CN105441588A - 登革热ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型rt-pcr一步mix检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

登革热ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型rt-pcr一步mix检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明适用于病毒检测试剂盒技术领域，提供了一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物和基因探针，该检测方法使用登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒进行检测。本发明登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法与现有技术比较，能够一步同时实现登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的检测，且具有灵敏度高、特异性强、周期短、准确度高等优点。

Description

登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。
登革热病毒是小型黄病毒，属于黄热病毒属，能引起登革热急性传染病，通常由在白天叮咬人的埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，登革热病毒感染人类不仅可引起登革热(Denguefever，DF)，还可引起登革出血热(Denguehemorrhagicfever。DHF)和登草休克综合症(Dengueshocksyndrome，DSS)，可导致30-40％的患者死亡。登革病毒在血清学上根据E蛋白抗原性不同分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。初次感染产生的型特异性抗体不仅对其他型别的登革病毒没有交叉免疫保护作用，甚至在异型病毒二次感染时还可能增强病毒的感染，导致更为严重的DHF/DSS。世界各国曾多次造成大规模暴发性登革热病毒疫情；仅2014年相关统计，马来西亚登革热病例已累计超六万例；斯里兰卡今年共确诊近三万例；巴西今年共确诊七万多例，中国广东省三万多例。
目前，确诊登革热病毒感染的实验室检测方法通常包括分离登革病毒、检测病毒的核酸、抗原或抗体或几种检测方法的联合使用。具体的，
1.病毒分离：经细胞培养分离病毒，需要生物安全二级(BSL-2)实验室及必要的仪器设备，在标本运输过程中保持低温(冷冻或冷藏)对于病毒分离非常重要。将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21、Vero)进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，需要数天，不适于快速诊断。
2.核酸检测：多种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法可用于登革病毒核酸检测，包括一步法RT-PCR、实时荧光RT-PCR或套式RT-PCR等方法等。核酸检测可在1-2天内鉴别病毒RNA。在病人标本中检出病毒核酸，可确诊且能分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作。阴性结果不能排除登革热诊断，需采集第二份标本(发病5天后)开展血清学检测，进行确诊。
3.抗原检测：NS1抗原检测可采用ELISA方法或快速检测试剂，可在几十分钟到数小时完成检测，适于现场使用，是登革热急性期诊断的重要手段，在发病后1天即可检出，也有报道在发病后18天仍可在血标本中检出。目前该方法尚不能分型。由于NS1抗原检测方法的特异性，也可用于黄病毒感染的鉴别诊断。基于我国登革热流行的特点，国家卫生计生委颁发的《登革热诊疗指南(2014年第2版)》将标本中检出NS1抗原作为确诊病毒感染依据，可用于早期诊断。阴性结果不能排除登革热诊断，需采集第二份标本(发病5天后)开展血清学检测，进行确诊。
4.IgM抗体检测：用于IgM抗体检测的捕获法ELISA(MAC-ELISA)是最常用的检测方法，也有多种商业化快检试剂可用于IgM抗体检测，均不能用于血清分型检测。目前检测试剂主要是检测病毒包膜蛋白特异性抗体，主要缺陷为与其他黄病毒存在交叉反应。标本中IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不能确诊。一些登革病毒再次感染者，血标本中IgM抗体滴度底，甚至不能检出，影响IgM抗体诊断精确性。
5.IgG抗体检测：可采用ELISA、免疫荧光(IFA)、免疫层析等方法检测。登革病毒IgG抗体与其他黄病毒有交叉反应。IgG抗体检测可以用来鉴定首次感染和再次感染，如果急性期标本IgG抗体阴性，恢复期阳转，则可确定为首次感染；如果患者恢复期血标本IgG抗体滴度较急性期(两份标本间隔应不少于7天)呈4倍及以上升高可认为是再次感染。采集第二份标本进行确诊对于登革热防控具有重要意义，尤其是非流行区。
6.中和抗体检测：空斑减少中和实验(PlaqueReductionandNeutralizationTest，PRNT)和微量中和实验可用来检测血清中的中和抗体，是最特异的血清学检测方法，可以分型。需要生物安全二级(BSL-2)实验室及必要的仪器设备，耗时长，需要数天，不适于快速诊断。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。
采用上述方法分离到登革病毒可以确诊，然而，其耗时长，需要数天，不适于快速诊断。登革病毒感染后，潜伏期为3-14天，通常4-7天，潜伏期内采集的患者标本尚不能检出登革病毒或相应的机体免疫反应，因此潜伏期内无法通过免疫学方法进行早期筛查和疫情的快速诊断。此外，现有的核酸检测方法存在无法一管多检直接分型，需要使用者按照一定配方配制反应液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，旨在解决现有登革热检测方法耗时、无法实现早期筛查和快速诊断、且不能一管同时实现登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型检测的问题。
本发明的另一目的在于提供一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法。
本发明是这样实现的，一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，包括RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物和基因探针；
所述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物包括：
登革热Ⅰ型上游引物：5’-GTCTGAGGGAATCTT-3’；
登革热Ⅰ型下游引物：5’-CAGCCTTTCGACGCC-3’；
登革热Ⅱ型上游引物：5’-GTYACAAGGAGTGGA-3’；
登革热Ⅱ型下游引物：5’-GAGGTCCATGATGGT-3’；
登革热Ⅲ型上游引物：5’-GTGCACACAGGAGATC-3’；
登革热Ⅲ型下游引物：5’-GATGCCTGAGGTGTTAT-3’；
登革热Ⅳ型上游引物：5’-GCTATTGAAGTCAGG-3’；
登革热Ⅳ型下游引物：5’-TAGTCCAATATGCCAC-3’；
所述基因探针包括：
登革热Ⅰ型基因探针：5’-CAAATTTAGCCGAGAGAGTTCTCG-3’；
登革热Ⅱ型基因探针：5’-TGTCATCTTCGATCTCTGGATTGT-3’；
登革热Ⅲ型基因探针：5’-CTCCCTGCGTTTCATTTCCCACC-3’；
登革热Ⅳ型基因探针：5’-CGCCTCCCATTATTGGCGG-3’。
一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法，该方法使用上述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
样本RNA提取；
RT-PCR一步法检测；
结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：20-40S；72℃：1-2min；45循环。
本发明提供的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法，运用登革热病毒(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)RT-PCR反应液MIX一步法检测试剂盒能同时检测登革热的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型，与细胞培养法相比具有快速、灵敏、安全和方便等优点，可应用于登革热病毒的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型的早期筛查和环境监控检测。此外，本发明具有操作简单、安全、快速、灵敏和方便等优点。
附图说明
图1是实时荧光定量PCR扩增曲线示意图；
图2是本发明实施例提供的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法示意图；
图3是本发明实施例提供的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法阳性结果和阴性结果扩增图谱示意图；
图4是本发明实施例1提供的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测结果扩增图谱示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中，对下述名词作出如下解释。
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
实时荧光PCR法：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。
逆转录PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)：是反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增目的片段。RT-PCR包括两步：1、mRNA逆转录为cDNA；2、以cDNA为模版进行PCR。将这两个步骤合二为一个反应管进行即为一步法，将两个步骤分开两管反应为两步法。一步法更方便快捷。
Ct值：每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
MIX：逆转录PCR过程需要多种组分共同协作才能进行，一般在反应之前各组分需要独立包装才能保证PCR反应扩增结果的稳定性，通过特殊方法处理在各组分无需独立包装，直接按照一定的方法直接混合好后用户可以直接使用的反应液称MIX。
本发明实施例提供了一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，包括RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物和基因探针；
登革热Ⅰ型上游引物：5’-GTCTGAGGGAATCTT-3’；
登革热Ⅰ型下游引物：5’-CAGCCTTTCGACGCC-3’；
登革热Ⅱ型上游引物：5’-GTYACAAGGAGTGGA-3’；
登革热Ⅱ型下游引物：5’-GAGGTCCATGATGGT-3’；
登革热Ⅲ型上游引物：5’-GTGCACACAGGAGATC-3’；
登革热Ⅲ型下游引物：5’-GATGCCTGAGGTGTTAT-3’；
登革热Ⅳ型上游引物：5’-GCTATTGAAGTCAGG-3’；
登革热Ⅳ型下游引物：5’-TAGTCCAATATGCCAC-3’；
所述基因探针包括：
登革热Ⅰ型基因探针：5’-CAAATTTAGCCGAGAGAGTTCTCG-3’；
登革热Ⅱ型基因探针：5’-TGTCATCTTCGATCTCTGGATTGT-3’；
登革热Ⅲ型基因探针：5’-CTCCCTGCGTTTCATTTCCCACC-3’；
登革热Ⅳ型基因探针：5’-CGCCTCCCATTATTGGCGG-3’。
本发明实施例针对登革热(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)基因设计特异性引物和Taqman探针。优选的，所述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述基因探针上标记的荧光信号不相同，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从而提高PCR单管中能够检测的靶的数目。具体的，所述基因探针为采用不同荧光标记物进行编码标记的基因探针，包括：
登革热Ⅰ型基因探针：
5’-FAM-CAAATTTAGCCGAGAGAGTTCTCG-BHQ1-3’；
登革热Ⅱ型基因探针：
5’-HEX-TGTCATCTTCGATCTCTGGATTGT-BHQ1-3’；
登革热Ⅲ型基因探针：
5’-ROX-CTCCCTGCGTTTCATTTCCCACC-BHQ1-3’；
登革热Ⅳ型基因探针：5’-CY5-CGCCTCCCATTATTGGCGG-BHQ3-3’。
进一步的，本发明实施例所述PCR反应液还包括包括M-MLV逆转录酶、Taq酶、dNTPs、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、溴酚蓝。更进一步地，所述试剂盒运用分装技术，将所述溴酚蓝、M-MLV逆转录酶、Taq酶与所述不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTPs、登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物和基因探针采用石蜡隔离，有效保证了酶的活性，延长了本发明实施例试剂盒的保存时间。优选的，所述石蜡的熔化温度为42-50℃。在RT-PCR反应过程中，由于温度在50-55℃，石蜡熔融，使得上述反应液混合，RT-PCR反应得以进行。
作为优选实施例，所述RT-PCR反应液的组成如下所述：
本发明实施例登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒是通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系的荧光扩增曲线图，当扩增曲线图Ct值≤35，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值，结果表现为阴性。因此，为了形成对照，登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。具体的，所述阳性对照包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的基因组。更具体的，所述阳性对照使用Tris-EDTA缓冲液对所述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的基因组进行稀释后冷冻保存，所述Tris-EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0。所述阴性对照为不含有登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的基因组的Tris-EDTA缓冲液，所述Tris-EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0。
应当理解，应不同实验需要，本发明实施例各组分的规格可依照上述含量进行调整。为了避免操作时取错组分或实验过程中由于混淆瓶盖造成的标品交叉污染，本发明实施例优选采用不同类型和/或颜色的盖子对不同样品进行区分，具体的，所述RT-PCR反应液采用无色透明PCR反应管；阴性对照使用紫色透明带盖离心管；阳性对照使用橙红色透明带盖离心管。当然，对于不同类型和/或颜色的盖子的选择，不限于此。
本发明实施例试剂盒MIX针对登革热(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)基因设计特异性引物和Taqman探针，在反应体系中含有登革热(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)RNA模板的情况下，可以一步法实现mRNA逆转录与cDNA的PCR反应，并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
本发明实施例还提供了一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法，该方法使用上述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒进行检测，包括以下步骤，如图2所示：
S01.样本RNA提取；
S02.RT-PCR一步法检测；
S03.结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：20-40S；72℃：1-2min；45循环。
上述步骤S01中，所述样本RNA提取采用登革热急性期患者(发病5日内)、恢复期患者和监测点发热或病毒性脑炎病人的血清100μL。
上述步骤S02中，包括取待检样本RNA如5μL，加入RT-PCR反应液，上机检测。值得注意的是，每次试验设置有阴性对照和阳性对照，否则该次试验视为无效试验。本发明实施例中，用于登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX的荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJOpticon2)、StratageneMX系列、RocheLightCycler、CepheidSmartCycler、CorbettRotor-Gene、杭州博日系列。
作为优选实施例，所述RT-PCR一步法检测时，对不同的所述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型基因探针上标记的荧光信号不相同。
上述步骤S03中，根据检测的荧光强度结果进行分析判断，当扩增曲线图Ct值≤35，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性，如图3A所示；当扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值，结果表现为阴性，如图3B所示。本发明实施例中，通过不同的通道(采用不同荧光基团标记)得到的结果可进行判定，具体的，当采用FAM标记登革热Ⅰ型基因探针时，阳性结果表示样品中检测出登革热Ⅰ型病毒，而阴性结果未检出登革热Ⅰ型病毒；当采用HEX标记登革热Ⅱ型基因探针时，阳性结果表示样品中检测出登革热Ⅱ型病毒，而阴性结果未检出登革热Ⅱ型病毒；采用ROX标记登革热Ⅲ型基因探针时，阳性结果表示样品中检测出登革热Ⅲ型病毒，而阴性结果未检出登革热Ⅲ型病毒；当采用CY5标记登革热Ⅳ型基因探针时，阳性结果表示样品中检测出登革热Ⅳ型病毒，而阴性结果未检出登革热Ⅳ型病毒；
本发明实施例提供的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法，运用登革热病毒(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)RT-PCR反应液MIX一步法检测试剂盒能同时检测登革热的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型，与细胞培养法相比具有快速、灵敏、安全和方便等优点，可应用于登革热病毒的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型的早期筛查和环境监控检测。此外，本发明具有操作简单、安全、快速、灵敏和方便等优点。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，包括PCR反应液、阴性对照和阳性对照，其中，所述RT-PCR反应液的规格为成分如下表1所示；所述阳性对照成分包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的基因组，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)稀释后冷冻保存；所述阴性对照成分为不含有猪瘟病毒野毒株和疫苗株的基因组RNA的Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)。
表1
所述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法，使用上述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S11.样本RNA提取：取待检样本20例；
S12.RT-PCR一步法检测；
S13.结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；45循环。
RT-PCR扩增图谱如图4所示。
对比例1
取待检样本20例用细胞培养法进行培养后检测。
本发明实施例和对比例的检测结果如下表2所示。
表2
由上表2可见，登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测盒检出结果与培养法结果一致，但是，采用试剂盒进行检测，检出时间段、灵敏度高，培养法耗时长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，包括RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物和基因探针；
所述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物包括：
登革热Ⅰ型上游引物：5’-GTCTGAGGGAATCTT-3’；
登革热Ⅰ型下游引物：5’-CAGCCTTTCGACGCC-3’；
登革热Ⅱ型上游引物：5’-GTYACAAGGAGTGGA-3’；
登革热Ⅱ型下游引物：5’-GAGGTCCATGATGGT-3’；
登革热Ⅲ型上游引物：5’-GTGCACACAGGAGATC-3’；
登革热Ⅲ型下游引物：5’-GATGCCTGAGGTGTTAT-3’；
登革热Ⅳ型上游引物：5’-GCTATTGAAGTCAGG-3’；
登革热Ⅳ型下游引物：5’-TAGTCCAATATGCCAC-3’；
所述基因探针包括：
登革热Ⅰ型基因探针：5’-CAAATTTAGCCGAGAGAGTTCTCG-3’；
登革热Ⅱ型基因探针：5’-TGTCATCTTCGATCTCTGGATTGT-3’；
登革热Ⅲ型基因探针：5’-CTCCCTGCGTTTCATTTCCCACC-3’；
登革热Ⅳ型基因探针：5’-CGCCTCCCATTATTGGCGG-3’。
2.如权利要求1所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，所述基因探针为采用不同荧光标记物进行编码标记的基因探针，包括：
登革热Ⅰ型基因探针：
5’-FAM-CAAATTTAGCCGAGAGAGTTCTCG-BHQ1-3’；
登革热Ⅱ型基因探针：
5’-HEX-TGTCATCTTCGATCTCTGGATTGT-BHQ1-3’；
登革热Ⅲ型基因探针：
5’-HEX-TGTCATCTTCGATCTCTGGATTGT-BHQ1-3’；
登革热Ⅳ型基因探针：5’-CY5-CGCCTCCCATTATTGGCGG-BHQ3-3’。
3.如权利要求1所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液还包括M-MLV逆转录酶、Taq酶、dNTPs、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、溴酚蓝。
4.如权利要求3所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，所述溴酚蓝、M-MLV逆转录酶、Taq酶与所述不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTPs、登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物和基因探针采用石蜡隔离。
5.如权利要求4所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，所述石蜡的熔化温度为42-50℃。
6.如权利要求1-5任一所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的基因组。
7.如权利要求1-5任一所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为不含有登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的基因组的Tris-EDTA缓冲液。
8.如权利要求1-5任一所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液的组成如下所述：
9.一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法，其特征在于，该方法使用如权利要求1-8任一项所述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
样本RNA提取；
RT-PCR一步法检测；
结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：20-40S；72℃：1-2min；45循环。
10.如权利要求9所述的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测方法，其特征在于，所述RT-PCR一步法检测时，对不同的所述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型基因探针上标记的荧光信号不相同。
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