CN105759050B - 一种定量检测肌钙蛋白i含量免疫荧光试剂盒及制备方法 - Google Patents
一种定量检测肌钙蛋白i含量免疫荧光试剂盒及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法,包括:肌钙蛋白抗体‑大颗粒荧光颗粒结合物配制;硝酸纤维素膜标记抗体的制备;试剂卡的装配;TNI校准品配制;建立标准曲线;计算出待测样本中肌钙蛋白的含量;所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒包括:硝酸纤维素膜、试剂和校准品。本发明试剂盒的最低检测限可达0.1 ng/ml,满足了临床应用的需求;从样本采集到出具检测结果最快只需10‑15分钟,为患者争取了更多的宝贵时间,可对患者病情进行动态检测。本发明结果相关性好,无显著差异,检测结果准确可靠,在临床上可以替代进口产品使用,大幅降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,尤其涉及一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法。
背景技术
肌钙蛋白是肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)及肌钙蛋白C(TnC)三种亚单位组成,它们是肌肉的主要调节蛋白,由于三者紧密结合与钙有依赖性,由钙的释放来控制肌肉的收缩功能。肌钙蛋白I(TnI)是分布在心肌细胞内(cTnI),主要调节心肌的收缩,健康人中cTnI的浓度低于20.4pg/ml。 因为特异性高,有较高的敏感性,心肌钙蛋白I(cTnI)成为心肌损伤的高敏感性和高特异性的标志物之一,同时也是判断心肌损伤和危险分级,以及判断预后的重要生化指标。当心肌损伤后,心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中,4~6小时后,开始在血液中升高,升高的 cTnI 能在血液中保持很长时间(6~10 天),这样就提供了较长的检测期。具有较宽的诊断窗:cTnI(4~10天),是维持时间最长的非酶类标志物。 在它们的诊断窗中,cTnI增高的幅度大,要比CK-MB高5~10倍。由于在无心肌损伤时cTnI在血液中含量很低,因此也可用于微小心损伤(MMD)的诊断,这是以前酶学指标所难以做到的。cTnI还具有判断预后的价值,对任何冠状动脉疾患病人,即便ECG或其他检查(如运动试验)阴性,只要cTnI增高,应视为具有高危险性。临床研究表明,cTNI检测在急性的诊断和治疗有很高的价值,可应用外科、内科、急诊科和治疗实验室等众多科室。与目前所应用的诊断指标相比,cTNI在诊断和鉴别诊断心机坏死有独特作用。目前检测cTNI的方法有很多,不仅可以定性,亦可以定量,常用的方法有:凝胶层析及高效液相色谱分析、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、放射免疫测定Radioimmunoassay,RIA)、免疫发光法和胶体金层析法。其中凝胶层析及高效液相色谱分析费时且不易自动化;ELISA法定量准确性 差、操作时间长、自动化程度低,多用于定性检测;金标方法虽稳定 性较好,但灵敏度较低,一般只能定性,不能定量,特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用,尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。免疫层析法采用两个抗原特异性抗体分别结合在cTNI的不同位点。一个抗体是用于荧光标记,而另一个则包被在硝酸纤维素上面,在标记过程中,荧光抗体与标本中的肌钙蛋白分子结合形成夹心复合物,此复合物在结合了待测样品的cTnI后流经吸水纤维素膜表面时,会和膜上包被的另一种cTnI抗体结合,并固定于结合处,反应完成后,应用适当的光度计测量光信号,计算结合到膜载体的复合物量。光信号强度与cTNI浓度成正比。应用自有算法建立标准曲线,通过它就可求得全血,血清或血浆中未知的TNI浓度。该方法特异性强,敏感性高,不需要价格昂贵的仪器,适合各种规模医疗机构。免疫荧光快速检测法采用双抗体夹心免疫检测和免疫色谱检测原理,能检测心肌受损后游离肌钙蛋白I。在检测膜上已预先包被了与能够结合血样中cTnI的特异性抗体和该抗体种属对应的抗抗体。标本加入后,当标本中cTnI和标记有免疫荧光颗粒的样品液混合,形成抗原-抗体-荧光标记物复合体,该复合物流经膜表面,被停留在 T线的另一特异性抗体捕获,沉淀形成肉眼可见的色带。同时“C”区也总会出现有抗抗体形成的另一条色带,该色带为内部质量控制。经免疫荧光检测仪获取T和 C线数据,经过预先设置的数学模型,计算出相应检测值,转换成患者血样的cTnI浓度,色带的信号深浅与标本中cTnI的浓度呈正相关。在免疫检测技术中,采用改善的包被技术,利用新的材料以提高检测试剂中载体上连接的与待检标本发生免疫反应的成份的浓度,是提高临床检测产品的灵敏度的重要途径。在免疫荧光侧流技术中,使用的荧光颗粒的尺寸和检测灵敏度有极大相关,目前常用的是150-250nm的颗粒。
目前检测cTNI的方法存在凝胶层析及高效液相色谱分析费时且不易自动化;ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低,灵敏度较低,一般只能定性,不能定量,特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用,尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法,旨在解决目前检测cTNI的方法存在凝胶层析及高效液相色谱分析费时且不易自动化;ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低,灵敏度较低,一般只能定性,不能定量,特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用,尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白定量检测的问题。
本发明是这样实现的,一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法,所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法包括以下步骤:
第一步,肌钙蛋白抗体-大颗粒荧光颗粒结合物配制,使用磷酸缓冲液浓度为10mM,缓冲液包括磷酸二氢钠 0.39 克,磷酸氢二钠1.02克,唑氮钠0.2 克;
用盐酸调节pH为7.2,再加入BSA 5 克,使终浓度为:BSA 5mg/ml、Proclin 0. 05%w/v;
第二步,硝酸纤维素膜标记抗体的制备,取CN140硝酸纤维素膜30cm,置放于点膜仪上,按照点膜仪操作要求,将抗体液体以1ml/cm的速度均匀点在膜上;
第三步,试剂卡的装配,将标记有抗体的硝酸纤维素膜置于合适卡盒底盒中指定的位置,在依次放入样品垫,吸水垫,然后盖上卡盒上盒,并置于湿度不高于20%的密封合内保存;
第四步,TNI校准品配制,将人肌钙蛋白重组蛋白溶于磷酸缓冲液加5%牛血清中,制成不同浓度的校准品;以肌钙蛋白校准品为原始标准,采用肌钙蛋白试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次,求出均值,得到肌钙蛋白校准品的浓度:0. 2,0.67,1,3, 4.8,10,27.3 ng/ml;
第五步,建立标准曲线;将上述6个标准品溶入含有5%的牛血清的磷酸缓冲液,然后每种取75ul,滴入测试卡的样品孔中,等待10分钟,有检测仪读取荧光信号,然后带入Excel软件进行计算,得到标准曲线;
第六步,由免疫荧光检测仪收集发射光波长的数据,代入校准曲线y=0.9188x+0.5444,由此计算出待测样本中肌钙蛋白的含量。
所述肌钙蛋白抗体-大颗粒荧光颗粒结合物配制具体包括:
步骤一,胶乳粒子的活化、洗涤,取2%醛基基化乳胶胶乳颗粒溶液100μ1,向胶乳溶液中加入0.6mg/ml NaBH4 溶液I. 1ml,置于37°C往复式摇床中反应2h;12000rpm离心30min,弃上清,加入50mM pH7.2磷酸缓冲液洗涤三次,将沉淀分散于10mM pH 7.2 磷酸缓冲液中,使胶乳颗粒浓度为1% w/v;
步骤二,大尺寸乳胶颗粒化肌钙蛋白抗体的交联,用10mM 磷酸缓冲液将5mg/ml羊抗人TNI多克隆抗体稀释成1mg/ml的抗体溶液,在1 ml制备的活化胶乳颗粒溶液中加入400μl抗体溶液,置37°C摇床lh,形成大尺寸乳胶颗粒-TNI多克隆抗体连接复合物,12500rpm速度离心20min,弃上清,将沉淀物溶于O. 1M pH7. 4PBS缓冲液,混匀,12500rpm离心20min,弃上清,而后重复洗涤两次;将末次沉淀溶解于含4mg/ml BSA及0.05% 的Proclin300的10mM 磷酸缓冲液。
所述胶乳颗粒的制备方法包括以下步骤:
步骤一,大颗粒胶乳粒子的活化、洗涤;将大颗粒表面修饰的氨基基团活化,将乳胶胶乳溶液活化后离心,弃上清,沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次;将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中,使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1%,所述洗 涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种;
步骤二,肌钙蛋白I抗体包被胶乳颗粒
取Iml活化洗涤后的胶乳溶液,加入肌钙蛋白I抗体,使肌钙蛋白I抗体终浓度为1mg/ml;混匀后,置437°C摇床以220rpm转速包被218h;
用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的肌钙蛋白I抗体,重复3次;
封闭:将洗涤后的包被肌钙蛋白I抗体的胶乳颗粒溶于包含所述保护剂的 缓冲液中,使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1-0. 14%;
步骤三,抗人肌钙蛋白抗体和大尺寸乳胶颗粒结合后的封闭,将大尺寸乳胶颗粒与所述抗人肌钙蛋白抗体混合物,加入脱脂奶粉0.3%,室温下反应2 h,离心,除去其中少量的沉淀物;
步骤四,清洗,将步骤三中形成的大尺寸乳胶颗粒-抗人肌钙蛋白抗体复合物溶液离心,弃上清,加入磷酸盐缓冲液重复清洗3次;将末次沉淀溶于含所述保护剂和防腐剂的缓冲液中,使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0. 04%-0.14%。
一种如上述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法制备的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒,所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒包括:硝酸纤维素膜、试剂和校准品;
所述试剂包含表面活性剂,阻断剂,防腐剂和包被抗人肌钙蛋白抗体的乳胶颗粒,所述试剂中抗人肌钙蛋白抗体与大尺寸乳胶颗粒之间通过肽链系统连接;所述校准品包含保护剂、防腐剂、缓冲液及重组肌钙蛋白;
所述抗人肌钙蛋白抗体与大尺寸乳胶颗粒的质量比为1:10 - 1:100;
所述包被抗人肌钙蛋白抗体的乳胶胶乳颗粒质量体积比终浓度为0.04-0.4%。
所述试剂中大颗粒荧光载体直径为390nm的乳胶颗粒;
所述试剂中抗人肌钙蛋白抗体选自多克隆抗体和单克隆抗体中的一种;为鼠源、兔源或羊源抗体;
所述保护剂选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和明胶中的一种或多种,所述牛血清白蛋白,浓度为0.310mg/ml;
所述肌钙蛋白试剂盒中包括样品液,样品液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种;所需浓度为10mM-100mM, pH为610;所述肌钙蛋白样品液使用磷酸缓冲液,其浓度为10mM,pH为7.2。
所述表面活性剂选自吐温20,吐温100;所述表面活性剂的质量体积比为 0.02-0.4%;
所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞和PrOClin300中的一种或多种;所述防腐剂的质量体积比为0.1- 2%。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法制备的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的免疫荧光检测仪。
本发明提供的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法,肌钙蛋白I的及时快速,高灵敏度检测对于抢救心肌梗塞患者性命有极大临床应用价值,世界各先进国家,包括中国都基本采取0.1ng/ml为正常和异常的分界线,这就要求临床检测方法要能够检测到0.1ng/ml的水平,目前世界各国研发生产肌钙蛋白I检测的公司都在以此标准为目标进行努力。当前所采用的技术方法是化学发光,时间分辨,免疫荧光。 其中免疫荧光定量检测由于设备简单,成本低,快速,方便使用,以成为世界卫生组织大力推广的新技术。但是免疫荧光方法研发生产的试剂盒对每个组份的要求严格,其中荧光颗粒的尺寸大小就是一个决定产品灵敏度的一个重要参数。本专利利用大颗粒的荧光颗粒能够结合较多抗体分子,能够装填更多荧光素的高荧光强度特性,达到更高灵敏度的检测效果,能够结合更多待检测物质并产生更强荧光;与现有技术相比,具有如下特点:
1)本发明试剂盒在免疫荧光原理基础上进一步采用了大尺寸免疫荧光颗粒,大大提高了试剂的检测灵敏度
,
本发明试剂盒的最低检测限可达0.1 ng/ml,满足了临床应用的需求。
2)本发明试剂盒可在免疫荧光分析仪上实现多样本类型灵活快速定量检测;市售肌钙蛋白I检测多采用血清或血浆进行检测,不能满足临床快速检测需求,本发明试剂盒当在免疫荧光分析仪上使用时可采用的样本类型包括全血、血清或血浆,可在临床多科室应用。本发明试剂盒从样本采集到出具检测结果最快只需10-15分钟,为患者争取了更多的宝贵时间,可对患者病情进行动态检测。
3)本发明试剂盒与进口试剂盒对同一样本的TNI含量检测结果经统计分析,结果
相关性好,无显著差异,检测结果准确可靠,
浓度 | 重复5次 | AV | SD | C.V. | ||||
1.10 | 0.9300 | 1.1200 | 0.9760 | 1.1600 | 1.1050 | 1.058 | 0.099 | 9.4 |
5.00 | 4.7900 | 5.2900 | 5.1300 | 5.3400 | 4.7800 | 5.066 | 0.268 | 5.3 |
10.40 | 10.7800 | 10.1100 | 9.8900 | 10.7200 | 9.8900 | 10.278 | 0.441 | 4.3 |
在临床上可以替代进口产品使用,目前达到C.V.<10%都是化学发光的产品,化学发光的产品检测成本高,如cTnI每次化学发光方法检测费用为120元,本方法为60元/每次,可以大幅降低检测成本。
附图说明
图1是本发明实施例提供的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法
图2是本发明实施例提供的试剂原理示意图;
展示通用快速诊断试剂合的内部结构,在硝酸纤维素膜上设定有质控区,测试区,样品垫,吸水垫,并注明检测液体流动方向。
图3是本发明实施例提供的大颗粒乳胶的浓度和光学OD的线性关系;展示本专利方法使用的大直径乳胶在0-0.14%内线性关系良好。
图4是本发明实施例提供的cTnI标准值和本专利方法检测值的对比图;展示从行业内认可的cTnI标准品生产公司购买的标准品在用本专利方法测量的分析图,经统计分析得到R=0.995,线性关系良好。
图5是本发明实施例提供的和标准方法(Dade)检测血液样品对照数据图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒一种定量检测肌钙蛋白I的免疫荧光试剂盒,利用大颗粒荧光载体,配合较大孔径硝酸纤维素膜,加以优化的各种试剂配方,使需检测血样平稳流过膜表面,并获得高灵敏度检测结果。试剂包含表面活性剂,阻断剂,防腐剂和包被抗人肌钙蛋白抗体的乳胶颗粒,所述试剂中抗人肌钙蛋白抗体与大尺寸乳胶颗粒颗粒之间通过肽链系统连接;所述校准品包含保护剂、防腐剂、缓冲液及重组肌钙蛋白。
所述试剂中的大颗粒荧光载体直径为390nm的乳胶颗粒。
所述硝酸纤维素膜有多种品牌德国sartorius 的NC95,NC140,美国millipore 公司的 HF135, HF180,中国依能公司的类似膜,首选NC95。
所述试剂中的抗人肌钙蛋白抗体选自多克隆抗体和单克隆抗体中的一种,优选多克隆抗体。所述肌钙蛋白抗体可为鼠源、兔源或羊源抗体,优选羊源抗体。
所述试剂中的包被抗人肌钙蛋白抗体的大颗粒苯乙烯胶乳颗粒是通过制备抗人肌钙蛋白抗体与乳胶胶乳颗粒混合并化学反应交联而制成,在所述抗人肌钙蛋白抗体-荧光颗粒制备中,所述抗人肌钙蛋白抗体与大尺寸乳胶颗粒的质量比为I :10 - 1:100,优选I:20。
所述试剂中的大尺寸胶乳颗粒的表面修饰基团供与抗人肌钙蛋白抗体化学反应交联有多种,羧基,氨基,醛基,羰基,首选醛基,该系统可提高检测方法的灵敏度,同时不增加非特异干扰。将抗体和颗粒表面交联,此标记反应温和,很少抑制抗体活性,标记抗体稳定,且背景水平很低,结合紧密迅速。此外,抗体和颗粒的结合很稳定,不会因反应试剂的高度稀释而受影响,保证了检测结果的准确性。
所述包被抗人肌钙蛋白抗体的致敏乳胶胶乳颗粒保存液为优化的配方。
大尺寸乳胶颗粒标记抗体时,活化大尺寸乳胶颗粒与待标记抗体应有适当的比例,使每个抗体分子上标记的大尺寸乳胶颗粒分子数量控制在一定范围。与大尺寸乳胶颗粒结合后,所述大尺寸乳胶颗粒结合cTNI抗体制备中,所述抗人肌钙蛋白抗体与大尺寸乳胶颗粒的摩尔比优选1 :20。
所述试剂中的包被抗人肌钙蛋白抗体的乳胶胶乳颗粒质量体积比终浓度为0.04-0.4% 优选0.2 %牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和明胶,能够保护胶乳颗粒表面交联的抗体。所述保护剂A选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和明胶中的一种或多种,优选牛血清白蛋白,浓度为0.310mg/ml,优选0.3-1mg/ml。
所述肌钙蛋白试剂中包括样品液,其中所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种,优选磷酸盐缓冲液;所述样品液的浓度为10mM-100mM,优选10 mM,pH为610,优选7.28. 5;所述肌钙蛋白I 抗体标记的缓冲液选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种,优选磷酸盐缓冲液;所述缓冲液的浓度为10mM ,pH为7.2。
所述反应增强剂选自吐温20,吐温100,优选吐温20;所述反应增强剂的质量体积比为 0.02-0.4%,优选0.02%。吐温20是非离子型水溶性聚合物,有很强的亲水性,可以破坏溶液中蛋白质周围的电子云和水化层,促进特异性的抗原和抗体分子靠近并结合形成大分子复合物。
所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞和PrOClin300中的一种或多种,优选Proclin300,所述防腐剂的质量体积比为0.1- 2%,优选0. 1%。
所述抗体和颗粒复合物的制备方法包括以下步骤:
1)大颗粒胶乳粒子的活化、洗涤,此步骤需要将大颗粒表面修饰的氨基基团活化,将商品化的乳胶胶乳溶液活化后离心,弃上清,沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次;将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中,使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1%,所述洗 涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种;
2)肌钙蛋白I抗体包被胶乳颗粒
①取Iml活化洗涤后的胶乳溶液,加入肌钙蛋白I抗体,使肌钙蛋白I抗体终浓度为1 mg/ml;混匀后,置437°C摇床以220rpm转速包被218h;
②用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的肌钙蛋白I抗体,重复3次;
③封闭:将洗涤后的包被肌钙蛋白I抗体的胶乳颗粒溶于包含所述保护剂的 缓冲液中,使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1-0. 14%。
3)抗人肌钙蛋白抗体和大尺寸乳胶颗粒结合后的封闭
将所述大尺寸乳胶颗粒与所述抗人肌钙蛋白抗体混合物,加入脱脂奶粉0.3%,室温下反应2 h,离心,除去其中少量的沉淀物;
4)清洗,将步骤3)中形成的大尺寸乳胶颗粒-抗人肌钙蛋白抗体复合物溶液离心,弃上清,加入磷酸盐缓冲液重复清洗3次;将末次沉淀溶于含所述保护剂和防腐剂的缓冲液中,使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0. 04%-0.14%。
所述的肌钙蛋白免疫荧光试剂盒可在免疫荧光检测仪上用于定量检测人体血液中肌钙蛋白的含量,其中所述血液包括全血、血清及血浆。
如图1所示,本发明实施例的定量检测肌钙蛋白I含量的免疫荧光试剂盒的制备方法包括以下步骤:
S101:肌钙蛋白抗体-大颗粒荧光颗粒结合物配制,使用磷酸缓冲液浓度为10mM,用盐酸调节pH为7.2,再加入BSA 及防腐剂,使终浓度为:BSA 5mg/ml、Proclin O. 05% (w/v);
S102:硝酸纤维素膜标记抗体的制备;
S103:试剂卡的装配,将标记有抗体的硝酸纤维素膜置于合适卡盒底盒中指定的位置,在依次放入样品垫,吸水垫,然后盖上卡盒上盒,并置于湿度不高于20%的密封合内保存。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
一、肌钙蛋白测定试剂盒的制备
1、肌钙蛋白抗体-大颗粒荧光颗粒结合物配制,使用磷酸缓冲液浓度为10mM,用盐酸调节pH为7.2,再加入BSA 及防腐剂,使终浓度为:BSA 5mg/ml、Proclin O. 05% (w/v)。
1)胶乳粒子的活化、洗涤 取2%醛基基化乳胶胶乳颗粒溶液(ThermolFisher,Inc.,粒径为390nm) 100μ1,向胶乳溶液中加入0.6mg/ml NaBH4 溶液I. 1ml,置于37°C往复式摇床中反应2h。12000rpm离心30min,弃上清,加入50mM pH7.2磷酸缓冲液洗涤三次,将沉淀分散于10mM pH 7.2 磷酸缓冲液中,使胶乳颗粒浓度为1% (w/v)。
2)大尺寸乳胶颗粒化肌钙蛋白抗体的交联,用10mM 磷酸缓冲液将5mg/ml羊抗人TNI多克隆抗体(Biospacific公司)稀释成1mg/ml的抗体溶液,在1 ml步骤2)制备的活化胶乳颗粒溶液中加入400μ I抗体溶液,置37°C摇床lh,形成大尺寸乳胶颗粒-TNI多克隆抗体连接复合物。12500rpm速度离心20min,弃上清,将沉淀物溶于O. IM pH7. 4PBS缓冲液,混匀,12500rpm离心20min,弃上清,而后重复洗涤两次;将末次沉淀溶解于含4mg/ml BSA及0.05% 的Proclin300的10mM 磷酸缓冲液。
2、硝酸纤维素膜标记抗体的制备
3、试剂卡的装配,将标记有抗体的硝酸纤维素膜置于合适卡盒底盒中指定的位置,在依次放入样品垫,吸水垫,然后盖上卡盒上盒,并置于湿度不高于20%的密封合内保存。
4、TNI校准品配制, 将市售人肌钙蛋白重组蛋白溶于类似人血清基质的溶液(磷酸缓冲液加5%牛血清)中,制成不同浓度的校准品。以进口的罗氏公司肌钙蛋白校准品为原始标准,采用其肌钙蛋白试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次,求出均值,得到肌钙蛋白校准品的浓度:0. 2,0.67,1,3, 4.8,10,27.3 ng/ml。
5、标准曲线的建立
6、本试剂盒适用于各种可以有激发光源,并收集发射光波长的免疫荧光检测仪,具体参数可根据仪器进行调整,代入校准曲线,即可计算出待测样本中肌钙蛋白的含量。
二、检测试剂盒的分析性能评估
1,线性范围
用接近线性范围上限的肌钙蛋白高浓度样本(20ng/ml),用生理盐水将其按1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64稀释,共配制成6个稀释浓度的溶液,用所述生化分析仪检测方法测定各稀释样本浓度。每个浓度重复测定3次,分别求出测定结果的平均值。以稀释浓度为自变量,以测定结果平均值为因变量求出线性回归方程。按公式计算线性回归的相关系数r,结果显示回归方程为y=0.9188X+0.5444,相关系数r=0.995,表明本发明试剂盒在0.1ng/ml-30ng/ml线性范围内相关性较好(见图3)。
2、灵敏度(最低检测限)
以临床正常人血加入按照标准品定标的不同浓度标准品,测量得到标准曲线,以正常均值加两倍标准差报告最低检测限,由最低检测限计算得到最低检测值,结果显示本发明试剂盒的最低检测限为0. 1ng/ml。
附图4 为和标准方法检测血液样品对照数据图。
临界值0.1ng/ml以下的抗凝血新鲜血液,按照0,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,4,8,16浓度加入肌钙蛋白I抗原(购自 Hytest 公司),分别用 Dimension RxL Max IntegratedChemistry System (Siemens)检测和本发明检测,得到R=0.972,表明相关性良好。
表1表明,检测血样经本发明得到标准曲线,并计算最低检测值,重复3个样品,均低于0.1ng/ml,表明本发明符合世界卫生组织及专业机构制定的要求。
表1
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法,其特征在于,所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法包括以下步骤:
第一步,肌钙蛋白抗体-大颗粒荧光颗粒结合物配制,使用磷酸缓冲液浓度为10mM,缓冲液包括磷酸二氢钠0.39克,磷酸氢二钠1.02克,唑氮钠0.2克;
用盐酸调节pH为7.2,再加入BSA5克,使终浓度为:BSA5mg/ml、Proclin0.05%w/v;
第二步,硝酸纤维素膜标记抗体的制备,取CN140硝酸纤维素膜30cm,置放于点膜仪上,按照点膜仪操作要求,将抗体液体以1ml/cm的速度均匀点在膜上;
第三步,试剂卡的装配,将标记有抗体的硝酸纤维素膜置于合适卡盒底盒中指定的位置,在依次放入样品垫,吸水垫,然后盖上卡盒上盒,并置于湿度不高于20%的密封合内保存;
第四步,TNI校准品配制,将人肌钙蛋白重组蛋白溶于磷酸缓冲液加5%牛血清中,制成不同浓度的校准品;以肌钙蛋白校准品为原始标准,采用肌钙蛋白试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次,求出均值,得到肌钙蛋白校准品的浓度:0.2,0.67,1,3,4.8,10,27.3ng/ml;
第五步,建立标准曲线;将上述7个标准品溶入含有5%的牛血清的磷酸缓冲液,然后每种取75ul,滴入测试卡的样品孔中,等待10分钟,有检测仪读取荧光信号,然后带入Excel软件进行计算,得到标准曲线;
第六步,由免疫荧光检测仪收集发射光波长的数据,代入校准曲线y=0.9188x+0.5444,由此计算出待测样本中肌钙蛋白的含量;
所述肌钙蛋白抗体-大颗粒荧光颗粒结合物配制具体包括:
步骤一,胶乳粒子的活化、洗涤,取2%醛基基化乳胶胶乳颗粒溶液100μ1,向胶乳溶液中加入0.6mg/mlNaBH4溶液I.1ml,置于37℃往复式摇床中反应2h;12000rpm离心30min,弃上清,加入50mMpH7.2磷酸缓冲液洗涤三次,将沉淀分散于10mMpH7.2磷酸缓冲液中,使胶乳颗粒浓度为1%w/v;
步骤二,大尺寸乳胶颗粒化肌钙蛋白抗体的交联,用10mM磷酸缓冲液将5mg/ml羊抗人TNI多克隆抗体稀释成1mg/ml的抗体溶液,在1ml制备的活化胶乳颗粒溶液中加入400μl抗体溶液,置37℃摇床lh,形成大尺寸乳胶颗粒-TNI多克隆抗体连接复合物,12500rpm速度离心20min,弃上清,将沉淀物溶于O.1MpH7.4PBS缓冲液,混匀,12500rpm离心20min,弃上清,而后重复洗涤两次;将末次沉淀溶解于含4mg/mlBSA及0.05%的Proclin300的10mM磷酸缓冲液;
所述胶乳颗粒的制备方法包括以下步骤:
步骤一,大颗粒胶乳粒子的活化、洗涤;将大颗粒表面修饰的氨基基团活化,将乳胶胶乳溶液活化后离心,弃上清,沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次;将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中,使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1%,所述洗涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种;
步骤二,肌钙蛋白I抗体包被胶乳颗粒
取Iml活化洗涤后的胶乳溶液,加入肌钙蛋白I抗体,使肌钙蛋白I抗体终浓度为1mg/ml;混匀后,置37℃摇床,以220rpm转速包被18h;
用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的肌钙蛋白I抗体,重复3次;
封闭:将洗涤后的包被肌钙蛋白I抗体的胶乳颗粒溶于包含保护剂的缓冲液中,使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1-0.14%;
步骤三,抗人肌钙蛋白抗体和大尺寸乳胶颗粒结合后的封闭,将大尺寸乳胶颗粒与所述抗人肌钙蛋白抗体混合物,加入脱脂奶粉0.3%,室温下反应2h,离心,除去其中少量的沉淀物;
步骤四,清洗,将步骤三中形成的大尺寸乳胶颗粒-抗人肌钙蛋白抗体复合物溶液离心,弃上清,加入磷酸盐缓冲液重复清洗3次;将末次沉淀溶于含所述保护剂和防腐剂的缓冲液中,使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04%-0.14%。
2.一种如权利要求1所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法制备的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒,其特征在于,所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒包括:硝酸纤维素膜、试剂和校准品;
所述试剂包含表面活性剂,阻断剂,防腐剂和包被抗人肌钙蛋白抗体的乳胶颗粒,所述试剂中抗人肌钙蛋白抗体与大尺寸乳胶颗粒之间通过肽链系统连接;所述校准品包含保护剂、防腐剂、缓冲液及重组肌钙蛋白;
所述抗人肌钙蛋白抗体与大尺寸乳胶颗粒的质量比为1:10-1:100;
所述包被抗人肌钙蛋白抗体的乳胶胶乳颗粒质量体积比终浓度为0.04-0.4%。
3.如权利要求2所述的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒,其特征在于,所述试剂中大颗粒荧光载体直径为390nm的乳胶颗粒;
所述试剂中抗人肌钙蛋白抗体选自多克隆抗体和单克隆抗体中的一种;为鼠源、兔源或羊源抗体;
所述保护剂选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和明胶中的一种或多种,所述牛血清白蛋白,浓度为10mg/ml;
所述肌钙蛋白试剂盒中包括样品液,样品液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种;所需浓度为10mM-100mM,pH为10;所述肌钙蛋白样品液使用磷酸缓冲液,其浓度为10mM,pH为7.2。
4.如权利要求2所述的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒,其特征在于,所述表面活性剂选自吐温20,吐温100;所述表面活性剂的质量体积比为0.02-0.4%;
所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞和PrOClin300中的一种或多种;所述防腐剂的质量体积比为0.1-2%。
5.一种保护权利要求1任意一项所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法制备的定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的免疫荧光检测仪。
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