CN112526125A - 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112526125A
CN112526125A CN202011380951.8A CN202011380951A CN112526125A CN 112526125 A CN112526125 A CN 112526125A CN 202011380951 A CN202011380951 A CN 202011380951A CN 112526125 A CN112526125 A CN 112526125A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trichina
antigen
test strip
pad
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011380951.8A
Other languages
English (en)
Inventor
刘明远
刘晓雷
杨勇
王鑫宇
王学林
白雪
唐斌
丁静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN202011380951.8A priority Critical patent/CN112526125A/zh
Publication of CN112526125A publication Critical patent/CN112526125A/zh
Priority to PCT/CN2021/097205 priority patent/WO2022110733A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
    • G01N2333/43526—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms
    • G01N2333/4353—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法，属于血清学检测技术领域。为了更快速、方便、灵敏地检测旋毛虫感染，本发明所述的试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述结合垫喷涂有荧光探针，所述荧光探针包括作为指示探针的时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG和作为捕获探针的时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原，所述旋毛虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML‑ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML‑ESP抗原组成；所述层析膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂有鼠抗猪IgG，质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。本发明可用于旋毛虫现场快速检测。

Description

一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制 备方法
技术领域
本发明属于血清学检测技术领域，具体涉及一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
旋毛虫引起的旋毛虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，其可感染150多种食肉动物和杂食动物，人主要因为生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫的肉及肉类产品而感染，同时只有人感染才表现出明显的临床症状。据旋毛虫国际委员会报道：在1986-2009年期间，全球共计有65818例旋毛虫感染事件发生。同时，据相关文献报道，1964-2011年期间，我国共计有38794例旋毛虫感染事件发生，其中有336例患者不幸死亡。因此我国已成为受旋毛虫病侵袭的主要国家之一。鉴于上述严重情况，我国每年花费22亿元用来阻断和防控旋毛虫病。我国从古至今都有喜食猪肉的风俗，而猪作为旋毛虫的中间宿主，在旋毛虫病的传播方面起到了一定作用。
目前旋毛虫的检测方法分为直接检测法和间接检测法。直接检测法即人工消化法，也是检测旋毛虫病的金标准检测方法。而间接检测法应用的是基于肌幼虫排泄分泌产物(ML-ES)抗原的ELISA法和胶体金免疫层析法。而上述方法存在费时费力、检测仪器昂贵、灵敏度低的弊端。因此，为确保食品安全和稳定畜牧业经济增长，亟待研制一种旋毛虫病的现场快速检测方法。
荧光微球免疫层析试纸条是近年来兴起的一种快速灵敏的检测方法。荧光微球斯托克斯位移长、荧光猝灭时间长的优点使得其在灵敏度方面与胶体金免疫层析技术有了较大的提高，且该技术已经成功应用于环境卫生、食品安全、化学药物残留的检测工作之中。作为现有技术的申请号为201910604044.8的专利，提供了一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，这种试纸条包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄物分泌物iMP-ESP抗原组成的旋毛虫肌幼虫ES混合抗原；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG，这种试纸条与OIE规定的ES ELISA方法相比虽然能够在旋毛虫感染后的更早期准确地检测出旋毛虫抗体阳性，缩短检测的“窗口”期，但是该试纸条能够检测出旋毛虫抗体阳性的最早的时间点距旋毛虫发育成具有感染能力的感染性幼虫还有一段时间，因此该技术有待进一步改进。
发明内容
为解决旋毛虫病的现场检测难题，并提高旋毛虫试纸条检测的灵敏度及特异性，本发明提供了一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述样品垫设有加样孔；所述结合垫喷涂有荧光探针，所述荧光探针包括作为指示探针的时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG和作为捕获探针的时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原；所述层析膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂有鼠抗猪IgG，质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。
进一步地限定，所述旋毛虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原组成。
进一步地限定，所述时间分辨荧光微球为Eu纳米颗粒；所述样品垫材质为玻璃纤维素膜XQ-Y8；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜SB-06；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜Millipore135。
本发明还提供了一种可早期检测猪旋毛虫感染的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)旋毛虫ES混合抗原制备：将旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原及旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原，按照1:1-3:1的质量比混合，获得旋毛虫ES混合抗原；
2)结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针和时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针按照10:1-5:1的质量比喷涂于结合垫上，真空抽干后干燥保存备用；
3)检测线和质控线的制备：将鼠抗猪IgG抗体与兔抗山羊IgG抗体按照2:1的质量比，分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，真空干燥2-3h，，密封保存备用；
4)试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条。
进一步地限定，步骤1)所述旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原。
进一步地限定，步骤1)所述旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫经口感染大鼠，感染剂量为8000条/只，6h后处死，取出大鼠小肠，切割成碎片，放置于含有培养液的培养皿筛网上，37℃孵育2-3h，收集培养皿底部的虫体，用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原。
进一步地限定，步骤2)所述时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针的制备方法如下：每14000g 1％(w/v)的时间分辨荧光微球经离心后弃掉保存液中的甘油和磷酸盐；加入浓度为0.025mol/L的2-吗啉乙磺酸MES溶液100μL、浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS 1.5μL、浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC 1μL和浓度为10mg/ml的时间分辨荧光微球10μL混合均匀后，搅拌孵育45min；待反应结束，离心后弃上清，使用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀，加入200μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入5μL浓度为1mg/mL的羊抗兔IgG抗体，室温孵育2-3h；待反应结束，离心后弃上清，然后，加入200μL质量分数为5％的BSA溶液，室温封闭2h，离心后弃上清，向沉淀中加入200μL储存液重悬；所述偶联储存液为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液，每升偶联储存液中含有0.5mLProclin300，BSA 10g和聚乙二醇40020g。
进一步地限定，步骤2)所述时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针的制备方法如下：每1％(w/v)的时间分辨荧光微球经14000g/min离心后弃掉保存液中的甘油和磷酸盐；加入PH＝6.1浓度为0.025mol/L的2-吗啉乙磺酸MES溶液100μL、浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS 1.5μL、浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC 1μL和浓度为10mg/ml的时间分辨荧光微球10μL混合均匀后，搅拌孵育45min；待反应结束，离心后弃上清，使用PH＝7浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀，加入200μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入5μL浓度为1mg/mL的羊抗兔IgG抗体，室温孵育2-3h；待反应结束，离心后弃上清，然后，加入200μL质量分数为5％的BSA溶液，室温封闭2h，离心后弃上清，向沉淀中加入200μL储存液重悬；所述偶联储存液为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液，每升偶联储存液中含有0.5mLProclin300，BSA 10g和聚乙二醇40020g。
进一步地限定，步骤2)所述喷涂荧光探针的点样速度为10μL/cm。
进一步地限定，步骤3)所述检测线喷涂鼠抗猪IgG的点样速度和质控线喷涂兔抗山羊IgG的点样速度均为0.8μL/cm。
旋毛虫病免疫层析检测试纸条的检测原理示意图如图1中的B所示，当试纸条检测阳性血清时，结合垫上的荧光微球-ES探针会与血清中的旋毛虫抗体结合，进一步在层析作用下，探针结合物会与检测线上的鼠抗猪IgG抗体结合；而荧光微球-羊抗兔IgG探针会与质控线上兔抗山羊IgG抗体反应。最终检测线和质控线可见荧光信号。当试纸条检测阴性血清时，只有荧光微球-羊抗兔IgG探针与质控线上的兔抗山羊抗体发生反应，同时也只有质控线可见荧光信号。
有益效果
本发明制备的可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条主要由样品垫、结合垫、层析摸、吸水垫和底板五个基本结构单元组成，从检测时的测试端至手柄端依次叠加于支撑底板上。样品垫为经过处理的玻璃纤维素膜XQ-Y8，用于快速吸收待检样品溶液，使其通过虹吸作用向结合垫侧向流动；结合垫为玻璃纤维素膜SB-06，吸附有标记的生物活性材料：时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针和时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针，它可与待检样品溶液中的检测靶标结合形成肉眼可见的免疫复合物，即当试纸条检测阳性血清时，荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针作为捕获探针会与猪血清中的旋毛虫阳性抗体结合，而血清中的猪非特异抗体将不被结合在捕获探针上，从而在最初完成了对血清中阳性抗体的筛选，降低了试纸条检测的本底，进而有助于提高试纸条检测的灵敏度和特异性，因此与申请号为201910604044.8的专利中提供的试纸条相比能够在猪感染旋毛虫的更早期准确地检测出旋毛虫抗体阳性；层析膜为硝酸纤维素膜Millipore135，其上固定有两种抗体，形成“检测线”(T线)和“质控线”(C线)印迹，用于拦截带标记的免疫复合物；吸水垫为吸水纸板，用于吸收流过层析膜的待检样品溶液，以维持层析膜两端的压差，促使更多的待检样品溶液在毛细作用下向一定的方向流动，加快整个免疫层析系统的流动速度，也可防止样品的随意流动。除了样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板外，本发明的试纸条还可添加一些辅助结构，如外层塑胶膜或塑料外壳等，组装成不同类型的免疫层析试纸产品。
本发明所述的试纸条具有操作简单、省时省力、结果易判读等特点，对使用者的专业技能没有限制，同时与现有的荧光微球免疫层析试纸条相比有具有更高的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于旋毛虫的现场快速检测，具有市场开发价值及前景。
附图说明
图1.A为荧光免疫层析检测试纸条结构示意图：其中，1为样品垫；2为结合垫；3为检测线；4为质控线；5为硝酸纤维膜；6为吸水垫；B为荧光免疫层析检测试纸条检测原理示意图；
图2.荧光免疫层析检测试纸条检测结果判定示意图：其中1为加样孔；2为检测线；3为质控线；a)为阴性结果示意图；b)为阳性结果示意图；
图3荧光免疫层析检测试纸条灵敏度检测结果，其中，A为感染100条旋毛虫的猪血清(0-120天)试纸条检测结果；B为感染1000条旋毛虫猪血清(0-120天)试纸条检测结果；C为感染10000条旋毛虫猪血清(0-120天)试纸条检测结果；1为质控线；2为检测线；
图4荧光免疫层析检测试纸条特异性检测结果，其中，1为质控线；2为检测线。
具体实施方式
本发明所述试剂或仪器设备均可通过商业化途径购买获得。
实施例1、旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条
本实施例所述可早期检测猪旋毛虫感染的荧光免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述样品垫设有加样孔；所述结合垫喷涂有荧光探针，所述荧光探针包括作为指示探针的时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG和作为捕获探针的时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原，其中，所述旋毛虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原组成；所述层析膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂有鼠抗猪IgG，质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。所述时间分辨荧光微球为Eu纳米颗粒；所述样品垫材质为玻璃纤维素膜XQ-Y8；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜SB-06；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜Millipore135，试纸条结构示意图如图1中A所示。
实施例2、旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条的制备方法。
1)旋毛虫ES混合抗原制备：将旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原及旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原，按照1:1的质量比混合，获得旋毛虫ES混合抗原；具体方法为：
①旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原的制备：
将收集的旋毛虫肌幼虫用含有青霉素(500U/mL)和链霉素(500U/mL)的培养液洗涤三次(自然沉淀，每次20min)，然后将其放入含青霉素(250U/mL)和链霉素(250U/mL)的培养液中(密度为5000条/mL)，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清。用一次性针头式过滤器过滤掉残留的肌幼虫及碎片后，收集的培养液上清依次经PBS透析过夜及3KDa超滤管浓缩至2-3mg/mL，得到旋毛虫ML-ESP抗原并保存于-70℃备用。培养过程中务必保证培养基无细菌、真菌等污染，污染的抗原不能被利用。
②旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原的制备：
将收集的旋毛虫肌幼虫经口感染雌性Wistar大鼠，,6-8周龄，购自吉林大学实验动物中心，所述Wistar大鼠的感染剂量为8000条/只，6h后处死，立即取出大鼠小肠，使用注射器用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗小肠，纵向和横向将小肠切割成1～2cm的碎片，放置于含有培养液的培养皿筛网上，37℃孵育3h，将培养皿底部的虫体收集到15mL的离心管中，用含有青霉素(500U/mL)和链霉素(500U/mL)的培养液洗涤三次(自然沉淀，每次20min)，然后将其放入含青霉素(250U/mL)和链霉素(250U/mL)的培养液中(密度为5000条/mL)，于37℃，10％二氧化碳条件下，培养18-24h后收集上清。用一次性针头式过滤器过滤掉残留的肌幼虫及碎片后，收集的培养液上清依次经PBS透析过夜及3KDa超滤管浓缩至2-3mg/mL，得到旋毛虫iML-ESP抗原并保存于-70℃备用。培养过程中务必保证培养基无细菌、真菌等污染，污染的抗原不能被利用。
③旋毛虫ES混合抗原的制备：
用0.01mol/L PBS缓冲液分别将旋毛虫ML-ESP抗原和旋毛虫ML-ESP抗原将旋毛虫肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原稀释至浓度2mg/mL，将两种抗原按1：1的质量比充分混合(工作浓度均为1mg/L)。
2)结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针和时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针按照10:1的比例喷涂于结合垫上，真空抽干后干燥保存备用；具体方法为：
①时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针的制备：
将14000g 1％(w/v)的时间分辨荧光微球离心后弃掉保存液中的甘油和磷酸盐；加入PH为6.1，浓度为0.025mol/L的2-吗啉乙磺酸MES溶液100μL，浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS 1.5μL，浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC 1μL和浓度为10mg/ml的时间分辨荧光微球10μL混匀，搅拌孵育1～2h；待反应结束，离心后弃上清，使用PH＝7,浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀后加入200μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入5μL浓度为1mg/mL的旋毛虫ES混合抗原，室温孵育2-3h；待反应结束，离心后弃上清，然后，加入200μL质量分数为5％的BSA溶液，室温封闭2h，离心后弃上清，向沉淀中加入200μL储存液重悬；所述偶联储存液为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液，每升偶联储存液中含有0.5mL Proclin300，BSA 10g和聚乙二醇40020g。
②时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG抗体荧光探针的制备
时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG抗体荧光探针的制备方法与时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针的制备相同。
③结合垫的制备
将上述制备获得的含有偶联旋毛虫ES混合抗原的荧光微球和含有偶联山羊抗兔IgG抗体的荧光微球用试纸喷膜仪喷涂至300×5mm玻璃纤维素膜SB-06上，点样速度为10μL/cm，4℃真空抽干，于4℃干燥保存备用。
3)检测线和质控线的制备：将鼠抗猪IgG抗体与兔抗山羊IgG抗体按照2:1的质量比，分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，37℃真空干燥2h，于4℃密封保存备用；具体方法为：
用浓度为1μg/mL鼠抗猪IgG抗体与0.5μg/mL兔抗山羊IgG抗体(0.01mol/LPBS缓冲液稀释)分别作为检测线盒质控线试剂。用试纸喷膜仪将两种试剂分别点在硝酸纤维素膜Millipore135上，点样速度为0.8μL/cm。37℃干燥2h。使用封闭剂(磷酸缓冲液PBS含质量分数为2％的BSA)浸泡干燥后的硝酸纤维素膜Millipore1351-2h，随后37℃干燥1-2h，于4℃密封保存备用。
4)试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条，具体方法为：按图1所示，将荧光专用黑色底板、样品垫XQ-Y8、结合垫SB-06、吸水垫H5072和硝酸纤维素膜Millipore135粘在一起，并用试纸条切割机将其切成3.5mm宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中，将试纸条放入含有干燥剂的密封袋内，密封后于4℃保存备用。
5)旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条检测旋毛虫病。
样品稀释：分别用样品稀释液将旋毛虫抗体阳性血清(如猪感染旋毛虫血清)、阴性血清(如正常猪血清)和待检血清(如猪血清)样品稀释100倍，即向99μL稀释液中加入1μL猪血清，用移液器混匀。将试纸条平放于操作台面，加样孔朝上，向加样孔中加入100μL稀释后的血清样品，室温静置10min，用紫外灯360-370nm照射试纸条观察结果，所述样品稀释液由0.9％NaCl、1.5％BSA和0.05％吐温-20组成。
结果判定应在加样后20min内进行。待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性；如果质控线不显色，则检测无效，应更换试纸条重新检测。荧光免疫层析试纸条检测结果判定示意图见图2。
6)考察旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条灵敏度和特异性。
①灵敏度检测：
将感染剂量为分别为100、1000和10000条的旋毛虫肌幼虫的猪血清(采集血清时间点为：第0、7、9、11、13、15、17、19、21、25、30、35、45、60、90和120天)分别使用试纸条和商品化的Qiagen ELISA检测。感染剂量为10000条旋毛虫肌幼虫的猪血清，ELISA在21-25天检测到旋毛虫抗体阳性，而试纸条可以在17-19天检测到旋毛虫感染。感染剂量为1000条旋毛虫肌幼虫其中ELISA在25-30天检测到旋毛虫抗体阳性，而试纸条在21-25天可以检测到旋毛虫感染。感染剂量为100条肌幼虫，其中ELISA在30-45天检测到旋毛虫抗体阳性，试纸条可在25-35天检测到旋毛虫抗体。该结果表明：与Qiagen ELISA相比该试纸条灵敏度明显升高，可以较早地检测到抗体阳性，可用于旋毛虫感染血清的筛查，检测结果如图3所示。
②特异性检测：
用试纸条检测猪感染华支睾吸虫、囊虫、隐孢子虫、亚热带绦虫、弓形虫等10份血清(每种虫种各两份血清)，设置阳性对照。经检测：试纸条结果无阳性条带，表明试纸条特异性良好，检测结果如图4所示。
③荧光微球免疫层析试纸条临床样本检测
应用试纸条、消化法和Qiagen ELISA对云南和内蒙古地区15000头猪进行检测，检测结果显示：有19头猪被试纸条检测为抗体阳性，诊断为旋毛虫病。有17头猪被消化法和Qiagen ELISA诊断为旋毛虫病。试纸条准确率高达99％以上。
④荧光微球免疫层析试纸条重复性和稳定性实验
采用不同批次的3批试纸条检测，经ELISA检测后的30份阴性血清和30份旋毛虫感染阳性血清，其灵敏度和特异性均为100％。实验表明：制备的荧光微球免疫层析试纸条重复性和稳定性良好。
⑤与结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的旋毛虫免疫荧光试纸条灵敏度的比较。
将感染剂量为分别为100、1000和10000条的旋毛虫肌幼虫的猪血清分别使用本发明所述试纸条和结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的旋毛虫免疫荧光试纸条(申请公开号为CN110221006A的专利申请中所述的试纸条)检测。感染剂量为10000条旋毛虫肌幼虫的猪血清，其中本发明的试纸条最早可以在17天检测到旋毛虫抗体阳性，而辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的旋毛虫免疫荧光试纸条最早21天可以检测到旋毛虫感染，。感染剂量为1000条旋毛虫肌幼虫，其中本发明的试纸条试纸条在21-25天检测到旋毛虫感染，而辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的旋毛虫免疫荧光试纸条在25-35天可以检测到旋毛虫感染。感染剂量为100条肌幼虫，其中本发明的试纸条试纸条在25-35天检测到旋毛虫感染，而辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的旋毛虫免疫荧光试纸条在35-40天可以检测到旋毛虫感染该结果表明：本发明中的试纸条比辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的旋毛虫免疫荧光试纸条更为灵敏，可用于旋毛虫感染血清的筛查。

Claims (10)

1.一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，其特征在于，所述样品垫设有加样孔；所述结合垫喷涂有荧光探针，所述荧光探针包括作为指示探针的时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG和作为捕获探针的时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原；所述层析膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂有鼠抗猪IgG，质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。
2.根据权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述旋毛虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原组成。
3.根据权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球为Eu纳米颗粒；所述样品垫材质为玻璃纤维素膜XQ-Y8；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜SB-06；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜Millipore135。
4.权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)旋毛虫ES混合抗原制备：将旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原及旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原，按照1:1-3:1的质量比混合，获得旋毛虫ES混合抗原；
2)结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针和时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针按照10:1-5:1的质量比喷涂于结合垫上，真空抽干后干燥保存备用；
3)检测线和质控线的制备：将鼠抗猪IgG抗体与兔抗山羊IgG抗体按照2:1的质量比，分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，真空干燥2-3h，密封保存备用；
4)试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫经口感染大鼠，感染剂量为8000条/只，6h后处死，取出大鼠小肠，切割成碎片，放置于含有培养液的培养皿筛网上，37℃孵育2-3h，收集培养皿底部的虫体，用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针的制备方法如下：每14000g 1％(w/v)的时间分辨荧光微球经离心后弃掉保存液中的甘油和磷酸盐；加入PH为6.1，浓度为0.025mol/L的2-吗啉乙磺酸MES溶液100μL，浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS 1.5μL，浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC 1μL和浓度为10mg/ml的时间分辨荧光微球10μL混匀，搅拌孵育1～2h；待反应结束，离心后弃上清，使用PH＝7浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀后加入200μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入5μL浓度为1mg/mL的旋毛虫ES混合抗原，室温孵育2-3h；待反应结束，离心后弃上清，然后，加入200μL质量分数为5％的BSA溶液，室温封闭2h，离心后弃上清，向沉淀中加入200μL储存液重悬；所述偶联储存液为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液，每升偶联储存液中含有0.5mL Proclin300，BSA 10g和聚乙二醇40020g。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针的制备方法如下：每14000g 1％(w/v)的时间分辨荧光微球经离心后弃掉保存液中的甘油和磷酸盐；加入浓度为0.025mol/L的2-吗啉乙磺酸MES溶液100μL、浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS 1.5μL、浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC 1μL和浓度为10mg/ml的时间分辨荧光微球10μL混合均匀后，搅拌孵育45min；待反应结束，离心后弃上清，使用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀，加入200μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入5μL浓度为1mg/mL的羊抗兔IgG抗体，室温孵育2-3h；待反应结束，离心后弃上清，然后，加入200μL质量分数为5％的BSA溶液，室温封闭2h，离心后弃上清，向沉淀中加入200μL储存液重悬；所述偶联储存液为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液，每升偶联储存液中含有0.5mLProclin300，BSA 10g和聚乙二醇40020g。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述喷涂荧光探针的点样速度为10μL/cm。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述检测线喷涂鼠抗猪IgG的点样速度和质控线喷涂兔抗山羊IgG的点样速度均为0.8μL/cm。
CN202011380951.8A 2020-11-30 2020-11-30 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 Pending CN112526125A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011380951.8A CN112526125A (zh) 2020-11-30 2020-11-30 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
PCT/CN2021/097205 WO2022110733A1 (zh) 2020-11-30 2021-05-31 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011380951.8A CN112526125A (zh) 2020-11-30 2020-11-30 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112526125A true CN112526125A (zh) 2021-03-19

Family

ID=74995651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011380951.8A Pending CN112526125A (zh) 2020-11-30 2020-11-30 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112526125A (zh)
WO (1) WO2022110733A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113406324A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 吉林大学 一种s形光纤锥免疫传感器、制备方法及其应用
CN113655220A (zh) * 2021-08-19 2021-11-16 浙江嘉孚生物科技有限公司 一种检测侵袭性曲霉菌感染的时间分辨荧光免疫层析试纸及其制备方法
WO2022110733A1 (zh) * 2020-11-30 2022-06-02 吉林大学 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115856284B (zh) * 2022-12-15 2023-11-28 西交利物浦大学 一种具有仿生流道的层析试纸条及其应用
CN116106284A (zh) * 2023-04-11 2023-05-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于氧化石墨烯的比色荧光双模式复合纳米片及其制备方法与应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1263599A (zh) * 1998-04-14 2000-08-16 大塚制药株式会社 测定抗体的方法及抗体测定装置
CN1403813A (zh) * 2001-12-15 2003-03-19 河南省农业科学院生物技术研究所 旋毛虫病快速诊断试纸条
WO2011101790A1 (fr) * 2010-02-17 2011-08-25 Agence Nationale Chargee De La Securite Sanitaire De L'alimentation, De L'environnement Et Du Travail Antigenes polypeptidiques de trichinella, et leurs applications
CN102495216A (zh) * 2011-12-16 2012-06-13 吉林大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速检测试纸条
CN103869072A (zh) * 2014-01-22 2014-06-18 东南大学 用于纳米颗粒标记免疫检测的磁场辅助介电泳富集方法
CN110221066A (zh) * 2019-07-05 2019-09-10 吉林大学 一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110514843B (zh) * 2019-08-12 2021-08-10 吉林大学 一种猪旋毛虫病上转发光诊断试剂盒
CN111007257A (zh) * 2019-12-13 2020-04-14 暨南大学 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体检测免疫阻断层析试剂盒及其应用
CN112526125A (zh) * 2020-11-30 2021-03-19 吉林大学 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1263599A (zh) * 1998-04-14 2000-08-16 大塚制药株式会社 测定抗体的方法及抗体测定装置
CN1403813A (zh) * 2001-12-15 2003-03-19 河南省农业科学院生物技术研究所 旋毛虫病快速诊断试纸条
WO2011101790A1 (fr) * 2010-02-17 2011-08-25 Agence Nationale Chargee De La Securite Sanitaire De L'alimentation, De L'environnement Et Du Travail Antigenes polypeptidiques de trichinella, et leurs applications
CN102495216A (zh) * 2011-12-16 2012-06-13 吉林大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速检测试纸条
CN103869072A (zh) * 2014-01-22 2014-06-18 东南大学 用于纳米颗粒标记免疫检测的磁场辅助介电泳富集方法
CN110221066A (zh) * 2019-07-05 2019-09-10 吉林大学 一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B.Q. FU等: "Detection of anti-Trichinella antibodies in serum of experimentally-infected swine by immunochromatographic strip", 《VETERINARY PARASITOLOGY》 *
CHENG-CHENG ZHAI等: "Kinetics Evaluation of IgM and IgG Levels in the Mice Infected with Trichinella spiralis Experimentally Using ES Antigens from Different Developmental Stages of the Parasite", 《IRAN J PARASITOL》 *
任科研: "应用免疫胶体金技术对猪旋毛虫病诊断方法的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
李亚明 等: "《中国医学发展系列研究报告 核医学进展 2014-2016》", 30 April 2018, 中华医学电子音像出版社 *
王春等: "上转发光免疫层析技术快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体方法的建立", 《中国兽医学报》 *
王鑫瑜等: "旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条的研制", 《中国兽医科学》 *
郑继昌等: "旋毛虫血清学诊断研究进展", 《中国兽医寄生虫病》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022110733A1 (zh) * 2020-11-30 2022-06-02 吉林大学 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN113406324A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 吉林大学 一种s形光纤锥免疫传感器、制备方法及其应用
CN113655220A (zh) * 2021-08-19 2021-11-16 浙江嘉孚生物科技有限公司 一种检测侵袭性曲霉菌感染的时间分辨荧光免疫层析试纸及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022110733A1 (zh) 2022-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112526125A (zh) 一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN109765384B (zh) 一种犬冠状病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用
CN110658339B (zh) 非洲猪瘟病毒的检测试纸、试剂盒及其制备方法
KR101942098B1 (ko) 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트
CN105137072B (zh) 一种结核分枝杆菌lam检测试剂盒、制备方法以及使用方法
CN105259354B (zh) 结核T细胞释放γ‑干扰素检测试剂盒及其使用方法
CN110221066B (zh) 一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用
CN108398565A (zh) 用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡与制备方法
CN102650642A (zh) 一种用于检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡和试剂盒
CN111007257A (zh) 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体检测免疫阻断层析试剂盒及其应用
CN111596064B (zh) 同时检测pedv和tgev的速测卡及其制备、使用方法
CN108414753A (zh) 用于检测犬细小病毒抗原的免疫荧光层析检测卡与制备方法
CN105759028A (zh) 一种诺如病毒拉曼探针标记的免疫层析检测方法
CN109856406B (zh) 一种犬细小病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用
CN110514843A (zh) 一种猪旋毛虫病上转发光诊断试剂盒
CN202141725U (zh) 一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒
CN109613273A (zh) 一种乙肝五项时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒
CN106526166A (zh) 猪肉中瘦肉精的快速检测
CN112379089A (zh) 一种基于量子点微球免疫层析试纸条的新冠病毒检测方法
CN208607234U (zh) 用于检测犬细小病毒抗原的免疫荧光层析检测卡
CN108226468A (zh) 一种检测NT-proBNP的试纸条及其制备方法与应用
CN109633163B (zh) 降钙素原/c反应蛋白二合一检测试剂盒
CN102692502A (zh) 一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法
JP3841559B2 (ja) 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット
CN102608320B (zh) 检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单抗及酶联免疫方法与试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Liu Mingyuan

Inventor after: Liu Xiaolei

Inventor after: Yang Yong

Inventor after: Wang Xinyu

Inventor after: Wang Xuelin

Inventor after: Bai Xue

Inventor after: Tang Bin

Inventor after: Ding Jing

Inventor before: Liu Mingyuan

Inventor before: Liu Xiaolei

Inventor before: Yang Yong

Inventor before: Wang Xinyu

Inventor before: Wang Xuelin

Inventor before: Bai Xue

Inventor before: Tang Bin

Inventor before: Ding Jing