CN109085356A - 拟中肋骨条藻的快速检测方法及试纸条的制备与使用方法 - Google Patents

Abstract

拟中肋骨条藻的快速检测方法及试纸条的制备与使用方法，涉及基于胶体金免疫层析分析技术的浮游藻类免疫层析检测。提供拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条、拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的制备方法、拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的使用方法和拟中肋骨条藻的免疫层析检测方法。通过免疫学技术，以藻细胞免疫实验动物，制备浮游藻的单克隆抗体，利用抗体，建立GICA的免疫分析方法。又通过比色板，对GICA的显色结果进行较别，估算出赤潮藻在水体当中的浓度。直接将含藻的水样滴加到试纸条上即可获得结果阳性，并且可以根据反应的的强弱给出藻细胞浓度的大致数值结果。

Description

拟中肋骨条藻的快速检测方法及试纸条的制备与使用方法

技术领域

本发明涉及基于胶体金免疫层析分析技术(gold immune chromatographya55ay，GICA)的浮游藻类免疫层析检测，尤其是涉及拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条及其制备检测方法领域和拟中肋骨条藻细胞浓度监测领域，其属于免疫学和浮游生物学交叉技术领域。

背景技术

浮游植物的分类、鉴定和定量一直是藻类学和生态学研究中最基础的课题之一，对生态动力学、赤潮发生机制与预警预报、海水养殖水域常规检测等都有着重要意义。对于常规环境监测、渔业养殖水体检测等应用领域来说，需要一种对主要赤潮藻进行现场快速检测的方法。本发明内容主要以在东南沿海主要的的赤潮藻中肋骨条藻中的拟中肋骨条藻为研究对象，涉及海洋浮游植物的检测技术和胶体金免疫层析分析技术两个领域。

现有的有关赤潮藻的检测方法主要有基于形态学特征的分析方法、基于细胞色素的检测方法、基于分子探针的检测方法、以及不同技术的交叉，如流式细胞术和FLOWCAM技术等。这些技术极大地丰富了浮游植物观测技术，推动了相关研究的发展，各项技术均有着突出的优势但也存在着难以克服的制约因素。现有的浮游藻类检测方法主要包括：

1、基于形态学特征的分析方法：传统的基于形态学的光镜和电镜观测技术是浮游植物鉴定与定量的基础，至今仍有着不可动摇的地位，发挥着很重要的作用。但其存在着耗时长，需要富有经验的专家、专业仪器设备等限制性因素。FLOWCAM技术是形态学与流式细胞术的结合，利用计算机技术对捕获的照片进行识别分类。相对传统技术，这一技术加快了分析的速度，但是仍然存在需要专家干预、形态相似的种类无法区分等缺点。同时，由于技术的限制，该技术获得的图像分辨率较差，更在一定程度上影响了识别的准确度[曾呈奎,相建海.海洋生物技术[M].济南:山东科学技术出版社,1998.416-429；米铁柱,甄毓,于志刚,等.海洋浮游藻类检测技术发展及其展望[J].高技术通讯,2003,13(3,增刊):96-100].。

2、流式细胞术：该技术通过逐个测量细胞的散射光、细胞自体荧光、染色荧光和免疫标记荧光等来检测其生理生化指标并对其分类、收集，现已成为环境微生物学中的十分有用的工具。该技术的限制主要是在环境变化的情况下，细胞的形态、大小及生理生化特性会发生显著变化，而这正是流式细胞术的检测基础，这将影响该技术对于各种类的正确区分。同时，仪器成本较高、对工作环境要求严格、需要良好训练的专业技术人员等因素也限制了应用[Collier J L.Flow cyt om et ry and the single cell inphycology[J].Journal of Phycology,2000,36(4):1529-8817.]。

3、基于细胞色素的检测方法：由于不同种属的浮游藻中含有不同的色素组成，或特征色素，基于细胞色素的检测方法就是藉由检测样品中各种色素的丰度(及特征色素)对不同的浮游植物类群加以区分和定量。依据对色素的检测方法不同而有化学分类学方法、现场荧光、遥感反演等不同的技术。这些技术均可以迅速地获取结果，但由于藻类色素地相似性，这些技术仅能提供浮游植物几个种类群地分类数据，难以提供精确到种属地结果。化学分类法是以分类对象各类群中化学成分的特征为分类依据。可以在藻纲一级进行较好的分类，甚至于对于某些形态学上十分相近地种类在标志化合物上也有着差异，可以借助这一方法区分鉴定。但在属或种之间的分类还不能完全实现。现场荧光方法是在光源的激发下，检测藻类中色素发出的荧光，借助光谱的差异可以区分不同的浮游植物类群。这一方法可以迅速测定，并可以在水下等现场环境连续测定，但此方法只能将浮游植物根据其色素分为几个类群。利用卫星遥感数据，对海域叶绿素含量进行测量。这一方法可以迅速提供广大区域的数据，但往往只能反演叶绿素含量，估算浮游植物总量，难以进一步提供浮游植物的类群等信息。同时，由于环境因素的变化、不同的生长周期，浮游植物的色素含量会发生变化，基于细胞色素的各种方法的检测结果也会受到影响[Quilliam M A.The role ofchromatography in the huntfor red tide t oxins[J].Journal of ChromatographyA,2003,1000:527-548].。

对于常规环境监测、渔业养殖水体检测来说，需要一种对主要赤潮藻进行现场快速简易低成本的检测方法。在现有浮游植物检测方法中尚未有完全适用的方法。而临床检测中的GICA技术由于具有不需仪器，操作简单，检测快速而成为满足这一领域需求的最佳选择。目前国际国内在应用免疫学方法检测浮游植物的研究，多以制备抗体和ELISA检测居多，也有采用利用多抗制备GICA的技术来检测浮游植物的研究，但未有利用单克隆抗体制备GICA来检测浮游植物的研究，与ELISA不同之处是GICA反应时间大大缩短，不需要仪器设备，仅需十几分钟就完成了ELISA需要数小时才能显色的结果。因为在GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用(immunoconcentration)。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需要很长时间。与多抗制备胶体金免疫层析试纸条不同的是，单克隆制备的好处在于，可以通过细胞源源不断地生产该抗体，而无需一再注射动物使其免疫后产生抗原，节省时间成本和经济成本。另外，基于藻细胞浓度和显色差异所制成的比色板，能够快速地估算海水中藻细胞的浓度，为及时采取赤潮防范措施和预警机制提供参考。本发明突出特点是检测时间短(3-15分钟)，无需特殊仪器可以现场检测，对样品无需任何破碎处理，直接用含藻的水样即可进行检测。目前还没有查到与本项目类似的论文和专利报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条。

本发明的第二目的在于提供拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的制备方法。

本发明的第三目的在于提供拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的使用方法。

本发明的第四目的在于提供拟中肋骨条藻的免疫层析检测方法。

所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条设有塑料载体板、玻璃纤维膜样品层、玻璃纤维膜抗体标记层、硝酸纤维膜检测层和玻璃纤维膜吸水层；所述玻璃纤维膜样品层、玻璃纤维膜抗体标记层、硝酸纤维膜检测层和玻璃纤维膜吸水层依次胶合固定在塑料载体板的一侧；所述硝酸纤维膜检测层上设有拟中肋骨条藻抗原检测线和二抗质控线；所述玻璃纤维膜吸水层胶合在硝酸纤维膜检测层的右端上；所述塑料载体板的中部设有硝酸纤维膜检测层，在硝酸纤维膜检测层与玻璃纤维膜样品层之间设有载有胶体金标记的拟中肋骨条藻抗体的玻璃纤维膜抗体标记层，所述玻璃纤维膜抗体标记层的一端置于玻璃纤维膜样品层下并与塑料载体板胶合，玻璃纤维膜抗体标记层的另一端设置在硝酸纤维膜检测层上并与硝酸纤维膜检测层胶合。

所述硝酸纤维膜检测层上的二抗质控线包被有羊抗鼠IgG；所述玻璃纤维膜抗体标记层上载有胶体金标记的小鼠抗拟中肋骨条藻单克隆抗体。

所述胶体金标记(immunogold labeling technique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应，并最终通过反应结果输出藻细胞浓度；胶体金是由氯金酸在还原剂(如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等)作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合，根据胶体金的一些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫-生物学特性，使其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。

所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的制备方法的具体步骤如下：

通过已知拟中肋骨条藻浓度样品试验，确定检测藻细胞样品需要的捕获抗原浓度，在膜上划检测线，得拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条。

所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的使用方法如下：

将被检测样品溶液取出80～100μL，直接滴在拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条加样处，最快3min平均约15min后观察结果，显色稳定后，根据不同浓度抗原与抗体反应后在拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条上显示颜色的不同，建立颜色深浅与藻细胞浓度之间的关系，得到颜色深浅与藻细胞浓度之间的拟合关系，然后通过将显色结果与比色板进行比对，估算出藻细胞浓度。

所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测方法如下：

建立以GICA技术为基础，通过提取显色结果中的颜色信息，对应到程序当中设置的颜色信息和藻细胞之间的拟合关系公式，得出藻细胞浓度。

抗体金探针为胶体金标记的抗体，其制备方法如下：

1)采用胶体金制备方法，优化胶体金标记的实验条件，取得稳定高效的抗体金探针，透析纯化目标藻抗体，检验制备的胶体金的颗粒直径、均匀度等指标，制备胶体金，得抗体金探针；所述胶体金制备方法可采用抗坏血酸还原法、鞣酸—柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法等中的一种；所述胶体金可为20～30nm的胶体金，4℃保存。

2)将标记好的抗体金探针在蔗糖或硅胶中浓缩保存，选用凝胶过滤法纯化抗体金探针，用牛血清白蛋白作稳定剂，除去其中未标记的抗体，未反应的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。对纯化后免疫金探针的特异性、敏感性进行鉴定，判断其是否仍保持很好的生物学活性。

3)免疫原的制备：将生长旺盛的拟中肋骨条藻细胞培养溶液用终浓度为2％的甲醛固定过夜，10000r/min离心10min，收集藻细胞沉淀。藻细胞团块再用蒸馏水清洗一次，PBS清洗两次，每次均通过离心收集藻细胞，离心条件均为，10000r/min，10min。将收集的藻细胞分装于1.5mlEP管，甩去残余水分，-20℃保存备用。临用前取出，用灭菌的5mlPBS重新悬浮均匀。

4)多克隆抗体和单克隆抗体的制备及纯化：将处理好的藻细胞用0.5mlPBS重悬，混匀，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，乳化程度尽量完全。家兔通过背部皮下多点注射的方式进行免疫。免疫剂量约为每只家兔4×10⁶个细胞，每隔一周免疫一次，共免疫四次，最后一次免疫后一周取全血。采集的血液室温放置2h，然后离心(4000r/min，5min)分离血清。为提高测定的稳定性与专一性，需要对抗体纯化。对兔抗血清进行亲和层析柱纯化处理后，可以去除大部分血清杂蛋白从而IgG得到富集，纯化后抗血清效价有较大的提高，对于需要包被IgG抗体或者对抗体进行标记十分必要。

5)待标记抗体的预处理：透析除盐，由于过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附，需要透析除去蛋白质溶液内多余的电解质。去除沉淀，蛋白质的聚合物对标记过程及抗体金探针的稳定性有一定影响，标记之前须离心以除去这些聚合物。优化胶体金标记抗体的实验条件：调整pH值；将胶体金溶液的PH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。通过实验确定胶体金:抗体最适用量比例。

6)胶体金探针玻璃纤维素膜的制备：将玻璃纤维素膜在免疫金探针溶液中浸泡后晾干。

7)固定捕获抗体的硝酸纤维素膜(NC)的制备：取制备的拟中肋骨条藻细胞、羊抗鼠抗体用固定液稀释。用拟中肋骨条藻细胞或破碎物固定溶液在硝酸纤维素膜上划线作为捕获抗原检测线。将固相抗体硝酸纤维素膜置封闭液中孵育后洗去未结合的抗体，晾干备用。

与现有技术相比，本发明具有以下突出技术效果：

通过免疫学技术，以藻细胞免疫实验动物，制备浮游藻的单克隆抗体，利用抗体，建立GICA的免疫分析方法。又通过比色板，对GICA的显色结果进行较别，从而估算出赤潮藻在水体当中的浓度。不需实验仪器，操作简单，检测快速，且对样品无需破碎等特殊处理，直接将含藻的水样滴加到试纸条上即可获得结果阳性，并且可以根据反应的的强弱给出藻细胞浓度的大致数值结果。中肋骨条藻虽然不具有毒性，但是确是目前东南沿海引起赤潮的重要藻类之一，目前应用免疫学方法开展相关技术检测只有ELISA方法(耗时长，大约4h)，而本发明的快速检测的胶体金技术和方法(一般在3～15min可以获得结果)及相关产品还未见有报道。

附图说明

图1为拟中肋骨条藻检测试纸条的立体结构示意图。图中标记分别为：1、塑料载体板，2、玻璃纤维膜样品层，3、附有抗体金标记的拟中肋骨条藻抗体玻璃纤维膜抗体标记层，4、硝纤维膜检测层，5、玻璃纤维膜吸水层，6、抗原检测线，7、二抗质控线。

图2为拟中肋骨条藻检测试纸条的侧视图。图中标记分别为：1、塑料载体板，2、玻璃纤维膜样品层，3、附有抗体金标记的拟中肋骨条藻抗体玻璃纤维膜抗体标记层，4、硝酸纤维膜检测层，5、玻璃纤维膜吸水层，6、抗原检测线，7、二抗质控线。

图3为抗体效价测定曲线。五次免疫后对实验用兔颈动脉取全血，离心纯化后作为抗体备用。在抗体使用前，首先对抗体的效价进行测定。从测定结果来看，抗体效价较高，特别是3号抗体，其效价达到大于64000的水平。

图4为利用斑点杂交的方法确定最低检测浓度的结果照片。确定最低检测浓度实验检测中，将拟中肋骨条藻作为抗原进行包被，并把抗原(抗原原液为10⁸)进行倍比稀释。从左至右抗原的稀释浓度分别为：稀释2倍、稀释128倍、稀释256倍、稀释512倍、稀释1024倍、稀释2048倍、稀释4096倍，另外设置一个PBS进行对照。(图中各个浓度抗原所显示的斑点有明显的深浅之分，并且和浓度梯度有对应关系。能够很好说明本发明对最低浓度的检测检测限值)

图5为斑点杂交方法进行特异性检测的结果照片。特异性实验检测中，选取集中常见的赤潮藻，分别采用斑点杂交的方法使之与所制备的抗体反应，最后根据实验显色结果进行拟中肋骨条藻抗体的特异性判定。各编号分别代表：A1、拟中肋骨条藻；A2、小球藻；A3、三角褐指藻；A4、颗石藻；A5、东海原甲藻；A6、球等難金藻。

图6为斑点杂交方法快速检测拟中肋骨条藻实验的结果照片。以拟中肋骨条藻作为抗原，一抗、二抗分别使用最佳反应稀释浓度：1︰1000和1︰2000，在原有斑点杂交的基础上，对中间各个环节进行缩短时间，以寻找到可以快速检测出拟中肋骨条藻的反应时间组合。各编号分别代表：

B1、封闭时间：30min；一抗反应时间：60min；二抗反应时间：30min；

B2、封闭时间：20min；一抗反应时间：30min；二抗反应时间：20min；

B3、封闭时间：10min；一抗反应时间：20min；二抗反应时间：10min。

图7为试纸条检测各个时期拟中肋骨条藻实验的结果照片。用所制备出的试纸条对各个生长时期的拟中肋骨条藻进行检测，共采用三个生长时期或不同生长时期的藻细胞混合作为抗原，每种抗原又分为破碎处理和为破碎处理。具体编号分别代表：

抗原1、对数期拟中肋骨条藻未处理；

抗原2、对数期拟中肋骨条藻破碎处理；

抗原3、适应期、平台期拟中肋骨条藻混合未处理；

抗原4、适应期、平台期拟中肋骨条藻混合破碎处理；

抗原5、适应期、对数期、平台期拟中肋骨条藻混合未处理；

抗原6、适应期、对数期、平台期拟中肋骨条藻混合破碎处理。

图8试纸条的灵敏度检测实验结果照片。把处于生长状态的拟中肋骨条藻液(原液浓度为：3.20×10⁶cell/ml)进行梯度稀释，不做任何处理分别点滴在试纸条上，约5min后观察显色结果。各编号所对应的拟中肋骨条藻液浓度分别为：

C1、3.20×10⁶cell/ml；

C2、1.60×10⁶cell/ml；

C3、0.80×10⁶cell/ml；

C4、3.20×10⁵cell/ml；

C5、3.20×10⁴cell/ml；

C6、1.60×10⁴cell/ml；

C7、PBS代替抗原作为对照。

图9为试纸条的特异性检测实验的结果照片。选取几种骨条藻属的藻和几种常见的赤潮藻分别用试纸条进行检测，以验证试纸条对拟中肋骨条藻检测的特异性。各编号分别代表：

D1、中肋骨条藻；D2、拟中肋骨条藻；D3、玛氏骨条藻；D4、中肋骨条藻、拟中肋骨条藻和玛氏骨条藻混合液；D5、三角褐指藻；D6、小球藻；D7、小新月菱形藻；D8、布氏双尾藻；D9、以上7种藻类混合液。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

一、参见图1和2，所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条设有塑料载体板1、玻璃纤维膜样品层2、玻璃纤维膜抗体标记层3、硝酸纤维膜检测层4和玻璃纤维膜吸水层5；所述玻璃纤维膜样品层2、玻璃纤维膜抗体标记层3、硝酸纤维膜检测层4和玻璃纤维膜吸水层5依次胶合固定在塑料载体板1的一侧；所述硝酸纤维膜检测层4上设有拟中肋骨条藻抗原检测线6和二抗质控线7；所述玻璃纤维膜吸水层5胶合在硝酸纤维膜检测层4的右端上；所述塑料载体板1的中部设有硝酸纤维膜检测层4，在硝酸纤维膜检测层4与玻璃纤维膜样品层2之间设有载有胶体金标记的拟中肋骨条藻抗体的玻璃纤维膜抗体标记层3，所述玻璃纤维膜抗体标记层3的一端置于玻璃纤维膜样品层2下并与塑料载体板1胶合，玻璃纤维膜抗体标记层3的另一端设置在硝酸纤维膜检测层4上并与硝酸纤维膜检测层4胶合。

所述硝酸纤维膜检测层4上的二抗质控线7包被有羊抗鼠IgG；所述玻璃纤维膜抗体标记层3上载有胶体金标记的小鼠抗拟中肋骨条藻单克隆抗体。

所述胶体金标记(immunogold labeling technique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应，并最终通过反应结果输出藻细胞浓度；胶体金是由氯金酸在还原剂(如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等)作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合，根据胶体金的一些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫-生物学特性，使其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。

二、所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的制备方法的具体步骤如下：

通过已知拟中肋骨条藻浓度样品试验，确定检测藻细胞样品需要的捕获抗原浓度，在膜上划检测线，得拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条。

将被检测样品溶液取出80～100μL，直接滴在拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条加样处，最快3min平均约15min后观察结果，显色稳定后，根据不同浓度抗原与抗体反应后在拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条上显示颜色的不同，建立颜色深浅与藻细胞浓度之间的关系，得到颜色深浅与藻细胞浓度之间的拟合关系，然后通过将显色结果与比色板进行比对，估算出藻细胞浓度。

三、所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测方法如下：

建立以GICA技术为基础，通过提取显色结果中的颜色信息，对应到程序当中设置的颜色信息和藻细胞之间的拟合关系公式，得出藻细胞浓度。

实施例1：免疫原的制备

将生长旺盛的拟中肋骨条藻细胞培养溶液用终浓度为2％的甲醛固定过夜，10000r/min离心10min，收集藻细沉淀。藻细胞团块再用蒸馏水清洗一次，PB 5清洗二次，每次均通过离心收集藻细胞，离心条件均为，10000r/min，10min。将收集的藻细胞分装于1.5ml Eppendorf管，甩去残余水分，-20℃保存备用。临用前取出，用灭菌的5ml PBS重新悬浮均匀。得到已知细胞密度的藻细胞标准溶液。取一定量的藻细胞悬液与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，乳化程度尽量完全，最终制备出用于动物注射的免疫抗原。

实施例2：单克隆抗体的制备。见参考文献(徐志凯.实用单克隆抗体技术[M].西安:陕西科学技术出版社,1992:27-36)

实施例3：抗体效价的测定

采用间接ELISA法测定抗体的效价，主要步骤如下:

(1)拟中肋骨条海藻液包被(10⁶～10⁷个细胞/ml),100μL/孔，4℃湿盒过夜；

(2)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(3)封闭，用1％的BSA，包被缓冲溶液稀释，120μL/孔，37℃，3h或者4℃过夜；

(4)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(5)加入海藻的多克隆抗体梯度稀释溶液，100μL/孔，37℃，1.5h；

(6)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(7)加入酶标二抗的稀释溶液，100μL/孔，37℃，1.5h；

(8)洗板，O.5％PBST洗6次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(9)加入底物TMB溶液，100μL/孔，37℃，15min；

(10)2mol/L H₂SO₄终止反应，50μL/孔；

(11)酶标仪读取A₄₅₀值。

将满足条件P(待检血清)/N(阴性对照血清≥2.1,且P(待检血清)>0.2的显色孔判为阳性，并将抗血清的效价定义为与50％固相抗原结合时抗血清的稀释倍数。如图3所示，兔抗血清的效价至少在8000以上，其中3号、5号和6号抗体效价达到64000以上。

实施例4：一抗、二抗最佳使用浓度的确定。

采用间接ELISA法确定抗体的最佳使用浓度，具体步骤为:

(1)将一抗、二抗分别倍比稀释成1︰500、1︰1000、1︰2000、1︰4000四个浓度，并进行两两组合得到16个一抗、二抗的浓度组合，每个组合作为一个实验组，设置三个平行样；

(2)拟中肋骨条藻液包被(10⁶～10⁷个细胞/ml)，100μL/孔，4℃湿盒过夜；

(3)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(4)封闭，用1％的BSA，包被缓冲溶液稀释，120μL/孔，37℃，3h或者4℃过夜；

(5)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(6)将拟中肋骨条藻的多克隆抗体稀释溶液分别加入到酶标板相应的孔中，100μL/孔，37℃，1.5h；

(7)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(8)将酶标二抗的稀释溶液分别加入到酶标板相应的孔中，100μL/孔，37℃,1.5h；(9)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸馏水冲2次，甩干残存液体；

(10)加入底物TMB溶液，100μL/孔，37℃，15min；

(11)2mo1/L H₂SO₄终止反应，50μL/孔；

(12)酶标仪读取A450值和A620值。

将满足条件P(待检海藻)/N(阴性对照)≥2.1，且P(待检海藻)>0.2的显色孔判为阳性，将所得到的吸光度值每组实验组数值的平均值，并用下列公式进行处理：

A_样品＝(OD_450nm-OD_620nm)_样品-(OD_450nm-OD_620nm)_空白

得到最终数值。其中最接近1的数值所对应的一抗、二抗使用浓度即为抗体的最佳使用浓度组合(见表1～3)。

实施例5：抗体灵敏度的检测方法

采用斑点杂交的方法测定抗体的灵敏度，具体步骤为：

(1)在NC膜(硝酸纤维素膜)上画取1×1cm方格；

(2)将拟中肋骨条藻原液(约10⁸cell/ml)稀释成1︰2、1︰128、1︰256、1︰512、1︰1024、1︰2048、1︰4096等7个浓度，并将其分别滴加在方格中，每格2μL。在最后一个方格中滴加PBS溶液2μL代替拟中肋骨条藻溶液作为对照；

(3)将滴加好抗原的NC膜于水浴锅中孵育，37℃，0.5h；

(4)孵育完成后，将NC膜浸于5％的脱脂牛奶溶液(0.25g/ml)中封闭1h；

(5)用PBST溶液洗脱NC膜，共摇洗3次，每次5min；

(6)将摇洗过后的NC膜稍稍晾干后浸于稀释1000倍的一抗溶液中，4℃过夜；

(7)用PBST洗脱NC膜，摇洗3次，每次5min；

(8)将摇洗过后的NC膜稍稍晾干后浸于稀释2000倍的二抗溶液中，室温，1h；

(9)用PBST洗脱NC膜，摇洗3次，每次5min；

(10)将洗脱后的NC膜晾干后，滴加DAB显色液(先配现用，注意避光)避光反应3～5min后，用水冲洗终止反应。观察显色结果，有显色斑点的说明抗原抗体可以反应，即抗体能够检测出该浓度下的抗原，若没有显色，说明抗体不能检测出该浓度下的抗原。

从反应结果来看，该抗体可以检测出稀释了2048倍的拟中肋骨条藻抗原(浓度为1.2×10⁵cell/ml)溶液(见图4)。

实施例6：抗体的特异性检测方法

采用斑点杂交的方法测定抗体的特异性，具体步骤为：

(1)在NC膜(硝酸纤维素膜)上画取1cm×1cm方格；

(2)将6种藻原液(约10⁶cell/ml)分别滴加在方格中，每格2μL，每种藻细胞作为一个实验组，每组设置8个平行样；

(3)将滴加好抗原的NC膜于水浴锅中孵育，37℃，0.5h；

(4)孵育完成后，将NC膜浸于5％的脱脂牛奶溶液(0.25g/ml)中封闭1h；

(5)用PBST溶液洗脱NC膜，共摇洗3次，每次5min；

(6)将摇洗过后的NC膜稍稍晾干后浸于稀释1000倍的一抗溶液中，4℃过夜；(7)用PBST洗脱NC膜，摇洗3次，每次5min；

(8)将摇洗过后的NC膜稍稍晾干后浸于稀释2000倍的二抗溶液中，室温，1h；

(9)用PBST洗脱NC膜，摇洗3次，每次5min；

(10)将洗脱后的NC膜晾干后，滴加DAB显色液(先配现用，注意避光)避光反应3～5min后，用水冲洗终止反应。观察显色结果，有显色斑点的说明抗原抗体可以反应，即抗体能够检测出该抗原，若没有显色，说明抗体不能检测出该抗原，以此来验证拟中肋骨条藻抗体的特异性(见图5)。

实施例7：抗体快速检测拟中肋骨条藻抗原的实验方法

采用快速斑点杂交的方法检测拟中肋骨条藻抗原，具体步骤为：

(1)在NC膜(硝酸纤维素膜)上画取1×1cm方格；

(2)将拟中肋骨条藻原液(约10⁸cell/ml)稀释成1︰64、1︰128、1︰256、1︰512、1︰1000、1︰2000、1︰4000等7个浓度，并将其分别滴加在方格中，每格2μL。在最后一个方格中滴加PBS溶液2μL代替拟中肋骨条藻溶液作为对照。设置三个实验组，每组采用不同的反应时间组合，编号分别为a、b、c；

(3)不孵育，直接将NC膜浸于5％的脱脂牛奶溶液(0.25g/ml)中封闭，a组封闭30min、b组封闭20min、c组封闭10min；

(4)用PBST溶液洗脱NC膜，共摇洗1次，每次2min；

(5)将摇洗过后的NC膜稍稍晾干后浸于稀释1000倍的一抗溶液中，a组反应60min、b组反应30min、c组反应15min；

(6)用PBST洗脱NC膜，摇洗1次，每次2min；

(7)将摇洗过后的NC膜稍稍晾干后浸于稀释2000倍的二抗溶液中，室温，a组反应30min、b组反应20min、c组反应10min；

(8)用PBST洗脱NC膜，摇洗1次，每次2min；

(9)将洗脱后的NC膜晾干后，滴加DAB显色液(先配现用，注意避光)避光反应3～5min后，用水冲洗终止反应。观察显色结果，有显色斑点的说明抗原抗体可以反应，即抗体能够在该反应时间内检测出该浓度下的抗原，若没有显色，说明抗体不能在该时间内检测出该浓度下的抗原。

从反应结果来看，该抗体至少能够在35min之内检测出稀释了500倍(藻细胞浓度为10⁶个藻细胞/ml)的拟中肋骨条藻液(见图6)。

实施例8：样品的试纸条检测方法

现场样品提取：将被检测样品溶液取100μL滴加在拟中肋骨条藻试纸条玻璃纤维膜样品层上，5～10min后可观察结果。

进行检测时，使用微量移液器吸取一定体积的样品溶液，滴加在玻璃纤维膜样品层2上，样品溶液在毛细作用的拉动下做横向层析流动：样品向玻璃纤维膜吸水层5方向流动，途径载有抗体金标记的赤潮拟中肋骨条藻抗体的玻璃纤维膜抗体标记层3后，将抗体金探针完全复溶，抗原与抗体金探针形成抗体金探针——抗原复合物，抗体金探针——抗原复合物与未结合的抗体金探针继续向前流动至硝酸纤维膜检测层4上固定有捕捉抗体金探针的捕获抗原线6处。当样品中不含有检测物时，抗体金探针就不会在6处形成抗体金探针——捕获抗原复合物，胶体金聚合，呈现阴性条带；如样品中有抗原，则抗原会在吸附抗体金标记的拟中肋骨条藻抗体的玻璃纤维层3处形成抗原——抗体复合物，抗体金探针以及抗原——抗体复合物继续向前流动至硝酸纤维素膜条4上，抗原——抗体复合物会在6处形成抗体金探针——捕获抗原复合物，胶体金聚合，呈现红色阳性条带；形成的抗原——抗体复合物继续前移至固定有抗体金探针二抗的质控线7处，被固定呈现红色的阳性条带，表明该检测试纸条未失效。

实施结果显示，各个时期抗原都能够被本试纸条检测出，在检测线6和质控线7都有显色。而没有拟中肋骨条藻的海水只在质控线上显示，检测线上无法检测到。结果见图7。

为了检测浓度梯度，将拟中肋骨条藻进行梯度稀释，分别进行检测，发现随着浓度的下降，阳性检测线逐渐减弱，证明本发明可以检测到的最低浓度是3.20×104cell/ml；见图8。

将其他几种藻与拟中肋骨条藻分别进行检测，考察本发明的特异性，结果证明只有拟中肋骨条藻有阳性反应，其余藻均为阴性，说明本发明有很好的特异性，能够与其他藻进行区分，结果见图9。

表1 ELISA方法检测抗体效价的实验结果记录表

由表1可看出，对兔子和小鼠进行注射免疫，共免疫五次，每次免疫间隔一周，并于最后一次免疫后取全血离心纯化后作为抗体备用。将抗体倍比稀释成若干个浓度，用ELISA的方法使之于抗原进行反应，并用酶标仪读取A₄₅₀的吸光度值。

表2 ELISA方法确定一抗、二抗最佳使用浓度的实验结果记录表。

将一抗、二抗分别倍比稀释成若干个浓度并进行两两组合，在ELISA实验中，分别用这些组合中所对应的一抗、二抗稀释浓度与拟中肋骨条藻进行反应，用酶标仪读取A₄₅₀、A₆₂₀的吸光度值。

表3为表2中数据经过处理后的记录表。

表3

本发明给出了一种基于胶体金免疫层析分析技术(gold immunochromatography，GICA)检测拟中肋骨条藻试纸，并根据试纸条显色结果的区别，判别水体中藻细胞的大致浓度，从而对赤潮发生的可能性做出预测，包括塑料载体板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜。检测试纸条硝酸纤维层、玻璃纤维层分别用胶固定在塑料载体板上；检测试纸条硝酸纤维素膜上设有拟中肋骨条藻抗原标记线、质控线；吸水玻璃纤维素膜层置于硝酸纤维膜检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有胶体金标记的小鼠抗拟中肋骨条藻单克隆抗体的玻璃纤维素膜抗体标记层。利用试纸条显色结果差异，建立颜色信息数据和藻细胞浓度之间的拟合关系，并最终实现通过显色信息判断藻细胞的大致浓度。本发明为常规环境监测、渔业养殖水体检测、以及赤潮生效过程监测的现场实验，提供快速简便的对赤潮多发藻进行快速检测方法，并能及时提供藻细胞浓度的参考数据，为赤潮藻爆发提供预警，以便及时采取应对措施，减少经济损失。

Claims (10)

1.拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条，其特征在于设有塑料载体板、玻璃纤维膜样品层、玻璃纤维膜抗体标记层、硝酸纤维膜检测层和玻璃纤维膜吸水层；所述玻璃纤维膜样品层、玻璃纤维膜抗体标记层、硝酸纤维膜检测层和玻璃纤维膜吸水层依次胶合固定在塑料载体板的一侧；所述硝酸纤维膜检测层上设有拟中肋骨条藻抗原检测线和二抗质控线；所述玻璃纤维膜吸水层胶合在硝酸纤维膜检测层的右端上；所述塑料载体板的中部设有硝酸纤维膜检测层，在硝酸纤维膜检测层与玻璃纤维膜样品层之间设有载有胶体金标记的拟中肋骨条藻抗体的玻璃纤维膜抗体标记层，所述玻璃纤维膜抗体标记层的一端置于玻璃纤维膜样品层下并与塑料载体板胶合，玻璃纤维膜抗体标记层的另一端设置在硝酸纤维膜检测层上并与硝酸纤维膜检测层胶合。

2.如权利要求1所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条，其特征在于所述硝酸纤维膜检测层上的二抗质控线包被有羊抗鼠IgG；所述玻璃纤维膜抗体标记层上载有胶体金标记的小鼠抗拟中肋骨条藻单克隆抗体。

3.如权利要求1所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条，其特征在于所述胶体金标记是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应，并最终通过反应结果输出藻细胞浓度；胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金；利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合，根据胶体金的物理特性，加上结合物所具有的免疫-生物学特性，使其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用；所述还原剂包括白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸；所述胶体金的物理特性包括高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应。

4.如权利要求1～3所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：

通过已知拟中肋骨条藻浓度样品试验，确定检测藻细胞样品需要的捕获抗原浓度，在膜上划检测线，得拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条。

5.如权利要求1～3所述拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条的使用方法，其特征在于所述方法如下：

将被检测样品溶液取出80～100μL，直接滴在拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条加样处，最快3min平均约15min后观察结果，显色稳定后，根据不同浓度抗原与抗体反应后在拟中肋骨条藻的免疫层析检测分析试纸条上显示颜色的不同，建立颜色深浅与藻细胞浓度之间的关系，得到颜色深浅与藻细胞浓度之间的拟合关系，然后通过将显色结果与比色板进行比对，估算出藻细胞浓度。

6.拟中肋骨条藻的免疫层析检测方法，其特征在于所述方法如下：

建立以GICA技术为基础，通过提取显色结果中的颜色信息，对应到程序当中设置的颜色信息和藻细胞之间的拟合关系公式，得出藻细胞浓度。

7.抗体金探针的制备方法，其特征在于所述抗体金探针为胶体金标记的抗体，其制备方法如下：

采用胶体金制备方法，优化胶体金标记的实验条件，取得稳定高效的抗体金探针，透析纯化目标藻抗体，检验制备的胶体金的颗粒直径、均匀度指标，制备胶体金，得抗体金探针；所述胶体金制备方法采用抗坏血酸还原法、鞣酸—柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法中的一种；所述胶体金为20～30nm的胶体金，4℃保存。

8.如权利要求7所述抗体金探针的制备方法，其特征在于将标记好的抗体金探针在蔗糖或硅胶中浓缩保存，选用凝胶过滤法纯化抗体金探针，用牛血清白蛋白作稳定剂，除去其中未标记的抗体，未反应的胶体金以及在标记过程中形成的各种聚合物，对纯化后免疫金探针的特异性、敏感性进行鉴定，判断其是否仍保持很好的生物学活性。

9.多克隆抗体和单克隆抗体的制备及纯化方法，其特征在于将处理好的藻细胞用0.5mlPBS重悬，混匀，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，乳化程度尽量完全；家兔通过背部皮下多点注射的方式进行免疫；免疫剂量为每只家兔4×10⁶个细胞，每隔一周免疫一次，共免疫四次，最后一次免疫后一周取全血；采集的血液室温放置2h，然后离心分离血清；对兔抗血清进行亲和层析柱纯化处理后，去除大部分血清杂蛋白从而IgG得到富集。

10.胶体金探针玻璃纤维素膜的制备方法，其特征在于将玻璃纤维素膜在免疫金探针溶液中浸泡后晾干。