CN106011309A - 用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针 - Google Patents

用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针 Download PDF

Info

Publication number
CN106011309A
CN106011309A CN201610341409.9A CN201610341409A CN106011309A CN 106011309 A CN106011309 A CN 106011309A CN 201610341409 A CN201610341409 A CN 201610341409A CN 106011309 A CN106011309 A CN 106011309A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
sample
primer sets
primer
hcv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610341409.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈华
彭进
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cage Biological Engineering (shenzhen) Co Ltd
Original Assignee
Cage Biological Engineering (shenzhen) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cage Biological Engineering (shenzhen) Co Ltd filed Critical Cage Biological Engineering (shenzhen) Co Ltd
Priority to CN201610341409.9A priority Critical patent/CN106011309A/zh
Publication of CN106011309A publication Critical patent/CN106011309A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于特异性检测人丙型肝炎病毒(HCV)的引物组和/或探针。本发明还涉及包含引物组和/或探针的用于特异性检测人丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列。本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于特异性检测样品中丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用引物组和/或探针检测样品中HCV基因的方法。

Description

用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针
技术领域
本发明涉及用于特异性检测人丙型肝炎病毒(HCV)的引物组和/或探针。本发明还涉及包含引物组和/或探针的用于特异性检测人丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列。本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于特异性检测样品中丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用引物组和/或探针检测样品中HCV基因的方法。
背景技术
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎的传染源主要为急性临床型和无症状的亚临床病人、慢性病人和病毒携带者。一般病人发病前12天，其血液即有感染性，并可带毒12年以上。HCV主要经血源传播，国外30-90%输血后肝炎为丙型肝炎，我国输血后肝炎中丙型肝炎占1/3。此外还可通过其他方式如母婴垂直传播，家庭日常接触和性传播等。
输入含HCV或HCV-RNA的血浆或血液制品，一般经6-7周潜伏期后急性发病，临床表现为全身无力，胃纳差，肝区不适，1/3病人有黄疸，ALT升高，抗HCV抗体阳性。丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，临床丙型肝炎病人50%可发展为慢性肝炎。甚至部分病人会导致肝硬化及肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大。
丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，当HCV在肝细胞内复制引起肝细胞结构和功能改变或干扰肝细胞蛋白合成，可造成肝细胞变性坏死，表明HCV直接损害肝脏，对发病起一定作用。但多数学者认为细胞免疫病理反应可能起重要作用，发现丙型肝炎与乙型肝炎一样，其组织浸润细胞以CD3+为主，细胞毒T细胞（TC）特异攻击HCV感染的靶细胞，可引起肝细胞损伤。
在HCV急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105～107拷贝/ml。在HCV慢性感染者中，HCV RNA水平在不同个体之间存在很大差异，但同一名患者的血液中HCVRNA水平相对稳定。对抗-HCV阳性的HCV持续感染者，需要通过HCV RNA检测确证。只要一次病毒定性检测为阳性，即可确证HCV感染，但一次检测阴性并不能完全排除HCV感染，应重复检查。HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。
抗-HCV阳性，但反复检测HCV RNA均为阴性：可能为既往HCV感染已自行恢复，或经治疗病毒已清除；一些自身免疫缺陷病患者可能出现抗-HCV阳性，但HCV RNA始终阴性。HCVRNA阳性，但抗-HCV阴性：可能为HCV感染早期，抗-HCV尚未产生；处于严重免疫抑制状态或免疫受损（如HIV感染），或接受透析的患者，亦可在HCV RNA阳性的情况下呈抗-HCV阴性。母体的IgG型抗-HCV可以通过胎盘进入胎儿体内，因此6个月以内的婴儿抗-HCV阳性并不一定代表HCV感染。应以HCV RNA阳性作为其HCV感染的依据。
发明内容
发明要解决的技术问题
目前市场上已有的HCV检测试剂盒已不能满足临床诊断治疗的要求，主要表现在以下几个方面：
(1)灵敏度较低，低于500 IU/ml病毒载量很难检测到，然而丙型肝炎病毒核酸国家参考品要求灵敏度至少达到50IU/ml；
(2)手工操作，低重现性，非标准化的操作流程极大的影响了病人的治疗效果；
(3)低通量，手动操作时间长，结果报告不及时；
(4)因长期进行抗病毒治疗，产生耐药性，导致假阴性率不断升高。
另外《YY/T 1182-2010核酸扩增检测用试剂盒》行业标准于2012年6月1日开始实施，其中对HBV、HIV、HCV有要求，(1) 加入全程参与的内标；(2)质控品和标准品需要进行核酸提取和纯化；(3)核酸加样体积不小于20μl，总反应体积不小于40μl。
为满足临床诊断治疗要求，需要具有灵敏度高、精密度高和假阴性率低的用于检测人HCV的引物、探针以及包含所述引物和探针的试剂盒。
本发明目标在于提供能满足上述要求的用于检测人HCV的引物组、探针以及包含所述引物组和探针的试剂盒。本发明的引物组和探针可解决因HCV高突变而产生的漏检问题，并且具有较高的灵敏度及特异性。
技术方案
本发明涉及一种用于检测人丙型肝炎病毒(HCV)基因的引物组。在一个实施方案中，所述引物组包括或者是至少一种选自以下的引物组：
(1) 引物组1，其包含具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有如SEQ IDNO: 2所示的核苷酸序列的引物；或者由所述引物组成；和
(2) 引物组2，其包含具有如SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列的引物和具有如SEQ IDNO: 5所示的核苷酸序列的引物，或者由所述引物组成。
在一个实施方案中，所述引物组包括或者是至少一种选自以下的引物组：
(1) 引物组1，其包含核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的引物和核苷酸序列如SEQ IDNO: 2所示的引物；或者由所述引物组成；和
(2) 引物组2，其包含核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示的引物和核苷酸序列如SEQ IDNO: 5所示的引物，或者由所述引物组成。
在一个实施方案中，本发明的引物组包括或者是：
(1) 引物组1，其包含核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的引物和核苷酸序列如SEQ IDNO: 2所示的引物，或者由所述引物组成；和
(2) 引物组2，其包含核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示的引物和核苷酸序列如SEQ IDNO: 5所示的引物，或者由所述引物组成。
本发明还涉及一种用于检测人HCV基因的探针。在一个实施方案中，探针包括或者是至少一种选自以下的探针：
(1) 探针1，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；和
(2) 探针2，其具有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，探针包括或者是至少一种选自以下的探针：
(1) 探针1，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；和
(2) 探针2，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
在一个实施方案中，探针包括或者是：
(1) 探针1，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；和
(2) 探针2，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
在一个实施方案中，探针通过标记物标记。在一个实施方案中，所述探针的一个末端(例如5'末端或3'末端)通过报告荧光基团标记，并且探针的另一个末端(例如3'末端或5'末端)通过淬灭荧光基团标记。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 3所示的探针1的5'末端由FAM标记并且3'末端由BHQ1标记。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 6所示的探针2的5'末端由FAM标记并且3'末端由BHQ1标记。
本发明还涉及一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其含有本发明的引物组。在一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1。在又一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组2。在再一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1以及引物组2。
本发明还涉及一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其含有本发明的探针。在一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含探针1。在又一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含探针2。在再一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含探针1以及探针2。
本发明还涉及一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其含有本发明的引物组和探针。在一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1和探针1。在又一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组2和探针2。在再一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1和探针1以及引物组2和探针2。
本发明还涉及引物组在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒或微阵列中的用途。在一个实施方案中，引物组是至少一种选自以下的引物组：引物组1和引物组2。
本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒或微阵列中的用途。在一个实施方案中，引物组和探针为引物组1和探针1。在另一个实施方案中，引物组和探针为引物组2和探针2。在又一个实施方案中，引物组和探针为引物组1和探针1以及引物组2和探针2。
本发明还涉及检测样品中HCV基因的方法，所述方法包括：
(1)提取和任选纯化样品中的核酸，和
(2)使用引物组进行扩增和/或使用探针进行特异性杂交，以检测所述核酸。
在一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法包括：
(1)提取和任选纯化样品中的核酸，
(2)使用引物组对从步骤(1)中获得的核酸进行扩增，从而得到扩增产物，和
(3)使探针与扩增产物进行特异性杂交，以检测所述核酸。
在一个实施方案中，步骤(2)和步骤(3)同时进行。在一个实施方案中，检测HCV基因可为定性检测或定量检测。在另一个实施方案中，检测为定量检测。在又一个实施方案中，通过RT-PCR法来检测。在再一个实施方案中，检测为通过荧光定量RT-PCR检测。在另一个实施方案中，检测为通过一步荧光定量RT-PCR检测。
在一个实施方案中，核酸包括DNA和/或RNA，优选RNA。
在一个实施方案中，通过RT-PCR进行扩增反应。在另一个实施方案中，使用荧光定量RT-PCR法对样品中HCV基因进行定量检测。在又一个实施方案中，使用一步荧光定量RT-PCR法对样品中HCV基因进行定量检测。
在一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法所使用的引物组和/或探针包括引物组1和/或探针1。在另一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法所使用的引物组和探针包括引物组2和/或探针2。在另一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法所使用的引物组和探针包括引物组1和探针1以及引物组2和探针2。
在一个实施方案中，样品可来源于动物受试者，例如人受试者。在一个实施方案中，样品为生物学样品，例如来源于人的生物学样品，包括但不限于体液样品或组织样品。在一个实施方案中，样品可为受试者的体液，包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液、分泌液、泪液等，优选血液、血清和血浆，和更优选血液。
在一个实施方案中，样品可不来源于人受试者或者任何其它动物来源，优选为环境样品和工业样品。在又一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法可不用于诊断受试者受到HCV感染，例如可用于检测环境样品和工业样品是否受到HCV污染。
在一个实施方案中，样品经过QIAsymphony SP/AS自动化仪器平台处理以提取并纯化HCV核酸，优选HCV RNA。
引物及探针
本发明的引物组包括引物组1和/或引物组2。本发明的探针包括探针1和/或探针2。
用于检测人HCV基因的本发明引物组和探针的实例分别见表1和2。
表1 本发明所用的引物及相应的靶序列
表2 本发明所用的探针
探针编号 名称 探针序列 SEQ ID NO:
1 探针1 CCTTTCGCGACCCAACACTACTCG 3
2 探针2 CCACTATGGCTCTCCCGGGAGG 6
靶序列1对应于引物组1，靶序列2对应于引物组2。探针1可与由引物组1扩增得到的PCR产物特异性杂交。探针2可与由引物组2扩增得到的PCR产物特异性杂交。
本发明的引物和探针的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增效果或者探针的杂交效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基，例如将A替换成T，将C替换成G等。本领域技术人员清楚，所述修饰形成的引物或探针也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。在一个实施方案中，引物和探针的核苷酸序列的修饰形式为如CN103270174A中所公开的化学增强型引物。
探针的一个末端(例如5'末端或3'末端)可通过报告荧光基团标记，并且探针的另一个末端(例如3'末端或5'末端)可通过相应的淬灭荧光基团标记。一方面，SEQ ID NO: 3所示的探针1的5'末端可由FAM标记并且3'末端可由MGB或BHQ1或BHQ2标记。另一方面，SEQID NO: 6所示的探针2的5'末端可由FAM标记并且3'末端可由MGB或BHQ1或BHQ2标记。
可以使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型)，经化学方法合成本发明引物组和探针中的各个核苷酸。还可采用本领域众所周知的任何其它方法来合成寡核苷酸，例如引物组和探针。
使用从样品中提取的HCV病毒核酸作为模板，并使用前述引物组对HCV基因进行扩增反应，以获得扩增产物。扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)，其公开于以下参考文献(在此引作参考)中：Mullis等，美国专利第4,683,195号；第4,965,188号；第4,683,202号；第4,800,159 (PCR)号；Gelfand等，美国专利第5,210,015号(用“Taqman”或”Taq” [注册商标]探针进行的实时PCR)；Wittwer等，美国专利第6,174,670号；Kacian等，美国专利第5,399,491号(“NASBA”)；Lizardi,美国专利第5,854,033号；Aono等，日本专利公开第JP 4-262799号(滚环扩增)；等等。
优选使用PCR法对HCV基因进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。术语“PCR”包括该反应的衍生形式，其包括但不限于反转录PCR (RT-PCR)、实时PCR、嵌套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。优选使用荧光定量RT-PCR法、特别是一步荧光定量RT-PCR法对HCV基因进行定量检测。
样品经过提取并纯化获得HCV RNA后，可使用RT-PCR对HCV RNA进行检测。首先，通过反转录酶对HCV RNA进行反转录成cDNA。在本发明的HCV检测中，可使用各种常规的反转录酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶；禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、黄栖热菌(Thermus flavus)等嗜热微生物的热稳定性反转录酶；MMLV反转录酶的RNA酶H突变体(商品名为SuperScript 和SuperScriptII)。然后，在引物、模板cDNA和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物)，通过使退火、延伸和变性步骤的循环重复大约30次～50次(例如45次)来进行PCR。
在本发明的HCV检测中，可使用各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增，包括但不限于FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、Ex Taq (注册商标, Takara)、Z-Taq、AccuPrimeTaq DNA聚合酶和HotStarTaq Plus DNA聚合酶。优选使用HotStarTaq Plus DNA聚合酶。也可使用市售反转录酶和DNA聚合酶的混合物，例如OneStep Enzyme Mix (例如可获自德国QIAGEN公司)。在存在引物例如本发明引物组的情况下，所述酶混合物可用于在同一管中进行cDNA的合成和PCR反应，即一步RT-PCR。在存在引物和探针例如本发明引物组和探针的情况下，所述酶混合物可用于一步荧光定量RT-PCR法，即在同一管中进行cDNA的合成、PCR反应和PCR产物的检测。
基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的，本领域普通技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最佳条件。例如，可使用以下条件进行荧光定量PCR反应：50℃ 30分钟，95℃ 15分钟，95℃ 15秒，50℃ 45秒，72℃ 15秒，循环45次。
可将能够检测HCV的本发明探针与样品中的核酸例如HCV核酸或者由PCR扩增的DNA产物进行特异性杂交反应，从而实现对扩增产物的定量或定性检测。本发明的探针可通过标记物进行标记以方便光学仪器检测，标记物例如包括荧光物质和生物素中的任一种。标记物的实例包括FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、TAMRA、Dabcyl、ROX、TET、罗丹明、德克萨斯红、HEX、Cyber Green、FAM、MGB、BHQ1和BHQ2等。优选的标记物可包括但不限于FAM、MGB、BHQ1和BHQ2等。通过采用光学检测手段，观察源于这类荧光物质的荧光强度，能够以高灵敏度检测被用于荧光标记的各种荧光物质。标记物还可包括报告荧光基团和淬灭荧光基团。报告荧光基团可为例如FAM、HEX或TET；猝灭荧光基团可为例如TAMRA、MGB、BHQ1或BHQ2。
可采用Taqman技术使用本发明的引物组和探针进行PCR检测。TaqMan技术的要点是在普通PCR原有的特异性引物对基础上增加了特异性的荧光双标记探针。该探针同样与病原体核酸特异性结合，而且结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5′端和3′端分别标记不同的荧光素，如5′端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示），3′端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5′端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。当PCR反应在退火阶段时，引物对和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5′→3′外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。如上所述，PCR进行一个循环，合成了N条新链的同时，就水解了N条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线—称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈“S”型；而当标本中不含病原体，则PCR过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线（Threshold）；而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为Ct值。样本中病原体的浓度越高，Ct值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量。
样品
本发明所用的样品可以是生物来源、环境来源、医学来源或患者来源的一定量的材料。一方面，它可包括标本或培养物(例如微生物培养物)。另一方面，它也可包括但不限于生物学样品和非生物样品(例如环境样品和工业样品等)。生物学样品可包括采自受试者的材料，其包括但不限于体液样品(例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液和粘液)和组织样品(例如活组织切片等)。生物学样品可获自人受试者或其它动物。环境样品是指取自例如自然环境、生活环境、工作环境和生产环境等的样品，包括但不限于天然食物、表面物质、土壤、水。工业样品是指取自工业制品的样品，包括但不限于从加工食品和奶制品、加工设备、仪器、装置、器具、一次性用品和非一次性用品中获得的样品。这些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。
从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的，可用例如苯酚和氯仿进行RNA提取，或者使用市售RNA提取试剂进行提取。例如，可使用RNA提取试剂盒(例如RNeasy MiniKit (Qiagen))进行提取。
核酸可通过本领域众常规的纯化方法来纯化。本发明优选采用磁珠法核酸纯化技术实现病毒核酸纯化。在磁珠(纯化)法中，加入蛋白酶使病毒裂解并将病毒DNA或RNA释放出来，磁珠表面包裹有一层二氧化硅，二氧化硅在高离液剂的条件下特异吸附核酸DNA或RNA，接着通过洗涤步骤有效去除二价阳离子和蛋白质等PCR反应抑制物，最后用洗脱液(低盐)将病毒DNA或RNA从磁珠上洗脱下来，完成纯化。经过纯化的病毒DNA或RNA不含蛋白质、核酸酶和其他杂质，而且回收率高。
本发明可以采用QIAsymphony SP/AS自动化仪器平台进行核酸提取并纯化。
试剂盒
本发明涉及一种用于检测人HCV基因的试剂盒，其含有本发明的引物组或者引物组与探针的组合。本发明还涉及引物组或者引物组与探针的组合在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒中的用途。在一个实施方案中，引物组选自引物组1和引物组2。在一个实施方案中，所述引物组和探针的组合选自至少一种以下组合：引物组1和探针1的组合，和引物组2和探针2的组合。
试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括引物组和探针)。试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、探针、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)。例如，试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。例如，第一个容器可含有用于测定的酶，第二个容器含有引物组，而第三个容器含有探针。所述试剂盒还可含有适合容纳所述试剂或容器的隔室。作为一个实例，试剂盒可含有引物组、探针、PCR反应缓冲液和使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有UNG、用于质控的内标、阳性和阴性对照和/或HCV假病毒标准品等。试剂盒还可包含用于从样品制备HCV RNA的试剂。本发明试剂盒还可包含除了本发明的引物组和探针之外的其它任何引物组和/或探针，例如能够有效检测人HCV基因的引物组和/或探针。以上实例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。
微阵列
本发明涉及一种用于检测人HCV基因的微阵列，其含有本发明的引物组和/或探针。本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于检测样品中HCV基因的微阵列中的用途。在一个实施方案中，引物组选自引物组1和引物组2。在一个实施方案中，探针选自探针1和探针2。在一个实施方案中，引物组和探针的组合选自至少一种以下组合：引物组1和探针1的组合，和引物组2和探针2的组合。
微阵列是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝，所述区域或位点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠；也就是说，所述区域或位点在空间上是离散的。此外，空间上确定的杂交位点可为“可寻址的”，因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身份是已知或预先确定的(例如在其使用前是已知或预先确定的)。通常寡核苷酸或多核苷酸为单链，并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm2，更优选大于1000/cm2。微阵列技术公开于例如以下参考文献中：Schena编辑的Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000)；Southern, Current Opin. Chem. Biol., 2:404-410，1998，其全部内容通过引用结合到本文中。
有益效果
本发明提供了检测限低、假阴性率低、灵敏度高、线性范围宽以及精密度高的用于人HCV基因检测的引物组和探针、包含它们的试剂盒以及检测方法。
附图说明
图1表示ABI7300、ABI7500、RGQ和LC480四个PCR平台最低检测限的原始数据。A.RGQ仪器，其中左侧窗口为定量检测数据，右侧窗口为内标检测数据；N50为中国食品药品检定研究院HCV核酸国家参考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度为50IU/ml；NC为阴性对照，HP为强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为定量标准品。B. ABI7300仪器，其中N50和N100为中国食品药品检定研究院HCV核酸国家参考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度分别为50IU/ml和100IU/ml；NC为阴性对照，HP为强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为定量标准品。C. ABI7500仪器，其中N50和N100为中国食品药品检定研究院HCV核酸国家参考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度分别为50IU/ml和100IU/ml；NC为阴性对照，HP为强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为定量标准品。D. LC480仪器，其中N50为中国食品药品检定研究院HCV核酸国家参考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度为50IU/ml；NC为阴性对照，HP为强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为定量标准品。
图2表示本发明试剂盒通过荧光定量PCR检测HCV核酸的线性范围(1×102-5×107IU/mL)。
本发明的目的、特征及优点将结合实施例，参照附图作进一步详细阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，0989)中所述的条件，或者试剂盒生产厂家推荐的方法。
实施例
实施例1
材料
1. 试剂盒
本发明试剂盒包含以下组分：RT-PCR溶液和OneStep Enzyme Mix (购自德国QIAGEN公司)。
RT-PCR溶液包含以下组分：超纯水、OneStep RT-PCR缓冲液, 5x (450ml/500),KG、白蛋白, Rinderserum, Mol-Biol.、100mmol/L dATP、100mmol/L dCTP、100mmol/LdGTP、100mmol/L dTTP、引物组1(正向引物1和反向引物1)、探针1(探针1)、引物组2 (正向引物2和反向引物2)和探针2(探针2)。
2. 定量标准品
用HCV假病毒(HCV Armored RNA, SEQ ID NO: 9)制备。首先标定浓度（可溯源至中国食品药品检定研究院的丙型肝炎病毒RNA国家定量标准品(购自中国食品药品检定研究院，批号：GB-1307004），然后用阴性血浆稀释至合适浓度。检测4个定量标准品各3次，计算每一标准品标示浓度的对数值，以浓度的对数值为Yi，Ct均值为Xi，进行线性拟合并计算线性相关系数，线性相关系数应|r|值≥0.98。
3. HCV对照
3.1 HCV阴性对照：
市售阴性(HCV-RNA＝0 IU/mL)且外观澄清的血清或血浆。
3.2 HCV强阳性对照：
选用HCV假病毒(SEQ ID NO: 9)制备，用市售阴性血清或血浆稀释至合适浓度(HCV-RNA＝6.32×105～6.32×106IU/mL)。
3.3 HCV临界阳性对照：
选用HCV假病毒(SEQ ID NO: 9)制备，用市售阴性血清或血浆稀释至合适浓度(HCV-RNA＝6.32×103～6.32×104IU/mL)。
4. 样品制备试剂
样品制备试剂为QIAsymphony Virus/Bacteria Midi Kit (购自德国QIAGEN，批号148045667)，其包含下列成分：PK (Enzyme Rack Virus (购自QIAGEN GmbH))、ReagentRack Virus(购自QIAGEN GmbH，包含MBS、QSL2、QSB1、QSW1、QSW5、QSW2)和AVE (40ml/20ml/2ml)。
方法
1. HCV RNA样品的制备
按照QIAsymphony SP/AS自动化仪器操作说明书进行操作，利用样品制备试剂QIAsymphony Virus/Bacteria Midi Kit按照试剂说明书进行核酸自动化提取，并按照下表用量完成自动化上样。
表3
PCR试剂 1个测试的用量(μl)
RT-PCR溶液 13
OneStep Enzyme Mix 2
样品 35
2. 荧光定量RT-PCR反应(一步法)
在使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR反应中，使用以下引物和探针：
正向引物1: ACCCTATCAGGCAGTACCACAAG
反向引物1: CGTGCCCCCGCAAGA
探针1: FAM-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCG-BHQ1
正向引物2: GAGTGTCGTGCAGCCTCCAGG
反向引物2: AATTCCGGTGTACTCACCGG
探针2: FAM-CCACTATGGCTCTCCCGGGAGG-BHQ1。
反应条件如下:50℃ 30分钟，95℃ 15分钟，95℃ 15秒，50℃ 45秒，72℃ 15秒，循环45次。反应体系50μl，其中引物终浓度0.4μM，探针终浓度0.1μM，dNTP终浓度0.3mM，样品35μl，酶混合物2μl。
实施例2 —本发明试剂盒的最低检测限(LOD)
使用实施例1中所述的定量标准品，用阴性血浆稀释至50IU/ml (IU/ml表示每毫升所含病毒的量)。通过实施例1中所述的方法制备标准品的HCV RNA。使用本发明试剂盒，通过荧光定量RT-PCR反应对每个浓度梯度重复检测25次。
ABI7300、ABI7500、RGQ和LC480四个PCR平台检测原始数据见图1（仅示第1批），结果统计见下表4。
表4
结果表明本发明试剂盒最低检测限可以达到50IU/ml。目前国内几家优秀体外诊断试剂生产企业HCV试剂盒的灵敏度均较低，为250 IU/ml~1000 IU/ml，本发明试剂盒明显占优。
实施例3 —本发明试剂盒的精密度（重复性）
取1份HCV临床阳性样本，用定量标准品标定浓度后，梯度稀释成5×102IU/ml和5×104IU/ml浓度的2个样本。通过实施例1中所述的方法制备临床阳性样本的HCV RNA，用3个批次的本发明试剂盒，通过荧光定量RT-PCR反应对每个样本重复检测40次，统计每个样本定量结果均值、标准差，并计算变异系数CV。
通过以下标准判定精密度：以同一浓度样品的定量检测结果的对数值计算变异系数(CV，%)(CV = STD/平均值x100%，即分别计算定量检测结果对数值的标准偏差和平均值，然后用标准偏差除以平均值得到变异系数)，同一批次试剂盒的检测结果用于计算批内精密度。要求CV小于5%。
结果见下表5。
表5
3批试剂盒检测了5×102IU/ml和5×104IU/ml两个浓度样本，定量结果变异系数CV<5%，显示试剂盒精密度较好。
实施例4 —本发明试剂盒的定量准确性和线性
取定量标准品，用阴性血浆梯度稀释至106IU/ml、105IU/ml、104IU/ml、103IU/ml和102IU/ml浓度。通过实施例1中所述的方法制备定量标准品的HCV RNA，用本发明试剂盒通过荧光定量RT-PCR反应对每个浓度重复检测3次。结果见下表6。
表6
各样本定量检测浓度均在验收标准范围（样本实际浓度±0.5log10值范围）内，提示试剂盒定量检测准确性好。
各浓度样本理论浓度log10对数值与PCR Ct值之间呈现良好的线性关系，线性拟合的相关系数大于0.99 (见图2)。试剂盒检测线性范围为1×102~5×107 IU/mL。
实施例5 —本发明试剂盒的特异性
按照实施例1，用本发明的试剂盒检测了HCV核酸国家参考品(购自中国食品药品检定研究院，批号：GB-1307004)中的特异性参考品、HBV、HIV-1、EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、金黄色葡萄球菌样本以及健康献血员血浆样本，检测结果均显示HCV RNA=0 IU/ml（结果未显示）。这表明本发明试剂盒无交叉反应，特异性较好。
实施例6 —本发明试剂盒的敏感性
按照实施例1，用本发明的试剂盒检测了HCV核酸国家参考品(购自中国食品药品检定研究院，批号：GB-1307004)中的阳性参考品和NIBSC的用于核酸扩增技术的HCV RNA基因型组(购自NIBSC， code:08/264) 1、2、3、4、5和6基因型样本，所有样本检测结果为HCV RNA>0IU/ mL（结果未显示），即HCV1-6基因型样本均能被本发明试剂盒成功检测，显示试剂盒具有良好的敏感性。
本领域技术人员应该明白，本文所述发明除明确阐述的内容外，还容允变化和修改，特别是等同的变化和修改。应该理解，所有这样的变化和修改均落入本发明，特别是权利要求中所限定的保护范围内。

Claims (10)

1. 一种用于检测人丙型肝炎病毒HCV基因的引物组，所述引物组包括至少一种选自以下的引物组：
(1) 引物组1，其包含具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的引物；和
(2) 引物组2，其包含具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的引物。
2. 一种用于检测人HCV基因的探针，所述探针包括至少一种选自以下的探针：
(1) 探针1，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；和
(2) 探针2，其具有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列，
优选其中所述探针通过标记物来标记。
3.权利要求2的探针，其中所述探针的一个末端例如5'末端通过报告荧光基团标记，并且探针的另一个末端例如3'末端通过淬灭荧光基团标记。
4.权利要求3的探针，其中所述报告荧光基团为FAM，并且所述淬灭荧光基团为MGB或BHQ1或BHQ2。
5.一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其包含权利要求1的引物组，或权利要求2-4中任一项的探针。
6.一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其包含权利要求1的引物组，和权利要求2-4中任一项的探针。
7.权利要求1的引物组在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒或微阵列中的用途。
8.权利要求1的引物组和权利要求2-4中任一项的探针在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒或微阵列中的用途。
9.权利要求7或8的用途，其中所述样品选自生物学样品、环境样品和工业样品，优选其中所述样品为体液样品或组织样品，和更优选所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、分泌液和泪液。
10. 检测样品中HCV基因的方法，所述方法包括：
(1)提取和任选纯化样品中的核酸，和
(2)使用权利要求1的引物组进行扩增和/或使用权利要求2-4中任一项的探针进行特异性杂交，以检测所述核酸，
其中所述方法不用于诊断受试者受到HCV感染，
优选其中所述核酸为RNA，并且
优选所述检测是RT-PCR检测，更优选荧光定量RT-PCR检测。
CN201610341409.9A 2016-05-20 2016-05-20 用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针 Pending CN106011309A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610341409.9A CN106011309A (zh) 2016-05-20 2016-05-20 用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610341409.9A CN106011309A (zh) 2016-05-20 2016-05-20 用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106011309A true CN106011309A (zh) 2016-10-12

Family

ID=57096462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610341409.9A Pending CN106011309A (zh) 2016-05-20 2016-05-20 用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106011309A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018196975A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 The University Of Sheffield Probe
WO2020160502A1 (en) * 2019-01-31 2020-08-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for detecting transfusion-transmitted pathogens

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268575A (zh) * 1999-02-03 2000-10-04 奥索临床诊断有限公司 有效的多重检测丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺损病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268575A (zh) * 1999-02-03 2000-10-04 奥索临床诊断有限公司 有效的多重检测丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺损病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CATHERINE A. LAZARO等: "Hepatitis C Virus Replication in Transfected and Serum-Infected Cultured Human Fetal Hepatocytes", 《THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY》 *
DAVIDE GIBELLINI等: "Simultaneous detection of HCV and HIV-1 by SYBR Green real time multiplex RT-PCR technique in plasma samples", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *
ELISA DE CRIGNIS等: "HIV-1 and HCV detection in dried blood spots by SYBR Green multiplex real-time RT-PCR", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018196975A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 The University Of Sheffield Probe
WO2020160502A1 (en) * 2019-01-31 2020-08-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for detecting transfusion-transmitted pathogens
US20220119898A1 (en) * 2019-01-31 2022-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Methods and compositions for detecting transfusion-transmitted pathogens

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen-Fu et al. Detection and identification of vaccine-related polioviruses by the polymerase chain reaction
CN110184390A (zh) 用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重fq-pcr检测试剂盒
CN103045755B (zh) 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒
CN111719016A (zh) 检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用
CN103602757B (zh) 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用
US20240117451A1 (en) Spike-in reference standard for use in detecting sample target from dna or rna organism
CN105420410B (zh) 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法
CN108034764A (zh) 多重pcr检测柯萨奇病毒、肠道病毒71型和肠道病毒通用型用引物探针组
CN103045754B (zh) 一步法检测z/s亚型埃博拉病毒的实时荧光定量rt‑pcr方法及其试剂盒
CN109517927A (zh) 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
CN107557493A (zh) 一种肠道病毒分型检测试剂盒
CN105483283B (zh) 丙型肝炎病毒hcv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN109196124A (zh) 同时检测及定量分析四种血源性病毒的多重Taqman探针qPCR的试剂盒及方法
CN110938709A (zh) 基于重组酶聚合酶扩增技术的肠道病毒可视化核酸检测试剂盒及方法
CN115873993B (zh) 一种检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒及其应用
CN102559930A (zh) 一种荧光定量rt-pcr检测丙型肝炎病毒的试剂盒
CN109439800B (zh) 检测hiv-1基因pr区和rt区基因突变的试剂盒及方法
CN103966356A (zh) 人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量pcr检测试剂盒
TWI377255B (en) Nucleic acid detection
CN104878126A (zh) 一种柯萨奇病毒a6型核酸的检测试剂盒及检测方法
CN106011309A (zh) 用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针
CN114214455A (zh) 乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统
WO2011074181A1 (ja) 複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスの網羅的な検出方法、ウイルス検出用プライマーセット、マイクロアレイ及びウイルス検出用キット
CN111647686B (zh) 肠道病毒ev71、ca16、ev通用型核酸检测试剂
CN104611420A (zh) 一种结核菌检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161012