CN115856284B - 一种具有仿生流道的层析试纸条及其应用 - Google Patents
一种具有仿生流道的层析试纸条及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有仿生流道的层析试纸条及其应用，所述层析试纸条包括PVC背板(105)和PVC背板(105)上沿层析方向依次连接的共轭垫(101)、PDMS仿生流道(102)、检测垫(103)和吸水垫(104)；所述PDMS仿生流道(102)包括PDMS流道(301)和沿层析方向相互交错平行排布的PDMS制作的模仿蜥蜴角的结构凸起(302)，其中的沟壑为流道。所述PDMS仿生流道能够实现流体速度控制，以所述PDMS仿生流道替代T线前的硝酸纤维素膜，可以避免内部孔隙吸附蛋白质或核酸等样品，所述PDMS仿生流道能够实现更少的浪费，增加样品之间的反应时间，提高层析试纸条的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种具有仿生流道的层析试纸条及其应用。
背景技术
侧流免疫层析试纸条检测是临床诊断中非常有吸引力的工具，它们可以通过更迅速的诊断来改善病人护理，具有快速诊断、简单操作、低成本、给予非熟练人员使用的可能性等特点，被认为是一种“手边的实验室”，代表了从样本到实验室到简易样本操作的范式转变，改善诊断效率。侧流免疫层析检测可以利用标记物的显色特性，实现对待测物的定性、半定量、定量分析，从检测用于临床的分子、生物标记物，侧流免疫层析试纸条的应用已经迅速扩展到其他领域，包括食品和饲料安全、兽医和环境控制。
然而，侧流免疫层析试仍然有重要的局限性，特别在灵敏度方面，灵敏度以及检测限度是目前免疫层析检测试纸条发展的关键点。T线和共轭垫之间的检测垫是免疫层析检测试纸条检测的关键部分，这一部分必须允许流体流动，但同时也要为分析物和生物结合物之间的相互作用提供机会。
已有许多方法尝试通过修改检测垫的结构和位置来提高检测灵敏度，但仍然缺乏对层析流动速度精确的控制。检测垫是试纸条的关键部分。硝酸纤维素的孔隙率必须足够高，以允许流体流动，但同时也要给予样本和生物结合物相互作用的机会。
现有的一些方法能够提高灵敏度，如在共轭垫和T线之间的区域已经引入了不同的物理屏障，以便延迟流动，最大限度地提高生物共轭物的相互作用时间；例如通过蜡印制造的延迟疏水屏障降低速度；通过嵌入可调节的亲水棉线型屏障降低速度；也有方法应用可溶解的盐水屏障降低流速，增强免疫反应时间；也有方法利用二氧化碳激光图案作为疏水性材料的替代品，在检测垫上创建流道。这些方法显然在不同程度上提高了灵敏度，但缺乏精确的速度控制，而且难以整合。
因此，开发一种能够实现更少的浪费，增加蛋白质之间的反应时间，但不超过即时诊断的时间要求，并具有较高灵敏度的层析试纸条在即时检测领域具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种具有仿生流道的层析试纸条及其应用。本发明所述层析试纸条的检测垫前含有PDMS仿生流道，所述PDMS仿生流道能够实现流体速度控制，以所述PDMS仿生流道替代T线前的硝酸纤维素膜，可以避免内部孔隙吸附蛋白质或核酸等样品，这种新型PDMS仿生流道能够实现更少的浪费，增加样品之间的反应时间，但不超过即时诊断的时间要求，并最终提高层析试纸条的灵敏度。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有仿生流道的层析试纸条，所述层析试纸条包括PVC背板105和PVC背板105上沿层析方向依次连接的共轭垫101、PDMS仿生流道102、检测垫103和吸水垫104；
所述PDMS仿生流道102包括PDMS流道301和沿层析方向相互交错平行排布的PDMS制作的模仿蜥蜴角的结构凸起302，其中的沟壑为流道。
本发明所述具有仿生流道的层析试纸条可以在即时检测时间要求的范围内，在一定程度上增加配体和受体(包括抗原抗体、互补的核酸与探针)反应时间，提高反应灵敏度，并减少生物样本的残留和损失，可有效实现对流道中液体的速度控制，增加检测范围，降低反应限度。
本发明按照仿生方法，设计了一个人工表面，其灵感来自于收集水分的蜥蜴，其皮肤能够通过鳞片之间的毛细管系统定向收集和输送水分。在此，本发明旨在开发一个新型的层析试纸条平台，通过3D打印具有不同微观形状和角度的树脂模板，以树脂模板为基础使用PDMS制作流道，从而实现对流体速度控制。所述流道用于替代T线前的硝酸纤维素膜，可以避免内部孔隙吸附蛋白质或核酸等样品。这种新型平台能够实现更少的浪费，增加样品之间的反应时间，但不超过即时诊断的时间要求，并最终提高层析试纸条的灵敏度。
优选地，沿层析方向上，每两个相邻的模仿蜥蜴角的结构凸起302平行排布的间距为1-3mm，例如可以是1mm、1.5mm、2mm、2.5mm或3mm等。
优选地，沿层析方向上，单个模仿蜥蜴角的结构凸起302的轴向长度与所述PDMS仿生流道102的轴向长度的比例为1:(8-15)，例如可以是1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15等。
优选地，垂直于沿层析方向上，单个模仿蜥蜴角的结构凸起302的纵向宽度与所述PDMS仿生流道102的纵向宽度的比例为1:(2-4)，例如可以是1:2、1:2.5、1:3、1:3.5或1:4等。
优选地，所述PDMS仿生流道102采用包括如下步骤的方法制备得到：
(1)采用异丙醇清洗光敏树脂模具，将清洗后的光敏树脂模具先后进行光固化和干燥固化；
(2)将PDMS与固化剂搅拌混合，脱气泡后，倒入步骤(1)处理后的光敏树脂模具中，再次脱气泡后进行干燥固化。
本发明中，使用3D打印软件绘制如图3所示的仿生流道立体模型301、302；再将模型导入微纳3D打印机，打印出光敏树脂材料的模具；对光敏树脂模具进行处理，最后制备得到具有优异脱模效果的光敏树脂模具，从而制备仿生流道。
优选地，步骤(1)中，所述异丙醇清洗光敏树脂模具的时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min或12min等；所述清洗温度为20-25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
优选地，步骤(1)中，所述光固化在紫外光源下进行，所述光固化的时间为55-65min，例如可以是55min、58min、60min、62min或65min等。
优选地，步骤(1)中，所述干燥固化的温度为115-125℃，所述干燥固化的时间为55-65min，例如可以是55min、58min、60min、62min或65min等。
优选地，步骤(2)中，所述PDMS与固化剂的质量比例为(8-12):1，例如可以是8:1、9:1、10:1、11:1或12:1等。
优选地，步骤(2)中，所述搅拌混合的时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min或12min等。
优选地，步骤(2)中，所述干燥固化的温度为55-65℃，例如可以是55℃、58℃、60℃、62℃或65℃等，所述干燥固化的时间大于等于2h，例如可以是2h、3h、4h或5h等。
作为本发明的优选技术方案，所述PDMS仿生流道102采用包括如下步骤的方法制备得到：
(1)采用异丙醇在20-25℃清洗光敏树脂模具8-12min，将清洗后的光敏树脂模具在紫外光源下进行光固化55-65min，在115-125℃干燥固化55-65min；
(2)将PDMS与固化剂按质量比例为(8-12):1搅拌混合8-12min，脱气泡后，倒入步骤(1)处理后的光敏树脂模具中，再次脱气泡后在55-65℃干燥固化，干燥固化的时间大于等于2h。
优选地，所述PDMS仿生流道102为聚乙二醇改性后的亲水性PDMS仿生流道。
优选地，所述改性采用包括如下步骤的方法进行：将所述PDMS仿生流道102进行等离子处理，再采用聚乙二醇改性。
优选地，所述等离子处理的时间为5-15min，例如可以是5min、8min、10min、12min或15min等。
优选地，所述改性采用的聚乙二醇溶液的浓度为0.08-0.4M，例如可以是0.08M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M或0.4M等。
优选地，所述聚乙二醇的分子量为1000-6000，例如可以是1000、2000、3000、4000、5000或6000等。
优选地，所述聚乙二醇改性的温度为20-25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等，所述聚乙二醇改性的时间大于等于2h，例如可以是2h、3h、4h或5h等。
作为本发明的优选技术方案，所述改性采用包括如下步骤的方法进行：
将所述PDMS仿生流道102进行等离子处理5-15min，再采用0.08-0.4M聚乙二醇溶液在20-25℃改性，所述聚乙二醇的分子量为1000-6000，改性的时间大于等于2h。
由于PDMS具有超疏水性，液体很难流动，是本发明所述层析试纸条制备和实施过程中的难点。发明人采用聚乙二醇实现了对PDMS的表面改性，得到了表面永久亲水性固态PDMS，以实现液体的流动和铺展。聚乙二醇及其衍生物具有极好的生物相容性，还具有极高的亲水性，聚乙二醇与水的亲和力大大高于它与生物大分子如蛋白质等的亲和力，因此生物大分子、细菌、病毒(如SARS病毒)等不能吸附在聚乙二醇材料的表面上，从而达到自洁净的效果。
本发明选用聚乙二醇来修饰PDMS，并将修饰后的PDMS应用在试纸条结构中。聚乙二醇对PDMS表面的改性之后，聚乙二醇与PDMS材料连成一体，极大地改善了亲水层的致密性、均匀性、和稳定性，其表面基本上不吸附蛋白质，而且永久保持亲水性，同时，其表面的生物兼容性更加完美，这就为本发明的表面永久亲水性固态PDMS在生物医学上的应用提供了必要和充分的条件。本发明的表面永久亲水性PDMS制备简易，成本低，便于推广和利用。
优选地，所述共轭垫101上有固定好的荧光微球标记偶联抗体或核酸。
优选地，所述荧光微球标记偶联抗体在共轭垫101的固定量为1-9μL/cm，例如可以是1μL/cm、3μL/cm、5μL/cm、7μL/cm或9μL/cm等。
优选地，所述荧光微球标记偶联核酸在共轭垫101的固定量为1-9μL/cm，例如可以是1μL/cm、3μL/cm、5μL/cm、7μL/cm或9μL/cm等。
优选地，所述检测垫103上包括包被了捕获抗体或捕获探针的检测线1031和包被了质控抗体或通用探针的C线1032。
本发明中，在硝酸纤维素膜上制作检测线包括以下步骤：采用捕获抗体或捕获探针溶液在硝酸纤维素膜的区域使用喷膜仪喷一条线，由于硝酸纤维素膜的孔径吸附，从而将抗体蛋白或核酸固定在硝酸纤维素膜上。
优选地，所述T线1031上捕获抗体的包被量为0.5-2mg/cm，例如可以是0.5mg/cm、1mg/cm、1.5mg/cm或2mg/cm等。
优选地，所述T线1031上捕获探针的包被量为0.5-2mg/cm，例如可以是0.5mg/cm、1mg/cm、1.5mg/cm或2mg/cm等。
优选地，所述C线1032上质控抗体的包被量为0.5-2mg/cm，例如可以是0.5mg/cm、1mg/cm、1.5mg/cm或2mg/cm等。
优选地，所述C线1032上通用探针的包被量为0.5-2mg/cm，例如可以是0.5mg/cm、1mg/cm、1.5mg/cm或2mg/cm等。
优选地，所述质控线与所述检测线为分别垂直于所述试纸条的上下边的平行线。
优选地，所述质控线靠近所述吸水垫104端。
优选地，所述T线1031和C线1032的间隔为2-8mm，例如可以是2mm、4mm、5mm、6mm或8mm等。
本发明中，共轭垫为待测样品滴加区域，在进行免疫层析时，共轭垫上含有固定好的荧光微球标记偶联抗体(fluorescent microsphere-antibody，FM-Ab)，用于待测样品中的抗原与FM-Ab的结合。仿生流道为样品与共轭垫中标记抗体的反应区域。NC膜(硝酸纤维素膜)是主要的检测区域，其中有包被的捕获抗体，反应后的信号集中于检测线及质控线。吸水垫用于吸收流动的样本溶液，提供层析动力。PVC作为支撑，使其余四个部件组装在一起。硝酸纤维素膜为层析及检测区域，当含有一定浓度的抗原以及缓冲液滴加至共轭垫时，在毛细作用下使捕获抗原的FM-Ab途经仿生流道并充分结合，在硝酸纤维素膜上FM-Ab与固定抗体发生反应，FM-Ab复合物与捕获抗体结合形成“FM-Ab-抗原-捕获抗体”。最后，剩余未与抗原结合的游离FM-Ab可被质控线上的质控抗体捕获。样品中的待测物越多，固定在相应检测线上的标记物也就越多，当标记物达到一定数量后，使检测线出现肉眼可见的信号点。在一定范围内信号强度随着待测物抗原浓度的升高而增强，通过肉眼观察或者结合相应地信号检测仪器，可以对结果进行定性或者定量分析。
当样品中不含有待测物时，检测线(T线)无法捕获FM-Ab；如果试纸条在检测过程中，质控线(C线)没有出现信号，表示“FM-Ab-抗体”复合物失活，检测判定为无效。T线的抗体作为FM-ab的配对抗体(捕获抗体)，捕获了携带有荧光微球的FM-ab，所以聚集于T线形成信号点，C线的质控抗体可与FM-ab结合，携带荧光微球的FM-ab在C线与质控抗体聚集形成信号点。
优选地，所述共轭垫101为玻璃纤维材料，所述共轭垫101的厚度为0.19-0.29mm，例如可以是0.19mm、0.2mm、0.21mm、0.23mm、0.25mm、0.27mm或0.29mm等。
优选地，所述PDMS仿生流道102为PDMS材料，所述PDMS仿生流道102的厚度为0.2-0.3mm，例如可以是0.2mm、0.25mm或3mm等。
优选地，所述检测垫103为硝酸纤维素膜，所述检测垫103的厚度为0.2-0.3mm，例如可以是0.2mm、0.25mm或3mm等，所述硝酸纤维素膜的孔径为0.015-0.02mm，例如可以是0.015mm、0.018mm或0.02mm等。
优选地，所述吸水垫104为植物纤维材料，所述吸水垫104的厚度为0.6-0.76mm，例如可以是0.6mm、0.65mm、0.7mm或0.76mm等。
第二方面，本发明提供一种层析检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的具有仿生流道的层析试纸条。
第三方面，本发明提供第一方面所述的具有仿生流道的层析试纸条和/或第二方面所述的层析检测试剂盒在层析检测中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的层析试纸条不仅保留了传统层析检测试纸条操作简便、结构简单、低成本的优点，还有效避免了样品在传统试纸条中流过T线之前被硝酸纤维素膜吸附样品的缺点，减少了残留，并通过仿生流道的设计增加反应时间，精确控制速度，实现最佳检测限的控制，有效提高了灵敏度，扩大了检测范围。
附图说明
图1是层析试纸条整体结构；其中，101为玻璃纤维共轭垫，加样区；102为PDMS仿生流道；103为硝酸纤维素膜反应区；1031为包被了cTnI捕获抗体的T线；1032为包被了IgG羊抗鼠抗体的C线；104为吸水垫；105为PVC塑料胶板底板。
图2是层析试纸条整体俯视图；其中，101为玻璃纤维共轭垫，加样区；102为PDMS仿生流道；103为硝酸纤维素膜反应区；1031为包被了cTnI捕获抗体的T线；1032为包被了IgG羊抗鼠抗体的C线；104为吸水垫。
图3是层析试纸条仿生流道部分；其中，301为PDMS流道；302为PDMS制作的模仿蜥蜴角的结构凸起，其中的沟壑为流道。
图4是仿生流道俯视图；其中，301为PDMS流道；302为PDMS制作的模仿蜥蜴角的结构凸起。
图5是层析时间10秒时不同的层析试纸条的层析效果。
图6是层析时间20秒时不同的层析试纸条的层析效果。
图7是层析时间40秒时不同的层析试纸条的层析效果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1、制备PDMS微结构
(1)使用3D打印软件绘制图3的仿生流道立体模型；
(2)将模型导入微纳3D打印机，打印出光敏树脂材料(BMF魔方精密，HTL，Resin，Yellow-30)的模具；
(3)对光敏树脂模具进行处理，采用异丙醇清洗10min后，在紫外光源下进行光固化60min，在120℃烘箱中干燥固化60min；
(4)将道康宁的PDMS:固化剂以10:1的质量比混合，搅拌10min；
(5)使用真空干燥箱对PDMS抽真空，将其倒入步骤(3)处理后的模具中，二次抽真空处理；
(6)60℃烘箱固化3h。
2、PDMS微结构的亲水性处理
(1)将图3中的PDMS仿生流道放入等离子处理仪(善准科技VP-R series)中，等离子处理10min；
(2)将等离子处理后的PDMS仿生流道放入0.1M的聚乙二醇溶液，分子量为1500，在20℃反应3h。
基于上述PDMS仿生流道制备得到具有仿生流道的层析试纸条，所述试纸条的整体结构如图1所示，其中，101为玻璃纤维共轭垫，加样区，所述共轭垫101的厚度为0.25mm；102为PDMS仿生流道，所述PDMS仿生流道102的厚度为0.25mm；103为硝酸纤维素膜反应区，所述检测垫103的厚度为0.25mm；1031为包被了cTnI捕获抗体的T线；1032为包被了IgG羊抗鼠抗体的C线；104为吸水垫，所述吸水垫104的厚度为0.65mm；105为PVC塑料胶板底板。
图2是层析试纸条整体俯视图；其中，101为玻璃纤维共轭垫，加样区；102为PDMS仿生流道；103为硝酸纤维素膜反应区；1031为包被了cTnI捕获抗体的T线；1032为包被了IgG羊抗鼠抗体的C线；104为吸水垫。
图3是层析试纸条仿生流道部分；其中，301为PDMS流道；302为PDMS制作的模仿蜥蜴角的结构凸起，其中的沟壑为流道。
图4是仿生流道俯视图；其中，301为PDMS流道；302为PDMS制作的模仿蜥蜴角的结构凸起。
本实施中沿层析方向上，每两个相邻的模仿蜥蜴角的结构凸起302平行排布的间距为2mm，沿层析方向上，单个模仿蜥蜴角的结构凸起302的轴向长度与所述PDMS仿生流道102的轴向长度的比例为1:10；垂直于层析方向上，单个模仿蜥蜴角的结构凸起302的纵向宽度与所述PDMS仿生流道102的纵向宽度的比例为1:3。
实施例2
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1、制备PDMS微结构
(1)使用3D打印软件绘制图3的仿生流道立体模型；
(2)将模型导入微纳3D打印机，打印出光敏树脂材料的模具；
(3)对光敏树脂模具进行处理，异丙醇清洗8min后，在紫外光源下进行光固化55min，在115℃烘箱中干燥固化65min；
(4)将道康宁的PDMS:固化剂以8:1的重量比混合，搅拌12min；
(5)使用真空干燥箱对PDMS抽真空，将其倒入步骤(3)处理后的模具中，二次抽真空处理；
(6)55℃烘箱固化4h。
2、PDMS微结构的亲水性处理
(1)将图3中的PDMS仿生流道放入等离子处理仪中，等离子处理5min；
(2)将等离子处理后的PDMS放入0.08M的聚乙二醇溶液，分子量为6000，在25℃反应4h。
实施例3
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1、制备PDMS微结构
(1)使用3D打印软件绘制图3的仿生流道立体模型；
(2)将模型导入微纳3D打印机，打印出光敏树脂材料的模具；
(3)对光敏树脂模具进行处理，异丙醇清洗12min后，在紫外光源下进行光固化65min，在125℃烘箱中干燥固化55min；
(4)将道康宁的PDMS:固化剂以12:1的重量比混合，搅拌8min；
(5)使用真空干燥箱对PDMS抽真空，将其倒入步骤(3)处理后的模具中，二次抽真空处理；
(6)65℃烘箱固化2h；
2、PDMS微结构的亲水性处理
(1)将图3中的PDMS仿生流道放入等离子处理仪中，等离子处理15min；
(2)将等离子处理后的PDMS放入0.4M的聚乙二醇溶液，分子量为1000，在25℃反应2h。
实施例4
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，对光敏树脂模具进行处理时，采用乙醇清洗光敏树脂模具，其余步骤参照实施例1。
实施例5
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，对光敏树脂模具进行处理时，采用甲醇清洗光敏树脂模具，其余步骤参照实施例1。
实施例6
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，对光敏树脂模具进行处理时，采用异丙醇清洗清洗光敏树脂模具的时间为5min，其余步骤参照实施例1。
实施例7
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，对光敏树脂模具进行处理时，采用异丙醇清洗清洗光敏树脂模具的时间为18min，其余步骤参照实施例1。
实施例8
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，制备PDMS微结构时，步骤(1)光固化的时间为40min，干燥固化的时间为80min，其余步骤参照实施例1。
实施例9
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，制备PDMS微结构时，步骤(1)光固化的时间为80min，干燥固化的时间为40min，其余步骤参照实施例1。
实施例10
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，制备PDMS微结构时，步骤(1)光固化的时间为120min，其余步骤参照实施例1。
实施例11
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，制备PDMS微结构时，步骤(1)干燥固化的温度为120℃，干燥固化的时间为180min，其余步骤参照实施例1。
实施例12
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，制备PDMS微结构时，步骤(1)干燥固化的温度为120℃，干燥固化的时间为80min，其余步骤参照实施例1。
实施例13
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，制备PDMS微结构时，步骤(1)干燥固化的温度为60℃，干燥固化的时间为180min，其余步骤参照实施例1。
实施例14
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，制备PDMS微结构时，步骤(1)干燥固化的温度为130℃，干燥固化的时间为48min，其余步骤参照实施例1。
实施例15
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，PDMS微结构的亲水性处理时，等离子处理的时间为3min，其余步骤参照实施例1。
实施例16
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，PDMS微结构的亲水性处理时，等离子处理的时间为20min，其余步骤参照实施例1。
实施例17
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，PDMS微结构的亲水性处理时，聚乙二醇溶液的浓度为0.05，其余步骤参照实施例1。
实施例18
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，PDMS微结构的亲水性处理时，聚乙二醇溶液的浓度为0.5，其余步骤参照实施例1。
实施例19
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，PDMS微结构的亲水性处理时，聚乙二醇溶液的分子量为800，其余步骤参照实施例1。
实施例20
本实施例提供了一种PDMS仿生流道的制备方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，PDMS微结构的亲水性处理时，聚乙二醇溶液的分子量为7000，其余步骤参照实施例1。
对实施例1-20中所得PDMS仿生流道进行质量检测，包括脱模情况和亲水性处理结果，质量检测结果如表1所示。
表1
通过实施例1与实施例4和5的结果可知，清洗模具过程中，异丙醇应用于脱模效果最佳。通过实施例1与实施例6和7的结果可知，用异丙醇清洗清洗光敏树脂模具的时间在8-12min范围内效果最佳。通过实施例1与实施例8-10的结果可知，光固化在紫外光源下进行，所述光固化的时间55-65min效果最好。通过实施例1与实施例11-14的结果可知，干燥固化的温度在115-125℃范围内，且加热时间为55-65min范围内效果最好。通过实施例1与实施例15-20的结果可知，聚乙二醇溶液的浓度应在0.08-0.4M浓度范围内，且分子量为1000-6000时效果最佳，等离子处理的时间应在5-15min范围内。
不同的层析试纸条的层析效果比较如图5-7所示。图中的试纸对应的类型(表2所示)从左到右依次为传统试纸条(左1)、仿生试纸条设计1、仿生试纸条设计2、仿生试纸条设计3(分别对应实施例1-3中的试纸条)。图5为层析时间10秒时不同的层析试纸条的层析效果，图6为层析时间20秒时不同的层析试纸条的层析效果，图7为层析时间40秒时不同的层析试纸条的层析效果。
表2
| 图中的试纸对应的类型 | 层析速度 |
| 传统试纸条(左1) | 0.00047m/s |
| 仿生试纸条设计1 | 0.00027m/s |
| 仿生试纸条设计2 | 0.00010m/s |
| 仿生试纸条设计3 | 0.000077m/s |
实施例21
本实施例提供一种检测心肌肌钙蛋白(cTnI)的具有仿生流道的层析试纸条，所述具有仿生流道的层析试纸条的结构参照实施例1中的结构，所述具有仿生流道的层析试纸条采用如下步骤制备得到：
1、制作荧光微球偶联cTnI抗体
将荧光微球0.5mg加入含有1mL MES缓冲液的2mL离心管中，离心去除上清液(11000rpm，10min，4℃)，将清洗后的微球于1mL MES缓冲液中超声，清洗2次；称取一定量的NHS和EDC，用MES缓冲液溶解，现用现配，快速混匀，即10mg/mL的NHS和EDC，取3.5μL EDC加入微球，快速混匀；取33μL NHS加入微球，快速混匀，室温混匀孵育20min；孵育结束后，离心去除上清液，用1mL MES缓冲液清洗2次，最终将清洗后的微球超声重悬于1mLMES缓冲液中，添加0.5μg待标记抗体，加入活化后的微球，室温混匀孵育3h；偶联结束后，离心去除上清液，加入0.5mL封闭液，室温封闭1h；封闭结束后，离心去除上清液，使用1mL封闭液清洗2次，微球超声重悬于1mL保存液，4℃保存待用。
2、共轭垫101的处理及标记抗体的固定
将玻璃纤维素膜浸泡在含有5％蔗糖、2％海藻糖、0.02M BST缓冲液中1h，润湿后，37℃干燥过夜即得共轭垫101。将所得荧光微球偶联抗体复合物，按照30cm/2mL的用量均匀喷涂在共轭垫101上，静置20min后，置于37℃恒温干燥箱干燥过夜，封袋置于4℃保存备用。
3、硝酸纤维素膜103的选取及抗体的固定
硝酸纤维素膜103选自商品化的pall vivid 90，孔径9μm。用pH7.0的PBS缓冲液分别将捕获抗体和抗鼠IgG稀释到l mg/mL。用BioDot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别划出T线1031及C线1032。T线1031上喷膜l mg/mL的cTnI捕获抗体，C线1032上喷膜l mg/mL的抗鼠IgG，各线之间的间隔距离约为3mm。喷膜完成后放在37℃恒温干燥箱干燥过夜，封袋置于4℃保存备用。
组装各部分，将共轭垫、PDMS仿生流道、检测垫、吸水垫与带有粘合剂的PVC背板固定在一起。
在具体使用时，将含有cTnI抗原的PBS滴加至加样区，即共轭垫101。在20min内出现荧光，通过紫外光束判读结果。结果判读的标准：当T线1031和C线1032都显色时，检测结果为阳性；当只有C线1032显色时，检测结果为阴性；当C线1032不显色时，实验过程有问题，该检测结果无效，需重新进行实验。
本实施例的检测灵敏度优于传统试纸条，实例心梗患者的阳性样本C、T线出现荧光激发光，检测结果具有特异性和准确性。非心梗患者阴性样品C线发光、T线不发光；空白样品只有C线发光，T线无发光。
心肌肌钙蛋白(cTnI)是急性心肌梗死诊断标志物，心肌损伤后4-8h开始在血液中升高，能够在血液中保持5-10天，提供较长的窗口期，具有卓越的心肌特异性和灵敏度，被誉为诊断急性心肌梗死的“金标准”。对于诊断心肌梗死、评价溶栓治疗效果、评价栓塞范围及危险程度都具有重要意义，对临床诊断具有较大的参考价值。本实施例使用cTnI作为生物标志物，不仅验证灵敏度的提高，同时对临床应用具有重要意义。
实施例22
本实施例提供一种检测人乳头瘤病毒(HPV)核酸的具有仿生流道的层析试纸条，人乳头瘤病毒是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。症状表现为寻常疣、生殖器疣(尖锐湿疣)等。本实施例提供一种稳定性高、灵敏度高、无污染的宫颈癌HPV检测装置的测试条，应用了PDMS制备的仿生结构，试纸条的结构参照实施例1中的结构，试纸条包括PVC背板105、共轭垫101、PDMS仿生流道102、检测垫103、吸水垫104；其中，T线1031和C线1032上分别设有核酸探针。所述PDMS仿生流道102为聚乙二醇改性后的亲水性PDMS仿生流道，共轭垫101上包含红色微球。
所述具有仿生流道的层析试纸条采用如下步骤制备得到：
1、核酸试纸条的制备：试纸条的结构如图1所示，在共轭垫101处使用碱性磷酸酶处理，然后在T线1031处使用与目的产物能特异性杂交的探针进行处理，在C线1032处使用通用探针进行处理，该通用探针被设计为与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补。
2、前处理：HPV核酸样本的提取：所述HPV核酸样本是从江苏省苏州市工业园区某医院HPV患者的宫颈脱落细胞标本中提取的。
3、制作荧光基团偶联标记探针：将荧光微球0.5mg加入含有1mL MES缓冲液的2mL离心管中，离心去除上清液(11000rpm，10min，4℃)，将清洗后的微球于1mL MES缓冲液中超声，清洗2次；称取一定量的NHS和EDC，用MES缓冲液溶解，现用现配，快速混匀，即10mg/mL的NHS和EDC，取3.5μLEDC加入微球，快速混匀；取33μL NHS加入微球，快速混匀，室温混匀孵育20min；孵育结束后，离心去除上清液，用1mL MES缓冲液清洗2次，最终将清洗后的微球超声重悬于1mL MES缓冲液中，添加0.5μg待标记核酸探针，加入活化后的微球，室温混匀孵育3h；偶联结束后，离心去除上清液，加入0.5mL封闭液，室温封闭1h；封闭结束后，离心去除上清液，使用1mL封闭液清洗2次，超声重悬于1mL保存液，4℃保存待用。
4、共轭垫101的处理及标记抗体的固定：将玻璃纤维素膜浸泡在含有5％蔗糖、2％海藻糖、0.02M BST缓冲液中1h，润湿后，37℃干燥过夜即得共轭垫101。将所得荧光标记探针复合物，按照30cm/2mL的用量均匀喷涂在共轭垫101上，静置20min后，置于37℃恒温干燥箱干燥过夜，封袋置于4℃保存备用。
5、硝酸纤维素膜103的选取及检测线的固定：硝酸纤维素膜103选自商品化的pallvivid 90，孔径9μm。用PBS缓冲液分别将探针稀释到l mg/mL。用BioDot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别划出T线1031及C线1032。T线1031上喷膜l mg/mL的HPV捕获探针，C线1032上喷膜l mg/mL的核酸捕获探针，各线之间的间隔距离约为3mm。喷膜完成后放在37℃恒温干燥箱干燥过夜，封袋置于4℃保存备用。
组装各部分，将共轭垫、PDMS仿生流道、检测垫、吸水垫与带有粘合剂的PVC背板固定在一起。
宫颈病变细胞的处理：
A.将标本倒入15mL离心管离心2500rpm，用2mL去离子水后冲洗后离心，倒掉上清液；B.加入如下混合液：200μL裂解液和400μL去离子水(混合加入为1:2)，用移液枪吹打细胞使分散悬浮；C.再加入5μL蛋白酶K，70℃放置1h，放置过程中进行3次震荡；D.取上清液进行检测。
检测过程：取10μL样本裂解后的上清液与45μL去离子水混匀后，加入试纸条中的共轭垫101，静置15min，根据试纸条上T线1031、C线1032在紫色光束下的显色情况判断，当T线1031和C线1032都显色时，检测结果为阳性；当只有C线1032显色时，检测结果为阴性；当C线1032不显色时，实验过程有问题，该检测结果无效，需重新进行实验。
本实施例的检测结果灵敏度优于传统试纸条，实例阳性样本C、T线出现荧光激发光，检测结果具有特异性和准确性。
本实施例中核酸探针的设计能够降低非特异作用，本发明的PDMS仿生流道设计能够提升灵敏度，加强反应作用效果，降低检测限。
综上，本发明提供了一种具有仿生流道的层析试纸条，所述层析试纸条的检测垫前含有PDMS仿生流道，所述PDMS仿生流道能够实现流体速度控制，以所述PDMS仿生流道替代T线前的硝酸纤维素膜，可以避免内部孔隙吸附蛋白质和样品，这种新型PDMS仿生流道能够实现更少的浪费，增加蛋白质之间的反应时间，但不超过即时诊断的时间要求，并最终提高层析试纸条的灵敏度
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (25)
1.一种具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述层析试纸条包括PVC背板（105）和PVC背板（105）上沿层析方向依次连接的共轭垫（101）、PDMS仿生流道（102）、检测垫（103）和吸水垫（104）；
所述PDMS仿生流道（102）包括PDMS流道（301）和沿层析方向相互交错平行排布的PDMS制作的模仿蜥蜴角的结构凸起（302），其中的沟壑为流道；
沿层析方向上，每两个相邻的模仿蜥蜴角的结构凸起（302）平行排布的间距为1-3 mm；
沿层析方向上，单个模仿蜥蜴角的结构凸起（302）的轴向长度与所述PDMS仿生流道（102）的轴向长度的比例为1:(8-15)；
垂直于层析方向上，单个模仿蜥蜴角的结构凸起（302）的纵向宽度与所述PDMS仿生流道（102）的纵向宽度的比例为1:(2-4)。
2.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述PDMS仿生流道（102）采用包括如下步骤的方法制备得到：
（1）采用异丙醇清洗光敏树脂模具，将清洗后的光敏树脂模具先后进行光固化和干燥固化；
（2）将PDMS与固化剂搅拌混合，脱气泡后，倒入步骤（1）处理后的光敏树脂模具中，再次脱气泡后进行干燥固化。
3.根据权利要求2所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，步骤（1）中，所述异丙醇清洗光敏树脂模具的时间为8-12 min；所述清洗的温度为20-25℃。
4.根据权利要求2所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，步骤（1）中，所述光固化在紫外光源下进行，所述光固化的时间为55-65 min。
5.根据权利要求2所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，步骤（1）中，所述干燥固化的温度为115-125℃，所述干燥固化的时间为55-65 min。
6.根据权利要求2所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，步骤（2）中，所述PDMS与固化剂的质量比例为(8-12):1。
7.根据权利要求2所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，步骤（2）中，所述搅拌混合的时间为8-12 min。
8.根据权利要求2所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，步骤（2）中，所述干燥固化的温度为55-65℃，所述干燥固化的时间大于等于2 h。
9.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述PDMS仿生流道（102）为聚乙二醇改性后的亲水性PDMS仿生流道。
10.根据权利要求9所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述改性采用包括如下步骤的方法进行：将所述PDMS仿生流道（102）进行等离子处理，再采用聚乙二醇改性。
11.根据权利要求10所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述等离子处理的时间为5-15 min。
12.根据权利要求10所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述改性采用的聚乙二醇溶液的浓度为0.08-0.4 M。
13.根据权利要求10所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000-6000。
14.根据权利要求10所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述聚乙二醇改性的温度为20-25℃，所述聚乙二醇改性的时间大于等于2 h。
15.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述共轭垫（101）上有固定好的荧光微球标记偶联抗体或核酸。
16.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述检测垫（103）上包括包被了捕获抗体或捕获探针的T线（1031）和包被了质控抗体或通用探针的C线（1032）。
17.根据权利要求16所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述C线与所述T线为分别垂直于所述试纸条的上下边的平行线。
18.根据权利要求16所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述C线靠近所述吸水垫（104）端。
19.根据权利要求16所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述T线（1031）和C线（1032）的间隔为2-8 mm。
20.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述共轭垫（101）为玻璃纤维材料，所述共轭垫（101）的厚度为0.19-0.29 mm。
21.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述PDMS仿生流道（102）为PDMS材料，所述PDMS仿生流道（102）的厚度为0.2-0.3 mm。
22.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述检测垫（103）为硝酸纤维素膜，所述检测垫（103）的厚度为0.2-0.3 mm，所述硝酸纤维素膜的孔径为0.015-0.02 mm。
23.根据权利要求1所述的具有仿生流道的层析试纸条，其特征在于，所述吸水垫（104）为植物纤维材料，所述吸水垫（104）的厚度为0.6-0.76 mm。
24.一种层析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-23中任一项所述的具有仿生流道的层析试纸条。
25.权利要求1-23中任一项所述的具有仿生流道的层析试纸条或权利要求24所述的层析检测试剂盒在非诊断目的的层析检测中的应用。
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