CN114345430A - 一种通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，属于免疫检测技术领域。其包括盖板、纸基微流控芯片、反应孔和托盘；所述纸基微流控芯片设置于盖板和托盘之间；所述盖板中央设有反应孔；所述反应孔底部设置于纸基微流控芯片上方；所述盖板、纸基微流控芯片和托盘形状一致。本发明还提供了使用该装置用于多种抗生素检测的间接竞争免疫分析方法，通过对反应区信号强度进行分析处理，根据拟合曲线可对不同抗生素进行定性及定量分析。本发明解决了当前抗生素类小分子物质在免疫层析试纸上无法实现多种同时检测等问题，实现待测样品中抗生素的现场即时检测，可应用于食品安全等多个领域中。

Description

一种通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式 装置

技术领域

本发明涉及一种通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，具体涉及抗生素残留检测，属于免疫检测技术领域。

背景技术

抗生素出现的近一个世纪以来，主要应用于治疗和预防人类及动物的疾病。抗生素作为一种兽药，除了被用于治疗动物疾病之外，还用于饲料添加剂来改善食用动物的生长情况。中国是全球最大的抗生素生产国和使用国，在2013年抗生素生产量超过20万吨，使用量超万吨，其中有52％用于动物，48％用于人类。到目前为止，抗生素已经污染了人类的食物供应，包括畜禽产品(肉、奶、蛋)、水产品和蔬菜。

抗生素残留的快速检测对食品安全、医疗卫生以及环境监测等领域具有重要意义。基于微生物法、色谱法和传统的免疫分析方法的检测较为成熟，但是具有成本高、试剂消耗较大和步骤复杂等不足。

纸基免疫分析是集单克隆抗体技术、免疫技术和新材料技术于一体的检测方法，可实现对多目标进行同时检测。抗生素属于小分子物质，目前对于抗生素的间接竞争免疫层析检测手段中，极少能够实现对四种以上抗生素进行同时、快速检测。

微流控纸芯片是以纸基作为原材料制作的新型多通道检测平台，集成了液体进样、分子反应、信号检测等一系列复杂的操作，具有成本低廉、便于携带、操作简单、生物相容性好、可多元检测等优点。将微流控纸芯片与化学发光免疫分析技术相结合，可开发出新型微流控纸芯片多通道化学发光免疫分析装置。而国内外在此方面的研究仍处于起步阶段，因此，开发灵敏、快速、廉价的新型微流控纸芯片的多通道化学发光免疫分析装置，对于未来的生物、化学分析的领域具有重要的科学意义和价值。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，可同时检测待测样品中残留的多种抗生素。通过智能手机摄像头对检测结果进行图像采集和分析处理，能够对待测样品中的抗生素进行快速定性、定量检测及分析。本发明可应用于食品安全检测等领域中，可实现待测样品中多种抗生素的同时、快速、集成化检测。

本发明的技术方案，一种通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，包括盖板、纸基微流控芯片、反应孔和托盘；所述纸基微流控芯片设置于盖板和托盘之间；所述盖板中央设有反应孔；所述反应孔底部设置于纸基微流控芯片上方；所述盖板、纸基微流控芯片和托盘形状一致。

所述纸基微流控芯片包括若干个疏水区、若干个检测区和一个中心加样区；所述疏水区和检测区间隔均匀分布；所述若干个检测区在纸基微流控芯片的中央交汇，形成中心加样区。

进一步地，所述检测区上设有反应区和对照区；所述中心加样区近端设有反应区，远端设有对照区。

进一步地，所述盖板上设有中央通孔和观察孔；所述盖板中心设有中央通孔，反应孔设置于中央通孔内部；所述观察孔沿径向均匀分布于盖板上，观察孔与检测区的位置对应设置。

进一步地，所述托盘上开有卡槽；所述纸基微流控芯片设置于托盘的卡槽中。

进一步地，所述盖板和托盘通过连接部件连接；所述连接部件为子母件，分别位于盖板和托盘内径，通过互相匹配固定连接盖板和托盘。

进一步地，所述反应孔的底部设有刀口。

进一步地，每条检测区上对应设置两个观察孔，一个位于反应区上方，另一个位于对照区上方。

进一步地，所述盖板、纸基微流控芯片、反应孔和托盘均为圆形；所述纸基微流控芯片具体为纤维素层析纸；疏水区上覆盖了疏水材料；所述反应孔底部为厚度0.5-0.8mm的薄层，薄层上设有“十”字形刀口。

作为本发明的一种具体实施方式，所述纸基微流控芯片具有四个以上的检测区流体通道，整体为半径为28-32mm的圆形；中心加样区为半径3-5mm的圆形，检测区的流体通道长28-32mm，宽2-3mm；所述纸基微流控芯片的流体通道上各含有2个椭圆形区域，长半径5-6mm，短半径3-4mm，靠近中心加样区域的为反应区，靠近通道末端的为对照区。

作为本发明的一种具体实施方式，所述盖板和托盘的半径均为32mm；所述盖板圆心处开有半径为4-5mm的中央通孔；盖板在内部纸基微流控芯片上的反应区和对照区的相应位置正上方开有椭圆形观察孔，长半径5-6mm，短半径3-4mm，分别对应于每个反应区和对照区。

作为本发明的一种具体实施方式，所述连接部件为圆柱形卡扣结构，其中上卡扣均匀分布于盖板内侧，下卡口对应分布于托盘内侧，两者互为子母件；所述纸基微流控芯片疏水区边缘处有8个直径约1-2mm的开孔，其位置对应于装置内侧的圆柱形卡扣结构，使其穿过卡扣并固定于装置内部。

作为本发明的一种具体实施方式，所述中心反应孔材质为PDMS；盖板材质为PLA；可以通过3D打印机打印制成。

作为本发明的一种具体实施方式，所述中心反应孔底部为圆形PDMS薄层，厚度为0.5-0.8mm；底部半径为4mm，柱体高6mm，容积约200μL。

作为本发明的一种具体实施方式，所述中心反应孔底部中心设计有“十”字形启封口，该启封口由两条长约5-7mm的直线刀口垂直交叉所形成，此结构可通过外力刺破使上部液体流入下层。所述反应孔内保存有多种抗生素所对应的胶体金标记抗体混合物。

所述底部托盘与顶部盖板通过连接部件卡扣结构相嵌合，将纸基微流控芯片固定于装置内部，三者共同组成一个集成化检测装置。

本发明的另一个技术方案，所述装置的制备方法，具体如下：

(1)纸基微流控芯片的制备：取纤维素层析纸，选择石蜡作为疏水材料；设计带有一个中心加样区和自中心加样区向径向延伸的若干个检测区；每个检测区上都包括一个形状与检测区不同的反应区和对照区；反应区和对照区距离中心加样区的距离一致；其余部分均为疏水区；将疏水材料覆盖于疏水区，加热使得疏水材料熔化并渗透进纸基微流控芯片，形成疏水屏障；即得到纸基微流控芯片；

(2)反应孔的制备：取聚二甲基硅氧烷PDMS与引发剂混合后进行反应，烘干后得到厚度0.5-0.8mm的薄层，采用PDMS为材料制备柱形反应孔，采用PDMS薄层作为反应孔底部；在底部上开设“十”字形刀口；

(3)盖板和托盘的制备：取作为盖板的圆盘，圆心中央开有中央通孔，将步骤制备的反应孔嵌入中央通孔中，两者互相配合密封；盖板上对应反应区和对照区的位置处开设观察孔；

取与盖板相同大小的圆盘作为托盘，托盘上开有卡槽；所述盖板和托盘通过子母件进行连接固定；

(4)装配：将步骤(1)制备的纸基微流控芯片卡入托盘上的卡槽；通过子母件将盖板和托盘进行闭合，即得到通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置。

进一步地，所述检测装置可重复利用，检测时所用的纸基微流控芯片及顶部中心反应孔可进行更换。

进一步地，所述纸基微流控芯片的反应区包被有待检测抗生素的合成抗原，对照区包被有二抗。

本发明的另一个技术方案，所述装置的应用，将其应用于多种抗生素残留检测。

进一步地，通过间接竞争免疫反应对待测样品中残留的8种抗生素进行即时检测，可检测的抗生素种类包括氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类和磺胺类等。

步骤如下：

(1)包被抗原及抗体：纸基微流控芯片通过等离子清洗机处理，使表面产生醛基，将若干种抗生素的合成抗原分别滴在对应若干个反应区中，将二抗滴于相对应的对照区中，孵育20-30min；

(2)洗涤：孵育结束用缓冲液进行多次洗涤，洗涤区域下方用吸水纸吸去多余的洗涤液；

(3)封闭：将质量浓度为0.5％的BSA溶液滴在每个包被区域上以封闭残留的反应位点，孵育10-15min；

(4)装置组装：将包被有抗原抗体的纸基微流控芯片通过连接部件固定于装置的下层托盘上，并将顶部盖板通过连接部件与托盘嵌合，最后将底部带有”十”字形启封口的反应孔置于盖板中心的中央通孔中，其内部含有胶体金标记的多种抗生素单克隆抗体；

(5)样品孵育：将待检测样品加入装置的反应孔中，与胶体金标记抗体混合均匀后室温孵育5-8min；

(6)间接竞争免疫反应：孵育结束后将反应孔的”十”字形启封口刺破，使样品与抗体的混合液流入下层，此时液体浸润纸基亲水区，沿若干条通道流向反应区和对照区，计时5-8min后观察结果；反应区显色程度与抗生素含量呈反比，对照区显色与否作为衡量该检测结果的标准；

(7)检测：同时对若干个反应区显色结果进行图像采集及数据处理，根据标准拟合曲线，对待测样品中的多种抗生素进行定性及定量分析。

进一步，所述数据分析是指通过Image J等图像处理软件对所得图像进行处理，提取每条通道中反应区的RGB信号值。

进一步，所述数据分析是指以反应区的显色信号强度为纵坐标，对应抗生素浓度为横坐标，绘制显色信号强度与待测抗生素浓度拟合曲线并得到检测限。

本发明的有益效果：本发明中，检测原理及装置制作流程简单，所用材料成本较低，将图像采集与智能手机拍照相结合，应用图像处理软件进行定性及定量分析，操作流程简单便捷。与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明将多个间接竞争免疫反应集成在一个装置中，并与智能拍照设备相结合，检测时间控制在15-20min内。检测装置具有成本低、易操作和简易便携等优点，能够同时对多种抗生素进行快速现场检测，提高了检测效率，可为食品安全及医疗卫生等领域的应用提供新技术。

附图说明

图1是纸基微流控芯片结构示意图。

图2是反应孔结构示意图。

图3盖板正面及背面示意图。

图4底部托盘结构示意图。

图5装置组合及整体结构图。

图6抗生素检测流程图。

图7实施例6检测结果示意图；

a、β-内酰胺类抗生素拟合曲线；b、磺胺类抗生素拟合曲线。

附图标记说明：1、盖板；1-1、中央通孔；1-2、观察孔；2、纸基微流控芯片；2-1、疏水区；2-2、检测区；2-3、中心加样区；2-4、反应区；2-5、对照区；3、反应孔；3-1、刀口；4、托盘；4-1、卡槽；5、连接部件。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行完整、详细说明。显然，此处所描述的具体实施例仅用于解释，并不限定此发明。

实施例1纸基微流控芯片的制备

纸基微流控芯片结构如图1所示，亲水材料可选用纤维素层析纸，选择石蜡作为疏水材料。通过Adobe Illustrator(2021)设计芯片结构，使用蜡打印机将图案打印至层析纸上。将打印好的纸裁剪后置于120-150℃的加热板上烘烤1-2min，使蜡熔化并渗透至纸张内部，形成疏水屏障。最后将层析纸取下，冷却至室温，得到带有图案的纸基微流控芯片1。

纸基微流控芯片包含1个中心加样区2-3和8条流体通道，每条通道都包括两个椭圆形区域，靠近中心加样区的椭圆形为反应区2-4，靠近通道末端的为对照区2-5。反应区2-4距离中心加样区1约5-6mm，反应区2-4与对照区2-5之间间隔约8-10mm。在疏水区域边缘开有8个直径约1-2mm的开孔，其位置对应于装置内侧的圆柱形卡扣结构，使其穿过卡扣并固定于装置内部。

实施例2PDMS”十”字形启封口制作。

将PDMS及其引发剂按照质量比10：1的比例混合均匀后，一部分倒于洁净硅片上，用匀胶机以800rpm的速度甩胶60s，于75℃条件下烘干后揭下，得到PDMS薄层，厚度为0.5-0.8mm，作为反应孔底部。另一部分则厚铺于模具中，于75℃烘箱中静置2-3h后取出，作为反应孔柱体。将柱体与底部薄层通过键合作用形成一个圆柱形反应孔3(图2)，底部半径为4mm，柱体高约6mm。用手术刀在底部中心切割出两条长度相等且相互垂直的直线刀口3-1，该直线刀口3-1长度在6-7mm之间，形成”十”字形启封口7。

实施例3检测装置制作。

如图3-5所示，检测装置的顶部盖板1和底部托盘4由3D打印机打印制成，中心反应孔材质为PDMS。

顶部盖板1为半径32mm的圆盘(图3)，圆心处开有半径为4-5mm的中央通孔1-1，能够将PDMS中心反应孔3嵌入。顶部盖板1圆心周围开有16个观察孔1-2，分别对应下方纸基微流控芯片2的反应区2-4和对照区2-5。盖板1厚度为3mm，盖板1边缘向内0.5-1mm处凸出一圈高约1mm的围堰。顶部反应孔材质为PDMS，其底部中心开有一个”十”字形启封口，制作方法同实施例1。卡扣为直径1mm的圆柱形公扣。

底部托盘4如图4所示，为半径约为32mm的圆盘，外沿高约3mm，托盘边缘向内0.5-1mm处有一圈向内凹陷约1mm，形成一个卡槽4-1。卡扣为直径约为1-1.5mm的空心圆柱，作为卡扣结构的母扣。凹槽与顶部盖板的围堰以及卡扣结构可使装置上下层牢固嵌合。

装置整体组合如图5所示，将托盘4、纸基微流控芯片2、盖板1和反应孔3按图5顺序放置并牢固结合，形成整个检测装置。

整个检测装置为直径约65mm的圆盘，总高度为7-8mm，整体尺寸较小，便于携带与即时检测。

应用实施例1牛奶样品中的抗生素残留检测。

首先在纸基微流控芯片2上包被抗原及抗体：纸基微流控芯片通过等离子清洗机处理，使表面产生醛基，将8种抗生素的合成抗原分别滴在8个反应区2中，将二抗滴于相对应的对照区3中，孵育20-30min。大分子偶联蛋白可选用牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。孵育结束后用0.01M PBS进行多次洗涤，洗涤区域下方用吸水纸吸去多余的洗涤液。将0.5％BSA溶液滴在每个包被区域上以封闭残留的反应位点，孵育10-15min。

装置组装如图5所示，将包被有抗原抗体的纸基芯片通过卡扣固定于装置的底部托盘4上，并将顶部盖板1通过卡扣结构与托盘4嵌合，最后将PDMS反应孔3置于盖板中心卡槽4-1中，其内部含有胶体金标记的多种抗生素单克隆抗体。

样品检测流程如图6所示，首先将待检测牛奶样品加入装置反应孔3中，与胶体金标记抗体混合均匀后室温孵育5-8min。孵育结束后将反应孔3的”十”字形启封口刺破，使样品与抗体的混合液流入纸基芯片的中心加样区2-3，此时液体浸润纸基亲水区，沿8条通道流向反应区2-4及对照区2-5，流至反应区2-4开始进行间接竞争免疫反应，计时5-8min后观察结果，反应区2-4显色程度与抗生素含量呈反比，对照区2-5显色与否作为衡量该检测结果的标准(显色＝检测结果有效，无色＝检测结果无效)。

用智能手机摄像头同时对8个反应区2的显色结果进行图像采集及数据处理，具体过程如下：在固定白光光源下用手机后置摄像头对每条通道中反应区的显色结果进行拍摄，通过Image J图像处理软件将图片转换为RGB格式，并将图像进行黑白反转后获取每个反应区域的RGB信号强度，记为I。以(I₀-I)/I₀为纵坐标(I₀＝空白样品信号强度)，对应抗生素浓度为横坐标，绘制显色信号强度与待测抗生素浓度拟合曲线。

β-内酰胺类抗生素拟合曲线如图7(a)所示，磺胺类抗生素拟合曲线如图7(b)所示；随牛奶中所含抗生素浓度增大，反应区信号强度I逐渐减小，故(I₀-I)/I₀值逐渐增大。拟合曲线R²均在0.99以上，具有较好的线性。根据标准拟合曲线，可对待测样品中的多种抗生素进行定性及定量分析。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的变化、修改、替换和变型等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，其特征是：包括盖板(1)、纸基微流控芯片(2)、反应孔(3)和托盘(4)；所述纸基微流控芯片(2)设置于盖板(1)和托盘(4)之间；所述盖板(1)中央设有反应孔(3)；所述反应孔(3)底部设置于纸基微流控芯片(2)上方；所述盖板(1)、纸基微流控芯片(2)和托盘(4)形状一致。

2.如权利要求1所述通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，其特征是：所述纸基微流控芯片(2)包括若干个疏水区(2-1)、若干个检测区(2-2)和一个中心加样区(2-3)；所述疏水区(2-1)和检测区(2-2)间隔均匀分布；所述若干个检测区(2-2)在纸基微流控芯片(2)的中央交汇，形成中心加样区(2-3)；

进一步地，所述检测区(2-2)上设有反应区(2-4)和对照区(2-5)；所述中心加样区(2-3)近端设有反应区(2-4)，远端设有对照区(2-5)。

3.如权利要求2所述通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，其特征是：所述盖板(1)上设有中央通孔(1-1)和观察孔(1-2)；所述盖板(1)中心设有中央通孔(1-1)，反应孔(3)设置于中央通孔(1-1)内部；所述观察孔(1-2)沿径向均匀分布于盖板(1)上，观察孔(1-2)与检测区(2-2)的位置对应设置。

4.如权利要求2所述通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，其特征是：所述托盘(4)上开有卡槽(4-1)；所述纸基微流控芯片(2)设置于托盘(4)的卡槽(4-1)中。

5.如权利要求2所述通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，其特征是：所述盖板(1)和托盘(4)通过连接部件(5)连接；所述连接部件(5)为子母件，分别位于盖板(1)和托盘(4)内径，通过互相匹配固定连接盖板(1)和托盘(4)。

6.如权利要求2所述通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，其特征是：所述反应孔(3)的底部设有刀口(3-1)。

7.如权利要求3所述通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置，其特征是：每条检测区(2-2)上对应设置两个观察孔(1-2)，一个位于反应区(2-4)上方，另一个位于对照区(2-5)上方。

8.权利要求1-7之一所述装置的制备方法，其特征是：

(1)纸基微流控芯片的制备：取纤维素层析纸，选择石蜡作为疏水材料；设计带有一个中心加样区和自中心加样区向径向延伸的若干个检测区；每个检测区上都包括一个形状与检测区不同的反应区和对照区；反应区和对照区距离中心加样区的距离一致；其余部分均为疏水区；将疏水材料覆盖于疏水区，加热使得疏水材料熔化并渗透进纸基微流控芯片，形成疏水屏障；即得到纸基微流控芯片；

(2)反应孔的制备：取聚二甲基硅氧烷PDMS与引发剂混合后进行反应，烘干后得到厚度0.5-0.8mm的薄层，采用PDMS为材料制备柱形反应孔，采用PDMS薄层作为反应孔底部；在底部上开设字形刀口；

(3)盖板和托盘的制备：取作为盖板的圆盘，圆心中央开有中央通孔，将步骤(2)制备的反应孔嵌入中央通孔中，两者互相配合密封；盖板上对应反应区和对照区的位置处开设观察孔；

取与盖板相同大小的圆盘作为托盘，托盘上开有卡槽；所述盖板和托盘通过子母件进行连接固定；

(4)装配：将步骤(1)制备的纸基微流控芯片卡入托盘上的卡槽；通过子母件将盖板和托盘进行闭合，即得到通过纸基微流控芯片同时检测多种抗生素残留的便携式装置。

9.权利要求1-7之一所述装置的应用，其特征是：将其应用于多种抗生素残留检测。

10.如权利要求1-7之一所述装置的应用，其特征是步骤如下：

(1)包被抗原及抗体：纸基微流控芯片通过等离子清洗机处理，使表面产生醛基，将若干种抗生素的合成抗原分别滴在对应若干个反应区中，将二抗滴于相对应的对照区中，孵育20-30min；

(2)洗涤：孵育结束用缓冲液进行多次洗涤，洗涤区域下方用吸水纸吸去多余的洗涤液；

(3)封闭：将质量浓度为0.5％的BSA溶液滴在每个包被区域上以封闭残留的反应位点，孵育10-15min；

(4)装置组装：将包被有抗原抗体的纸基微流控芯片通过连接部件固定于装置的下层托盘上，并将顶部盖板通过连接部件与托盘嵌合，最后将底部带有启封口的反应孔置于盖板中心的中央通孔中，其内部含有胶体金标记的多种抗生素单克隆抗体；

(5)样品孵育：将待检测样品加入装置的反应孔中，与胶体金标记抗体混合均匀后室温孵育5-8min；

(6)间接竞争免疫反应：孵育结束后将反应孔的启封口刺破，使样品与抗体的混合液流入下层，此时液体浸润纸基亲水区，沿若干条通道流向反应区和对照区，计时5-8min后观察结果；反应区显色程度与抗生素含量呈反比，对照区显色与否作为衡量该检测结果的标准；

(7)检测：同时对若干个反应区显色结果进行图像采集及数据处理，根据标准拟合曲线，对待测样品中的多种抗生素进行定性及定量分析。

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