CN102384973B - 快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条及其制备方法。该免疫层析试纸条包括样品垫、荧光胶乳垫、包被膜、吸水纸和聚乙烯塑料底板；以聚乙烯塑料底板为支持底板，按从左到右样品垫、荧光胶乳垫、包被膜和吸水纸顺次搭接在支持底板上；将质量浓度为0.1mg/ml～2mg/ml的羊抗兔免疫球蛋白G和质量浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的羟甲基糠醛完全抗原溶液分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上对应的质控区和检测区，然后将硝酸纤维素膜烘干，制成包被膜。应用本发明的免疫层析试纸条可定量检测出食品药品中羟甲基糠醛含量，且简便、快速、灵敏。

Description

快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种5-羟甲基糠醛检测技术，具体是一种快速定量检测5-羟甲基糠醛的免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

5-羟甲基糠醛(又名5-羟甲基-2-糠醛、羟甲基糠醛、5-羟甲基呋喃甲醛或5-羟甲基-2-呋喃甲醛)，英文名5-hydroxymethyl-2-furfural或5-HMF，为针状结晶。羟甲基糠醛分子中有一个醛基和一个羟甲基，可以通过加氢、氧化脱氧、酯化、卤化、聚合、水解以及其它化学反应，用于合成许多有用化学物和新型高分子材料，包括医药、树脂类塑料等。然而，据有关文献报道5-羟甲基糠醛对人体横纹肌和内脏有损害，同时也是导致神经性疾病的主要因素，其在食品药品中的大量存在会严重危害人体健康，世界卫生组织已经对蜂蜜中5-羟甲基糠醛的含量加以控制，中国药典也对葛根素葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的含量有非常严格的控制。因此，通过检测进而控制食品药品中5-羟甲基糠醛的含量具有重要的现实意义。

目前，国内外有关检测5-羟甲基糠醛的方法主要有：比色法、紫外法以及高效液相色谱法(HPLC)。比色法中由于5-羟甲基糠醛并非葡萄糖注射液变色的唯一因素，该法专属性和准确性较差；紫外法对被测样品的浓度，各个国家有不同的要求，没有统一的标准，很难确定最终的检测结果；使用高效液相色谱法，虽然可以非常准确的测出样品中5-羟甲基糠醛的含量，但是，此法需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对被检材料要求较高，样品预处理及操作过程复杂，费时又费力，已经不能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。目前，国内利用快速定量检测免疫层析试纸条检测食品药品中5-羟甲基糠醛含量的专利文献及相关报道为空白。

发明内容

本发明针对现有检测羟甲基糠醛技术的缺点和不足，提供了一种快速定量检测羟甲基糠醛免疫层析试纸条及其制备方法，利用荧光胶乳微球标记抗体技术检测羟甲基糠醛的手段更加简便、快速、灵敏。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条，包括样品垫、荧光胶乳垫、包被膜、吸水纸和聚乙烯塑料底板；以聚乙烯塑料底板为支持底板，按从左到右样品垫、荧光胶乳垫、包被膜和吸水纸顺次搭接在支持底板上；

所述荧光胶乳垫由如下方法制备形成：将羟甲基糠醛完全抗原用于免疫实验动物家兔，获得羟甲基糠醛多克隆抗体并进行亲和层析纯化；用荧光胶乳微球标记已纯化好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G；将荧光胶乳标记好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G按质量比为1∶10～1∶2000均匀混合，并将混合液均匀喷涂于聚酯纤维膜上，然后将聚酯纤维膜烘干，备用；

所述包被膜由检测区和质控区组成；由如下方法制备：将质量浓度为0.1mg/ml～2mg/ml的羊抗兔免疫球蛋白G和质量浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的羟甲基糠醛完全抗原溶液分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上对应的质控区和检测区，然后将硝酸纤维素膜烘干，备用；

所述样品垫为玻璃纤维膜；所述吸水纸为植物纤维滤纸；所述羟甲基糠醛完全抗原为羟甲基糠醛-牛血清白蛋白。

进一步地，所述搭接是指样品垫、荧光胶乳垫、包被膜和吸水纸中相邻两块左右两侧有1～3mm重叠。

所述试纸条宽优选为0.3～0.4cm，长优选为7～8cm。

所述荧光胶乳微球的颜色为橘黄色、蓝色和红色中的一种；所述的荧光胶乳微球的粒径为0.05μm～0.5μm；所述的荧光胶乳微球的激发波长为300nm～600nm；所述的荧光胶乳微球标记的羟甲基糠醛多克隆抗体的终浓度为0.1mg/ml～1mg/ml，荧光胶乳微球标记的兔免疫球蛋白G的终浓度为0.1mg/ml～1mg/ml。

快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)多抗的制备：将羟甲基糠醛完全抗原用于免疫实验动物家兔，获得羟甲基糠醛多克隆抗体并进行亲和层析纯化；

(2)蛋白的标记：用荧光胶乳微球标记已纯化好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G；

(3)荧光胶乳垫的制备：将荧光胶乳标记好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G均匀混合，并将混合液均匀喷涂于聚酯纤维膜上，然后将聚酯纤维膜烘干，备用；

(4)包被膜的制备：将质量浓度为0.1mg/ml～2mg/ml的羊抗兔免疫球蛋白G和质量浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的羟甲基糠醛完全抗原溶液分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上对应的质控区和检测区，然后将硝酸纤维素膜烘干，备用；

(5)免疫层析试纸条的制备：以聚乙烯塑料板为支持底板，将样品垫、荧光胶乳垫、包被膜以及吸水纸顺次相互搭接在底板上，即组装成可快速检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸板，然后按要求切割成适当宽度的免疫层析试纸条。

本发明所述的一种快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条的检测原理是竞争法。在硝酸纤维素膜的检测区包被有羟甲基糠醛完全抗原，在质控区包被有羊抗兔IgG，荧光胶乳垫上涂有荧光胶乳标记的羟甲基糠醛多抗和兔IgG。当被检样品中含有羟甲基糠醛抗原时，样品中的羟甲基糠醛就会和荧光胶乳标记垫上的羟甲基糠醛多抗结合形成抗原-荧光胶乳标记抗体复合物，在层析力的作用下，沿着硝酸纤维素膜依次经过检测区和质控区，由于荧光胶乳标记的多抗已和样品中的羟甲基糠醛形成复合物，因此，在检测区，荧光胶乳标记的多抗不再与此处包被的羟甲基糠醛结合，将不会出现荧光信号，而在质控区，荧光胶乳标记的兔IgG与包被的羊抗兔IgG结合，将出现强荧光信号，此时的检测结果为阳性。当被检样品中没有羟甲基糠醛时，在层析力的作用下，只有荧光胶乳垫上的羟甲基糠醛多抗和兔IgG向质控区和检测区扩散，此时，质控区和检测区都出现强的荧光信号，检测结果为阴性。最后，根据检测区荧光信号的强弱，显示样品中羟甲基糠醛抗原的浓度。

相对于现有技术，本发明的优点为：应用本发明快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条，仅需5min就能实现对食品药品中羟甲基糠醛进行定量检测，最低检测限达到4ppb，该检测方法快速、简便、灵敏。

附图说明

图1为本发明的一种快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条的结构示意图。

图2为本发明的一种快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条的组装模式图。

图3为5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

如图1、2所示，一种快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条包括样品垫1(玻璃纤维膜，厚度0.25～0.75mm，宽度3.2cm)、荧光胶乳垫2(宽度1cm)、包被膜3(宽度3cm)、吸水纸4(植物纤维滤纸，厚度0.45～1.25mm，宽度1.7cm)、检测区5、质控区6、聚乙烯塑料底板7；以聚乙烯塑料底板7为支持底板，按从左到右的顺序，顺次将样品垫1搭接于荧光胶乳垫2上距离2左边边缘1～3mm处，荧光胶乳垫2搭接于包被膜3(检测区5在左，质控区6在右)上距离3左边边缘1～3mm处，优选2mm处，吸水纸4搭接于包被膜3上距离3右边边缘1～3mm处，试纸条优选并切割成宽0.3～0.4cm宽，长7～8cm。

实施例1羟甲基糠醛-牛血清白蛋完全抗原的制备：

将15mg的5-羟甲基糠醛溶解于5mL，浓度为1.0mol/L，pH为2的戊二醛水溶液中，配制成5-羟甲基糠醛质量浓度为3.0g/L的混合液，在30℃下反应1.5h，制备A液；

将20mg的牛血清白蛋白溶解于5mL，浓度为0.2mol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液(0.2mol/L的磷酸二氢钠与0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比81∶19配置)中，配制成牛血清白蛋白质量浓度为4.0g/L的B溶液，放置于4℃冰箱中保存；

在磁力搅拌器的充分搅拌A液的同时，将B液缓慢滴加到A液中，使两者充分反应，在10℃下反应5h，反应完成后，即得到人工抗原混合液；

将人工抗原混合液装入能透过分子量为50kDa的透析袋中，用浓度为0.2mol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液(0.2mol/L的磷酸二氢钠与0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比81∶19配置)透析1天，每隔12h更换一次磷酸盐缓冲液；透析结束后，将人工抗原混合液进行冷冻干燥，即得到人工抗原：5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白产品。

5-羟甲基糠醛人工抗原的鉴定：采用紫外分光光度计测定其紫外扫描图谱。本实施例中5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图如附图3所示。从图中可以看出牛血清白蛋白在280nm左右出现吸收峰，5-羟甲基糠醛在280nm左右出现吸收峰，另外在280nm左右出现一更强吸收峰，峰值比牛血清白蛋白比5-羟甲基糠醛的吸收峰要高，认为这是5-羟甲基糠醛与牛血清白蛋白成功偶联后峰相互迭加的结果，说明已成功合成5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原。

实施例2

①制备羟甲基糠醛多克隆抗体并测定多抗效价。

步骤一：将1mg实施例1制备的羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原溶解于1ml质量分数为0.9％的NaCl溶液中，再与1ml弗氏完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0.5mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的剂量进行兔背部皮下多点注射；

步骤二：间隔14天后，将1mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原溶解于1ml质量分数为0.9％的NaCl溶液中，再与1ml的弗氏不完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0.5mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的剂量进行兔背部皮下多点注射，然后每隔14天重复步骤二1次，共重复3次。最后一次免疫十天后，对兔子进行颈静脉取血，分离血清，用饱和硫酸铵法沉淀抗体，并用亲和层析法纯化分离羟甲基糠醛抗体。用间接酶联免疫吸附法(ELISA)法检测出多抗的效价为1∶256000。

②荧光胶乳标记羟甲基糠醛抗体和兔免疫球蛋白G(兔IgG)。取0.1ml质量浓度为10％的荧光胶乳微球(颜色为红色，粒径为0.05μm，激发波长为300nm)，用0.9ml，0.1mol/L pH 6的MES缓冲液将荧光胶乳微球的浓度调整为1％，然后顺序加入5mg EDC和5mg Sulfo-NHS活化，室温下温和搅拌30min，活化结束后，溶液在1000rpm转速下离心30min，沉淀用0.1mol/L pH 4的PBS缓冲液溶解，经超声重悬后，分别加入120μl质量浓度为10mg/ml兔IgG(ZI103-1兔IgG，上海信然生物技术有限公司)和步骤①制备的羟甲基糠醛多克隆抗体，经振荡器均匀混合后，室温下温和搅拌反应5h，反应结束后，溶液在1000rpm转速下离心30min，沉淀用溶解有0.05％Tween 20的PBS缓冲液(0.1mol/L pH 7.0)重复清洗三次以除去未标记上的蛋白，1000rpm转速下离心30min，沉淀用0.1mol/L，pH 7.4同时溶解有1％牛血清白蛋白和0.05％Na₃N的PBS缓冲液重新溶解，经超声重悬后，放置于4℃冰箱中待用，此时经过荧光胶乳标记的羟甲基糠醛抗体和兔IgG的终浓度为1mg/ml。

③制备荧光胶乳垫。用0.1mol/L，pH 7.4同时溶解有1％牛血清白蛋白和0.05％Na₃N的PBS缓冲液将步骤②制备的荧光标记的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔IgG同时稀释100倍，按质量比为1∶2000的比例均匀混合，将其混合液均匀喷涂至聚酯纤维膜(SB06上海金标生物有限公司)上，将聚酯纤维膜置于室温下干燥36h，备用。

④制备包被膜。用0.1mol/L，pH为7.4的PBS缓冲液将羟甲基糠醛-牛血清白蛋白质量浓度调整为0.5mg/ml，羊抗兔IgG(上海信然生物技术有限公司)的质量浓度调整为0.1mg/ml，将羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原和羊抗兔IgG分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区上的不同区域，形成条带状的检测区和质控区，其中检测区和质控区间隔5mm，将包被膜放置于50℃烘箱中干燥36h，备用。

⑤制备免疫层析试纸条。以聚乙烯塑料底板7为支持底板，按从左到右的顺序，顺次将样品垫1搭接于荧光胶乳垫2上距离2左边边缘3mm处，荧光胶乳垫2搭接于包被膜3(检测区5在左，质控区6在右)上距离3左边边缘3mm处，吸水纸4搭接于包被膜3上距离3右边边缘3mm处，并切割成0.4cm宽，7.7cm长的试纸条。

将本发明制得的试纸条装于带有加样孔和显示孔的塑料盒(深圳金灿华实业有限公司)中，然后将此装有试纸条的塑料盒放于铝箔袋中，密封，室温保存待用。

为了验证本试纸条的效果，分别抽取了面包、咖啡、蜂蜜，薯片作为被检样品。

检测前，先对样品进行预处理：分别准确称取面包、咖啡、蜂蜜和薯片各2.000g，将样品溶于1ml三蒸水中，分别添加0.5mL乙酸锌(100g/L)和1mL亚铁氰化钾(200g/L)，超声振荡提取5min，然后在6000rpm条件下离心10min，将上清液转移至100ml容量瓶中；沉淀再经0.5mL乙酸锌(100g/L)和1mL亚铁氰化钾(200g/L)溶解，超声振荡提取5min，然后在6000rpm条件下离心10min，收集上清，转移至100ml容量瓶中定容。

分别吸取100μl处理好的样品溶液，滴于装有试纸条的塑料盒的加样孔中，5min后，将此塑料盒放置于荧光仪中相应的检测位置，由荧光仪自动显示出检测结果。测定结果为：面包中羟甲基糠醛的含量为3.5ppm，咖啡中羟甲基糠醛的含量为32.3ppm，蜂蜜中中羟甲基糠醛的含量为16.3ppm，薯片中中羟甲基糠醛的含量为1.2ppm。

同时用液相色谱法对上述样品进行检测。过程严格按照液相色谱的步骤进行。测定结果为：面包中羟甲基糠醛的含量为2.8ppm，咖啡中羟甲基糠醛的含量为27.1ppm，蜂蜜中中羟甲基糠醛的含量为14.9ppm，薯片中中羟甲基糠醛的含量为0.98ppm。

通过对比试验测试结果可知，本发明检测出羟甲基糠醛含量的结果与液相色谱的检测结果非常接近，可能是由于检测时间短，以致没能达到与液相色谱完全一致的检测结果但用本产品检测羟甲基糠醛时，样品处理时间为30min，测定时间为5min；而用液相色谱法检测羟甲基糠醛时，样品处理时间为120min，测定时间为30min。可见，相对于液相色谱法而言，本方明显得更简单、省时，完全可以应用于食品药品中羟甲基糠醛的快速和定量的检测。

实施例3

①制备羟甲基糠醛多克隆抗体并测定多抗效价。

步骤一：将1mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原溶解于1ml质量分数为0.9％的NaCl溶液中，再与1ml弗氏完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0.5mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的剂量进行兔背部皮下多点注射；

步骤二：间隔14天后，将1mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原溶解于1ml质量分数为0.9％的NaCl溶液中，再与1ml的弗氏不完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0.5mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的剂量进行兔背部皮下多点注射，然后每隔14天重复步骤二1次，共重复3次。最后一次免疫十天后，对兔子进行颈静脉取血，分离血清，用饱和硫酸铵法沉淀抗体，并用亲和层析法纯化分离羟甲基糠醛抗体。用间接酶联免疫吸附法(ELISA)法检测出多抗的效价为1∶256000。

②荧光胶乳标记羟甲基糠醛抗体和兔IgG。荧光胶乳标记羟甲基糠醛抗体和兔免疫球蛋白G(兔IgG)。取0.1ml质量浓度为10％的荧光胶乳微球(颜色为橘黄色，粒径为0.5μm，激发波长为600nm)，用0.9ml，0.1mol/L pH 6的MES缓冲液将荧光胶乳微球的浓度调整为1％，然后顺序加入5mg EDC和5mg Sulfo-NHS活化，室温下温和搅拌30min，活化结束后，溶液在1000rpm转速下离心30min，沉淀用0.1mol/L pH 6的PBS缓冲液溶解，经超声重悬后，分别加入40μl质量浓度为10mg/ml兔IgG(ZI103-1兔IgG，上海信然生物技术有限公司)和步骤①制备的羟甲基糠醛多克隆抗体，经振荡器均匀混合后，室温下温和搅拌反应3h，反应结束后，溶液在1000rpm转速下离心30min，沉淀用溶解有0.05％Tween 20的PBS缓冲液(0.1mol/L pH 7.0)重复清洗三次以除去未标记上的蛋白，1000rpm转速下离心30min，沉淀用0.1mol/L，pH 7.4同时溶解有1％牛血清白蛋白和0.05％Na₃N的PBS缓冲液重新溶解，经超声重悬后，放置于4℃冰箱中待用，此时经过荧光胶乳标记的羟甲基糠醛抗体和兔IgG的终浓度为0.3mg/ml。

③制备荧光胶乳垫。用0.1mol/L，pH 7.4同时溶解有1％牛血清白蛋白和0.05％Na₃N的PBS缓冲液将步骤②制备的荧光标记的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔IgG同时稀释100倍，按质量比为1∶500的比例均匀混合，将其混合液均匀喷涂至聚酯纤维膜(SB06上海金标生物有限公司)上，将聚酯纤维膜置于室温下干燥36h，备用。

④制备包被膜。用0.1mol/L，pH为7.4的PBS缓冲液将羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原质量浓度调整为2mg/ml，羊抗兔IgG(上海信然生物技术有限公司)的质量浓度调整为0.25mg/ml，将羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原和羊抗兔IgG分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的不同区域，形成条带状的检测区和质控区，其中检测区和质控区间隔5mm，将包被膜放置于50℃烘箱中干燥36h，备用。

⑤制备免疫层析试纸条。以聚乙烯塑料底板7为支持底板，按从左到右的顺序，顺次将样品垫1搭接于荧光胶乳垫2上距离2左边边缘1mm处，荧光胶乳垫2搭接于包被膜3(检测区5在左，质控区6在右)上距离3左边边缘1mm处，吸水纸4搭接于包被膜3上距离3右边边缘1mm处，并切割成0.3cm宽，7cm长的试纸条。

按照实施例1的检测步骤对本实施例试纸条的效果进行评价。检测结果为：面包中羟甲基糠醛的含量为4.0ppm，咖啡中羟甲基糠醛的含量为35.1ppm，蜂蜜中中羟甲基糠醛的含量为18.2ppm，薯片中中羟甲基糠醛的含量为1.3ppm。本实施例检测出的羟甲基糠醛含量的结果与液相色谱的检测结果也很接近，说明本实施例制备的免疫层析试纸条也完全可以应用于食品药品中羟甲基糠醛的快速和定量的检测。

实施例4

①制备羟甲基糠醛多克隆抗体并测定多抗效价。

步骤一：将1mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原溶解于1ml质量分数为0.9％的NaCl溶液中，再与1ml弗氏完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0.5mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的剂量进行兔背部皮下多点注射；

步骤二：间隔14天后，将1mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原溶解于1ml质量分数为0.9％的NaCl溶液中，再与1ml的弗氏不完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0.5mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的剂量进行兔背部皮下多点注射，然后每隔14天重复步骤二1次，共重复3次。最后一次免疫十天后，对兔子进行颈静脉取血，分离血清，用饱和硫酸铵法沉淀抗体，并用亲和层析法纯化分离羟甲基糠醛抗体。用间接酶联免疫吸附法(ELISA)法检测出多抗的效价为1∶256000。

②荧光胶乳标记羟甲基糠醛抗体和兔免疫球蛋白G(兔IgG)。取0.1ml质量浓度为10％的荧光胶乳微球(颜色为蓝色，粒径为0.2μm，激发波长为450nm)，用0.9ml，0.1mol/L pH 6的MES缓冲液将荧光胶乳微球的浓度调整为1％，然后顺序加入5mg EDC和5mg Sulfo-NHS活化，室温下温和搅拌30min，活化结束后，溶液在1000rpm转速下离心30min，沉淀用0.1mol/L pH 6的PBS缓冲液溶解，经超声重悬后，分别加入10μl质量浓度为10mg/ml兔IgG(ZI103-1兔IgG，上海信然生物技术有限公司)和步骤①制备的羟甲基糠醛多克隆抗体，经振荡器均匀混合后，室温下温和搅拌反应3h，反应结束后，溶液在1000rpm转速下离心30min，沉淀用溶解有0.05％Tween 20的PBS缓冲液(0.1mol/L pH 7.0)重复清洗三次以除去未标记上的蛋白，1000rpm转速下离心30min，沉淀用0.1mol/L，pH 7.4同时溶解有1％牛血清白蛋白和0.05％Na₃N的PBS缓冲液重新溶解，经超声重悬后，放置于4℃冰箱中待用，此时经过荧光胶乳标记的羟甲基糠醛抗体和兔IgG的终浓度为0.1mg/ml。

③制备荧光胶乳垫。用0.1mol/L，pH 7.4同时溶解有1％牛血清白蛋白和0.05％Na₃N的PBS缓冲液将步骤②制备的荧光标记的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔IgG同时稀释100倍，按质量比为1∶10的比例均匀混合，将其混合液均匀喷涂至聚酯纤维膜(SB06上海金标生物有限公司)上，将聚酯纤维膜置于室温下干燥36h，备用。

④制备包被膜。用0.1mol/L，pH 7.4PBS缓冲液将羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原质量浓度调整为5mg/ml，羊抗兔的质量浓度调整为1mg/ml，将羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的检测区，将羊抗兔均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的质控区，检测区和质控区间隔5mm，放置于50℃烘箱中干燥36h，备用。

⑤制备免疫层析试纸条具体实施过程同实施例1。以聚乙烯塑料底板7为支持底板，按从左到右的顺序，顺次将样品垫1搭接于荧光胶乳垫2上距离2左边边缘1.5mm处，荧光胶乳垫2搭接于包被膜3(检测区5在左，质控区6在右)上距离3左边边缘1.5mm处，吸水纸4搭接于包被膜3上距离3右边边缘1.5mm处，并切割成0.35cm宽，8cm长的试纸条。

按照实施例一的步骤对本实施例试纸条的效果进行评价。检测结果为：面包中羟甲基糠醛的含量为3.1ppm，咖啡中羟甲基糠醛的含量为29.2ppm，蜂蜜中中羟甲基糠醛的含量为15.3ppm，薯片中中羟甲基糠醛的含量为1.0ppm。本实施例检测出的羟甲基糠醛含量的结果与液相色谱的检测结果同样很接近，说明本实施例制备的免疫层析试纸条也完全可以应用于食品药品中羟甲基糠醛的快速和定量的检测。

由以上实施例可以看出，虽然每个实施例的检测结果并不一样，但是本发明制备的免疫层析试纸条耗时少，操作简便，且能达到与液相色谱相当的检测水平，总体效果优于液相色谱及其它现有检测技术。说明本发明制备的一种快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条能够快速、简便、准确、灵敏的检测出羟甲基糠醛的含量，克服了现有方法检测时需要昂贵的仪器设备以及耗时、耗力的缺点和不足。

Claims (5)

1.一种快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条，其特征在于：包括样品垫、荧光胶乳垫、包被膜、吸水纸和聚乙烯塑料底板；以聚乙烯塑料底板为支持底板，按从左到右样品垫、荧光胶乳垫、包被膜和吸水纸顺次搭接在支持底板上；

所述荧光胶乳垫由如下方法制备形成：将羟甲基糠醛完全抗原用于免疫实验动物家兔，获得羟甲基糠醛多克隆抗体并进行亲和层析纯化；用荧光胶乳微球标记已纯化好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G；将荧光胶乳标记好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G按质量比为1∶10～1∶2000均匀混合，并将混合液均匀喷涂于聚酯纤维膜上，然后将聚酯纤维膜烘干，备用；

所述包被膜由检测区和质控区组成；由如下方法制备：将质量浓度为0.1mg/ml～2mg/ml的羊抗兔免疫球蛋白G和质量浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的羟甲基糠醛完全抗原溶液分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上对应的质控区和检测区，然后将硝酸纤维素膜烘干，备用；

所述样品垫为玻璃纤维膜；所述吸水纸为植物纤维滤纸；所述羟甲基糠醛完全抗原为羟甲基糠醛-牛血清白蛋白。

2.根据权利要求1所述的快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条，其特征在于：所述搭接是指样品垫、荧光胶乳垫、包被膜和吸水纸相邻两块左右两侧有1～3mm重叠。

3.根据权利要求1所述的快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条，其特征在于：所述试纸条宽为0.3～0.4cm，长为7～8cm。

4.根据权利要求1所述的快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光胶乳微球的颜色为橘黄色、蓝色和红色中的一种；所述的荧光胶乳微球的粒径为0.05μm～0.5μm；所述的荧光胶乳微球的激发波长为300nm～600nm；所述的荧光胶乳微球标记的羟甲基糠醛多克隆抗体的终浓度为0.1mg/ml～1mg/ml，荧光胶乳微球标记的兔免疫球蛋白G的终浓度为0.1mg/ml～1mg/ml。

5.根据权利要求1～4任一项所述的快速定量检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)多抗的制备：将羟甲基糠醛完全抗原用于免疫实验动物家兔，获得羟甲基糠醛多克隆抗体并进行亲和层析纯化；

(2)蛋白的标记：用荧光胶乳微球标记已纯化好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G；

(3)荧光胶乳垫的制备：将荧光胶乳标记好的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔免疫球蛋白G均匀混合，并将混合液均匀喷涂于聚酯纤维膜上，然后将聚酯纤维膜烘干，备用；

(4)包被膜的制备：将质量浓度为0.1mg/ml～2mg/ml的羊抗兔免疫球蛋白G和质量浓度为0.5mg/ml～5mg/ml的羟甲基糠醛完全抗原溶液分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上对应的质控区和检测区，然后将硝酸纤维素膜烘干，备用；

(5)免疫层析试纸条的制备：以聚乙烯塑料板为支持底板，将样品垫、荧光胶乳垫、包被膜以及吸水纸顺次相互搭接在底板上，即组装成可快速检测羟甲基糠醛的免疫层析试纸板，然后按要求切割成适当宽度的免疫层析试纸条。