CN105510577B

CN105510577B - 一种快速多点定标定量检测血液多种分析物的方法

Info

Publication number: CN105510577B
Application number: CN201510866062.5A
Authority: CN
Inventors: 李欢; 顾晓慧; 葛志兵
Original assignee: SHANGHAI AIRUIDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI AIRUIDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2018-02-23
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: CN105510577A

Abstract

本发明提供了一种快速多点定标定量检测血液多种分析物的方法。所述方法包括以下步骤：(1)提供一待测样品和一测试片；(2)将所述待测样品滴加于所述测试片的样品垫上，使得所述待测样品向所述吸收垫方向流动，并流经所述的结合区、第一质控区、检测区和第二质控区；(3)分别读取第一质控区中的第一质控线的光学强度A1和第二质控区中所述第二质控线的光学强度A2；以及读取所述检测区中各检测线的光学强度Pi；以及(4)将所述光学强度Pi与所述光学强度A1和A2进行比较，从而分别得出n种分析物中各种分析物的存在与否和/或定量检测结果。

Description

一种快速多点定标定量检测血液多种分析物的方法

技术领域

本发明涉及检测领域。具体地，本发明涉及一种非诊断性地多点定标定量检测血液多种分析物的方法。

背景技术

免疫金标记技术是特异、快速、简便、准确率高的体外诊断方法，其广泛应用于医疗诊断领域，如国内厂家艾博的血筛项目、万孚的毒品、热带病项目、康华的优生优育不孕不育产品，艾德蓝十字大卫的早孕排卵项目、南京基蛋的心肌类项目、奥普的结核项目。但是各个厂家在精确定量的应用上却面临背景干扰大、检测指标少的缺陷。

试纸的反射测光方法常应用于尿、血液样本的测定当中。目前这种试纸及测定仪器和日常的尿试纸等广泛使用于居民健康诊断及医院的筛查当中。应用上，一种吸收垫含有一种检查项目，例如糖、蛋白、胆红素、血红蛋白、尿胆素等常见项目。这种试纸的读取方式是通过固定仪器的光学测定部分依次移动试纸上的反应部分，利用反射测光来测取浓度。另外,一种做法则是固定试纸位置，通过移动光学测定部分来测取浓度。

但是，目前技术只可以检测一种分析物，并且使用一点定标技术，实验结果误差较大，测定结果的可信度较低。

因此，本领域迫切需要开发一种快速高效、多点定标定量地精确检测血液多种分析物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非诊断性地多点定标定量检测血液多种分析物的方法及装置。

在本发明的第一方面，提供了一种非诊断性地用于检测样品中的多种分析物的方法，所述分析物为n种，n为≥2的正整数，所述方法包括以下步骤：

(1)提供一待测样品和一测试片，其中所述测试片包括：样品垫、结合区、第一质控区、检测区、第二质控区、和吸收垫；

其中，所述结合区包含用于检测所述多种分析物的检测抗体，所述检测抗体包括n种特异性抗体，每种特异性抗体分别针对所述多种分析物中每种分析物，并且所述的检测抗体标记有可检测的标记物；

并且所述的检测区含有m条检测线，其中m为正整数且m≥n，各检测线分别用于捕获一种所述分析物与其特异性抗体结合所形成的复合物；

所述的第一质控区含有至少一条第一质控线，所述第一质控线用于捕获所述第一质控物与其特异性抗体结合所形成的复合物；

所述的第二质控区含有至少一条第二质控线，所述第二质控线用于捕获所述第二质控物与其特异性抗体结合所形成的复合物；

(2)将所述待测样品滴加于所述测试片的样品垫上，使得所述待测样品向所述吸收垫方向流动，并流经所述的结合区、第一质控区、检测区和第二质控区；

(3)分别读取第一质控区中的第一质控线的光学强度A1和第二质控区中所述第二质控线的光学强度A2；以及读取所述检测区中各检测线的光学强度Pi，其中i＝1到n；以及

(4)将所述光学强度Pi与所述光学强度A1和A2进行比较，从而分别得出n种分析物中各种分析物的存在与否和/或定量检测结果。

在另一优选例中，所述的光学强度包括：颜色信号强度。

在另一优选例中，所述光学强度与所述检测线上形成的复合物浓度为二次函数关系。

在另一优选例中，在所述步骤(4)中，按下式计算质控物的浓度：

C1＝(A1-b)/a

C2＝(A2-b)/a

式中，a与b分别为一常数。

在另一优选例中，a和b分别为“浓度－信号强度”标准曲线(拟合的直线)的斜率和截距。

在另一优选例中，在所述步骤(4)中，按下式计算各分析物的浓度：Ci＝(C1+C2)(Pi-P_blank)/(A1+A2-2P_blank)，式中，

Ci为第i个检测区检测物浓度，

C1与C2为质控物浓度，

Pi为检测区第i个检测区的信号强度，

P_blank为光学背景的信号强度，

A1与A2为质控区的信号强度。

在另一优选例中，所述的信号强度包括光学强度。

在另一优选例中，所述的第一质控物和第二质控物是相同的，或不同的。

在另一优选例中，所述的第一质控物和第二质控物选自下组：抗兔多克隆抗体、抗羊多克隆抗体、抗驴多克隆抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的可检测标记物包括金纳米颗粒。

在另一优选例中，所述样品垫区域为测试片近端，所述吸收区为测试片远端，所述第一质控线位于近端，所述第二质控线位于远端，所述第一质控线与所述第一检测线的距离为1-10mm，较佳地为2-8mm，更佳地为3-6mm，所述第二质控线与所述第m条检测线之间的距离为1-10mm，较佳地为2-8mm，更佳地为3-6mm。

在另一优选例中，所述m条检测线之间的距离为0.5-10mm，较佳地为1-8mm，更佳地为2-6mm。

在另一优选例中，所述检测抗体数目为≥1的整数。

在另一优选例中，所述质控线数目为≥1的整数，优选地为1-3。

在另一优选例中，所述检测线数目为≥4的整数。

在另一优选例中，所述分析物的数量为1-10，优选地为2-6。

在另一优选例中，所述分析物选自下组：血降钙素原、C反应蛋白、肌钙蛋白、肌球素、肌红蛋白、肌酸激酶MB同工酶、B型尿钠肽、D-二聚体、N-端脑利钠肽前体、心型脂肪酸结合蛋白、微量白蛋白、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、β2-微球蛋白、淀粉样蛋白、胱抑素C。

在本发明第二方面，提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)测试片，所述测试片包括样品垫、结合区、第一质控区、检测区、第二质控区、和吸收垫；

(b)第一容器，以及位于所述第一容器中的、用于与待测样品进行混合的第一测试试剂。

本发明第三方面，提供一种如本发明第一方面所述的测试片的用途，用于制备检测生物样本中分析物浓度的制剂盒。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明检测试纸外壳。

图2显示了本发明检测试纸，其上包被有各种单克隆抗体，从左至右依次为：1为样品垫，2为结合垫，3为层析反应膜，4为吸收垫，5为包被抗体，6为底部背衬。

图3显示了同时测定心肌梗塞标志物肌钙蛋白T和肌球素的试纸条，其中7为样品垫，8为结合垫，9为层析反应膜，10为吸收垫，11为底部背衬，12为抗兔包被抗体，13为心肌梗塞标志物肌钙蛋白T包被抗体，14为肌球素包被抗体，15为抗兔包被抗体。

图4显示了定标线检测原理。

图5显示了测试线检测原理。

图6显示了本发明的光学测试原理，其中，1为凸透镜，2为试剂条放置部位，3为CCD摄像机，5为LED光源。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种快速高效、多点定标定量检测血液多种分析物的方法，其中引入多条定标曲线并结合新型的数据处理方法，从而能够更准确地同时检测多个指标。本发明的多指标检测方案，不仅提高临床应用的范围，提供准确的检测结果，而且可以减少测定的时间或次数，降低患者的诊断成本。在此基础上完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

免疫层析技术

免疫层析技术(immunochromatography)是20世纪80年代末90年代初建立的一种快速检测技术。由于免疫层析技术不须进行结合标记物与自由标记物的分离，因而操作简单、快速，非常适合现场检测之用。

免疫层析侧流片(或试纸条、或试纸片)

在本发明中，提供一测试片，所述测试片包括：样品垫、检测区、质控区、和吸收垫。

在本发明中，术语“测流片”、“试纸片”、“试纸条”、“试纸板”、“层析条”、“测试条”具有相同的含义，可以互换使用。

本发明优选的免疫层析试剂条的结构如图1所示，其中包括：

塑料件ABS壳体，其内部可以放置图2所示检测试纸，上部为两个窗口(样品口、层析窗口)，其中样品口为滴加样品位置，层析窗口为样品层析以及观察检测位置。

检测试纸结构如图2所示，其中包括：1为样品垫，2为结合垫，3为层析反应膜，4为吸收垫，5为包被抗体，6为底部背衬，其中包被抗体由a、d质控区和b、c检测区组成。

底部背衬6的长度与检测试纸相同。

样品垫1位于测试条的一端，吸收垫4位于测试条的另一端。

结合垫2位于样品垫1和层析反应膜3之间，在样品垫1的近端和层析反应膜3的远端，临近样品垫1。

层析反应膜3位于结合垫2和吸收垫4之间，通常包被抗体5设置在层析反应膜3上，通过所述层析反应膜连接结合垫2和吸收垫4。优选地，所述层析反应膜3上还设置有两个质控区a与质控区d(也称质控线)，质控区a位于检测区(也称检测线)b、c和结合垫2之间，质控区d位于吸收垫4和检测区b、c之间。

检测试纸条的制造方法，优选地，分别将样品垫1、结合垫2、层析反应膜3、吸收垫4通过粘合剂粘贴于底部背衬6上，即得所述检测试纸条。

在本发明中，所述检测试纸条的各组成元件(或组件)可选用本领域已有的材料制成。

底部背衬6可以用任何稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其上的各组成元件。

在另一优选例中，所述底部背衬6基本上不透水，因为许多测定用水作为扩散介质。

在另一优选例中，底部背衬6由聚合物膜制成，较佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC胶板)。

样品垫1可用任何吸收性材料制成，较佳地，可用纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜、或其组合制成。

结合垫2或层析反应膜3可以用任何材料制成，只要该材料有足够孔隙度从而允许在表面和内部发生流体的毛细管作用。结合垫2或层析反应膜3应有足够的孔隙度，从而允许涂有抗体或抗原的颗粒移动。结合垫2或层析反应膜3还可被含待检测分析物的样品中所用的液体润湿(例如，对于水性液体具有亲水性，对于有机溶剂具有疏水性)。通过例如在美国专利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(这些方法描述了将疏水表面转变成亲水表面)，可以改变其疏水性从而使其具有亲水性以便用于水性液体。可用于制造结合垫2或层析反应膜3的材料包括但不限于：聚脂膜、纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜(polyethersulfone)。

在另一优选例中，结合垫2是用聚脂膜制成的，层析反应膜3是用硝酸纤维素制成的。

吸收垫4可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫4的吸收能力应足够大，以便吸收添加至测试条的液体。适用于吸收垫4的材料的例子包括纤维素和吸水滤纸。

检测试剂盒和检测方法

本发明还提供了可用于检测生物样本中分析物浓度的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

检测装置

本发明的检测装置可以包括：测试条、检测器、光源和计算机。还可以包括一份检测方法的使用说明。其中测试条的工作原理如上所述，任何可用于检测光照强度的方法均可用于本发明的检测装置。

本发明使用一次性快速诊断试剂片，内部放置有层析试纸。层析试纸上的样品垫包被了可检测标记物(优选为金纳米颗粒)标记的多种检测抗体。

当人或动物的体液样品加入后，样品中的待分析物与检测抗体结合并且逐步层析扩散至检测区。检测区为层析反应膜，其上预先包被有多条待分析物的特异性抗体，包被抗体和分析物检测抗体纳米金结合后，会在相应的区域内形成多条颜色深浅不同的检测区带反应线。

在仪器直角的斜上方放置数个光源，且在一定间隔配备镜头，光源照射至试纸的反射光经过光轴上放置的镜头再通过CCD等成像元件，通过免疫层析法展开的检测样本，在出现测试项目与定量相关的2条以上的反应线后再对其强度进行读取，通过自带的CPU对测定项目的浓度进行定量计算。

试剂条反应完全后，需要通过相应的CCD读取每个测试条上C1与C2以及测试线的强度数据，其测试原理如图6所示：其中，3为CCD摄像机，1为凸透镜，5为LED光源，2为试剂条放置部位。当测试条插入后其位置处于2处，经LED光源照明后，其通过凸透镜成像于CCD，CCD的为200-1000像素的直列线性。每次测量10-50次数据后，系统将C1位置作为参考位置，通过C1位置的确定进而确定测试线与C2的位置，避免由于测试线信号较低造成干扰。随后系统去除每次测量的最大值与最小值，剩余数据通过计算得到其平均值，并且四舍五入。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明以人或动物的体液成分为测定对象，使用免疫层析法的原理检测体液中多种样本，对其所展现的反应线或斑点色调的深浅进行读取和定量，使用多点定标方法有效提高定量分析准确度。

(2)本发明可以灵活增加待分析物质的数量至2-5种，同时可以精确定量分析分析物的浓度，在同样的时间内可以得到多种分析物的浓度数据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：同时测定血液中的PCT(降钙素原)、CRP(C反应蛋白)

将所述待测样品滴加于所述测试片的样品垫上，使得所述待测样品向所述吸收垫方向流动，并流经所述的结合区、第一质控区、检测区和第二质控区。

样本从样品垫流到结合区(含有标记鼠抗人CRP单克隆抗体胶体金物质，标记鼠抗人PCT单克隆抗体胶体金物质和标记兔IgG胶体金物质)，并渗析出抗体，到达NC膜，在吸收垫发生毛细现象。

若样本中存在CRP与PCT，则与结合区中的标记抗人CRP与PCT单克隆抗体胶体金物质形成复合体。然后与检测区标记抗人CRP与PCT单克隆抗体胶体金物质反应，产生带红色的线。

另外，不论是否存在CRP与PCT，胶体金垫中的标记兔IgG胶体金物质都会与羊抗兔IgG多克隆抗体发生反应，在C1及C2出现质控线。

如图2所示，左边为样品垫，随后是结合区(金纳米颗粒CRP标记抗体复合物，金纳米颗粒PCT标记抗体复合物，金纳米颗粒兔抗体复合物预包被在结合区中)。

其次为包被抗体区，测试试纸为NC膜，试纸条的中部分别包被有：抗兔多克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗PCT单克隆抗体、抗兔多克隆抗体。

在试纸条的右方放置废液吸收垫。

试纸条放置于如图1所示的试纸条外壳中，样品溶液可以经过样品口加入。

当加入样品后，样品中的抗原与结合区中的金标抗体复合物首先结合，然后通过层析反应逐步扩散至试纸条的中部，在试纸条中部的6条包被抗体随扩散逐步与金标抗原抗体复合物结合，并且形成6条颜色深浅不一的检测线，按照位置与定量计算分别命名为：控制线C1、测试线T_CRP、测试线T_PCT、控制线C2。

反应结束后，将试剂条放入试剂条读取仪器内，直接读取数据。为提高试剂条像素读取的解析能力，读取200-1000像素的数据并且至少进行10次-50次的读取，且在去除其上限值和下限值后，对剩余的数据(每个点的像素)进行平均处理后作为样本集成信息使用。数据形成如下表一所示。

表一测定6个样本的数据

将以上表格数据带入标准曲线得到相应的浓度数据：

1、C1与C2标准曲线为：

y＝ax+b (1)

式中，x为样品浓度，y为信号强度。

标准曲线通过测量一系列标准物质中的金纳米颗粒兔抗体复合物在C1与C2处形成的颜色信号强度Pc与Pd可以确定a与b的值。随后，将式(1)带入上述表格可以得到相应的x值，为金纳米颗粒兔抗体复合物浓度。通过包被兔抗体的量控制可以形成C1处信号比C2处信号低。其中a与b的确定通过测量在C1与C2处包被不同浓度的兔抗体的量，固定金纳米颗粒兔抗体复合物的量得到。出厂批次间的测量值保持稳定。通过回归计算得到Pc与Pd的浓度为Cc与Cd。在实际样品测定中Cc与Cd为出厂时确定的固定值。

即x＝(y-b)/a (2)

通过线性回归计算得到Pc与Pd的浓度为Cc与Cd。

2、将上述结果引入下列公式:

C＝(Cc+Cd)(p-p_blank)/(Pc+Pd-2p_blank) (3)

其中P_blank为空白背景信号，经过计算可以精确定量得到CRP与PCT的浓度。

如上例所示，经过计算得到的结果如下。

表二同时测定CRP与PCT结果

患者编号	CRP浓度ng/mL	PCT浓度ng/mL
			1	8.9	6.5
2	6.4	6.4
			3	2.1	11.6
4	4.1	9.7
			5	6.5	2.1
6	12.6	4.1

实施例2：同时测定血液中的心肌梗塞标志物肌钙蛋白T和肌球素

如图3所示，在结合区处，用抗人肌钙蛋白抗体，抗人肌球素，鼠IgG三种金标记抗体进行混合后干燥处理，在其显色部分别使用羊抗鼠抗体，抗人肌钙蛋白抗体T，抗人肌球素抗体，羊抗鼠抗体进行点膜处理。

加入150μL检测标准分析样本进行反应后用本测定装置进行测定，然后通过上述的计算方法算出定量值。其结果如表所示：

表三同时测定心肌梗塞标志物肌钙蛋白T和肌球素结果

这种测定方式可实现一次操作检测两个项目，且通过增加反应线可实现一次操作检测3到4种项目。

结果讨论：

1.降低背景干扰：

本发明在左右两侧引入两条C1线以及C2线，形成两条定标线，此处为包被抗体与金标检测抗体连接反应(见图4)。由于使用单步抗体-抗体反应，因此检测效率高，可以避免大部分干扰，预先设置C1及C2的检测定标曲线并将此曲线保存于计算机系统，每次反应后通过同时读取C1与C2的信号强度，然后通过标准曲线回归后得到相应的浓度数据。同时，由于C1线作为反应的起始部分，将其作为位置参考点，通过距离精确定位测试线的位置，测量其测试线的强度，由于C1处信号为一强信号有利于精确定位，而测试线为弱信号，此方法可以进一步降低背景干扰。

测试线位置反应为双抗体夹心法(见图5)，而且应用时一般信号较低，精确定量测试线，并且有效降低干扰本发明采用公式(3)所用计算方法，可以减低一部分背景干扰。

2.C2的意义

C2线的引入有两点优势：

首先，C2处为反应完全指示。整个测试反应为层析干式化学法，此发明通过C2的引用可以代表反应的完全与否。

整个反应存在以下三种情况：

1、反应完全。C1处有颜色反应，C2处有颜色反应，测试线部分视样品的含量可以有颜色反应或者没有颜色反应；

2、反应不完全。C1处有颜色反应，C2处没有颜色反应；

3、反应失败。C1与C2均不反应，测试失效。

其次，C2作为定量反应的第二标准位点，每次反应后通过引入C2强度信号，然后通过公式3可以得到精确计算的测试线部分的浓度数据。

3.数据处理

试剂条出厂前经过标准物质的测定而形成标准曲线，并将此数据保存于仪器上的系统当中，C1与C2数据通过回归公式(2)进而得到浓度值为金纳米颗粒兔抗体复合物浓度。再通过公式(3)得到最终测试线的分析物浓度。

通过C1与C2可以免除一部分干扰信号的影响，通过引入数据修正公式(3)可以进一步消除底值部分杂波。

4.多种分析物测定

目前市面上快速免疫分析方法大多只能测定一种分析物，而临床应用上只有一种分析物质往往不能提供有效的诊断信息，需要联合多种分析物进而综合考虑。

如PCT在临床上可以用来作为：a、严重细菌感染的临床鉴别诊断；b、儿科感染等；c、指导抗生素治疗；d、PCT对疾病的愈后意义；e、胰腺炎的鉴别诊断。

如CRP则作为：a、鉴别细菌感染与病毒感染；b、监控感病情变化及术后感染；c、预测心血管病危险；d、用于疾病的随访和监控疗效。

联合CRP与PCT可以综合应用两种分析物的优点，为临床确诊提供更可靠的数据支持。

本发明的优势在于，通过增加试纸条上的检测线数目可以有效增加同时测定的分析物数目，通过灵活配置，可以制作出各种有价值的快速诊断数据。如肿瘤标志物领域，可以同时测定CEA、NSE与serum ferritin，毒品领域可以同时鉴别测试甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、可卡因，这些分析物结合本发明的应用可以快速对上述物质做出定量或者定性鉴别和诊断。

5.结论

本发明提供了一种快速检测生物体液的多组分检测方法以及数据处理方式，使用两条定标线可以有效降低背景干扰，同时通过引入新型的数据处理方法进一步降低了背景的干扰，通过C1确定测试线的位置，避免了测试线信号较低造成的误判，同时由于引入了多种分析物同时测定的概念可以极大的扩大本发明的应用领域，如可将本发明应用于肿瘤诊断领域，毒品鉴别诊断领域，炎症反应诊断领域等等。本发明可以应用于临床、法医、第三方实验室，科研等各个领域。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种非诊断性地用于检测样品中的多种分析物的方法，所述分析物为n种，n为≥2的正整数，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

其中，所述结合区包含用于检测所述多种分析物的检测抗体，第一质控物，第二质控物，所述检测抗体包括n种特异性抗体，每种特异性抗体分别针对所述多种分析物中每种分析物，并且所述的检测抗体标记有可检测的标记物；

并且所述的检测区含有m条检测线，其中m为正整数且m≥n，各检测线分别用于捕获一种所述分析物；

所述的第一质控区含有至少一条第一质控线，所述第一质控线用于捕获所述第一质控物；

所述的第二质控区含有至少一条第二质控线，所述第二质控线用于捕获所述第二质控物；

(3)分别读取第一质控区中的第一质控线的光学强度A1和第二质控区中所述第二质控线的光学强度A2；以及读取所述检测区中各检测线的光学强度Pi，其中i＝1到m；以及

(4)将所述光学强度Pi与所述光学强度A1和A2进行比较，从而分别得出n种分析物中各种分析物的存在与否和/或定量检测结果；且在所述步骤(4)中，按下式计算质控物的浓度：

C1＝(A1-b)/a

C2＝(A2-b)/a

式中，a与b分别为一常数，a和b分别为拟合得到的浓度－信号强度标准曲线的斜率和截距；

且在所述步骤(4)中，按下式计算各分析物的浓度：Ci＝(C1+C2)(Pi-P_blank)/(A1+A2-2P_blank)，式中，

Ci为第i条检测线检测物浓度，

C1与C2为质控物浓度，

Pi为检测区第i条检测线的信号强度，

P_blank为光学背景的信号强度，

A1与A2为质控区的信号强度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物包括金纳米颗粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一质控物和第二质控物选自下组：纳米金标记的兔IgG、纳米金标记的鼠IgG。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品垫区域为测试片近端，所述吸收区为测试片远端，所述第一质控线位于近端，所述第二质控线位于远端，所述第一质控线与第1条检测线的距离为1-10mm，所述第二质控线与第m条检测线之间的距离为1-10mm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质控线总数目为2或3。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物的数量为2-10。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物的数量为2-6。