CN112322796A - 一种检测柯萨奇病毒a组6型核酸的可视化试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测柯萨奇病毒a组6型核酸的可视化试剂盒及应用 Download PDF

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CN112322796A CN202011437509.4A CN202011437509A CN112322796A CN 112322796 A CN112322796 A CN 112322796A CN 202011437509 A CN202011437509 A CN 202011437509A CN 112322796 A CN112322796 A CN 112322796A
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rpa
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谢佳
杨笑涵
段磊
陈柯艺
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詹文丽
张畅斌
赵宏宇
魏梦汝
汤媛
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

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Abstract

本发明公开了一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒包括如SEQ ID NO.1～3所示的引物和探针。本发明提供的方法能实现一步法柯萨奇病毒A组6型的快速准确检测；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，结果可通过一次性防污染核酸检测装置直接肉眼观察，具有操作简便快捷，防止污染，检测灵敏度高等优点，为柯萨奇病毒A组6型现场快速检测提供了一种有效方法。

Description

一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒及应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，特别涉及一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒及应用。
背景技术
手足口病(Hand、foot、and mouth disease，HFMD)是一种主要由肠道病毒(Enterovirus，EV)所引起的常见儿童病毒传染性疾病。自HFMD在1957年首次报道以来，已在全球多个地区引起大规模爆发。在中国，HFMD亦是儿童最常见的传染病之一。我国于2008年将HFMD纳入丙类法定传染病，至2019年为止共报道了约1849万例HFMD，死亡人数约为3600例，且其发病人数连续10年居丙类传染病之首，HFMD已成为严重危害儿童健康的急性传染病之一。HFMD的主要临床表现为发热和/或手、足、口腔、臀部等部位皮疹，患者可在一周内痊愈，少数患者可在发病1-5天左右出现无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、心肌炎和神经源性肺水肿等严重并发症，甚至死亡。目前，已发现100多种EV血清型，其中柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A，CVA)6、10、16和肠道病毒71型(Enterovirus A71,EV-A71)被认为是造成HFMD的主要病原体。自2008年首次报道由CVA-6所引起的HFMD大爆发以来，CVA-6在HFMD中的检出率呈逐年上升趋势，甚至已取代CVA-16与EV-A71成为造成HFMD的主要流行株。目前，尚针对CVA-6感染的特异性抗病毒药物，且唯一的商业化EV-A71疫苗不能预防CVA-6感染。因此，早诊断早治疗是减少CVA-6感染所致重症及控制HMFD流行的重要手段。
目前对于CVA-6感染的实验室检测方法主要包括病毒分离培养、血清学和分子生物学等方法。病毒分离培养是诊断CVA-6感染的“金标准”，常用方法有细胞培养和乳鼠培养，通过采集患者粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液或疱疹液等制成悬液后接种于敏感细胞中进行培养，但此方法灵敏度低、培养时间长、对技术人员要求过高等缺点，限制其在临床上的应用，无法满足对疾病的早期诊断及病毒流行期大规模使用。常用的血清型检测方法有酶联免疫吸附试验、中和抗体检测、补体结合试验等，通过对单份血或急性期和恢复期双份血样本进行抗体检测从而做出诊断。该方法具有操作简便、对实验室和技术人员对要求不高等优点，适合在基层实验室开展，但因CVA-6血清型与其他血清型的EV之间由交叉反应使其临床运用价值有限，且机体产生抗体需要一定时间，不利于疾病的早期诊断。分子生物学方法是目前诊断CVA-6感染的最主要检测方法，可根据病毒衣壳蛋白VP1基因序列保守区域设计特异性引物及探针对CVA-6进行分型检测。相对于传统的培养法和血清学方法，分子生物学方法具有灵敏度高、特异性好和检测时间短等优点，目前已有少数的商业化荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)已投入临床使用。但该方法的检测需要精密的温控设备和专业的实验室及相关的技术人员，这限制了其在现场快速检测中的运用，因此，仍需一种更为快速、灵敏、简便且不依赖于精密仪器新型检测方法，满足在不发达地区及疾病爆发现场对CVA-6快速检测的需求。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)技术是一种新型恒温扩增技术，该技术可以在25～42℃的恒温条件下实现核酸的快速扩增，极大的降低了普通PCR对大型设备的依赖，使现场快速检测成为可能。RPA技术自2006首次报道以来，吸引了众多专家与学者的注意，并在多个领域得到成功运用。目前，根据产物分析方式的不同可以将RPA分为探针法RPA和侧流层析试纸条RPA。探针法RPA是采用实时荧光监测装置(如荧光定量PCR仪等)收集荧光信号的方式来判断结果。侧流层析试纸条RPA利用基于“夹心法”的试纸条对扩增产物进行检测，用肉眼即可判断结果。相比于前者，侧流层析试纸条RPA不需要复杂的仪器设备，对操作人员要求不高，在现场快速检测中具有无法比拟的优势。因此，侧流层析试纸条RPA更适合运用在条件简陋的偏远地区及现场检测。目前，侧流层析试纸条RPA对RNA的检测主要是先将RNA逆转录为cDNA后，再以cDNA为模板进行RPA扩增，中间需要进行开管操作，操作过程繁琐及实验时间较长。因此，有必要研究一种更为快速、易于操作侧流层析试纸条RPA检测方法用于满足柯萨奇病毒A组6型快速检测的需求。
发明内容
本申请的首要目的在于克服现有技术的缺陷与不足，将逆转录与RPA扩增步骤整合成一步完成，再结合侧流层析试纸条目视化检测，提供一种快速、简便且准确性高的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒。
本申请的另一目的在于提供上述可视化试剂盒的应用。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，包括引物RT-RPA-F-1、引物RT-RPA-R-1和探针RT-RPA-P-1；
引物RT-RPA-F-1：5’-Biotin-GGAGTTGTAGAGGTRAAGGACTCGGGYACTA-3’；
引物RT-RPA-R-1：5’-TCCGGCTTAGGGGCYCCTGGTGGYACATACAT-3’；
探针RT-RPA-P-1：
5’-FAM-AGGTTGGACACAAAAGTGAACTCRGCATCAA/idSp/GCGCATGTATGTTGA-C3Spacer-3’。
所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒还包括MMLV逆转录酶、
Figure BDA0002828975020000021
nfo试剂、水、一次性防污染核酸检测装置中的至少一种。
所述的
Figure BDA0002828975020000022
nfo试剂包括用于RPA扩增的酶、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。
所述的用于RPA扩增的酶包括能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。
所述的一次性防污染核酸检测装置包括一体化检测装置、用于核酸检测的侧流层析试纸条和装有检测缓冲液的滤泡。
所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒包含预混液，预混液中的主要成分为引物RT-RPA-F、引物RT-RPA-R和探针RT-RPA-P，引物RT-RPA-F、引物RT-RPA-R和探针RT-RPA-P按摩尔比7：7：2配比混合。
所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物RT-RPA-F 0.42μM，引物RT-RPA-R 0.42μM，探针RT-RPA-P 0.12μM。
所述的水优选为双蒸水或超纯水。
上述可视化试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)对待检测样本提取总RNA；
(2)配制RT-RPA扩增反应体系，每50μL反应体系的组成如下：MMLV逆转录酶100U、1管
Figure BDA0002828975020000023
nfo干粉试剂、用于RT-RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物RT-RPA-F和RT-RPA-R各2.1μL、浓度为10μM的探针RT-RPA-P 0.6μL、总RNA3μL，用于RPA扩增的水补足至47.5μL；
(3)加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即于37～42℃条件下进行RT-RPA扩增反应5～40min；
(4)检测：将经过扩增的PCR反应管放入一次性核酸检测装置，再合上检测装置，等待5～15min，最后判读结果；
(5)结果判读：
每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；
a)若只是试纸条的对照(Control)条带显色，检测结果为阴性；
b)若试纸条的对照(Control)条带和检测条(Test)带同时显色，检测结果为阳性。
c)若试纸条的对照(Control)条带不显色，重复进行试验。
步骤(1)中所述的待检测样本包括粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清和疱疹液中的至少一种。
步骤(3)中所述的RT-RPA扩增反应的条件优选为温度是37℃，时间为35min。
所述的应用是在非诊断目的中进行应用，如实验研究领域中。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明通过引物和探针的设计、优化，采用RPA等温扩增技术并将逆转录过程与DNA扩增过程相整合，对柯萨奇病毒A组6型的检测时间快速，灵敏度高，不需要特殊仪器设备。
(2)本发明的检测结果运用一次性防污染核酸检测装置，该装置采用物理封闭的环境中试纸条显色的方法，具有操作简便快捷，防止污染，检测灵敏度高等优点，检测限在低至1×101个拷贝的柯萨奇病毒A组6型核酸均可以被检测出来。
附图说明
图1是RT-RPA在不同温度下的扩增效果图；其中，BC为空白对照。
图2是RT-RPA在不同时间下的扩增效果图；其中，BC为空白对照。
图3是RT-RPA扩增灵敏性的检测结果图；其中，1～7分别对应的RNA拷贝数为：1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106，BC为空白对照。
图4是RT-RPA扩增特异性的检测结果图；其中，泳道1为CVA-2、泳道2为CVA-4、泳道3为CVA-5、泳道4为CVA-9、泳道5为CVA-10、泳道6为CVA-16、泳道7为EV-A71、泳道8为CVB-2、泳道9为CVB-3、泳道10为E-3、泳道11为E-11、泳道12为E-18、泳道13为阳性对照、BC为空白对照。
图5是一次性防污染检测试剂盒检测结果示意图；P为阳性对照，N为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本发明利用RT-RPA逆转录等温扩增技术结合免疫层析技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对CVA-6基因组序列进行分析，设计出了用于RPA扩增的特异性引物和探针，并对引物探针进行了优选，同时对RPA扩增反应条件进行了优化。
本发明中所使用的基因组模板为从肛拭子提取基因组得到。
(一)引物设计和优选
RPA技术中，引物和探针的选择将影响到灵敏度和可靠性。本发明发明人通过查阅大量关于RPA技术的文献，对其中的引物和探针分析其序列、GC含量等，然后以柯萨奇病毒A组6型的VP1序列为目标序列分别设计引物和探针。备选引物探针见表1。
表1备选RPA引物和探针序列(均为5’-3’)
Figure BDA0002828975020000031
表中的RT-RPA-F表示上游引物，RT-RPA-R表示下游引物，RT-RPA-P表示探针。上述引物及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将各个引物和探针配制成10μmol/L，备用。
柯萨奇病毒A组6型VP1序列RNA标准品的制备的合成：以柯萨奇A组6型病毒株(ATCC，VR-1011AS/MK)为标准提取RNA为模板，先进行逆转录获取cDNA后，选用一对引物(F：5’-CTTCGTAGTGCCACCAGATA-3’；R：5’-GTGGCGAGATGTCGGTTTA-3’)扩增出包含目的区域的产物纯化后克隆入质粒载体(pGEM-T vector)，从而得到包含目的片段的重组质粒。质粒经酶切线性化后，体外转录合成及纯化后获得包含全部VP1基因的RNA标准品。
RT-RPA扩增反应体系：RNA3μL、0.5μL MMLV逆转录酶(200U/μL)、1管
Figure BDA0002828975020000032
nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物RT-RPA-F和RT-RPA-R各2.1μL、浓度为10μM的探针RT-RPA-P 0.6μL、用于RT-RPA扩增的水补足至47.5μL，然后加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即进行RT-RPA扩增，37℃反应35min。
以1×105拷贝数的RNA标准品为RPA体系优化的模板，再采用上述备选的引物和探针进行RPA扩增，然后将扩增产物用免疫层析试纸条进行检测，观察其扩增效果。
结果表明，组1扩增出的目的条带最强，扩增效率最高，组2和组3扩增出的目的条带较暗弱。
(二)RPA扩增条件的优化
1、扩增温度的优化
将上述体系配制好以后(使用组1的探针和引物)，扩增温度分别采用20℃、30℃、35℃、37℃、40℃和42℃进行扩增反应，反应时间30min，然后用试纸条检测其扩增效果。
结果如图1所示，显示在37℃扩增条带最亮，扩增效果最好。
2、扩增时间的优化
将上述体系配制好以后，扩增温度采用37℃，扩增反应时分别采用5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min和40min，然后用试纸条检测其扩增效果。
结果如图2所示，显示在扩增35min条带最亮，扩增效果最好。
3、检测灵敏度
分别选用1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105和1×106个拷贝包含目标序列的RNA标准品，采用上述扩增体系，在37℃扩增35分钟，用试纸条检测其扩增效果。
结果如图3显示，检测限在低至1×101个拷贝的柯萨奇病毒A组6型基因组RNA可以被检测出来。
4、检测特异性
为了分析此方法的检测特异性，我们主要检测的标本为肛拭子，因此我们采用了除柯萨奇病毒A组6型以外的常见肠道病毒亚型及具有相同定植部位或具有相似临床表现的其他病原菌对此方法进行检测特异性分析，常见肠道病毒亚型选用如下所示：柯萨奇病毒A组[CVA-2(ATCC，VR-1006AS/HO)、CVA-4(ATCC，VR-1008AS/MK)、CVA-5(ATCC，VR-1010PI/HO)、CVA-9(ATCC，VR-1015PI/HO)、CVA-10(ATCC，VR-168)、CVA-16(ATCC，VR-1022AS/HO)]，柯萨奇病毒B组[CVB-2(ATCC，VR-29)、CVB-3(ATCC，VR-30)、EV-A71(ATCC，VR-1432)]和埃可病毒组[E-3(ATCC，VR-1040)、E-11(ATCC，VR-41)、E-18(ATCC，VR-1783)]；其他病原菌分别选取了：腺病毒(ATCC，VR-5)、轮状病毒(ATCC，VR-2018)和诺如病毒(ATCC，VR-3235SD)等病原体，本实验室保存上述病原体的总核酸。分别提取病毒基因组DNA或RNA，将基因组DNA或RNA3μL加入上述RT-RPA扩增体系，在37℃扩增35分钟，采用试纸条对扩增产物进行检测，最后判读结果。
基于RPA技术，应用组1的引物和探针，只有柯萨奇病毒A组6型可以被检出，其它肠道病毒亚型(图4)及其他非肠道病毒病原体均未被检出。
(三)临床标本检测
选取142例临床肛拭子样本，用商业化的荧光定量PCR(购自苏州天隆生物科技有限公司，苏州)与本方法同时进行检测，发现荧光定量方法的检测结果与本发明所述方法的检测结果一致，共检出阳性标本81例，阴性61例。
1.标本处理
采用核酸提取试剂盒(购自苏州天隆生物科技有限公司)进行标本RNA快速提取：
(1)向肛拭子中加入1mL灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子；
(2)在预封装好的试剂盒中分别加入20μL蛋白酶K溶液和200μL上述样本；
(3)采用核酸提取仪进行自动化提取。
2.RT-RPA扩增体系配置
将3μL RNA模板、0.5μL MMLV逆转录酶(200U/μL)、1管
Figure BDA0002828975020000041
nfo干粉试剂、用于RT-RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物PanEV-F和PanEV-R各2.1μL、浓度为10μM的探针PanEV-P0.6μL、用于RT-RPA扩增的水补足至47.5μL。
3.RT-RPA扩增
在各反应管中加入280mM乙酸镁2.5μL，混匀后立即进行RT-RPA扩增，37℃反应35min。
4.结果检测
将经过扩增的PCR反应管放入一次性防污染核酸检测装置，再合上检测装置，等待5～15min，最后判读结果。
142例标本的检测结果与荧光定量结果完全一致，其中阳性标本81例，阴性标本61例。其中一次性防污染检测试剂盒检测结果示意图如图5所示。
从上述实施例检测结果来看，本发明能准确地检测出临床标本中CVA-6，检测快速、灵敏且特异，整个实验过程可以在1个小时内完成；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，且结果直接肉眼观察，实验操作简捷。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省妇幼保健院
<120> 一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒及应用
<160> 11
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物RT-RPA-F-1
<220>
<222> (1)..(1)
<223> 5’端Biotin修饰
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ggagttgtagaggtraaggactcgggyact a 31
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<222> (46)..(46)
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cttcgtagtgccaccagata 20
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<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> 引物R
<400> 11
gtggcgagatgtcggttta 19

Claims (10)

1.一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示的引物RT-RPA-F-1、如SEQ ID NO.2所示的引物RT-RPA-R-1和如SEQ ID NO.3所示的引物探针RT-RPA-P-1。
2.根据权利要求1所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：还包括MMLV逆转录酶、
Figure FDA0002828975010000011
nfo试剂、水和一次性防污染核酸检测装置中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：所述的
Figure FDA0002828975010000012
nfo试剂包括用于RPA扩增的酶、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：
所述的用于RPA扩增的酶包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶；
所述的用于RT-RPA扩增的水为双蒸水或超纯水。
5.根据权利要求2所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：所述的一次性防污染核酸检测装置包括一体化检测装置、用于核酸检测的侧流层析试纸条和装有检测缓冲液的滤泡。
6.根据权利要求1所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：所述的柯萨奇病毒A组6型可视化核酸检测试剂盒包含预混液，预混液包含引物RT-RPA-F、引物RT-RPA-R和探针RT-RPA-P；引物RT-RPA-F、引物RT-RPA-R和探针RT-RPA-P按摩尔比7：7：2配比混合。
7.根据权利要求6所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于，所述的引物和探针的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物RT-RPA-F 0.42μM，引物RT-RPA-R 0.42μM，探针RT-RPA-P 0.12μM。
8.权利要求1～7任一项所述的可视化试剂盒的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)对待检测样本提取总RNA；
(2)配制RT-RPA扩增反应体系，每50μL反应体系的组成如下：0.5μL MMLV逆转录酶100U/μL、1管
Figure FDA0002828975010000013
nfo干粉试剂、用于RT-RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物RT-RPA-F和RT-RPA-R各2.1μL、浓度为10μM的探针RT-RPA-P 0.6μL、总RNA 3μL，用于RPA扩增的水补足至47.5μL；
(3)加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即于37～42℃条件下进行RT-RPA扩增反应5～40min；
(4)检测：将经过扩增的PCR反应管放入一次性核酸检测装置，再合上检测装置，等待5～15min，最后判读结果；
(5)结果判读：
每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；
a)若只是试纸条的对照条带显色，检测结果为阴性；
b)若试纸条的对照条带和检测条带同时显色，检测结果为阳性；
c)若试纸条的对照条带不显色，重复进行试验。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的待检测样本包括粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清或疱疹液中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤(3)中所述的RT-RPA扩增反应的条件为温度是37℃，时间是35min。
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