CN115060888A - 一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法 - Google Patents

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赵星星
陈少忠
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Abstract

本申请公开了一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法，包括如下步骤：步骤一)将检测线抗体溶液和质控线抗体溶液平行的包被在硝酸纤维素膜上，所述检测线抗体溶液中含有新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N2，所述质控线抗体溶液中含有兔抗鸡IgY多克隆抗体；干燥后得到包被抗体的硝酸纤维素膜；步骤二)将胶体金‑新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1结合物和胶体金‑鸡IgY抗体结合物喷涂在胶体金吸附垫上，干燥后得到金标垫；步骤三)使用包被抗体的硝酸纤维素膜和金标垫制作得到新型冠状病毒抗原检测试纸条。

Description

一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法
技术领域
本发明属于新型冠状病毒抗原检测领域，特别涉及一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)，和中东呼吸综合征病毒 (MERS)以及严重急性呼吸综合征病毒(SARS)都属于β冠状病毒，属于人畜共患病原体，可引起动物与人之间的感染，也可引起人与人之间的感染。COVID-19含有刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白、和核衣壳(N)蛋白等标志性蛋白。为了防止病毒的扩散和获得有效的治疗，针对病毒快速准确的诊断就显得尤为重要。目前针对新型冠状病毒的检测方法主要有核酸检测、抗体检测和抗原检测。核酸检测，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，是确诊新冠肺炎的“金标准”，但对样本的处理和运输需要实施一整套非常严格的流程，对检测设备、场地及操作人员都有极高的要求，且检测用时长，因此具有一定的局限性；抗体检测，虽然具有方便快捷、检测用时短，可以弥补核酸检测出现假阴性而造成漏诊的缺点。但又常常由于个别患者血液中含有类风湿因子、自身抗体或肿瘤细胞等因素而易出现假阳性，以及由于人在感染新冠病毒后需要两周左右才能产生抗体，故此检测方法存在一定的漏检窗口期；抗原检测，具有诊断快速、准确、对设备和人员要求低，因此可应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等基层的早期初步筛查。因此，亟需一种更加方便快捷、准确有效的诊断新型冠状病毒抗原检测试剂盒用于早期的筛查诊断。
发明内容
本发明要解决的问题在于一种新型冠状病毒抗原检测试纸条，以用于新型冠状病毒临床诊断的辅助技术手段，具有快速、准确、特异的特点，可应用于临床、医疗机构、科研等领域。本申请采用如下技术方案：
一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
步骤一)将检测线抗体溶液和质控线抗体溶液平行的包被在硝酸纤维素膜上，所述检测线抗体溶液中含有0.7～1.5mg/ml的新型冠状病毒N 蛋白单克隆抗体N2，所述质控线抗体溶液中含有0.5～1.5mg/ml的兔抗鸡 IgY多克隆抗体；干燥后得到包被抗体的硝酸纤维素膜；
步骤二)将含有15～25μg/ml的胶体金-新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1结合物的溶液和含有8～15μg/ml的胶体金-鸡IgY抗体结合物的溶液分别以30～70μl/cm2喷涂在胶体金吸附垫上，干燥后得到金标垫；
步骤三)使用步骤一)中的包被抗体的硝酸纤维素膜和步骤二)中的金标垫制作得到新型冠状病毒抗原检测试纸条。
可选的，所述步骤一)中所述检测线抗体溶液为将新型冠状病毒N 蛋白单克隆抗体N2溶解在Tris-HCl缓冲液中得到；
所述质控线抗体溶液为兔抗鸡IgY多克隆抗体溶解在Tris-HCl缓冲液中得到；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度为25mM，pH为7.0～8.0；所述Tris-HCl 缓冲液中含有150mM的NaCl。
可选的，所述步骤一)中检测线抗体溶液中含有0.9～1.2mg/ml的新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N2，所述质控线抗体溶液中含有 0.7～1.2mg/ml的兔抗鸡IgY多克隆抗体；
可选的，所述检测线与所述质控线的间距控制在距离3.5～5.5mm。
可选的，所述包被抗体的硝酸纤维素膜还经过封闭处理，所述封闭处理的方法为：将包被抗体的硝酸纤维素膜浸没在封闭处理液中30分钟，再干燥；
所述封闭处理液含有质量百分含量为2～10％的封闭蛋白、质量百分含量为0.1～1％的表面活性剂，封闭处理液的pH为7.0～8.0；
可选的，所述封闭处理液含有质量百分含量为5％的封闭蛋白、质量百分含量为0.5％的表面活性剂，封闭处理液的pH为7.0～8.0；
可选的，所述封闭处理液含有0.01M Tris-HCl缓冲液，所述封闭蛋白为牛血清白蛋白，所述表面活性剂为曲拉通100；
可选的，所述封闭液配方为0.01M，pH 7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液，其中包含2～10％BSA、0.1～1％triton X-100。
可选的，所述步骤二)中胶体金-新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体 N1结合物的溶液的制备方法为，将新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1 加入胶体金中，然后进行离心处理，收集沉淀，将沉淀采用复溶液溶解，稀释后得到胶体金-新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1结合物的溶液；
所述胶体金-鸡IgY抗体结合物的溶液的制备方法为，将鸡IgY抗体加入胶体金中，然后进行离心处理，收集沉淀，将沉淀采用复溶液溶解，稀释后得到胶体金-鸡IgY抗体结合物的溶液。
可选的，所述步骤二)中胶体金-新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体S1 结合物的浓度为15～18μg/ml；所述胶体金-鸡IgY抗体的浓度为9～ 12μg/ml。
可选的，所述复溶液中含有质量百分含量8～20％的海藻糖、质量百分含量0.5～1.5％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.05～0.2％的吐温20
可选的，所述复溶液中含有质量百分含量10％的海藻糖、质量百分含量1％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.1％的吐温20。
可选的，所述步骤三)中制作新型冠状病毒抗原检测试纸条的方法为：将包被抗体的硝酸纤维素膜粘贴在底板上；将金标垫贴在靠近检测线一侧的底板上，并与硝酸纤维素膜呈搭接；将滤血垫粘贴在底板上，并与金标垫远离检测线的一侧搭接；将样品垫粘贴在底板上，并与滤血垫远离金标垫的一侧搭接；将吸水垫粘贴再靠近质控C一侧的底板上，并与硝酸纤维素膜搭接。
可选的，所述金标垫和样品垫采用处理液进行预处理，预处理方法为，将金标垫和样品垫置于处理液中浸泡，所述处理液为0.01M，pH 7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液中包含0.1～1％BSA、3％～10％海藻糖、0.1～0.5％Tween-20进行配制；
可选的，处理液为0.01M，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液中包含0.3％BSA、4％海藻糖、0.2％Tween-20进行配制。
本发明的工作原理是：当适量的待测样本加入到试纸条的样本孔(样品垫)中，该样本将在层析作用下沿着向前移动，如果待测样本中含有新型冠状病毒，则该新型冠状病毒的N蛋白首先与金标垫上胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白抗体N1结合形成免疫复合物。样本继续向前移动到达硝酸纤维素膜上的检测线位置，则该免疫复合物会被检测线 (T线)上预先包被的抗新型冠状病毒N蛋白抗体N2捕获，从而在检测线(T线)处形成免疫夹心复合物并出现一条肉眼可见的红色线条，表示新型冠状病毒抗原阳性；金标垫上包被的胶体金标记的鸡IgY抗体随着层析左右继续流向质控线(C线)，被质控线(C线)上预先包被的兔抗鸡IgY多抗捕获，固定在C线上并出现一条肉眼可见的红色线条，表示本次检测结果有效；如果质控线(C线)上未出现红色线条，则表示本次检测结果无效，此样本需用另一检测试剂盒重新进行检测。
本发明的具有以下有益效果：
由发明人通过大量的条件摸索和筛选，最终确定了制备所述的胶体金标记抗体、检测线包被抗体和质控线包被抗体所需的最佳的原料组合及其缓冲液配方，利用胶体金双抗体夹心法原理，检测结果快速准确，特异性强，灵敏度高；
本发明通过对样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜的处理可以显著提高新型冠状肺炎的检出率，并且提高了试纸条的准确性、稳定性，有效降低了假阳性率；
本发明在样品垫和金标垫之间设置了滤血垫，可防止待测样本粘稠而不跑样，同时也可以过滤掉其他大分子干扰物质，提高检测特异性；
本发明填补了免疫学高效检测新型冠状病毒的空白，其快速性及简易操作性尤其适用于基层医疗机构、医疗器械不发达地区及其他人群聚集地，从而及早预防疫情扩散。
附图说明
图1是本发明一种新型冠状病毒抗原检测试纸条的结构示意图。
附图说明：1-PVC底板，2-样品垫，3-滤血垫，4-金标垫，5-检测线，6-质控线，7-硝酸纤维素膜，8-吸水垫；
图2显示了本发明一种新型冠状病毒抗原检测试纸条检测时的判读显色标准。
图3为新型冠状病毒N抗原检测结果。
图4为检测线实验结果。
图5为特异性检测结果。
具体实施方式
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为市售常规试剂产品。
下列实施例中的新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1、N2购自杭州启泰生物公司，货号分别为MNCP09和MNCP12。鸡IgY抗体为百奥莱博有限公司货号F050315、兔抗鸡IgY多抗为北京博奥森生物技术有限公司货号bs-0432R；胶体金试纸条耗材为市售产品。
实施例1
本实施例展示了新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
硝酸纤维素膜的制备
选择5μm～10μm孔径的硝酸纤维素膜，根据需要将膜分切成宽度为 2.5cm，长度为30cm的规格，备用。
用包含150mM NaCl的25mM Tris-HCl缓冲液配制供检测线包被使用的新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N2，抗体浓度为0.7～1.5mg/ml，本实施例中为1.0mg/ml；用包含150mMNaCl的25mM Tris-HCl缓冲液配制供质控线包被使用的兔抗鸡IgY多克隆抗体，抗体浓度为0.5～1.5mg/ml，本实施例中为1.0mg/ml。
选择硝酸纤维素膜的抗体包被面并作好标记，将需包被的检测线和质控线的抗体溶液平行均匀的包被在膜上，且检测线与质控线的间距控制在距离5.0mm，包被好抗体的硝酸纤维素膜在37℃的恒温条件下干燥备用。
配制封闭处理液，分别称量缓冲液、封闭蛋白和表面活性剂，将以上组分直接加入到超纯水中搅拌，直至完全溶解，加超纯水定容至所需体积，充分搅拌均匀，备用；其中配制的封闭处理浸泡液中含有0.01M 缓冲液、质量百分含量为5％的封闭蛋白、质量百分含量为0.5％的表面活性剂，其中，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，封闭蛋白为牛血清白蛋白，表面活性剂为曲拉通100。
将包被了检测线和质控线的膜放于封闭盒中，加入配好的封闭处理液，确保每条膜完全浸没在上述的封闭处理液中30分钟，并保证膜不移动、不重叠，30分钟后将膜从处理槽中取出，将上述的封闭处理液倒掉；用镊子将膜放在吸水纸上稍干，得到包被了抗体的硝酸纤维素膜。然后将包被了抗体的硝酸纤维素膜在37℃的恒温条件下干燥备用。
金标垫的制备
1、配制胶体金复溶液：用电子分析天平称量海藻糖、牛血清白蛋白、吐温20，直接加入到超纯水中搅拌，搅拌直至完全溶解，加超纯水定容至所需体积，充分搅拌均匀，备用；得到的胶体金复溶液中含有质量百分含量10％的海藻糖、质量百分含量1％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.1％的吐温20。
2、用量筒量取需要量的胶体金，按pH7.0～7.5进行调节，用包被液将新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1进行稀释，并按15～25μg/ml浓度标记胶体金(即向胶体金中加入新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1，新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1的终浓度为15～25μg/ml，在本实施例中选择终浓度为18μg/ml)，将新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1加入胶体金中，于磁力搅拌器上搅拌20分钟，加入质量百分含量10％的牛血清白蛋白使其终浓度为1％，搅拌30分钟后离心收集沉淀，用胶体金复溶液按体积百分含量10％复溶，得到胶体金-新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1结合物复溶液，备用。
3、用量筒量取需要量的胶体金，按pH7.0～7.5进行调节，用包被液将鸡IgY抗体进行稀释，并按8～15μg/ml浓度标记胶体金(即向胶体金中加入鸡IgY抗体，鸡IgY抗体的终浓度为8～15μg/ml，在本实施例中选择终浓度为10μg/ml)，将鸡IgY抗体加入胶体金中，于磁力搅拌器上搅拌20分钟，加入质量百分含量10％的牛血清白蛋白其终浓度为1％，搅拌30分钟后离心收集沉淀，用胶体金复溶液按体积百分含量10％复溶，得到胶体金-鸡IgY抗体结合物复溶液，备用。
4、取上述(2)和(3)中的胶体金-新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1 结合物复溶液胶体金-鸡IgY抗体结合物复溶液，用胶体金复溶液按体积百分含量25％进行复溶，按照50μl/cm2喷涂在准备好的胶体金吸附垫上，置于37℃干燥2h，保证空气畅通且气流不能直接吹于胶体金吸附垫上，将干燥好的金标垫放入到装有干燥剂的铝箔袋中，密封保存备用。
组装与裁切
取PVC底板，撕去表面的保护白纸漏出粘合面，将已经包被了抗体的硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板中间，将金标垫裁切成0.6cm×30cm贴在靠近检测线T一侧的PVC底板上，并保持与硝酸纤维素膜呈搭接约 1mm；然后将滤血垫裁切成0.4cm×30cm的条状后粘贴在金标垫远离检测线T一侧的PVC底板上，并保持与金标垫呈搭接约1mm；将样品垫粘贴在滤血垫远离金标垫一侧的PVC底板上，并与滤血垫呈搭接约1mm；将吸水垫粘贴在硝酸纤维素膜靠近质控线C一侧的PVC地板上，并于硝酸纤维素膜呈搭接约1mm，做好标记，备用。将已组装备用的底板，切割成条状试纸，放入到装有干燥剂的铝箔袋中，密封保存备用。
新型冠状病毒抗原检测试纸条结构如图1所示，在PVC底板1上依次重叠搭接有样品垫2、滤血垫3、金标垫4、硝酸纤维素膜7和吸水垫 8；所述硝酸纤维素膜7上设置有间隔的检测线T和质控线C，所述检测线T靠近所述金标垫，所述质控线C靠近所述吸水垫；所述金标垫4上包被有胶体金标记新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N1和胶体金标记的鸡 IgY抗体；所述检测线T上包被新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体N2，所述质控线C上包被兔抗鸡IgY抗体。
实施例2
将实施例1中制备的试纸条用于检测新型冠状病毒N抗原。
分别检测含有新型冠状病毒N抗原的阳性样本和不含新型冠状病毒 N抗原的阴性样本(含25mM Tris-HCl和150mM NaCl的缓冲液)，分别滴加三滴样本至试纸条的样品垫，记录检测线、质控线出现并稳定的时间。判读标准如下：
阴性：仅在质控线出现红色条带；
阳性：检测线和质控线都出现红色条带；
无效：检测线和质控线都不出现红色条带，或只有检测线出现红色条带。
检测结果如图3所示，在5min内检测线和质控线均明显出现红色条带。
实施例3
将实施例1中制备的试纸条用于检测新型冠状病毒N抗原。
分别检测含有新型冠状病毒N抗原的阳性样本进行梯度稀释，同时设立不含新型冠状病毒N抗原的阴性样本(含25mM Tris-HCl和150mM NaCl的缓冲液)为对照，分别滴加三滴样本至试纸条的样品垫，记录检测线、质控线出现并稳定的时间。判读标准如下：
阴性：仅在质控线出现红色条带；
阳性：检测线和质控线都出现红色条带；
无效：检测线和质控线都不出现红色条带，或只有检测线出现红色条带。
检测结果如图4所示，阳性结果在5min内出现红色条带。最低检测限为4800倍稀释(含有新型冠状病毒N抗原浓度为10ng)。
实施例4
将实施例1中制备的试纸条用于检测新型冠状病毒N抗原。
分别检测含有新型冠状病毒N抗原的阳性样本，以及非特异性蛋白 A、B、C、D，其中非特异性蛋白A为RdRp蛋白，非特异性蛋白B为 EthR蛋白，非特异性蛋白C为BSA蛋白，非特异性蛋白D为NS38蛋白；同时设立不含新型冠状病毒N抗原的阴性样本(含25mM Tris-HCl和150mM NaCl的缓冲液)为对照，分别滴加三滴样本至试纸条的样品垫，记录检测线、质控线出现并稳定的时间。判读标准如下：
阴性：仅在质控线出现红色条带；
阳性：检测线和质控线都出现红色条带；
无效：检测线和质控线都不出现红色条带，或只有检测线出现红色条带。
检测结果如图5所示，仅含有新型冠状病毒N抗原的样本出现阳性结果，非特异性蛋白及阴性对照均为阴性结果，证明该试纸条特异性较好。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一)将检测线抗体溶液和质控线抗体溶液平行的包被在硝酸纤维素膜上，所述检测线抗体溶液中含有0.7～1.5mg/ml的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体N2，所述质控线抗体溶液中含有0.5～1.5mg/ml的兔抗鸡IgY多克隆抗体；干燥后得到包被抗体的硝酸纤维素膜；
步骤二)将含有15～25μg/ml的胶体金-新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体N1结合物的溶液和含有8～15μg/ml的胶体金-鸡IgY抗体结合物的溶液分别以30～70μl/cm2喷涂在胶体金吸附垫上，干燥后得到金标垫；
步骤三)使用步骤一)中的包被抗体的硝酸纤维素膜和步骤二)中的金标垫制作得到新型冠状病毒抗原检测试纸条。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一)中所述检测线抗体溶液为将新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体N2溶解在Tris-HCl缓冲液中得到；
所述质控线抗体溶液为兔抗鸡IgY多克隆抗体溶解在Tris-HCl缓冲液中得到；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度为25mM，pH为7.0～8.0；所述Tris-HCl缓冲液中含有150mM的NaCl。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一)中检测线抗体溶液中含有0.9～1.2mg/ml的新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体N2，所述质控线抗体溶液中含有0.7～1.2mg/ml的兔抗鸡IgY多克隆抗体；
优选的，所述检测线与所述质控线的间距控制在距离3.5～5.5mm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述包被抗体的硝酸纤维素膜还经过封闭处理，所述封闭处理的方法为：将包被抗体的硝酸纤维素膜浸没在封闭处理液中30～90分钟，再干燥；
所述封闭处理液含有质量百分含量为2～10％的封闭蛋白、质量百分含量为0.1～1％的表面活性剂，封闭处理液的pH为7.0～8.0；
优选的，所述封闭处理液含有0.01M Tris-HCl缓冲液，所述封闭蛋白为牛血清白蛋白，所述表面活性剂为曲拉通100。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二)中胶体金-新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体N1结合物的溶液的制备方法为，将新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体N1加入胶体金中，然后进行离心处理，收集沉淀，将沉淀采用复溶液溶解，稀释后得到胶体金-新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体N1结合物的溶液；
所述胶体金-鸡IgY抗体结合物的溶液的制备方法为，将鸡IgY抗体加入胶体金中，然后进行离心处理，收集沉淀，将沉淀采用复溶液溶解，稀释后得到胶体金-鸡IgY抗体结合物的溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二)中胶体金-新型冠状病毒S蛋白单克隆抗体S1结合物的浓度为15～18μg/ml；所述胶体金-鸡IgY抗体的浓度为9～12μg/ml。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述复溶液中含有质量百分含量8～20％的海藻糖、质量百分含量0.5～1.5％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.05～0.2％的吐温20。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三)中制作新型冠状病毒抗原检测试纸条的方法为：将包被抗体的硝酸纤维素膜粘贴在底板上；将金标垫贴在靠近检测线一侧的底板上，并与硝酸纤维素膜呈搭接；将滤血垫粘贴在底板上，并与金标垫远离检测线的一侧搭接；将样品垫粘贴在底板上，并与滤血垫远离金标垫的一侧搭接；将吸水垫粘贴再靠近质控C一侧的底板上，并与硝酸纤维素膜搭接。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述金标垫和样品垫采用处理液进行预处理，预处理方法为，将金标垫和样品垫置于处理液中浸泡，所述处理液为0.01M，pH 7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液中包含0.1～1％BSA、3％～10％海藻糖、0.1～0.5％Tween-20。
10.根据权利要求1～9所述的制备方法制备得到的新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸条。
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