CN111381038A - 一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法 - Google Patents

一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于小分子物质检测领域，具体涉及一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法；本发明首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的辣根过氧化物酶与加入的TMB/H2O2显色底物溶液发生反应产生颜色变化，并且显色深浅与抗生素的含量成反比，整个检测过程不超过10 min，单个检测的成本不超过1 RMB。相比较传统检测抗生素的方法，本发明解决了前处理复杂、操作成本高、耗时长、需要专业仪器的问题，实现了对四环素和氯霉素的现场快速同时定量检测。

Description

一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的 方法
技术领域
本发明属于小分子物质检测领域，具体涉及一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法。
背景技术
微流控纸芯片作为新兴领域，具有以下三点优点:(1)在纸芯片上实现了进样、流通、检测等全部实验流程，使复杂的实验操作集成到一张小小芯片上，通过设计通道尺寸、微阀门、微零件等的搭配组合完成整体自动化；(2)检测试剂、样本量需求低，一般几微升就可以完成检测，缩短了配样时间和样品消耗，对于珍贵稀少的样品检测更加方便，纸张价格低廉，来源丰富，制作过程简单环保，可以重复使用，缩减了实验成本；(3)由于纸芯片的集成化使得实验操作简便实验消耗少，实验过程基本不产生污染物质，在纸芯片上进行的反应经过适当降解处理后可以直接当普通垃圾处理，对环境友好，对实验人员的健康损坏性小。此外，比色检测法是微流控纸芯片检测中最早、最常用、最简便直观的检测方法，主要通过待测物质和显色剂发生颜色反应，据颜色的深浅强弱来判断待测物质的含量。由于颜色的可视性，此法可直观的进行半定量分析，后期可以通过图像灰度准确定量检测。
抗生素被广泛应用于疾病防治中，但是动物饲料中抗生素的滥用，不可避免地导致蜂蜜、鸡蛋、鱼、奶等动物源性食品中抗生素的残留。其中，四环素(TET) 的残留会引起腹痛、腹泻、胀气、呕吐；氯霉素(CAP)的残留会引起致命的骨髓抑制和再生障碍性贫血。因此，我国规定了牛奶和鱼类中的TET最高残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)为100μg/kg，动物源性食品中禁止使用CAP。目前，已经开发了各种昂贵和复杂的方法来测定抗生素，如色谱技术、光学传感器、电化学传感器和生物传感器，常用的主要为仪器分析方法，包括HPLC、 LC-MS等方法，具有准确性好、灵敏度高的优点，但这些技术必然需要专业仪器，前处理繁琐，操作成本高。本发明基于纸芯片比色对抗生素进行定量检测可以改进这些不足，有效实现大量样本的快速、灵敏、便捷现场检测。
发明内容
为了解决现有检测抗生素方法的前处理复杂、操作成本高、耗时长、需要专业仪器的问题，本发明的目的是提供一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的辣根过氧化物酶与加入的TMB/H2O2显色底物溶液发生反应产生颜色变化，且显色深浅与抗生素的含量成反比。
所述基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法按照以下步骤进行：
一、制备纸芯片：
①设计纸芯片的图案为圆阵列，圆内部为白色，周围为黑色，三个定位符位于纸芯片的边缘作为位置校正，三种标准颜色(红、绿、蓝)的实心圆在纸芯片的底端作为颜色校正；
②用喷蜡打印机打印设计好的纸芯片图案，再将打印好的纸基置于120℃的加热板上加热1min后冷却至室温即可；
③在圆阵列白色区域滴加40μL羧甲基纤维素钠溶液，室温反应20min后，将纸基干燥后，滴加20μL含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液，室温反应30min后，将纸基干燥，滴加25μL抗原至不同检测区中，室温反应5min后，将纸基干燥，滴加20μL含有1％牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液进行封闭，室温反应5min 后，将纸基干燥后，最终将制备好的纸芯片保存在4℃备用；
二、定量检测四环素和氯霉素：
①将步骤一制备好的纸芯片水平悬空放置，并分别取25μL待测溶液、5 μL单克隆抗体和5μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗混合后滴加至纸芯片的不同检测区中，室温反应5min；所述待测溶液包括空白溶液即去离子水、含有四环素或者氯霉素标准品的标准溶液和经样品处理后的样品溶液；
②滴加40μL PBST缓冲液至检测区域中，放置吸水纸在纸芯片下层吸掉多余的物质，重复三次；
③滴加3μL TMB/H2O2显色底物溶液至检测区域中，进行显色反应1-5min，加入空白溶液的对照孔的颜色趋于深蓝色，加入含有四环素或者氯霉素溶液的样品孔的颜色趋于淡蓝色甚至白色，即检测区域的显色深浅与抗生素的含量成反比，若对照孔没有显色出现，则检测结果无效；
④用图片采集设备对显色后的纸芯片进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个检测区域的颜色强度数据，以标准溶液中抗生素的浓度为横坐标、对应的颜色强度数据为纵坐标，绘制工作曲线并拟合得到标准曲线方程，由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测样品溶液中抗生素的含量。
本申请在纸芯片上成功修饰蛋白并且修饰步骤相对现有方法简单，我们的修饰蛋白是首先在纸芯片上修饰上羧基，再通过EDC/NHS的反应将蛋白的氨基与纸芯片上的羧基进行偶联，从而将蛋白固定在纸芯片上，该反应原理较成熟并且蛋白结合较牢固，其他固定蛋白技术需要额外的仪器或者结合效率不高。
作为本申请的优选技术方案，步骤一①中所述的纸芯片的图案为直径和间距都为6mm的4×4圆阵列，白色区域为亲水区，其他区域为疏水区。
本申请的纸芯片的制备实现了高通量的检测，一张纸上可以有许多检测孔，而现有技术一般只能在单个纸芯片上检测单个或者少数样品。
作为本申请的优选技术方案，步骤一③中所述的不同检测区分别为检测四环素区域和检测氯霉素区域。
作为本申请的优选技术方案，步骤一③中所述的抗原为四环素-BSA抗原或者氯霉素-BSA抗原，稀释度分别为1:100～1:2000、1:50～1:3200。
优选的，所述四环素-BSA抗原的稀释度为1:400，所述氯霉素-BSA抗原的稀释度为1:800。
作为本申请的优选技术方案，步骤二①中所述的混合物滴加至纸芯片后，室温反应5min。
作为本申请的优选技术方案，步骤二①中所述的单克隆抗体为抗四环素单克隆抗体或者氯霉素单克隆抗体；所述抗四环素单克隆抗体的稀释度为1:40～1:320；所述氯霉素单克隆抗体的稀释度为1:80～1:640。
优选的，所述抗四环素单克隆抗体和氯霉素单克隆抗体的稀释度都为1:160。
作为本申请的优选技术方案，步骤二①中，样品为牛奶或者鱼肉。
作为本申请的优选技术方案，步骤二②中所述的PBST缓冲液为含有0.05％吐温的10mM PBS缓冲液。
作为本申请的优选技术方案，步骤二③中所述的滴加TMB/H2O2显色底物溶液后，显色反应3min。
作为本申请的优选技术方案，步骤二④中所述的颜色强度数据具体为红色通道的强度数据。
作为本申请的优选技术方案，步骤二④中图片采集设备为扫描机、相机或手机等。
作为本申请的优选技术方案，所述图像处理软件为ImageJ、PS等。
本发明所述纸芯片能够实现对0.5ng/mL四环素浓度和0.05ng/mL氯霉素浓度的检测。
有益效果
与现有技术相比，本发明有益效果为：
(1)本发明首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与HRP标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的HRP与加入的TMB/H2O2显色底物溶液发生反应产生颜色变化，并且显色深浅与抗生素的含量成反比，整个检测过程不超过10min，单个检测的成本不超过1RMB；
(2)相比较传统检测抗生素的方法，本发明解决了前处理复杂、操作成本高、耗时长、需要专业仪器的问题，实现了对四环素和氯霉素的现场快速同时定量检测；
(3)在修饰蛋白步骤中，我们通过优化反应物的浓度，使反应在常温下也能实现，而现有相似的固定蛋白方法需要非常温；
(4)修饰蛋白后需要对纸芯片表面进行封闭，封闭未反应的羧基从而减少后期检测中的非特异性，本申请优化了封闭液的浓度以及封闭时间和温度。
附图说明
通过下文中参照附图对本发明所作的描述，本发明的其它目的和优点将显而易见，并可帮助对本发明有全面的理解；
图1为本发明一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法的原理图；
图2为本发明的纸芯片表面经透射电镜(Transmission electron microscope，TEM) 的表征结果图；
图3为本发明的各个优化条件的结果图；
图4为本发明检测四环素和氯霉素的检测极限和标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例中所需试剂：氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氯化钙(CaCl2)、甲醇(CH3OH)、三氯乙酸(Cl3CCOOH)、四环素类标准品(四环素、多西环素、氧四环素、氯四环素)和氯霉素类标准品(氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考)均购自国家药品食品检定研究院；四环素-BSA抗原、抗四环素单克隆抗体、氯霉素-BSA抗原、抗氯霉素单克隆抗体均购自苏州快捷康生物技术有限公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自南京金斯瑞生物技术有限公司；TMB显色液均购自上海索莱宝股份有限公司；BSA、羧甲基纤维素钠、EDC、NHS均购自Sigma-Aldrich公司。
实施例提供了一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法按照以下步骤进行：
一、制备纸芯片：
①设计纸芯片的图案为圆阵列，圆内部为白色，周围为黑色，三个定位符位于纸芯片的边缘作为位置校正，三种标准颜色(红、绿、蓝)的实心圆在纸芯片的底端作为颜色校正；
②用喷蜡打印机打印设计好的纸芯片图案，再将打印好的纸基置于120℃的加热板上加热1min后冷却至室温即可；
③在圆阵列白色区域滴加40μL 0.5mg/mL羧甲基纤维素钠溶液(pH＝6)，室温反应20min后，将纸基置于40℃烘箱中干燥5min，滴加20μL含有1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液(摩尔比为1:4)，室温反应30min后，将纸基置于40℃烘箱中干燥5 min，滴加25μL抗原至不同检测区中，室温反应5min后，将纸基置于40℃烘箱中干燥5min，滴加20μL含有1％BSA的PBS缓冲液(pH＝7.4)进行封闭，室温反应5min后，将纸基置于40℃烘箱中干燥5min，最终将制备好的纸芯片保存在4℃备用；
二、定量检测四环素和氯霉素：
①将上述制备好的纸芯片水平悬空放置，并分别取25μL待测溶液，5μL 单克隆抗体和5μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗混合后滴加至纸芯片的不同检测区中，室温反应5min；所述待测溶液包括空白溶液即去离子水、含有四环素或者氯霉素标准品的标准溶液(四环素标准溶液是将四环素标准品溶于10mM PBS缓冲液(pH＝7.4)中配制成不同浓度的溶液，氯霉素标准溶液是将氯霉素标准品溶于甲醇中配制成不同浓度的溶液)和经样品处理后的牛奶或者鱼肉样品溶液；
②滴加40μL PBST缓冲液至检测区域中，放置吸水纸在纸芯片下层吸掉多余的物质，重复三次；
③滴加3μL TMB/H2O2显色底物溶液至检测区域中，进行显色反应3min，加入空白溶液的对照孔的颜色趋于深蓝色，加入含有四环素或者氯霉素溶液的样品孔的颜色趋于淡蓝色甚至白色，即检测区域的显色深浅与抗生素的含量成反比，若对照孔没有显色出现，则检测结果无效；
④用手机对显色后的纸芯片进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个检测区域的颜色强度数据，以标准溶液中抗生素的浓度为横坐标、对应的颜色强度数据为纵坐标，绘制工作曲线并拟合得到标准曲线方程，由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测样品溶液中抗生素的含量；
其中，步骤一①中所述的纸芯片的图案为直径和间距都为6mm的4×4圆阵列，白色区域为亲水区，其他区域为疏水区；步骤一③中所述的不同检测区分别为检测四环素区域和检测氯霉素区域；步骤二②中所述的PBST缓冲液为含有0.05％吐温的10mM PBS缓冲液(pH＝7.4)。
实施例1
本发明的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法的整个原理图如图1所示，
图1中，A图是本发明方法设计的纸芯片的图案，B图是用喷蜡打印机和加热板制备纸芯片纸基，C图是将纸基进行生物修饰后固定抗原完成纸芯片的制备，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与HRP标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的HRP与加入的TMB/H2O2显色底物溶液发生反应产生颜色变化，并且显色深浅与抗生素的含量成反比。
实施例2
本发明方法的纸芯片表面经透射电镜的表征结果图如图2所示，
图2中，A图是本发明使用的纸基材料在处理前的表征图，纸张表面的纤维比较光滑，且具有亲水性，B图是将本发明使用的纸基材料经喷蜡打印后的表征图，融化的蜡渗透到纸纤维中，显著降低了纸张的亲水性，形成了紧密的结构，纸纤维结构变得粗糙，C图显示了经生物修饰后的纸张表面的表征图，结构仍保持与A相似的多孔结构并且保持亲水性。
实施例3
为了提高本发明检测方法的可靠性及灵敏度，发明人在发明过程中还对抗原抗体稀释度和显色反应时间的条件进行了考察，具体实验如下：
首先配制不同稀释度的抗原抗体，然后将不同稀释度的抗原进行生物修饰在纸基材料上制备成纸芯片后，将25μL待测溶液(1μg/mL四环素、1ng/mL氯霉素、10mM PBS缓冲液)，5μL不同稀释度的单克隆抗体和辣根过氧化物酶 (HRP)标记的羊抗鼠二抗混合后滴加至纸芯片的不同检测区中，室温反应5min 后，加入40μL PBST缓冲液至检测区域中洗去未反应的物质，最终滴加3μL TMB/H2O2显色底物溶液至检测区域中，进行显色反应3min，用手机对显色后的纸芯片进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个检测区域的颜色强度数据。实验结果如图3A和3B，实验结果显示当四环素-BSA抗原和氯霉素-BSA 抗原稀释度为1:400和1:800时，本发明检测信号最强，因此此条件为本发明最佳的抗原抗体稀释度并利用到后面的考察中。同样，考察显色反应时间条件的实验步骤大体与考察抗原抗体稀释度条件一致，区别在于分别在显色反应1min，2 min，3min，4min，5min后对显色结果进行采集分析，实验结果如图3C和3D，当显色时间为3min时，本发明检测信号最强，因此此条件为本发明最佳的显色反应时间。
实施例4
采用实施例3优化的条件分析检测四环素和氯霉素确定检测限和线性范围，具体实验如下：
配制不同浓度的待测物质，四环素浓度为0～105ng/mL，氯霉素浓度为0～104 ng/mL，然后用制备的纸芯片对其进行检测，通过手机对显色结果进行采集分析得到数据，实验结果如图4，按照阴性样品的mean+3SD为阈值，可得到四环素的检测限为0.5ng/mL，线性范围为1～1000ng/mL，氯霉素的检测限为0.05 ng/mL，线性范围为0.1～100ng/mL。
实施例5
用商品ELISA试剂盒和试纸条对待测物质(四环素和氯霉素)进行检测，步骤均与实施例3相同。
待测物质四环素和氯霉素的浓度配制为0～100ng/mL，实验结果如表1，图中“+”表示样品中含有待检物质，“-”表示样品中不含待检物质。需要注意的是，商品化的ELISA试剂盒检测时间一般为1-2h，由此可知本发明方法和商业化的检测产品有可竞争性的检测灵敏度并且检测时间短，成本低的优势。
表1为本发明与商品化的ELISA试剂盒以及试纸条试剂盒的比较检测结果
Figure BDA0002402032550000081
实施例5
牛奶和鱼肉样品在检测之前需要经过一定的预处理步骤。先用粉碎机将鱼肉样品研磨均匀，然后将5.0g奶粉或5.0g鱼肉加入5.0mL 10mM PBS缓冲液(pH＝6.0)中，剧烈摇晃3min，鱼肉匀浆液以12000rpm/min(4℃)离心10min，除去多余的固体，将奶粉溶液或鱼肉匀浆液与250μL三氯乙酸(50％)混合沉淀蛋白质，再次离心，用0.22μm滤膜过滤，吸取上清液作为待检测样品溶液。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的辣根过氧化物酶与加入的TMB/H2O2显色底物溶液发生反应产生颜色变化，且显色深浅与抗生素的含量成反比。
2.根据权利要求1所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、制备纸芯片：
①设计纸芯片的图案为圆阵列，圆内部为白色，周围为黑色，三个定位符位于纸芯片的边缘作为位置校正，三种标准颜色的实心圆在纸芯片的底端作为颜色校正；
②用喷蜡打印机打印设计好的纸芯片图案，再将打印好的纸基置于120 ℃的加热板上加热1 min后冷却至室温即可；
③在圆阵列白色区域滴加40 μL羧甲基纤维素钠溶液，室温反应20 min后，将纸基干燥后，滴加20 μL含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，室温反应30 min后，将纸基干燥，滴加25 μL抗原至不同检测区中，室温反应5 min后，将纸基干燥，滴加20 μL含有1%牛血清蛋白的PBS缓冲液进行封闭，室温反应5 min后，将纸基干燥，最终将制备好的纸芯片保存在4 ℃备用；
二、定量检测四环素和氯霉素：
①将步骤一制备好的纸芯片水平悬空放置，并分别取25 μL待测溶液，5 μL单克隆抗体和5 μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗混合后滴加至纸芯片的不同检测区中，室温反应；所述待测溶液包括空白溶液、含有四环素或者氯霉素标准品的标准溶液以及经样品处理后的样品溶液；
②滴加40μL PBST缓冲液至检测区域中，放置吸水纸在纸芯片下层吸掉多余的物质，重复三次；
③滴加3μL TMB/H2O2显色底物溶液至检测区域中，进行显色反应1~5 min，加入空白溶液的对照孔的颜色趋于深蓝色，加入含有四环素或者氯霉素溶液的样品孔的颜色趋于淡蓝色甚至白色，即检测区域的显色深浅与抗生素的含量成反比，若对照孔没有显色出现，则检测结果无效；
④用图片采集设备对显色后的纸芯片进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个检测区域的颜色强度数据，以标准溶液中抗生素的浓度为横坐标、对应的颜色强度数据为纵坐标，绘制工作曲线并拟合得到标准曲线方程，由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测样品溶液中抗生素的含量。
3.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤一①中所述的纸芯片的图案为直径和间距都为6mm的4×4圆阵列，白色区域为亲水区，其他区域为疏水区。
4.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤一③中所述的不同检测区分别为检测四环素区域和检测氯霉素区域。
5.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤一③中所述的抗原为四环素-BSA抗原或者氯霉素-BSA抗原，稀释度分别为1:100~1:2000、1:50~1:3200；优选的，所述四环素-BSA抗原的稀释度为1:400，所述氯霉素-BSA抗原的稀释度为1:800。
6.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤二①中所述的混合物滴加至纸芯片后，室温反应5 min。
7.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤二①中所述的单克隆抗体为抗四环素单克隆抗体或者氯霉素单克隆抗体；所述抗四环素单克隆抗体的稀释度为1:40~1:320；所述氯霉素单克隆抗体的稀释度为1:80~1:640；优选的，所述抗四环素单克隆抗体和氯霉素单克隆抗体的稀释度都为1:160。
8.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤二②中所述的PBST缓冲液为含有0.05%吐温的10 mM PBS缓冲液。
9.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤二③中所述的滴加TMB/H2O2显色底物溶液后，显色反应3 min。
10.根据权利要求2所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，步骤二④中所述的颜色强度数据具体为红色通道的强度数据。
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