，对其中的引物和探针分析其序列、GC含量等，然后以肠道病毒的5’-UTR序列为目标序列分别设计引物和探针。备选引物探针见表1。
表1备选RPA引物和探针序列(均为5’-3’)
表中的PanEV-F表示上游引物，PanEV-R表示下游引物，PanEV-P表示探针。上述引物及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将各个引物和探针配制成10μmol/L，备用。
肠道病毒5’UTR序列重组质粒的构建：以柯萨奇A组6型病毒株(ATCC VR-1011AS/MK)为标准提取RNA为模板，先进行逆转录获取cDNA后，选用一对引物(F：5’-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’；R：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’)扩增出包含目的区域的产物纯化后克隆入质粒载体(pESI-T vector)，从而得到包含目的片段的重组质粒。
RPA扩增反应体系：RPA预混液(1管
nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物PanEV-F和PanEV-R各2.1μL、浓度为10μM的探针PanEV-P 0.6μL、用于RPA扩增的水补足至37.5μL)，5×104拷贝数的质粒DNA 10μL，然后加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即进行RPA扩增，38℃反应40min。
以5×104拷贝数的质粒DNA为RPA体系优化的模板，再采用上述备选的引物和探针进行RPA扩增，然后将扩增产物用Qiagen QIAquick PCR Purification Kit(购自德国凯杰公司)进行纯化，通过2％的琼脂糖电泳对产物进行分析，观察其扩增效果。
结果表明，组1扩增出的目的条带最强，扩增效率最高，组2和组3扩增出的目的条带较暗弱，且在尾部存在较强的弥散条带，为引物和探针形成二聚体。
(二)RPA扩增条件的优化
1、扩增温度的优化
将上述体系配制好以后(使用组1的探针和引物)，扩增温度分别采用36℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃进行扩增反应，反应时间40min，然后将扩增产物进行纯化，进行琼脂糖电泳观察其扩增效果。
结果如图1所示，显示在39℃扩增条带最亮，扩增效果最好。
2、扩增时间的优化
将上述体系配制好以后，扩增温度采用39℃，扩增反应时分别采用5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min和40min，然后将扩增产物进行纯化，进行琼脂糖电泳观察其扩增效果。
结果如图2所示，显示在扩增30min条带最亮，扩增效果最好。
3、检测灵敏度
分别选用5×100、5×101、5×102、5×103、5×104和5×105个拷贝包含目标序列的质粒，采用上述扩增体系，在39℃扩增30分钟，扩增产物采用免疫层析试纸条进行检测：取5μL RPA扩增产物，加入100μL试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5～15min，最后判读结果。
结果如图3显示，检测限在低至5×100个拷贝的肠道病毒基因组DNA可以被检测出来。
4、检测特异性
为了分析此方法的检测特异性，我们主要检测的标本为粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清、疱疹液，因此我们采用了常见肠道病毒亚型及具有相同定植部位或具有相似临床表现的其他病原菌对此方法进行检测特异性分析，常见肠道病毒亚型选用如下所示：柯萨奇病毒A组[CA2(ATCC，VR-1006AS/HO)、CA4(ATCC，VR-1008AS/MK)、CA5(ATCC，VR-1010PI/HO)、CA6(ATCC，VR-1011AS/MK)、CA9(ATCC，VR-1015PI/HO)、CA10(ATCC，VR-168)、CA16(ATCC，VR-1022AS/HO)]，柯萨奇病毒B组[CB2(ATCC，VR-29)、CB4(ATCC，VR-184)、CB5(ATCC，VR-1036AS/HO)、EV71(ATCC，VR-1432)]和埃可病毒组[E6(ATCC，VR-1045)、E11(ATCC，VR-41)、E18(ATCC，VR-1783)]；其他病原菌分别选取了：甲型流感病毒(ATCC，VR-95)、乙型流感病毒(ATCC，VR-823)、呼吸道合胞病毒(ATCC，VR-1540)、腺病毒(ATCC，VR-5)、轮状病毒(ATCC，VR-2018)、人双埃柯病毒(ATCC，VR-52)、巨细胞病毒(Toledu株)、人鼻病毒(ATCC，VR-1295)、大肠埃希氏杆菌(ATCC，35218)、金黄色葡萄球菌(ATCC，25923)、肺炎链球菌(ATCC，49619)、流感嗜血杆菌(ATCC，10211)、白色念珠菌(ATCC，10231)等病原体，本实验室保存上述病原体的总核酸。分别提取病毒及细菌基因组DNA或RNA，若提取核酸为RNA则需进一步逆转录获取cDNA，将基因组DNA或逆转录得到的cDNA 10μL加入上述预混好的RPA扩增体系，在39℃扩增30分钟，对扩增产物纯化后用琼脂糖电泳观察分析其扩增结果，并同时采用免疫层析试纸条对扩增产物进行检测：取5μL RPA扩增产物，加入100μL试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5～15min，最后判读结果。
逆转录合成cDNA预混反应体系：逆转录预混液A(随机引物50μM 0.5μL，dNTP混合物10mM 0.5μL，用于逆转录扩增的水补足至2.5μL)；逆转录预混液B(逆转录缓冲液2μL，逆转录酶0.5μL，RNA酶抑制剂0.25μL，用于逆转录扩增的水补足至5μL)。将2.5μL总RNA加入到逆转录预混液A中后，首先在65℃保温5min，随后冰上迅速冷却。取上一步产物5μL全部转移至逆转录预混液B中后缓慢混匀，42℃反应30min后95℃保温5min使酶失活，最后冰上放置备用；
RPA扩增反应体系：RPA预混液(1管
nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物PanEV-F和PanEV-R各2.1μL、浓度为10μM的探针PanEV-P 0.6μL、用于RPA扩增的水补足至37.5μL)，10μL逆转录反应产物或DNA。上述体系再加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即于39℃条件下进行RPA扩增反应30min，结果如图4所示。
从图4可知，基于RPA技术，应用组1的引物和探针，只有肠道病毒亚型可以被检出，其它病原体均未被检出。
(三)临床标本检测
选取177例临床样本(包括：粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液标本)，用商业化的荧光定量PCR(购自中山大学达安基因股份有限公司，广州)与本方法同时进行检测，发现荧光定量方法的检测结果与本发明所述方法的检测结果一致，检出阳性标本122例，阴性55例。
1.标本处理
采用QIAamp viral RNA mini kit试剂盒(购自德国凯杰公司)进行标本RNA快速提取：
(1)分别向粪便(黄豆大小)、肛拭子、咽拭子中加入1mL灭菌生理盐水，充分震荡摇匀；
(2)将上一步样本或脑脊液样本经5000rpm离心1min，取140μL上清加入到装有560μL AVL-carrier RNA缓冲液的离心管中，涡旋15s，混匀；
(3)室温静置10min后，在样品中加入560μL无水乙醇，涡旋15s后瞬时离心；
(4)吸取630μL步骤(3)中的溶液加入柱子中，8000rpm离心1min，将柱子装入到新的收集管中；
(5)往柱子里加入500μL AW2缓冲液，14000rpm离心3min；
(6)弃旧的收集管，将柱子放在1.5mL离心管中，加入60μL AVE缓冲液，室温放置1min后8000rpm离心1min。
2.逆转录扩增
将2.5μL RNA模板加入到逆转录预混液A后首先在65℃保温5min，随后冰上迅速冷却。将上一步产物5μL全部转移至逆转录预混液B中后缓慢混匀，42℃反应30min后95℃保温5min使酶失活，最后冰上放置备用。
3.RPA扩增
将37.25μL RPA扩增预混液(1管
nfo干粉试剂、RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物PanEV-F-1和PanEV-R-1各2.1μL、浓度为10μM的探针PanEV-P-1 0.6μL、水3.2μL)加入到上一步装有cDNA反应管中，再在各反应管中加入280mM乙酸镁2.5μL，混匀后立即进行RPA扩增，39℃反应30min。
4.试纸条检测
取5μL RPA扩增产物，加入100μL试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5～15min，最后判读结果。
177例标本的检测结果与荧光定量结果完全一致，其中阳性标本122例，阴性标本55例。
从上述实施例检测结果来看，本发明能准确地检测出临床标本中肠道病毒，检测快速、灵敏且特异，整个实验过程可以在1个小时内完成；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，且结果直接肉眼观察，实验操作简捷。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省妇幼保健院
<120> 基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒及方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-F-1
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> Biotin修饰
<400> 1
agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-R-1
<400> 2
ggatggccaa tccaatagct atatggtaac aa 32
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-P-1
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<221> modified_base
<222> (30)..(31)
<223> dSpacer修饰
<221> modified_base
<222> (45)..(45)
<223> C3 Spacer修饰
<400> 3
ggaaacacgg acacccaaag tagtcggttc gctgcagagt trccc 45
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-F-2
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> Biotin修饰
<400> 4
gtggctgcgt tggcggcctg ccyatggggc ag 32
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-R-2
<400> 5
gcagcggaac cgactacttt gggtgtccgt gtttc 35
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-P-2
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<221> modified_base
<222> (11)..(12)
<223> dSpacer修饰
<221> modified_base
<222> (43)..(43)
<223> C3 Spacer修饰
<400> 6
gctccgcagt tggattagcc gcattcaggg gccggaggac trc 43
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-F-3
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> Biotin修饰
<221> modified_base
<222> (14)..(15)
<223> i
<400> 7
tcaagcactt ctgttccccg gaccgagtat caata 35
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-R-3
<400> 8
gacacggtgy gaagagtcta ytgagctagt tgg 33
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> PanEV-P-3
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<221> modified_base
<222> (34)..(35)
<223> dSpacer修饰
<221> modified_base
<222> (51)..(51)
<223> C3 Spacer修饰
<400> 9
gtcacggtcg cccgtggggt tccrgtgact catccctgat ctacackggg g 51
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> F
<400> 10
agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc 30
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> R
<400> 11
attgtcacca taagcagcc 19
Claims (9)
1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的引物PanEV-F-1、如SEQ ID NO.2所示的引物PanEV-R-1和如SEQID NO.3所示的引物探针PanEV-P-1。
2.根据权利要求1所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括用于逆转录过程的逆转录预混液A和逆转录预混液B，用于RPA扩增的RPA扩增预混液和乙酸镁中的至少一种，以及用于RPA扩增的水、试纸条和试纸条检测缓冲液中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的用于逆转录过程的逆转录预混液A包括随机引物和dNTP混合物。
4.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的逆转录预混液B包括逆转录酶、逆转录缓冲液和RNA酶抑制剂。
5.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的RPA扩增预混液包括用于RPA扩增的酶、用于RPA扩增的缓冲液、引物PanEV-F、引物PanEV-R和探针PanEV-P。
6.根据权利要求5所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的引物和探针的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物PanEV-F 0.42μM，引物PanEV-R 0.42μM，探针PanEV-P 0.12μM。
7.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试纸条为侧流层析试纸条。
8.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测方法，其特征在于，应用权利要求1～7任一项所述的试剂盒实现，包括如下步骤：
(1)对待检测样本提取总RNA；
(2)逆转录合成cDNA预混反应体系：
逆转录预混液A：每5μL反应体系的组成如下：随机引物50μM 0.5μL，dNTP混合物10mM0.5μL，用于逆转录扩增的水补足至2.5μL；
逆转录预混液B：每10μL反应体系的组成如下：逆转录缓冲液2μL，逆转录酶0.5μL，RNA酶抑制剂0.25μL，用于逆转录扩增的水补足至5μL；
将2.5μL总RNA模板加入到逆转录预混液A中后，首先在65℃保温5min，随后冰上迅速冷却；取上一步产物5μL全部转移至逆转录预混液B中后缓慢混匀，42℃反应30min后95℃保温5min使酶失活，最后冰上放置备用；
(3)RPA扩增反应体系：
配制RPA预混液，然后将37.5μL RPA预混液与步骤(2)得到的10μL逆转录反应产物混合，再加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即于39℃条件下进行RPA扩增反应30min；
RPA预混液：1管
nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物PanEV-F和PanEV-R各2.1μL、浓度为10μM的探针PanEV-P 0.6μL、用于RPA扩增的水补足至37.5μL；
(4)试纸条检测：
取5μL RPA扩增产物，加入100μL试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5～15min，最后判读结果；
(5)结果判读：
每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；
a)若只是试纸条的对照条带显色，检测结果为阴性；
b)若试纸条的对照条带和检测条带同时显色，检测结果为阳性；
c)若试纸条的对照条带不显色，重复进行试验。
9.根据权利要求8所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测方法，其特征在于，所述的待检测样本包括粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清或疱疹液中的至少一种。
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