KR101356628B1

KR101356628B1 - 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 방법 및 장치

Info

Publication number: KR101356628B1
Application number: KR1020110126685A
Authority: KR
Inventors: 박제균; 권세용
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2014-02-04
Also published as: KR20130060560A

Abstract

본 발명은 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 방법 및 장치에 관한 것으로, 본 발명에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치를 이용한 방법을 이용할 경우 2가지 이상의 바이오마커를 하나의 반응채널에서 정성 분석할 수 있을 뿐만 아니라 상기 반응채널이 다수 존재하므로, 하나의 샘플에 대하여 다중 바이오마커에 대한 면역반응검사를 동시에 수행할 수 있어 검사 시간 및 비용을 현저히 줄일 수 있고, 또한 각 반응채널마다 기준항체와 서로 다른 단백질을 검출하는 바이오마커를 주입하여 각 반응채널에서 발현되는 바이오마커를 정량 분석할 수 있으므로, 암 연구 및 검사 등에 사용되는 면역반응검사에 매우 유용할 수 있다.

Description

다중 바이오마커 동시 면역반응검사 방법 및 장치{Simultaneous multiple biomarker detection method for immunoassay and apparatus thereof}

다중 바이오마커 동시 면역반응검사 방법 및 장치에 관한 것이다.

세포와 조직을 포함한 바이오샘플의 단백질 발현정보는 질병에 대한 연구, 진단과 치료법의 선택에서 중요한 단서가 되며, 다수의 단백질 발현정보를 하나의 바이오샘플 상에서 얻는 기술은 관련학계에서 큰 이슈로 떠오르고 있다.

면역조직화학법(immunohistochemistry)은 항체를 이용, 세포와 조직의 형태를 유지하며 단백질 발현정보를 얻는 방법으로 질병의 진단 및 연구 분야에 광범위하게 이용되는 면역염색법이다.

최근 서로 다른 색을 내는 형광물질을 특정 항체에 부착하여 하나의 세포나 조직 시료에서 여러 단백질을 서로 다른 색으로 염색하는 기술이 보고되어 많은 연구가 시도되고 있다. 대표적인 예가 양자점(Quantum dot)과 같이 여러 파장대의 형광을 내는 형광물질을 이용하는 경우이다.

현재, 양자점을 이용하여 여러 단백질의 발현을 하나의 조직시료 위에서 관찰한 사례가 보고된 바 있으며, 최근 새로운 면역조직화학법의 개발에서 큰 이슈가 되고 있다.

하지만, 이 경우 양자점을 이용한 면역조직화학염색법 특징상 많은 시간이 걸리고, 그에 따라 많은 노동력이 든다는 단점이 있다. 게다가, 최근 양자점을 이용한 면역조직화학염색법의 가장 보편화된 방법 중, 반응시키는 항체 수가 늘어남에 따라 비특이적 반응이 일어나 정확한 단백질 발현측정이 어렵다는 보고가 된 바 있다.

비특이적 반응의 문제점은 서로 다른 종의 항체를 사용하여 해결할 수 있는데, 상업적으로 이용 가능한 항체의 종은 대표적인 것이 3가지 정도로, 이 경우 3가지 정도의 단백질 발현만이 비특이적 반응없이 발현측정이 가능하게 된다.

이와 같은 경우 많은 수의 단백질 발현측정이 어려워지게 된다. 이러한 문제점들로 인해 현재 양자점을 이용한 면역조직화학법은 실제 임상에서 쓰이기가 어렵고, 연구에서도 이용 시 결과의 신뢰성을 확보할 수 없는 상태이다.

최근 미세유체제어 채널을 이용하여 조직샘플을 비롯한 바이오샘플의 구획을 미세유체제어 채널로 나누고 각 나뉘어진 구획을 서로 다른 항체를 이용하여 다중면역염색법을 가능케 한 기술이 보고된 바 있다.

이 경우 여러 개의 단백질 발현 측정이 가능하지만 각각의 채널에서 세포 또는 조직 샘플에서 세포가 불균일하게 분포하고 있으며, 특히 조직샘플의 경우 이러한 불균일한 분포가 심하기 때문에 각각의 채널에 분포하는 세포의 수가 서로 다르다.

예를 들어, 어떤 바이오마커를 양자점(형광물질)으로 염색하였을 때, 스펙트로미터(spectrometer)를 이용하여 염색된 양자점을 읽어 정량분석을 하게 되는데, 각각의 채널마다 세포수가 동일하다면, 바이오마커 간의 발현량을 정량적으로 분석하여 비교할 수 있지만, 세포수가 동일하지 않다면, 어떤 바이오마커가 강한 발현량을 보인다 해도, 단일세포 단위의 비교가 어려운 문제가 있다.

이에, 본 발명자들은 다중 바이오마커를 동시에 측정하기 위한 방법을 연구하던 중, 다수의 반응채널을 갖는 장치를 이용하여 2가지 이상의 바이오마커를 하나의 반응채널에서 정성 분석할 수 있을 뿐만 아니라 상기 반응채널이 다수 존재하므로, 하나의 샘플에 대하여 다중 바이오마커에 대한 면역반응검사를 동시에 수행할 수 있어 검사 시간 및 비용을 현저히 줄일 수 있고, 또한 각 반응채널마다 정량분석을 위한 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 항체와 서로 다른 바이오마커를 주입하여 각 반응채널에서 발현되는 바이오마커를 정량 분석할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 1차항체 및 2차항체의 혼합물을 이용한 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 1차항체 및 2차항체를 이용한 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다중 바이오마커 동시 면역반응검사용 랩온어칩(lab on a chip)을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

압착부를 이용하여 검사장치를 샘플에 부착시키는 압착단계(단계 2);

각각의 반응채널마다 서로 상이한 조합으로, 2가지 이상의 동종의 항체 혼합물, 2가지 이상의 이종의 항체 혼합물, 1가지 이상의 앱타머 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 서로 상이한 식별물질이 접합된 2가지 이상의 바이오마커를 반응채널의 주입구로 주입하는 주입단계(단계 3); 및

상기 바이오마커를 샘플과 반응시키는 반응단계(단계 4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

각각의 반응채널마다 서로 상이한 조합으로, 2가지 이상의 이종의 1차항체(primary antibody) 혼합물을 각각의 반응채널의 주입구로 주입하는 제1주입단계(단계 3);

상기 1차항체 혼합물을 샘플과 반응시키는 제1반응단계(단계 4);

상기 단계 4에서 샘플과 반응하지 않고 남은 1차항체 혼합물을 세척하는 단계(단계 5);

각각의 반응채널마다 서로 상이한 조합으로, 2가지 이상의 동종의 2차항체(secondary antibody) 혼합물, 2가지 이상의 이종의 2차항체 혼합물 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 서로 상이한 식별물질이 접합된 2가지 이상의 2차항체 혼합물을 주입하는 제2주입단계(단계 6); 및

상기 2차항체 혼합물을 샘플과 반응시키는 제2반응단계(단계 7)를 포함하되,

상기 2차항체 혼합물은 샘플과 반응한 1차항체 혼합물에 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

모든 반응채널마다 정량분석을 위한 기준이 되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머를 동일하게 주입하고, 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 검출항체 또는 검출앱타머를 각기 주입하는 주입단계(단계 3); 및

상기 기준항체 또는 기준앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머를 샘플과 반응시키는 반응단계(단계 4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법을 제공한다.

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

모든 반응채널마다 정량분석을 위한 기준이 되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체를 동일하게 주입하고, 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 1차항체를 각기 주입하는 제1주입단계(단계 3);

상기 기준항체 및 1차항체를 샘플과 반응시키는 제1반응단계(단계 4);

상기 단계 4에서 샘플과 반응하지 않고 남은 기준항체 및 1차항체를 세척하는 단계(단계 5);

각각의 반응채널마다, 서로 다른 이종 또는 서로 다른 동종의 2가지 2차항체를 주입하는 제2주입단계(단계 6); 및

상기 2차항체를 샘플과 반응시키는 제2반응단계(단계 7)를 포함하되,

상기 2차항체는 샘플과 반응한 기준항체 및 1차항체에 각각 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부;

상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지고, 반응채널의 각 주입구로 2가지 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및

상기 검사부를 상기 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부;

상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 일체인 반응채널을 가지고, 반응채널로 2가지 이상의 바이오마커가 주입되어 정적으로 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및

상기 검사부를 상기 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사용 랩온어칩(lab on a chip)을 제공한다.

본 발명에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치를 이용한 방법을 이용할 경우 2가지 이상의 바이오마커를 하나의 반응채널에서 정성 분석할 수 있을 뿐만 아니라 상기 반응채널이 다수 존재하므로, 하나의 샘플에 대하여 다중 바이오마커에 대한 면역반응검사를 동시에 수행할 수 있어 검사 시간 및 비용을 현저히 줄일 수 있고, 또한 각 반응채널마다 기준항체와 서로 다른 바이오마커를 주입하여 각 반응채널에서 발현되는 바이오마커를 정량 분석할 수 있으므로, 암 연구 및 검사 등에 사용되는 면역반응검사에 매우 유용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치의 전체 구성의 단면을 개략적으로 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치의 검사부만을 나타낸 평면도이다("a 점선"에 따른 단면을 도 1에 나타냄).
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치에서 혼합채널을 더 구비한 검사부의 평면도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법의 과정을 나타낸 공정도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 랩온어칩의 전체 구성의 단면도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 랩온어칩에서 검사부만을 나타낸 사시도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 랩온어칩의 검사부를 조직 샘플에 적용시키는 것을 간략하게 보여주는 개략도이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치에서 자력을 이용한 압착 과정을 보여주는 개략도이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 장치를 이용하여 다중 바이오마커를 동시에 정성 분석한 결과를 나타낸 형광이미지이다((a)는 제1반응채널, (b)는 제2반응채널, (c)는 제3반응채널, (d)는 제4반응채널을 나타낸다).
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 장치를 이용하여 다중 바이오마커를 동시에 정량 분석한 결과를 나타내는 형광이미지와 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

상기 바이오마커를 샘플과 반응시키는 반응단계(단계 4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법(1)을 제공한다.

이하, 본 발명의 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법(1)을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(1)에 있어서, 상기 단계 1은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를, 기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계이다.

상기 검사장치는 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널, 바람직하게는 6-10개의 반응채널을 가진다. 상기 각각의 반응채널에 2가지 이상의 바이오마커를 주입하여 동시에 면역반응검사할 수 있다. 상기 검사장치에 대한 상세한 설명은 하기에서 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(1)에 있어서, 상기 단계 2는 압착부를 이용하여 검사장치를 샘플에 부착시키는 압착단계이다. 상기 검사장치의 압착부를 이용한 압착단계에 대한 상세한 설명 역시 하기에서 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(1)에 있어서, 상기 단계 3은 각각의 반응채널마다 서로 상이한 조합으로, 2가지 이상의 동종의 항체 혼합물, 2가지 이상의 이종의 항체 혼합물, 1가지 이상의 앱타머 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 서로 상이한 식별물질이 접합된 2가지 이상의 바이오마커를 반응채널의 주입구로 주입하는 주입단계이다.

구체적으로, 상기 2가지 이상의 바이오마커를 검사장치 외에서 혼합하여 주입하거나, 검사장치 내에 구비되는 혼합채널에서 혼합하여 반응채널로 주입할 수 있다.

이때, 상기 2가지 이상의 바이오마커는 세포 또는 조직 샘플에 존재하는 각각의 단백질과 선택적으로 반응한다.

또한, 상기 바이오마커에는 식별물질이 붙어있는데, 여러 다른 광학적, 전기적, 자기적, 물리적 및 화학적 특성을 지니고 있어 서로 다른 항체에 다른 특성을 지닌 식별물질이 붙어있을 경우 식별이 가능하다.

바람직하게는, 상기 식별물로는 발색물질, 효소, 형광물질, 골드 나노입자, 양자점, 나노바코드 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(1)에 있어서, 상기 단계 4는 2가지 이상의 바이오마커를 샘플과 반응시키는 단계이다.

구체적으로, 세포 또는 조직 샘플에 존재하는 여러 단백질에 특이적으로 결합하는 2가지 이상의 바이오마커를 반응시키고, 상기 바이오마커에 도입되어 있는 식별물질로 검출하고자하는 단백질의 발현을 정성 분석할 수 있다.

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

상기 2차항체 혼합물은 샘플과 반응한 1차항체 혼합물에 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법(2)을 제공한다.

이하, 본 발명의 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법(2)을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(2)에 있어서, 상기 단계 1-4는 단계 3의 1차항체 혼합물에 식별물질이 접합되지 않은 것과 앱타머를 사용하지 않은 것을 제외하고는 상술한 정성 분석방법(1)과 유사하다.

이때, 상기 단계 3의 1차항체는 이종인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 단계 6의 2차항체는 동종 또는 이종의 항체를 모두 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(2)에 있어서, 상기 단계 5는 샘플과 반응하지 않고 남은 1차항체를 세척하는 단계이다.

구체적으로, 샘플과 반응한 1차항체에 선택적으로 2차항체를 도입하기 위하여, 샘플과 반응하지 못하고 잔류하는 1차항체를 제거하는 단계이다. 본 단계의 세척에 사용되는 세척액으로는 종래에 세포 또는 조직 샘플의 세척에 사용되는 세척액을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(2)에 있어서, 상기 단계 6은 검사부의 반응채널에, 2가지 이상의 동종의 2차항체 혼합물, 2가지 이상의 이종의 2차항체 혼합물 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 서로 상이한 식별물질이 접합된 2가지 이상의 2차항체 혼합물을 주입하는 단계이다.

이때, 상기 식별물질은 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 정성 분석방법(2)에 있어서, 상기 단계 7은 2차항체 혼합물을 샘플과 반응시키는 단계이다.

구체적으로, 세포 또는 조직 샘플에 존재하는 여러 단백질에 특이적으로 결합된 1차항체에 선택적으로 2차항체를 반응시키고, 상기 2차항체에 도입되어 있는 식별물질로 검출하고자하는 단백질의 발현을 정성 분석할 수 있다.

양자점을 이용한 면역조직화학염색법 특징상 많은 시간이 걸리고, 그에 따라 많은 노동력이 든다는 단점이 있다. 게다가, 최근 양자점을 이용한 면역조직화학염색법의 가장 보편화된 방법 중, 반응시키는 항체 수가 늘어남에 따라 비특이적 반응이 일어나 정확한 단백질 발현측정이 어렵다는 보고가 된 바 있다.

비특이적 반응의 문제점은 서로 다른 종의 항체를 사용하여 해결할 수 있는데, 상업적으로 이용 가능한 항체의 종은 대표적인 것이 3가지 정도로, 이 경우 3가지 정도의 단백질 발현만이 비특이적 반응없이 발현측정이 가능하게 된다. 이와 같은 경우 많은 수의 단백질 발현측정이 어려워지게 된다.

하지만, 본 발명에 따른 정성 분석방법 (1) 및 (2)에서는 여러 개의 반응채널이 세포 또는 조직 샘플을 여러 개의 구획으로 분리하여 각각의 구획에서 2가지 이상의 동종의 항체 혼합물, 2가지 이상의 이종의 항체 혼합물, 1가지 이상의 앱타머 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있기 때문에, 상기 반응채널의 개수 보다 약 3-4배 더 많은 수의 단백질 발현 측정을 동시에 정성 분석할 수 있으므로, 상기의 문제점을 극복할 수 있다.

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

상기 기준항체 또는 기준앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머를 샘플과 반응시키는 반응단계(단계 4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법(1)을 제공한다.

이하, 본 발명의 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법(1)을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 정량 분석방법에 있어서, 상기 단계 1-2는 상술한 정성 분석방법(1)과 동일하다.

본 발명에 따른 정량 분석방법에 있어서, 상기 단계 3은 모든 반응채널마다 정량분석을 위한 기준이 되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머를 동일하게 주입하고, 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 검출항체 또는 검출앱타머를 각기 주입하는 주입단계이다.

이때, 상기 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머 및 서로 다른 단백질을 검출하는 검출항체 또는 검출앱타머를 주입하는 방법은 검사장치 외에서 혼합하여 주입하거나, 검사장치 내에 구비되는 혼합채널에서 혼합하여 반응채널로 주입할 수 있다.

또한, 상기 모든 반응채널에 주입되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머에는 동일한 제1식별물질이 접합되고, 상기 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 검출항체 또는 검출앱타머에는 동일한 제2식별물질이 접합된다.

나아가, 상기 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머는 동종 또는 이종을 사용할 수 있으나, 이종을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 검출항체 또는 검출앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머는 세포 또는 조직 샘플에 존재하는 각각의 단백질과 선택적으로 반응한다.

나아가, 상기 제1식별물질 및 제2식별물질로는 상술한 식별물질과 동일한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 정량 분석방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 검출항체 또는 검출앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머를 샘플과 반응시키는 단계이다.

구체적으로, 세포 또는 조직 샘플에 존재하는 여러 단백질에 특이적으로 결합하는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머를 반응시키고, 상기 정량분석을 위한 기준이 되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머에 도입되어 있는 2종류의 식별물질(상술한 제1식별물질 및 제2식별물질)을 비교 분석하여 검출하고자하는 단백질의 발현을 정량 분석할 수 있다.

기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);

상기 2차항체는 샘플과 반응한 기준항체 및 1차항체에 각각 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법(2)을 제공한다.

본 발명에 따른 정량 분석방법(2)에 있어서, 상기 단계 1-2는 상술한 정량 분석방법(1)과 동일하다.

본 발명에 따른 정량분석 방법(2)에 있어서, 상기 단계 3은 모든 반응채널마다 정량분석을 위한 기준이 되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체를 동일하게 주입하고, 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 1차항체를 각기 주입하는 제1주입단계이다.

이때, 상기 기준항체와 1차항체는 이종인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 모든 반응채널에 주입되는 기준항체와 서로 다른 단백질을 검출하는 1차항체에는 식별물질이 접합되지 않는다.

본 발명에 따른 정량분석 방법(2)에 있어서, 상기 단계 4는 상기 기준항체 및 1차항체를 샘플과 반응시키는 제1반응단계이다.

본 발명에 따른 정량분석 방법(2)에 있어서, 상기 단계 5는 상기 단계 4에서 샘플과 반응하지 않고 남은 기준항체 및 1차항체를 세척하는 단계이다.

구체적으로, 샘플과 반응한 기준항체 및 1차항체에 각각 선택적으로 반응하는 2가지의 2차항체를 도입하기 위하여, 샘플과 반응하지 못하고 잔류하는 기준항체 및 1차항체를 제거하는 단계이다. 본 단계의 세척에 사용되는 세척액으로는 종래에 세포 또는 조직 샘플의 세척에 사용되는 세척액을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 정량분석 방법(2)에 있어서, 상기 단계 6은 각각의 반응채널마다, 서로 다른 이종 또는 서로 다른 동종의 2가지 2차항체를 주입하는 제2주입단계이다.

구체적으로, 상기 각 반응채널에 주입되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체에 선택적으로 반응하는 2차항체에는 동일한 제1식별물질이 접합되고, 상기 각 반응채널에 주입되는 1차항체에 선택적으로 반응하는 2차항체에는 동일한 제2식별물질이 접합된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

이때, 상기 2차항체로는 서로 다른 동종 또는 서로 다른 이종의 2가지 2차항체를 모두 사용할 수 있다. 여기서, 2가지 2차항체는 상술한 바와 같이, 기준항체에 선택적으로 반응하는 2차항체와 1차항체에 선택적으로 반응하는 2차항체를 나타낸다.

또한, 상기 제1식별물질 및 제2식별물질로는 상술한 식별물질과 동일한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 정량분석 방법(2)에 있어서, 상기 단계 7은 상기 2차항체를 샘플과 반응시키는 제2반응단계이다.

구체적으로, 세포 또는 조직 샘플에 존재하는 여러 단백질에 특이적으로 결합된 기준항체 및 1차항체 각각에 선택적으로 반응하는 2가지의 2차항체를 반응시키고, 상기 2가지의 2차항체에 각각 도입되어 있는 제1식별물질 및 제2식별물질로 검출하고자하는 단백질의 발현량을 비교하여 정량 분석할 수 있다.

세포 또는 조직 샘플에서 세포가 불균일하게 분포하고 있으며, 특히 조직샘플의 경우 이러한 불균일한 분포가 심하기 때문에 각각의 채널에 분포하는 세포의 수가 서로 다르다. 예를 들어, 어떤 바이오마커를 양자점으로 염색하였을 때, 스펙트로미터(spectrometer)를 이용하여 염색된 양자점을 읽어 정량분석을 하게 되는데, 각각의 채널마다 세포수가 동일하다면, 바이오마커 간의 발현량을 정량적으로 분석하여 비교할 수 있지만, 세포수가 동일하지 않다면, 어떤 바이오마커가 강한 발현량을 보인다 해도, 단일세포 단위의 비교가 어렵게 된다.

하지만, 본 발명에 따른 정량 분석방법은 세포마다 동일한 발현량을 보이는 하우스키핑 유전자(house keeping gene)에 의해 발현되는 비교단백질(reference protein)에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머를 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 검출항체 또는 검출앱타머와 동시에 반응시키고, 비교단백질의 발현량을 스펙트로미터로 동시에 읽어 정량하고, 각 반응채널에 주입된 검출항체 또는 검출앱타머의 양을 단일세포 단위로 비교분석이 가능하다. 결국, 다중 바이오마커를 단일세포 단위에서 정확한 정량분석을 가능하게 할 수 있다(도 10 참조).

또한, 다중 양자점을 사용하여 하나의 시료 위에서 여러 단백질 발현량을 비교분석할 수 있는 기술이 소개되어 있지만, 방출(emission) 파장대가 다른 양자점의 경우 같은 양이라 해도 그 형광신호의 세기가 서로 다르기 때문에 여러 단백질의 발현량을 정량적으로 비교하기가 매우 어려웠지만, 본 발명의 경우 개별 바이오마커를 같은 양자점으로 염색할 수 있기 때문에 이러한 문제 또한 해결할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다.

또한, 본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부;

이때, 상기 2가지 이상의 바이오마커로는 2가지 이상의 동종의 항체 혼합물, 2가지 이상의 이종의 항체 혼합물, 1가지 이상의 앱타머 및 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 장치를 구성별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 장치에 있어서, 상기 기판부는 투명한 재료로 이루어진 것을 아무런 제약 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 슬라이드 글라스를 사용할 수 있다(도 1 참조).

본 발명에 따른 장치에 있어서, 상기 검사부는 2가지 이상의 바이오마커가 주입되는 하나 이상의 주입구;

상기 주입구와 연결되며, 주입된 바이오마커가 면역검사를 위해 마련된 샘플과 반응이 일어나는 하나 이상의 반응채널; 및

상기 하나 이상의 반응채널과 연결되어 샘플과 반응하지 않고 남은 혼합물이 배출되는 하나 이상의 배출구를 포함할 수 있다(도 2 참조).

또한, 상기 검사부는 2가지 이상의 바이오마커가 주입되는 하나 이상의 주입구;

상기 주입구 2개 이상과 연결되며, 주입구를 통해 주입되는 2가지 이상의 바이오마커를 혼합하는 하나 이상의 혼합채널;

상기 혼합채널과 연결되며, 주입된 바이오마커가 면역검사를 위해 마련된 샘플과 반응이 일어나는 하나 이상의 반응채널; 및

상기 하나 이상의 반응채널과 연결되어 샘플과 반응하지 않고 남은 혼합물이 배출되는 하나 이상의 배출구를 포함할 수 있다(도 3 참조).

이때, 상기 검사부는 자력에 의해 영향을 받는 물질로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 섞인 혼합물로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 검사부의 특정 부분에 위치하여 이루어지는 것을 포함할 수 있다.

또한, 검사장치 내외에서 2가지 이상의 바이오마커를 혼합하는 방법은 구조적, 물리적, 화학적, 전기적, 자기적, 광학적 특성 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 장치에 있어서, 상기 압착부는 볼트 너트의 조임 방식, 스프링 눌림 방식, 무게추 방식 또는 클립 방식을 포함하여 상기 검사부를 기판부 일면에 위치하는 샘플에 압착시킬 수 있다.

또한, 상기 압착부는 영구자석 또는 전자석으로 이루어져, 상기 자력에 의해 영향을 받는 물질로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 섞인 혼합물로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 검사부의 특정 부분에 위치하여 이루어진 검사부를, 기판부 일면에 위치하고 있는 샘플에 부착할 수도 있다.

본 발명에 따른 상기 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치를 이용하여, 본 발명의 정성 분석방법 (1) 및 (2)와 정량 분석방법 (1) 및 (2)를 적용할 수 있다.

또한, 본 발명은 세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부;

상기 검사부를 상기 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 랩온어칩(lab on a chip)을 제공한다(도 5-7 참조).

본 발명에 따른 랩온어칩에 있어서, 상기 기판부는 본 발명에 따른 장치에서 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 랩온어칩에 있어서, 상기 검사부는 주입구와 일체형인 반응채널로 쓰이는 다수의 구멍이 생성된 평면판을 사용할 수 있다. 이때, 상기 구멍의 모양은 원형, 타원형, 사각형, 육각형 등을 아무런 제약 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 다중 바이오마커 동시 면역반응검사용 랩온어칩을 이용하여, 본 발명의 정성 분석방법 (1) 및 (2)와 정량 분석방법 (1) 및 (2)를 적용할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치를 이용한 방법을 이용할 경우 2가지 이상의 바이오마커를 하나의 반응채널에서 정성 분석할 수 있을 뿐만 아니라 상기 반응채널이 다수 존재하므로, 하나의 샘플에 대하여 다중 바이오마커에 대한 면역반응검사를 동시에 수행할 수 있어 검사 시간 및 비용을 현저히 줄일 수 있고, 또한 각 반응채널마다 기준항체와 서로 다른 바이오마커를 주입하여 각 반응채널에서 발현되는 바이오마커를 정량 분석할 수 있으므로, 암 연구 및 검사 등에 사용되는 면역반응검사에 매우 유용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예 1을 설명하면 다음과 같다. 본 실시예의 구체적인 과정은 도 4를 참조한다.

도 1-3은 본 발명의 실시예 1에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치의 구성 및 단면도를 나타내는 도면으로 본 실시예 1의 구성 및 동작기능 등에 대해 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 단백질 마이크로어레이, DNA 마이크로어레이, 조직 마이크로어레이, 세포블럭과 같은 다양한 세포 샘플에 적용할 수 있지만, 대표적인 실시예로 면역조직화학법에의 적용을 예로 설명한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치의 전체 구성의 단면을 개략적으로 나타낸 개략도이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치의 검사부만을 나타낸 평면도이다("a 점선"에 따른 단면을 도 1에 나타냄).

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치에서 혼합채널을 더 구비한 검사부의 평면도이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 방법의 과정을 나타낸 공정도이다.

본 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치의 구성은 크게 기판부, 샘플, 검사부, 압착부로 나누어진다. 기판부의 재료는 투명한 재료를 제약 없이 사용가능하지만, 본 실시예에서는 통상적인 예로 글라스 슬라이드의 경우로 설명한다. 면역조직화학법에서 사용되는 시료인 조직 샘플은 글라스 슬라이드 일면에 부착되어 있으며, 그 위로 압착부의 투명판이 일면에 부착된 검사부를 조직샘플위에 올려놓는다. 이 경우 조직 샘플은 버퍼액이나 물과 같은 용액에 젖어 있는 상태가 바람직하며, 검사부를 조직 샘플 위에 올려놓을 때 검사부의 채널 밑 조직샘플과 맞닿는 부분에는 공기방울이 생기지 않아야 한다.

이때 사용되는 조직샘플은 수화과정과 항원성 부활 과정, 블로킹 과정을 거친 후 본 다중면역결합장치와 결합이 되며, 블로킹 과정 전에도 필요에 의해 결합될 수 있다. 결합 후 장치의 정상적인 동작을 위해 검사부는 조직샘플과 압착이 되어야 하며, 이때 검사부의 각 반응구역 간에는 유체의 간섭이 일어나지 않아야 한다. 이때 압착을 위한 방법으로는 볼트 너트의 조임 방식, 스프링 눌림 방식, 무게추 방식, 클립 방식, 그리고 자력을 이용한 방법이 있을 수 있지만 상기 도면 1에서는 단순화하여 도식함을 밝힌다.

제대로 결합 후 압착이 되어 각각의 반응구역에서 유체의 유출이 일어나지 않을 때, 각 반응구역으로 연결되는 주입구로 2종 이상의 항체를 섞어 주입한다. 이때 사용되는 항체는 각각이 다른 단백질과 선택적으로 반응하는 항체이며, 각 항체에는 서로 다른 색의 형광을 발하는 형광물질이 붙어있는 것으로 한다. 여기서, 식별물질이 항체에 접합되는 사항에 대해서는 본 명세서에서 서술한 바와 같다.

한편, 항체 이외의 앱타머를 동일목적으로 사용가능함을 밝힌다. 본 실시예에서는 8개의 주입구가 존재하지만, 그 개수는 임의로 조절이 가능하다. 각 주입구와 반응구역은 서로 연결되어 있으며, 유체는 주입구에서 반응구역으로, 그리고 유체 배출구로 이동하게 된다.

이동 방법은 유체 주입구로 양압을 가하여 유체 배출구로 빠져나오게 하는 방법, 유체 배출구에서 음압을 가하여 유체 주입구에서 유체 배출구로 유체를 흐르게 하는 방법, 유체 주입구에 유체를 주입시켜 모관력에 의해 유체를 반응구역으로 이동시키는 방법 등 다양한 방법을 적용할 수 있다. 이때, 유체는 반응구역에서 시료와 반응하여 다중 면역조직화학법을 본 장치를 이용하여 수행할 수 있게 된다.

또한, 2종 이상의 항체를 섞는 작업을 도 3과 같이 주입구와 반응채널 사이에 혼합채널을 구비하여 혼합채널의 구조적, 물리적, 화학적, 전기적, 자기적, 광학적 특성을 이용하는 방법을 포함하여 반응채널로 항체가 이동하기 전 혼합채널에서 두 개 이상의 항체나 두 가지 종 이상의 항체를 섞어줄 수 있음을 명시한다.

나아가, 도 1과 같이 기판부의 일면에 열전도부를 구비하거나, 기판부에 열전도부를 내재시키거나, 기판부 일면에 발열물질을 도포시켜 열전도부를 형성할 수 있다. 면역조직화학법의 경우, 온도의 조절이 필요한 과정이 있고, 또한 다른 생물시료 실험의 경우 온도조절이 필수적인 요소가 될 수 있기 때문에 이와 같은 열전도부의 구비는 DNA 또는 그 밖의 다른 생물실험에의 적용을 가능하게 할 수 있다.

< 실시예 2>

본 실시예 2에서 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치가 결합된 시료의 블로킹 처리까지 완료하기 전 과정은 상기 실시예 1과 동일하다. 본 실시예 2에서는 1차항체와 1차항체에 특이적으로 반응하는 2차항체를 사용하는 방법이 추가됨을 밝힌다. 본 실시예의 구체적인 과정은 도 4를 참조한다.

수화 과정까지 완료되어 시료와 결합된 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치의 주입구로 두 개 이상의 1차항체나 2 가지 종 이상의 1차항체를 섞어 주입한다. 이때, 각 항체를 주입하는 주입구를 따로 구비하고, 반응채널과 주입구 사이에 혼합채널을 마련하여 항체를 섞는 과정을 장치 내에서 수행하게 할 수도 있다.

1차항체는 시료와의 반응채널에서 유체를 흐르게 하거나, 혹은 정적인 상태를 유지하며 반응을 유도한 후, 면역검사장치의 각 주입구로 워싱 버퍼액을 주입하고 유체를 흐르게 하는 워싱 과정을 거쳐 반응이 일어나지 않은 1차항체를 완전히 제거한다. 그 후 면역검사장치의 각 주입구로 식별물질이 접합된, 각각의 1차항체에 선택적으로 반응할 수 있는 2차항체를 섞어 주입하여, 역시 유체를 흐르게 하거나 정적 상태로 반응을 유도하여 각각의 반응구역에서 최소 두 가지 이상 바이오마커 발현 반응을 동시에 검출할 수 있는 면역반응을 수행할 수 있게 된다.

상기 식별물질은 여러 다른 광학적, 전기적, 자기적, 물리적, 화학적 특성 등을 지니고 있어 서로 다른 항체에 다른 특성을 지닌 식별물질이 붙어있을 경우 그 식별이 가능한 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 1차항체의 반응 이후에 진행되는 과정은 필요에 따라 상기 면역검사 장치를 시료에서 해제하고 나머지 과정을 기존의 방법대로 수행할 수 있다.

본 실시예 2에서는 일례로 하나의 세포 블럭 샘플에 바이오마커로써, β-액틴(β-actin), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor, PR), 인간 상피 수용체 2(human epidermal receptor 2, HER2(ErbB2)) 및 Ki-67을 본 발명의 장치와 방법을 이용하여 동시에 면역반응검사를 수행하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 장치를 이용하여 다중 바이오마커를 동시에 측정한 결과를 나타낸 형광이미지이다((a)는 제1반응채널, (b)는 제2반응채널, (c)는 제3반응채널, (d)는 제4반응채널을 나타낸다).

상기 도 9는 하나의 반응채널에 각각 두 가지 종에서 유래한 바이오마커를 동시에 반응시키고 각각 다른 색의 형광물질을 접합시켜 여러 반응채널에서 다수의 바이오마커 반응을 볼 수 있게끔 구현한 것이다. 이를 보면 알 수 있듯이, 하나의 샘플에서 다수의 바이오마커를 동시에 반응시켜 짧은 시간 안에 종래 기술로는 불가능했던 많은 수의 바이오마커 반응을 동시에 유발할 수 있어 단시간에 최소한의 샘플을 이용하여 다중 면역반응검사 정성 분석을 할 수 있다.

< 실시예 3>

본 실시예 3에서의 다중 바이오마커 동시 면역반응검사용 랩온어칩(lab on a chip)은 도 5-7에서 묘사된 바와 같다. 본 랩온어칩에서의 반응채널은 주입구와 일체이며, 유체의 흐름이 없이 항체가 주입되는 주입구에서 항체의 반응이 일어난다.

구체적인 과정을 상기 도면과 함께 설명하면 다음과 같다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 랩온어칩의 전체 구성의 단면도이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 랩온어칩에서 검사부만을 나타낸 사시도이다.

도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 랩온어칩의 검사부를 조직 샘플에 적용시키는 것을 간략하게 보여주는 개략도이다.

검사부는 관통된 형태의 하나 이상의 구멍을 가진 랩온어칩 형태를 가지며, 주입구와 반응구역이 따로 나눠져 있지 않다. 도 5와 같이 하나 이상의 구멍이 뚫려있는 검사 장치를 수화과정을 거친 시료 위에 올려 압착부로 결합시킨 후 두 개 이상의 항체나 서로 다른 2종 이상의 항체 또는 1종 이상의 앱타머를 각각의 반응구역에 반응시킴으로 마이크로웰 타입의 다중 바이오마커 동시 면역반응검사를 가능하게 한다. 상기 실시예 1-2와 마찬가지로 1차항체, 2차항체 모두 이용할 수 있으며 전체 면역분석 과정은 동일하다.

< 실시예 4>

기판부 위에 위치하고 있는 시료를 압착할 시, 볼트 너트의 조임 방식, 스프링 눌림 방식, 무게추 방식, 클립 방식 등의 압착 방법은 추가적인 장치를 필요로 하는데 비해, 자력에 영향을 받는 물질로 검사부를 만들거나, 혹은 그 물질을 검사부에 포함시키는 방법을 이용하면 영구자석과 검사부, 기판부 위에 위치하는 시료만으로도 다중 면역검사장치를 구성할 수 있어 휴대하기 용이하고 공간의 제약을 적게 받으며, 크기가 매우 작아진 점을 이용하여 다른 기기와 같이 사용할 수 있는 큰 장점을 가지게 된다.

도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치에서 자력을 이용한 압착 과정을 보여주는 개략도이다.

본 실시예에서는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)과 철 산화물을 혼합하여 제조한 검사부를 대표적 예로 들어 설명하도록 한다.

상기 실시예 1-3과 마찬가지로 검사부에 결합하기 전 수화과정을 거친 샘플 위에 검사부를 얹고 기판부 밑에 영구자석 혹은 전자석을 위치시켜 검사부가 완전히 압착되도록 한다. 검사부는 실시예 1-3에서 소개되었던 형태의 검사부가 사용자의 필요에 따라 사용될 수 있다. 결합 과정 외의 모든 과정은 역시 실시예 1-3에서 소개되었던 과정이 이루어질 수 있다.

< 실험예 1> 바이오마커의 정량 분석

본 발명에 따른 장치와 정량 분석방법을 사용하여 바이오마커의 정량 분석을 실시하였다.

구체적으로, 각 반응채널마다 동일하게 주입되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 항체로 mouse β-actin을 사용하였고, 각 반응채널마다 주입되는 서로 다른 검출항체로 rabbit ErbB2, rabbit PR, rabbit Ki-67 등을 사용하였다.

상기 항체들을 본 발명에 따른 장치를 이용하여 유방암 세포주(SK-BR-3 cell) 샘플과 반응시킨 다음, 형광 분석장치(모델명:QE65000, 제조사: Ocean Optics, USA)를 이용하여 측정하였고, 정량 측정된 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 항체의 강도와 검출항체의 강도를 각각 그래프로 나타내었다(본 실험예에서, 3개의 반응채널만을 확대하여 나타내었다).

다음으로, 상기 그래프들을 정규화(normalization)하여 검출항체들을 정량하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 장치를 이용하여 다중 바이오마커를 동시에 정량 분석한 결과를 나타내는 형광이미지와 그래프이다.

도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 정량 분석방법을 사용할 경우 하나의 샘플에서 동시에 여러 가지 바이오마커들을 정량 분석할 수 있는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법은 종래에는 실현하기 어려웠던, 하나의 샘플에서 동시에 여러 가지 바이오마커들을 정량 분석할 수 있으므로, 암 연구 및 검사 등에 사용되는 면역반응검사에 매우 유용할 수 있다.

Claims

세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,
기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);
압착부를 이용하여 검사장치를 샘플에 부착시키는 압착단계(단계 2);
각각의 반응채널마다 서로 상이한 조합으로, 2가지 이상의 동종의 항체 혼합물, 2가지 이상의 이종의 항체 혼합물, 1가지 이상의 앱타머 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 서로 상이한 식별물질이 접합된 2가지 이상의 바이오마커를 반응채널의 주입구로 주입하는 주입단계(단계 3); 및
상기 바이오마커를 샘플과 반응시키는 반응단계(단계 4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법.
세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,
기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);
압착부를 이용하여 검사장치를 샘플에 부착시키는 압착단계(단계 2);
각각의 반응채널마다 서로 상이한 조합으로, 2가지 이상의 이종의 1차항체(primary antibody) 혼합물을 각각의 반응채널의 주입구로 주입하는 제1주입단계(단계 3);
상기 1차항체 혼합물을 샘플과 반응시키는 제1반응단계(단계 4);
상기 단계 4에서 샘플과 반응하지 않고 남은 1차항체 혼합물을 세척하는 단계(단계 5);
각각의 반응채널마다 서로 상이한 조합으로, 2가지 이상의 동종의 2차항체(secondary antibody) 혼합물, 2가지 이상의 이종의 2차항체 혼합물 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 서로 상이한 식별물질이 접합된 2가지 이상의 2차항체 혼합물을 주입하는 제2주입단계(단계 6); 및
상기 2차항체 혼합물을 샘플과 반응시키는 제2반응단계(단계 7)를 포함하되,
상기 2차항체 혼합물은 샘플과 반응한 1차항체 혼합물에 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정성 분석방법.
제2항에 있어서,
상기 1차항체 혼합물은 세포 또는 조직 샘플에 존재하는 각각의 단백질과 선택적으로 반응하고,
상기 2차항체 혼합물은 샘플에 반응한 1차항체 혼합물에 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 정성 분석방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 식별물질은 발색물질, 효소, 형광물질, 골드 나노입자, 양자점 또는 나노바코드인 것을 특징으로 하는 정성 분석방법.
세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,
기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);
압착부를 이용하여 검사장치를 샘플에 부착시키는 압착단계(단계 2);
모든 반응채널마다 정량분석을 위한 기준이 되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머를 동일하게 주입하고, 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 검출항체 또는 검출앱타머를 각기 주입하는 주입단계(단계 3); 및
상기 기준항체 또는 기준앱타머 및 검출항체 또는 검출앱타머를 샘플과 반응시키는 반응단계(단계 4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법.
세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부; 상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지되, 주입구의 개수는 반응채널의 개수와 동일하거나 많으며, 반응채널의 각 주입구로 2개 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및 상기 검사부를 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하는 검사장치를,
기판부 일면에 위치한 샘플에 위치시키는 배열단계(단계 1);
압착부를 이용하여 검사장치를 샘플에 부착시키는 압착단계(단계 2);
모든 반응채널마다 정량분석을 위한 기준이 되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체를 동일하게 주입하고, 각각의 반응채널마다 서로 다른 단백질을 검출하는 1차항체를 각기 주입하는 제1주입단계(단계 3);
상기 기준항체 및 1차항체를 샘플과 반응시키는 제1반응단계(단계 4);
상기 단계 4에서 샘플과 반응하지 않고 남은 기준항체 및 1차항체를 세척하는 단계(단계 5);
각각의 반응채널마다, 서로 다른 이종 또는 서로 다른 동종의 2가지의 2차항체를 주입하는 제2주입단계(단계 6); 및
상기 2차항체를 샘플과 반응시키는 제2반응단계(단계 7)를 포함하되,
상기 2가지의 2차항체는 샘플과 반응한 기준항체 및 1차항체에 각각 선택적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 정량 분석방법.
제5항에 있어서,
상기 각 반응채널에 주입되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체 또는 기준앱타머에는 동일한 제1식별물질이 접합되고,
상기 각 반응채널에 주입되는 서로 다른 검출항체 또는 검출앱타머에는 동일한 제2식별물질이 접합되는 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
제6항에 있어서,
상기 각 반응채널에 주입되는 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체에 선택적으로 반응하는 2차항체에는 동일한 제1식별물질이 접합되고,
상기 각 반응채널에 주입되는 1차항체에 선택적으로 반응하는 2차항체에는 동일한 제2식별물질이 접합되는 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
제5항에 있어서,
상기 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체와 검출항체는 동종 또는 이종인 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
제6항에 있어서,
상기 하우스키핑 유전자에 의해 발현되는 단백질에 선택적으로 반응하는 기준항체와 1차항체는 이종인 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 제1식별물질 및 제2식별물질은 발색물질, 효소, 형광물질, 골드 나노입자, 양자점 또는 나노바코드인 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
세포 또는 조직 샘플이 위치되는 기판부;
상기 기판부에 위치되는 샘플의 일면에 위치하며 하나 이상의 주입구와 연결되는 하나 이상의 반응채널을 가지고, 반응채널의 각 주입구로 2가지 이상의 바이오마커가 주입되어 샘플과 반응이 일어나는 검사부; 및
상기 검사부를 상기 기판부의 일면에 위치한 샘플에 부착시키는 압착부를 포함하되,
상기 검사부는 2가지 이상의 바이오마커가 주입되는 하나 이상의 주입구; 상기 주입구 2개 이상과 연결되며 주입구를 통해 주입되는 2가지 이상의 바이오마커를 혼합하는 하나 이상의 혼합채널; 및 상기 혼합채널과 연결되며 주입된 바이오마커가 면역검사를 위해 마련된 샘플과 반응이 일어나는 하나 이상의 반응채널;을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치.
제12항에 있어서,
상기 2가지 이상의 바이오마커는 2가지 이상의 동종의 항체 혼합물, 2가지 이상의 이종의 항체 혼합물, 1가지 이상의 앱타머 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치.
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제12항에 있어서,
상기 검사부는 상기 하나 이상의 반응채널과 연결되어 샘플과 반응하지 않고 남은 혼합물이 배출되는 하나 이상의 배출구를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치.
제12항에 있어서,
상기 검사부는 자력에 의해 영향을 받는 물질로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 섞인 혼합물로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 검사부의 특정 부분에 위치하여 이루어지는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치.
제12항에 있어서,
상기 압착부는 볼트 너트의 조임 방식, 스프링 눌림 방식, 무게추 방식 또는 클립 방식을 포함하여 상기 검사부를 기판부 일면에 위치하는 샘플에 압착하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치.
제12항에 있어서,
상기 압착부는 영구자석 또는 전자석으로 이루어져, 자력에 의해 영향을 받는 물질로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 섞인 혼합물로 이루어지거나, 자력에 의해 영향을 받는 물질이 검사부의 특정 부분에 위치하여 이루어진 검사부를, 기판부 일면에 위치하고 있는 샘플에 부착하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 바이오마커 동시 면역반응검사 장치.
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