CN111443211B - 一种多血型系统自动检测卡及检测方法 - Google Patents

一种多血型系统自动检测卡及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多血型系统自动检测卡及检测方法，由上而下包括加样层、反应层、显色层、识别层四部分，在加样层上开设加样孔，反应层上设有全血垫或从全血中过滤红细胞的过滤垫，加样孔的底部与全血垫或过滤垫相连，全血垫的末端与若干个预包被血型抗体的抗体垫相连，过滤垫的末端通过延时垫与预包被血型抗原的抗原垫相连；反应层单独设置质控条带；显色层上设有若干个与抗体垫或抗原垫末端相连的显色区；识别层反向与显色层相连。本发明将血型检测与编码技术结合，可快速检测多种血型，实现多种血型自动识别，减少人工判断误差，提高检测效率，无需专用设备，实现血型快速、准确自动化便携式检测。

Description

一种多血型系统自动检测卡及检测方法
技术领域
本发明属于临床检验体外诊断技术领域，涉及一种多血型系统自动检测卡及检测方法。
背景技术
血型是指血液成分表面抗原的类型，通常是指红细胞(RBC)膜上特异性抗原的分型。已经发现并为国际输血协会承认的血型系统超过35种，与其中人类输血关系最密切的是ABO血型系统和Rh血型系统，另有MNS、Kell等系统也与某些疾病息息相关。血型鉴定是指对血液成分中细胞表面抗原进行鉴定的技术，其主要用于临床输血、器官移植、新生儿溶血症等时。准确的血型鉴定至关重要，因血型错配或急救时采用异型输血极易导致输血性溶血反应的发生，造成溶血性贫血、肾衰竭、休克以至死亡。
目前临床用血时常用血型鉴定方法为血清法，包括传统的玻片法、纸片法、试管法，后续发展起来的卡式微柱凝胶法。其通过判断红细胞凝集进行血型鉴定，其原理为检测受检者血液中RBC表面抗原以及血浆中的特异性抗体，若RBC表面存在相应抗原，即可与相应的抗体试剂发生凝集反应；同理，若受检者血浆中存在特异性抗体，则可与试剂红细胞发生凝集反应。目前临床使用最为广泛的为试管法和卡式微柱凝胶法，其优点是其结果准确，检测灵敏度、特异性好，但其耗时较长，大量的样本也加重临床工作负担，增加差错风险发生率，为紧急条件下临床用血带来严重挑战。同时，现有血型大多需借助于实验室专用仪器进行检测，且常用血型定型试剂需保存于4℃条件下，室温条件下难以长期保存，给室外血型检测带来极大不便。再者，受试剂及检测条件限制，仪器、试剂成本较高，为经济较落后地区血型检测带来困难，阻碍基层整体医疗水平提高，同时增加患者经济负担。
随着生物技术发展，便携式血型检测卡得到迅速发展。中国专利CN101603967B公开了一种快速检测人ABO/Rh/MN血型的方法及试剂盒。通过预先包被固定了抗A或抗B或抗D或抗M或抗N血型抗体的测试条上，在用冲洗液洗脱后，观察是否加样垫上是否有凝集的红细胞残留来判断被测血样的血型。该检测卡易携带，检测速度快，但仅检测ABO正定型，若出现ABO正反定型不符，容易导致检测错误。中国专利CN103389384B公开了一种Miltenberger血型抗体检测免疫荧光层析试纸条及其检测方法，以荧光定量检测Miltenberger血型，但荧光检测往往需配备大型专业的仪器，在实际推广应用中受限，不适用于资源稀少及经济欠发达地区。中国专利CN107167616B提供了一种血型检测方法和装置，利用多个反应腔包被不同抗体后，待测血液与抗体进行免疫反应后采集图像，将彩色图像转为灰度图像，通过灰度值判断血型结果；虽然为自动化检测提供一定支持，但是不同的两个彩色可能出现接近的灰度值，导致检测结果误差，提高检测假阴性率和假阳性率；同时，不能鉴别是否是血液样本；
所有上述方法大多检测血型系统中的单一血型或某几种抗原，无法对常见血型(如Rh血型、MNS血型等)进行自动同步检测；常规技术检测时间较长，需额外配置专用设备，无通用型检测方式，自动化检测未能完全实现，难以满足紧急情况下及经济落后地区的使用，极大限制了其应用价值。因此，快速、准确、便携式通用型的自动血型检测技术及方法可为抢救危急病人，应对突发事件提供保障，为提升资源稀缺地区医疗卫生保健助力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多血型系统自动检测卡及检测方法，将血型检测与条形码、二维码技术结合，无需大型专用仪器，可快速检测多种血型，实现多种血型自动识别，减少人工判断误差，提高检测效率，实现血型快速、准确自动化便携式检测。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种多血型系统自动检测卡，由上而下包括加样层、反应层、显色层、识别层四部分，在加样层上开设加样孔，反应层上设有全血垫或从全血中过滤红细胞的过滤垫，加样孔的底部与全血垫或过滤垫相连，所述全血垫的末端与若干个预包被血型抗体的抗体垫相连，所述过滤垫的末端通过延时垫与预包被血型抗原的抗原垫相连；反应层单独设置质控条带；显色层上设有若干个与抗体垫或抗原垫末端相连的显色区；所述识别层反向与显色层相连，包括二维码定位区、校准区、检测区、受检者信息区，所述的检测区与显色区的位置一一对应。
优选的，所述检测卡的结构为三维或二维，采用试纸串联、折纸技术、蜡打印、光敏印章、光刻蚀或三维(3D)打印中任一种方法加工得到。
优选的，所述加样层与反应层分开设置或者合为一体。
优选的，所述加样层的材质优选为玻璃纤维、棉浆纸、餐巾纸、滤纸、纱布或水凝胶等，加样孔可为圆形或方形的任意形状，其加样孔采用蜡打印、光刻蚀技术等使加样层形成亲水与疏水区域。
优选的，所述全血垫、抗体垫、延时垫和抗原垫的材质为孔径8μm～20μm的无纺布、无纺纸、滤纸、棉浆纸或玻璃纤维。
优选的，所述过滤垫的材质选自普鲁士蓝膜、玻璃纤维、石墨烯布、碳布、碳纸、全血分离膜或硝酸纤维膜。
优选的，所述抗体垫预包被商品化的ABO、Rh、MNS、Kell、P、Kidd、Duffy血型抗体，可采用IgM、IgG、IgM-IgG混合抗体，其包被固定方式可为﹣80℃冷冻干燥后固定、等离子处理、共价键偶联、20～50℃真空干燥、免疫磁珠结合或静电吸附。
优选的，所述质控条带包括与抗体垫位置对应的质控区域，质控区域包被PBS或生理盐水试剂，30～50℃干燥；其余顺序与包被试剂与其他条带一致。
优选的，所述延时垫用于调控抗体检测反应时间，采用化学方式或物理方式实现延时，化学方式为预包被糖类(蔗糖、葡聚糖、果胶等)、石蜡或烷基烯酮二聚体，物理方式为改变延时垫的形状或增加长度、宽度。其预包被固定方式为﹣80℃冷冻干燥后固定、30～50℃真空干燥。
优选的，所述抗原垫预包被ABO血型抗原，包括A1、A2、B、O型红细胞，其包被固定方式为﹣80℃冷冻干燥后固定、4-30℃真空干燥、免疫磁珠结合或静电吸附；或者直接加入新鲜红细胞作为抗原。A1、A2、B、O型红细胞可为商品化试剂。
优选的，所述显色层的材质选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚酯纤维素膜等。所述显色方式为颜色变化或灰度值变化，显色区域为正方形、长方形或圆形的任意形状，预包被试剂可为纳米粒子或染料；所述纳米粒子包括乳胶微粒、金纳米粒子、银纳米粒子等，染料包括双缩脲试剂、甲基绿、吡罗红、溴代麝香草酚蓝溶液、茚三酮等。
优选的，所述观察区的形状为正方形、长方形、三角形、菱形或圆形的任意形状。
优选的，所述识别层的材质选自打印纸、棉纸或吸墨纸，通过蜡打印、激光打印或光敏印章法呈现定位区、校准区、受检者信息区；所述定位区用于自动检测中自动定位、纠偏，其图案可为内圆外方、外圆内方、同心圆、内外皆方；所述校准区用于颜色校准，预防外部环境及拍摄仪器的干扰，其可为5～18个色块组成，其颜色以RGB表示，可为(0,0,0)至(255，255,255)间的任意组合；所述受检者信息区用于受检者信息登记与存储，为可为二维码、三维码或条形码，二维码、三维码的种类选自Data Matrix、MaxiCode、Aztec或QR Code，条形码的种类选自EAN、UPC或摩德巴码。所述信息包括基本姓名、年龄、性别、ID号、科室、标本类型、检验项目、检验人员、备注。
优选的，所述检测区与显色区域重叠，为镂空结构或透明膜，其镂空加工方式为激光切割、化学腐蚀或手工剪裁；其透明膜材质可为聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯或树脂。
利用上述检测卡实现的一种多血型系统自动检测方法，先向加样孔加入全血，经过血液分离及抗原抗体反应，30s-1min后加入PBS、生理盐水或超纯水，10秒后肉眼观察到检测区颜色变化，既可肉眼识别，也可采用自动识码软件进行结果判读。
优选的，向加样孔中注入的全血为新鲜或经抗凝剂处理的全血。
优选的，ABO血型反定型所需样本量为50～250μL，其余检测单一靶标所需样本量为5～15μL。
优选的，所述自动识别软件安装在通用的智能手机、电脑或手持式扫码仪上。
优选的，所述自动识别软件的识别流程包括：图像采集、图像定位与分割、识别采样、二维码或条形码识别；最后与内置数据库对比分析，自动获得图像中的信息并显示。
进一步优选的，图像采集通过拍照、扫描或录像等方式实现。
进一步优选的，图像定位与分割的具体方法是：利用OpenCV的FindContours函数区分定位区内部或外部边界，分五个参数，第一个参数对采集的图案进行二值化处理；第二个参数是内存存储器，FindContours找到的轮廓放到内存里面；第三个参数是层级；第四个参数是类型，采用树结构；第五个参数是节点拟合模式，全部寻找；从二值图像中检索轮廓作为轮廓树，指针fisrtcontour由该函数填充，获取层次结构值，可选用岛津法动态查找阈值，将所有点由链码形转化为点序列形式；对定位区的定位点图案进行轮廓识别，校正因不同拍摄角度导致的图像位置及形状差异，通过与定位点标定的几何变形对应标定检测区的位置。
进一步优选的，识别采样的具体方法是：对检测区颜色进行提取，借助彩色条带图案对检测对象的深度确定方法，根据校准区域条带的颜色RGB对比找相似度，根据每个检测区在校准区域条带上对应的位置确定真实的输出结果；检测区取得的检测值与校准区彩色条带从左到右依次比对，得出实际值而不受拍照色差、光线、角度的影响。进一步优选的，二维码或条形码识别通过Zbar工具包或ZXing工具包实现。
优选的，判读标准为：根据包被反应时间出现红色、褐色或棕色表示对应检测区阴性，出现白色、蓝色或黄色表示对应检测区阳性。
优选的，根据实际值自动与内置数据库对比，自动在软件界面输出血型判读结果。
本发明的有益效果在于：
本发明将血型检测卡与编码技术结合，利用多层血型检测卡实现微量样本快速、便携式血型检测；其卡为一次性使用，安全便捷，防止交叉污染；采用自动化结果判读，解决大样本临床检测问题；利用编码技术可实现自动定位、纠偏、校准，解决因拍照颜色、角度、手机型号等的偏差导致的检测稳定性低的难题，提高检测稳定性与准确率；将患者信息与检测结果自动对接，无需手工录入，减少操作人员工作量；自动识别软件无需专业仪器，可安装于通用的智能手机、电脑等设备，极大减轻基层卫生保健负担。总而言之，可采用微量血液快速检测多种血型，并实现多种血型自动识别，减少人工判断误差，提高检测效率，实现血型快速、准确、自动化、便携式检测。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1a～图1d为本发明检测卡的结构示意图，图1a为加样层，图1b为反应层，图1c为显色层，图1d为识别层；
其中，1为加样孔，2为过滤垫，3为全血垫，4为抗体垫，5为延时垫，6为抗原垫，7为观察区，8为检测区，9为定位区，10为校准区，11为受检者信息区。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1：
人ABO血型及Rh(C/c/D/E/e)血型自动检测
选用蜡打印技术构建三维检测卡结构，如图1a～图1d所示，加样层和反应层分开设置，加样孔1为圆形；加样层材质以玻璃纤维为例，反应层全血垫3、抗体垫4、延时垫5和抗原垫6的材质以无纺纸为例，过滤垫2的材质以全血分离膜为例。
抗体垫4预包抗A、B、C、c、D、E、e 7个抗体，为IgM型；质控区域以生理盐水浸润后干燥；所述延时垫5以预包被葡聚糖为例，均采用﹣80℃冷冻干燥后固定；显色层材质以硝酸纤维素膜为例，显色区域为8个正方形区域，分布对应ABO和Rh血型7个检测结果(编号1-7)及8号质控区，预包被甲基绿染料；观察区7为正方形；识别层的材质以打印纸为例，通过蜡打印呈现定位区9、校准区10、受检者信息区11，定位区9为内圆外方图案，校准区10由6个色块组成，其RGB分别为(68,114,196)、(240,142,24)、(44,220,65)、(218,46,148)、(220,78,44)、(41,219,223)；受检者信息区11为QR二维码，信息包括基本姓名、年龄、性别、ID号、科室、标本类型、检验项目、检验人员、备注。由上而下组装加样层、反应层、显色层、识别层，检测区8与显色区域重叠，采用激光切割镂空结构。
具体操作过程：
向加样孔1中加入70μL全血，30s后加入140μL超纯水，观察1-8号显色区域颜色变化并用手机对准检测卡拍照，10s后手机界面自动弹出血型结果；显色绿色为阳性，显示黄色为阴性结果。
其中A、B、C、c、D、E、e对应1-7号显色区域，8号检测区为质控结果。
结果举例见表1。
表1.实施例1检测结果
显色(1-8号显色区域) 结果 血型
1、3、5、6显色绿色，其余黄色 A阳性及CDE阳性 A型及Rh(CDE)型
1、2、3、5、6显色绿色，其余黄色 A、B阳性及CDE阳性 AB型及Rh(CDE)型
3、4、5、6显色绿色，其余黄色 A、B阴性及CcDE阳性 O型及Rh(CcDE)型
2、3、4、5、6、7显色绿色，其余黄色 B阳性及CcDEe阳性 B型及Rh(CcDEe)型
以上不为全部结果，其他结果以此类推，结果判断标准一致。
实施例2：
人MNS、Kell、P、Kidd血型自动检测
选用折纸技术构建三维检测卡结构，如图1a～图1d所示，加样层和反应层合二为一，加样孔1为方形；反应层全血垫3、抗体垫4、延时垫5和抗原垫6的材质以滤纸为例，过滤垫2的材质以碳纸为例；
抗体垫预包抗M、N、S、s、K、k、P、Jka、Jkb 9个抗体，为IgM、IgG混合型，均采用30℃真空干燥后固定；质控区域以超纯水浸润后干燥；显色层材质以醋酸纤维素膜为例，显色区域为10个正方形区域，分布对应MNS、Kell、P、Kidd血型9个检测结果(编号1-9)及10号质控区，预包被茚三酮；观察区7为正方形；识别层的材质以打印纸为例，通过蜡打印呈现定位区9、校准区10、受检者信息区11，定位区9为内圆外方图案，校准区10由10个色块组成，其RGB分别为(34,151,230)、(229,100,35)、(208,226,38)、(224,40,202)、(236,28,127)、(41,219,223)、(65,215,49)、(204,84,60)、(58,174,206)、(48,6,22)；受检者信息区11为QR二维码，信息包括基本姓名、年龄、性别、ID号、科室、标本类型、检验项目、检验人员、备注。由上而下组装加样层、反应层、显色层、识别层，检测区8与显色区域重叠，采用激光切割镂空结构。
具体操作过程：
向加样孔1中加入100μL全血，1min后加入200μL超纯水，观察1-10号显色区域颜色变化并用手机对准检测卡拍照，10s后手机界面自动弹出血型结果；显色绿色为阳性，显示黄色为阴性结果。
其中M、N、S、s、K、k、P、Jka、Jkb对应1-9号显色区域，10号检测区为质控结果。
结果举例见表2。
表2.实施例2检测结果
以上不为全部结果，其他结果以此类推，结果判断标准一致。
实施例3：
人ABO正反定型、Rh(C/c/D/E/e)血型自动检测
选用蜡打印技术构建三维检测卡结构，如图1a～图1d所示，加样层和反应层分开设置，加样孔1为圆形；加样层材质以滤纸为例，反应层全血垫3、抗体垫4、延时垫5和抗原垫6的材质以无纺布为例，过滤垫2的材质以玻璃纤维为例；
抗体垫预包抗A、B、C、c、D、E、e 7个抗体，为IgM型；质控区域以生理盐水浸润后干燥；所述延时垫以预包被果胶为例，均采用﹣80℃冷冻干燥后固定；抗原垫加入ABO血型A1、A2、B、O型红细胞检测ABO血型反定型，显色层材质以硝酸纤维素膜为例，显色区域为8个正方形区域，分布对应ABO和Rh血型7个检测结果(编号1-7)及8号质控区，预包被甲基绿染料；观察区7为正方形；识别层的材质以打印纸为例，通过蜡打印呈现定位区9、校准区10、受检者信息区11，定位区9为内圆外方图案，校准区10由15个色块组成，其RGB分别为(68,114,196)、(240,142,24)、(44,220,65)、(218,46,148)、(220,78,44)、(41,219,223)、(50,148，46)、(80,44，78)、(150,150,225)、(60,15,210)、(120,90,50)、(41,165,223)、(140,20,220)、(150,45,80)、(41,165,223)；受检者信息区11为条形码，信息包括基本姓名、年龄、性别、ID号、科室、标本类型、检验项目、检验人员、备注。由上而下组装加样层、反应层、显色层、识别层，检测区8与显色区域重叠，采用聚乙烯透明膜结构；
具体操作过程：
向加样孔1中加入300μL全血，60s后加入180μL超纯水，观察1-12号显色区域颜色变化并用手机对准检测卡拍照，10s后手机界面自动弹出血型结果；显色绿色为阳性，显示黄色为阴性结果。
其中A、B、C、c、D、E、e对应1-7号显色区域，A1、A2、B、O型红细胞对应8-11号显色区域，12号检测区为质控结果。
结果举例见表3。
表3.实施例3检测结果
以上不为全部结果，其他结果以此类推，结果判断标准一致。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

1.利用检测卡实现的一种多血型系统自动检测方法，其特征在于，先向加样孔加入全血，30s-1min后加入PBS、生理盐水或超纯水，10秒后肉眼观察到检测区颜色变化，同时采用自动识别软件进行结果判读；自动识别软件可通用安装于包括智能手机、电脑、手持式扫码仪在内的常用电子设备；
所述自动识别软件的识别流程包括：图像采集、图像定位与分割、识别采样、二维码或条形码识别；最后与内置数据库对比分析，自动获得图像中的信息并显示；
图像定位与分割的具体方法是：利用OpenCV的FindContours函数区分定位区内部或外部边界，分五个参数，第一个参数对采集的图案进行二值化处理；第二个参数是内存存储器，FindContours找到的轮廓放到内存里面；第三个参数是层级；第四个参数是类型，采用树结构；第五个参数是节点拟合模式，全部寻找；从二值图像中检索轮廓作为轮廓树，指针fisrtcontour由该函数填充，获取层次结构值，可选用岛津法动态查找阈值，将所有点由链码形转化为点序列形式；对定位区的定位点图案进行轮廓识别，校正因不同拍摄角度导致的图像位置及形状差异，通过与定位点标定的几何变形对应标定检测区的位置；
识别采样的具体方法是：对检测区颜色进行提取，借助彩色条带图案对检测对象的深度确定方法，根据校准区域条带的颜色RGB对比找相似度，根据每个检测区在校准区域条带上对应的位置确定真实的输出结果；检测区取得的检测值与校准区彩色条带从左到右依次比对，得出实际值而不受拍照色差、光线、角度的影响；
所述检测卡由上而下包括加样层、反应层、显色层、识别层四部分，在加样层上开设加样孔，反应层上设有全血垫或从全血中过滤红细胞的过滤垫，加样孔的底部与全血垫或过滤垫相连，所述全血垫的末端与若干个预包被血型抗体的抗体垫相连，所述过滤垫的末端通过延时垫与预包被血型抗原的抗原垫相连；反应层单独设置质控条带；显色层上设有若干个与抗体垫或抗原垫末端相连的显色区；所述识别层反向与显色层相连，包括二维码定位区、校准区、检测区、受检者信息区，所述的检测区与显色区的位置一一对应；
所述检测卡的结构为三维或二维，采用试纸串联、折纸技术、蜡打印、光敏印章、光刻蚀或三维打印中任一种方法加工得到；
所述加样层的材质为玻璃纤维、棉浆纸、餐巾纸、滤纸、纱布或水凝胶等，加样孔可为圆形或方形的任意形状，其加样孔采用蜡打印、光刻蚀技术使加样层形成亲水与疏水区域；所述全血垫、抗体垫、延时垫和抗原垫的材质为孔径8μm～20μm的无纺布、无纺纸、滤纸、棉浆纸、玻璃纤维材料；所述过滤垫的材质选自普鲁士蓝膜、玻璃纤维、石墨烯布、碳布、碳纸、全血分离膜或硝酸纤维膜；
所述抗体垫预包被商品化的ABO、Rh、MNS、Kell、P、Kidd、Duffy血型抗体，其包被固定方式可为﹣80℃冷冻干燥后固定、等离子处理、共价键偶联、20～50℃真空干燥、免疫磁珠结合或静电吸附；所述抗原垫预包被ABO血型抗原，包括A1、A2、B、O型红细胞，其包被固定方式为﹣80℃冷冻干燥后固定、4-30℃真空干燥、免疫磁珠结合或静电吸附；或者直接加入新鲜红细胞作为抗原；
所述延时垫采用化学方式或物理方式实现延时，化学方式为预包被糖类、石蜡或烷基烯酮二聚体，物理方式为改变延时垫的形状或增加长度、宽度；
所述显色层的材质选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚酯纤维素膜；显色方式为颜色变化或灰度值变化，显色区域为正方形、长方形或圆形的任意形状，预包被试剂为纳米粒子或染料；所述纳米粒子包括乳胶微粒、金纳米粒子、银纳米粒子，染料包括双缩脲试剂、甲基绿、吡罗红、溴代麝香草酚蓝溶液、茚三酮；
所述识别层的材质选自打印纸、棉纸或吸墨纸，通过蜡打印、激光打印或光敏印章法呈现定位区、校准区、受检者信息区；所述定位区用于自动检测中自动定位、纠偏；所述校准区用于颜色校准，预防外部环境及拍摄仪器的干扰；所述受检者信息区用于受检者信息登记与存储，为二维码、三维码或条形码；
所述检测区与显色区域重叠，为镂空结构或透明膜，其镂空加工方式为激光切割、化学腐蚀或手工剪裁；其透明膜材质可为聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯或树脂。
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