CN103675283A - 中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法，其中，该方法包括步骤：（a）通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物：(b)酶标板的准备：(c)试验试剂的配置和稀释：将浓缩洗涤液混合均匀（如果里面有晶体，要充分溶解混匀后再使用），按照浓缩洗涤液和去离子水（或者蒸馏水）1:19的比例稀释后放4℃储存备用；(d)选用双抗体夹心ELISA方法来完成抗体试验，加入封闭液，对取出的微孔条进行封闭处理：（e）用酶标仪单波长450nm或者双波长450nm/630nm检测参与反应的酶标二抗在显色后的OD值（用单波长测定时，需要用空白对照孔调零），记录结果，计算浓度。本发明的检测方法具有特异、灵敏、高效、易操作、造价低廉等优点，且能同时分析大量的样本，是一种对目标抗原进行定性定量分析的有效手段。

Description

中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法

技术领域

本发明属于利用免疫学方法检测海洋环境中微型生物的技术领域。具体地说，本发明涉及中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法和试剂盒，及其用于检测中肋骨条藻的用途。

背景技术

中肋骨条藻(Skeletonema costatum)是一种在世界范围内广泛存在的浮游植物，也是我国近海常见的甲藻优势种之一。本种是我国近海常见的赤潮生物，曾经有多次引发赤潮的报道，会引起大量鱼类死亡、贝类和人中毒事件，给海洋渔业和人类健康带来巨大威胁。因此，及时、准确、快速地检测中肋骨条藻，随时了解其在海洋中的动态变化具有重要意义。

在分类学上，中肋骨条藻(Skeletonema costatum)属于硅藻门（Bacillariophyta），圆筛藻目(Coscinodiscales)骨条藻科（Skeletonemaceae Lebour），骨条藻属（Skeletonema）。单细胞浮游植物，细胞透镜形或圆柱形，壳面圆而鼓起，着生一圈细长的刺，与邻细胞的对应刺相接组成长链。细胞间隙长短不一，往往大于细胞本身的长度。传统的鉴别方法，即从形态学上区分中肋骨条藻，主要是利用光学显微镜直接观察和计数，操作时存在一定困难，且过程烦琐，费时、费力，当样品量多时工作量极大，主要用于藻的定性和分离，而不适用于藻的定量研究。因此，发展用于快速检测中肋骨条藻的新方法和新技术极具现实意义。但是，目前国内国际关于这方面的研究进展不大，尚未形成非常有效的对藻类进行定性和定量测定的成熟技术。

基于抗体技术的双抗体夹心ELISA方法具有特异、灵敏、高效、易操作、造价低廉等优点，且能同时分析大量的样本，是一种对目标抗原进行定性定量分析的有效手段。目前，双抗体夹心ELISA方法主要在医学检测和微生物学检测研究中应用，尚未用于对藻细胞PCNA蛋白抗原进行检测的报道。另外，虽然藻细胞抗体的制备过程简单，但不易获得高特异性的抗体。

因此，本领域迫切的需要一种中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法。

发明内容

因此，在本发明的第一个方面，公开了中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法，包括步骤：

(a)将制备的中肋骨条藻的酶标板，选取适量的微孔条固定于酶标板的支架上，对其微板孔进行编号，平衡至室温（18-25℃）备用。微板开封以后，剩下的在密封袋中密封，4℃保存。；

(b)选用双抗体夹心ELISA方法来完成抗体试验，加入封闭液，对取出的微孔条进行封闭处理：在反应孔中加入中肋骨条藻SD缓冲液25ul。在相对应的微板孔中分别加入75ul中肋骨条藻标准样品（中肋骨条藻标准样品S1，S2，S3，S4，S5，S6）和待测样品，在37℃条件下温育30分钟后用配制好的洗涤液充分洗涤5次，然后扣干（每次应该保持30-70秒钟浸泡时间）。在每个反应孔中加入100ul酶标抗体（中肋骨条藻抗体ED），在37℃条件下温育30分钟。酶反应完成后，用配制好的洗涤液充分洗涤5次，洗涤后扣干（每次应保持30-60秒浸泡时间）。在每个反应孔中加入抗体显色A液和抗体显色B液各50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色反应30分钟，最后在每孔中加入50ul终止液，终止反应；

(c)用酶标仪单波长450nm或者双波长450nm/630nm检测参与反应的酶标二抗在显色后的OD值（用单波长测定时，需要用空白对照孔调零），记录结果，计算浓度。

在该方面的一个优选实施方式中，抗中肋骨条藻抗体是多克隆和单克隆抗体。更优选的是，多克隆抗体是通过用中肋骨条藻细胞、细胞裂解物或细胞分离组分免疫动物制备的，优选动物选自兔、鼠、豚鼠、鸡、羊、牛、马、狗、猪。

在该方面的另一个优选实施方式中，步骤(c)的检测是通过抗中肋骨条藻多克隆抗体的二抗，其中二抗与标记物偶联。优选标记物选自放射性同位素、生物素、酶、荧光素或化学发光物质。更优选的酶是辣根过氧化物酶。

在该方面的还有一个优选实施方式中，固相载体是酶标板。

在本发明的第二个方面，公开了一种试剂盒，含有：

(a)固定有抗中肋骨条藻的单克隆抗体的固相载体；

(b)抗中肋骨条藻PCNA蛋白的多克隆抗体；

(c)偶联有标记物的二抗，针对抗中肋骨条藻多克隆抗体。

在本发明的第三个方面，公开了上述试剂盒的用途，用于检测中肋骨条藻细胞。

附图说明

图1显示了实施例3中用已知浓度的系列稀释的中肋骨条藻定标绘制的标准曲线。

具体实施方式

本发明的目的是提供中肋骨条藻免疫学检测的方法，它可以客观、准确地对该藻进行检测。具体包括：本发明提供的检测方法，即双抗体夹心ELISA法，以专一性地识别中肋骨条藻的抗体作为基础。

抗体的产生

本发明所述的抗体可以经由中肋骨条藻免疫实验动物而获得，这些实验动物是本领域技术人员所熟知的，通常包括（但不局限于）兔、鼠、猪、狗、牛、羊、马等。特异性的抗体可以直接使用，另一方面抗体的特异性可以经由一些常规的手段，如抗体封闭技术等，得到提高，这也是为本领域内技术人员熟知的，另外，抗体本身也可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记而进行使用。

本发明所述的抗中肋骨条藻抗体具有较好的种特异性。利用双坑体夹心ELISA测定所述的抗体与其它藻之间的交叉反应率，结果表明它只能识别中肋骨条藻而不识别其它藻，故可用于中肋骨条藻的定性鉴别。

本发明所述的二抗可以经由直接购买通用的二抗或由一种动物的IgG免疫另一种实验动物而获得，这一技术是本领域技术人员所熟知的。

与二抗偶联的标记物可以是一直接可检测基团，如金属溶胶(如金溶胶)、发色团或荧光团(如花青、酞菁、部花青、三苯基甲基、马菁)等的结合位点，见应用化学论题，红外吸收发色团、M.Matsuoka编，Plenum Press，New York，NY，1990，应用化学论题，染料的化学和应用，Waring等，Plenum Press，New York，NY，1990，和荧光探针和研究化学手册，Haugland，Molecular Probes，Inc.1996,和放射性标记、酶、磁性颗粒，浊度诱导剂等的结合位点，或它可已携带这样的可直接检测的基团。

酶联免疫检测技术

酶联免疫检测技术具有灵敏度高（可百倍于常规检测技术）、操作简便、步骤可控、高效快速等优点，且能同时分析大量的样本，是一种对目标抗原进行定量分析的有效手段。

标准曲线的确定

(1)以制备的中肋骨条藻的单抗包被酶标板，用封闭液封闭，孵育后洗板，加入已知数量的中肋骨条藻细胞破碎液，加入中肋骨条藻的多克隆抗体稀释液，孵育后洗板，加入酶标二抗溶液，孵育，洗板后加入酶反应底物，孵育后加入终止液终止反应；

(2)用酶标仪测定板上各孔的吸光值，经过数据转换后，得出中肋骨条藻定量检测的标准曲线，其线形范围经过计算得出直线方程，根据得到的方程对待测样品中的中肋骨条藻进行定量。

用酶标仪测定板上各孔的吸光值，以已知浓度的中肋骨条藻细胞浓度进行梯度稀释作为横坐标，酶标仪检测得到的OD值为纵坐标，绘制出中肋骨条藻定量检测的标准曲线，找出其线性范围，线性相关系数必须在0.99以上。

本发明的最主要理论基础是特异性的抗体可以专一地识别特定的抗原决定簇，因而可对抗原进行定性和定量检测。该方法的基本原理如下：将制备的抗中肋骨条藻的单克隆抗体包被于固相载体上（如酶标板等），经封闭后，先加入双抗体夹心抗原（即含有目标藻的标准品或待检测样品），反应一段时间后，洗掉未反应的抗原，然后加入多克隆抗体。这样，固相上的单克隆抗体和液相中的抗原就会结合，洗掉未反应的抗原，参见反应的抗原就会与后面加入的多克隆抗体结合，洗掉未反应的多克隆抗体，加入酶标二抗，通过检测监测最后与多抗反应的酶标二抗的量，进而计算得出抗原的浓度，得到待测溶液中藻细胞的浓度，因此可准确地对未知样品进行定量测定。

这种分析方法不仅克服了中肋骨条藻常规检测中的缺点，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。

本发明首次提供了快速、简便、大批量定量检测该藻的方法，使监测某海区或养殖场内海水中中肋骨条藻的动态变化成为可能。通过监测到的动态数据，可以掌握海水污染状况，并即时做出调整以减少经济损失；同时，将这些动态数据与其他数据(诸如营养盐、其他物种的数量、气象资料等)结合，可为科学研究海洋生态中各因素之间的相互影响关系提供一些有益帮助。

以下通过实施例进一步说明本发明：

实施例1

本发明所用的中肋骨条藻藻种由中国海洋大学生命科学与技术学部提供。通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物。所用的培养基是常规的f/2培养基，培养条件为：光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lx，培养温度为22℃～25℃。

处于对数生长期的中肋骨条藻培养液，用0.45um的醋酸纤维膜过滤，得到滤膜，记录体积。将得到的滤膜放入5ml离心管中，加入2ml SD缓冲液，超声波破碎2min，得到中肋骨条藻样品溶液，与等体积的福氏完全佐剂（SIGMA公司）混合乳化，乳化程度尽量完全，乳化物用于免疫小鼠(购自中科院上海生物工程研究中心动物房)，选择皮下注射和肌肉注射方式，剂量为107个细胞/鼠。间隔两周后加强免疫，除佐剂换为福氏不完全佐剂(购自SIGMA公司)外，其它步骤不变，之后每隔两周加强免疫一次。从第3次加强免疫后一周，鼠耳静脉取血，分离血清，用常规ELISA检测血清效价，当血清效价到达较高水平时，不再免疫，采集小鼠全血清，检验后分装保存于-20℃。

实施例2

本实施例选用了胶州湾常见的几株优势浮游植物作为参照藻，它们是：旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）、米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)、裸甲藻(Gymnodinium sp)、诺氏海链藻(Thalassiosiranordenskioeldii)、尖刺伪菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、膜质舟形藻(Navicula membranacea)，它们均分离自胶州湾天然海水，通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物。按实施例1所述的方法培养和收集这些藻。

用双抗体夹心ELISA步骤进行抗中肋骨条藻抗血清的特异性鉴定。所有藻用1ml PBS重悬浮，显微镜计数后，取相同细胞量（3.2×10⁶）悬浮于PBS(终体积1ml)。各个海藻分别用PBS稀释成浓度梯度，按照施例1所述处理。

将制备的中肋骨条藻的酶标板，选取适量的微孔条固定于酶标板的支架上，对其微板孔进行编号，平衡至室温（18-25℃）备用，在反应孔中加入中肋骨条藻SD缓冲液25ul，在相对应的微板孔中分别加入75ul中肋骨条藻标准样品和待测样品，在37℃条件下温育30分钟后用配制好的洗涤液充分洗涤5次，然后扣干（每次应该保持30-70秒钟浸泡时间）。在每个反应孔中加入100ul酶标抗体（中肋骨条藻抗体ED），在37℃条件下温育30分钟。酶反应完成后，用配制好的洗涤液充分洗涤5次，洗涤后扣干（每次应保持30-60秒浸泡时间）。在每个反应孔中加入抗体显色A液和抗体显色B液各50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色反应30分钟，最后在每孔中加入50ul终止液，终止反应。用酶标仪单波长450nm或者双波长450nm/630nm检测参与反应的酶标二抗在显色后的OD值（用单波长测定时，需要用空白对照孔调零），记录结果。根据实验所得数据作出曲线，根据结果算出各个海藻与抗中肋骨条藻抗血清之间的交叉反应率，结果列于表1。

表1各海藻与抗中肋骨条藻抗血清的交叉反应率(%)

从表中可以看出，以中肋骨条藻的交叉反应率为标准（100%），其他海藻的交叉率都在3%以下，这样的反应率是非常低的，说明抗中肋骨条藻抗血清有很高的特异性，可以专一地识别中肋骨条藻，因此可用于中肋骨条藻的定性检测。

因此，对于某待检样品，以本实施例所述的步骤进行双抗体夹心ELISA反应，如果有明显较高的交叉反应率，即可判定该样品中有中肋骨条藻的存在；如果该样品为纯培养物，则可判定该纯培养物为中肋骨条藻。这种定性测定方法的优点是，由于使用的是中肋骨条藻的专一性抗血清，因此能非常准确地检测样品中是否存在中肋骨条藻。

实施例3

1.按实施例1所述的方法培养和收集中肋骨条藻。

2.将制备的中肋骨条藻的酶标板取出，取适量的微孔条，固定在支架上，平衡至室温（18-25℃）备用，加入分别含有0～32*10⁶个细胞的中肋骨条藻梯度稀释液75ul，和中肋骨条藻SD缓冲液25ul，37℃条件下温育30分钟，加入100ul抗体稀释液(1:2000)，37℃孵育30分钟后洗板，加入酶标二抗溶液(羊抗兔IgG-HRP,稀释5000倍)，37℃孵育30分钟，洗板后加入酶反应底物TMB基质液，孵育30分钟后加入2mol/L硫酸终止反应，读取板上各孔450nm处的吸光值。

3.标准曲线：以梯度稀释的中肋骨条藻的标准样品藻液为例进行破碎处理后按照双抗体夹心ELISA方法的步骤得到实验结果。最后获得的曲线方程是：y=0.0575x+0.0957，相关系数R2=0.9932，x是103个/毫升，y是OD值），本试剂盒的检测限度最小浓度为1.0*103个/毫升。图1显示了实施例3中用已知浓度的系列稀释的中肋骨条藻定标绘制的标准曲线。

4.定量计算和分析：

如步骤2所述，加入待测样品。根据待测样品的吸光值，代入标准曲线的线性方程，即可方便地计算出待测样品中中肋骨条藻细胞的数目，对应的原始水样中中肋骨条藻的浓度也可经过简单计算得出结果。

实施例4

根据实施例3所述的方法，对采自青岛胶州湾水域的6份海水样品进行了中肋骨条藻的双抗体夹心ELISA定量检测。对这6份海水样品，分别用双抗体夹心ELISA法和显微计数法检测后，结果列于表2。

表2海水样品中中肋骨条藻数目的定量结果

表2中数据为50微升加样液（相当于250毫升原始海水样品）中中肋骨条藻的细胞数目（个），均为5次测定结果的平均值±标准差。经比较分析表2中的数据，发现这两种方法所获的定量结果基本相同。说明用双抗体夹心ELISA检测中肋骨条藻，可获得与常规定量方法一样准确的效果。

本发明中，发明人成功地制备了高特异性的抗中肋骨条藻单克隆和多克隆抗体，并建立了双抗体夹心ELISA方法，应用该方法可定性定量地检测中肋骨条藻。发明人在世界上首次将双抗体夹心ELISA方法用于藻细胞的定性定量检测，并取得了好的结果。

本方法的优点：本方法最大的优点是能同时进行定量和定性检测，通过该方法既可知道待检样品中是否有中肋骨条藻存在，还可同时知道该藻的数目有多少。本方法的另一个明显的优点是定量结果准确。

另外本方法操作过程简单、省时，整个过程2小时内即可全部完成，可以实现海区中中肋骨条藻的动态跟踪监测。

Claims (6)

1.一种中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法，其特征在于，该方法包括步骤：

（a）通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物：所用的培养基是常规的f/2培养基，培养条件为：光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lx，培养温度为22℃～25℃；处于对数生长期的中肋骨条藻培养液，用0.45um的醋酸纤维膜过滤，得到滤膜，记录体积。将得到的滤膜放入5ml离心管中，加入2ml SD缓冲液，超声波破碎2min，得到待检测的样品溶液；

(b)酶标板的准备：将制备的中肋骨条藻的酶标板，选取适量的微孔条固定于酶标板的支架上，对其微板孔进行编号，平衡至室温（18-25℃）备用；微板开封以后，剩下的在密封袋中密封，4℃保存；

(c)试验试剂的配置和稀释：将浓缩洗涤液混合均匀（如果里面有晶体，要充分溶解混匀后再使用），按照浓缩洗涤液和去离子水（或者蒸馏水）1:19的比例稀释后放4℃储存备用；

(d)选用双抗体夹心ELISA方法来完成抗体试验，加入封闭液，对取出的微孔条进行封闭处理：在反应孔中加入中肋骨条藻SD缓冲液25ul；在相对应的微板孔中分别加入75ul中肋骨条藻标准样品（中肋骨条藻标准样品S1，S2，S3，S4，S5，S6）和待测样品，在37℃条件下温育30分钟后用配制好的洗涤液充分洗涤5次，然后扣干（每次应该保持30-70秒钟浸泡时间）；在每个反应孔中加入100ul酶标抗体（中肋骨条藻抗体ED），在37℃条件下温育30分钟。酶反应完成后，用配制好的洗涤液充分洗涤5次，洗涤后扣干（每次应保持30-60秒浸泡时间）；在每个反应孔中加入抗体显色A液和抗体显色B液各50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色反应30分钟，最后在每孔中加入50ul终止液，终止反应；

（e）用酶标仪单波长450nm或者双波长450nm/630nm检测参与反应的酶标二抗在显色后的OD值（用单波长测定时，需要用空白对照孔调零），记录结果，计算浓度。以梯度稀释的中肋骨条藻的标准样品藻液为例进行破碎处理后按照双抗体夹心ELISA方法的步骤，最后获得的曲线方程是：y=0.0521x+0.0536，相关系数R2=0.999（x是103个/毫升，y是OD值），本试剂盒的检测限度最小浓度为1.0*103个/毫升。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单克隆抗体和多克隆抗体是通过用中肋骨条藻细胞、细胞裂解物或细胞分离组分免疫动物制备的，所述动物选自兔、鼠、豚鼠、鸡、羊、牛、马、狗、猪。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述标记物选自放射性同位素、生物素、酶、荧光素或化学发光物质。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶。

5.一种使用如权利要求1所述的检测方法进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：

(a)固定有用中肋骨条藻免疫动物制备单克隆抗体；

(b)抗中肋骨条藻细胞的多克隆抗体；

(c)偶联有标记物的二抗，针对抗中肋骨条藻细胞多克隆抗体。

6.权利要求5所述的试剂盒的用途，其特征在于，该试剂盒用于检测中肋骨条藻细胞。

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