CN112924663A - 一种现场快速定量检测水中藻毒素的纸芯片器件及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种现场快速定量检测水中藻毒素的纸芯片器件及其应用，属于小分子检测技术领域。通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，基于竞争酶联免疫吸附原理，将样品与酶标记的藻毒素混合，两者同时竞争反应芯片中的捕获位点，过量的酶标记藻毒素被洗涤至比色芯片中，在比色芯片加入TMB/H2O2显色底物后反应产生颜色变化。整个检测过程不超过10min，检测成本低廉；与商品化的检测试纸相比，将反应区域与显色区域分离，调整了颜色信号输出与检测物浓度的比例关系，能够更加准确、清晰的体现出藻毒素的真实含量，不易造成混淆；与传统的检测方法相比，本发明解决了样品前处理复杂、成本高、耗时长等问题，实现了对藻毒素的快速现场定量检测。

Description

一种现场快速定量检测水中藻毒素的纸芯片器件及其应用
技术领域
本发明属于小分子检测技术领域，具体涉及一种现场快速定量检测水中藻毒素的纸芯片器件及其应用。
背景技术
近年来，水资源的富营养化导致蓝藻水华的频率不断增加，与此同时，水体中的毒素也大大增加，导致水资源进一步恶化。在众多毒素中，最常见和毒性最强的是微囊藻毒素(MC-LR)，其可改变生物体内相关酶的活性，导致磷酸化蛋白在肝脏中积累、生理紊乱、细胞坏死、多器官衰竭甚至死亡。因此，世界卫生组织将MC-LR归类为神经毒素和强致癌物，并规定饮用水中的含量不得超过1μg·L-1。因此，亟需开发一种简单、高灵敏度、准确以及快速的现场检测方法来监测水中的MC-LR。目前，已经开发出多种方法，如色谱法、各种光学、电化学和生物传感器，具有准确性好、灵敏度高的优点，但这些技术需要昂贵和复杂的仪器，且需要繁琐的样品预处理或预浓缩，用时长、费用高；最重要的是，这些方法无法实现水中MC-LR的现场检测。
纸芯片具有价格低廉、多样化、便携性好、良好的生物兼容性和环保等优点，近年来被广泛应用于食品、药品以及环境样本检测中。此外，纸芯片可以结合比色法实现更简便、直观、快速的检测方式，即通过待测物质和显色剂发生颜色反应，根据颜色判断待测物质的含量，或通过图像灰度进行准确定量分析。因此，可设计成小型化和便携式的现场检测平台。
目前，已经有基于竞争酶联免疫吸附(d-ELISA)原理的MC-LR的商品化检测试剂盒，但颜色信号输出与MC-LR浓度呈负相关，容易造成结果混淆。因此，本工作设计了一种基于d-ELISA原理的纸芯片，将反应区域和比色区域分为两个独立的区域，使颜色信号输出与MC-LR的浓度呈正相关，可弥补市售试剂盒的不足，有效实现大量样本的快速、灵敏、便捷的现场检测。然而，采用这种方法面临以下技术难题：
1、纸材料易对竞争性抗原产生非特异性吸附，影响定量结果的准确性；
2、环境样本的基质较为复杂，会影响检测结果的准确性；
3、将反应区域和比色区域分离，很难保证反应区域的溶液全部流入比色区域，需要合理设计纸芯片的结构和使用方法，并建立新的检测方案。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种现场快速定量检测水中藻毒素的纸芯片器件及其应用，将具有高特异性的捕获抗体结合在纸芯片器件的反应芯片区表面，经藻毒素和酶标记藻毒素竞争反应后，过量的酶标记藻毒素被洗涤至比色芯片区，经显色反应后进行定量分析，本方法的颜色信号与藻毒素的浓度呈正相关，定量更准确，弥补了市面上检测试剂盒的不足。
本发明的技术方案是：
一种纸芯片器件，所述纸芯片器件用于现场即时定量检测水中的藻毒素，所述纸芯片器件为在滤纸的同一平面上设有两个相离的圆形区域，分别为反应芯片区和比色芯片区；滤纸上有一条折叠线可将滤纸对折，所述折叠线在反应芯片区和比色芯片区之间，且当滤纸沿折叠线对折时，反应芯片区和比色芯片区被折叠到不同平面上；所述反应芯片区和比色芯片区之间设有两层矩形通道，第一层矩形通道与反应芯片区在同一平面内，且与反应芯片区相连，与比色芯片区相离；第二层矩形通道位于第一层矩形通道正上方且与比色芯片区相连；反应芯片区包被抗藻毒素的单克隆抗体。
进一步地，上述技术方案中，反应芯片区、比色芯片区、第一层矩形通道和第二层矩形通道均为亲水区，纸芯片器件上除了反应芯片区、比色芯片区以及两层矩形通道外的区域均采用喷蜡打印机打印一层蜡，以形成疏水区。
进一步地，上述技术方案中，所述滤纸的材质包括纤维素纸或硝化纤维素纸。
进一步地，上述技术方案中，用喷蜡打印机打印一层蜡后，将纸芯片器件置于120～150℃的加热板上，加热1～3min后冷却至室温。
进一步地，上述技术方案中，当反应芯片区和比色芯片区位于同一平面时，第二层矩形通道位于第一层矩形通道正上方且使第一层矩形通道位于第二层矩形通道区域内；当反应芯片区和比色芯片区通过折叠线折叠到不同平面时，与比色芯片区相连的第二层矩形通道与反应芯片区及第二层矩形通道相分离，使第一层矩形通道与第二次矩形通道处于不同平面内。
进一步地，上述技术方案中，反应芯片区包被的抗藻毒素的单克隆抗体的稀释度为1:10～1:5000v/v；优选的，所述抗藻毒素的单克隆抗体的稀释度为1:100v/v；反应芯片区中加入抗藻毒素的单克隆抗体的体积为5～20μL，包被反应时间为5～15min；包被完成后用磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)洗涤后干燥，再将反应芯片区浸入体积分数为1～5％的BSA溶液中封闭15～30min，封闭完成后用磷酸盐缓冲溶液洗涤、干燥。
一种纸芯片器件在现场即时定量检测水中藻毒素中的应用；首先通过喷蜡打印技术结合免疫修饰法制备纸芯片器件，基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的藻毒素与酶标记藻毒素竞争结合捕获抗体上的结合位点，过量的酶标记藻毒素被洗涤至比色芯片区中，在比色芯片区加入TMB/H2O2显色液后发生反应，产生颜色变化，显色深浅与藻毒素的含量成正比。
进一步地，上述技术方案中，所述应用包括如下步骤：a、将纸芯片器件沿折叠线对折，使反应芯片区朝上，显色芯片区朝下，取待测溶液并向待测水中加入酶标记藻毒素，混合后滴加至反应芯片区中，室温反应；所述待测溶液为不含藻毒素的空白溶液、含有藻毒素标准品的标准溶液以及经样品前处理后的实际水样；
b、反应结束后，向反应芯片区中加入洗涤液并反复吸打，使过量的酶标记藻毒素进入到洗涤液中，再将纸芯片器件展开平铺，使反应芯片区与显色芯片区在同一水平面，在毛细作用力下，洗涤液逐渐吸入到第二次矩形通道中，进而进入比色芯片区中；
c、把反应芯片区背靠背折在比色芯片区下面，将TMB/H2O2显色液滴加至比色芯片区中，进行酶催化反应，显色反应，记录每个比色芯片中的颜色变化，待测溶液为不含藻毒素的空白溶液的比色芯片区的颜色趋于白色，含有藻毒素样品的比色芯片区颜色趋于蓝色，即显色的深浅与藻毒素的含量成正比；
d、用图片采集设备对显色后的比色芯片区进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个比色芯片区的颜色强度数据，以含有藻毒素标准品的标准溶液中藻毒素的浓度为横坐标，对应的颜色强度数据为纵坐标，绘制工作曲线并拟合得到标准曲线方程，由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测溶液中藻毒素的含量。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤a中反应时间为5～10min，酶标记藻毒素为辣根过氧化物酶标记的藻毒素，酶标记藻毒素的稀释度为1:50～1:8000v/v，优选的，所述HRP-藻毒素的稀释度为1:2000v/v；待测溶液：酶标记藻毒素的体积比为2:1；经样品前处理后的实际水样为经滤膜过滤处理的实际水样。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤b中的洗涤液为磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)；步骤c中加入TMB/H2O2显色液的体积为3μL，显色反应的时间为1～5min。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤d中图片采集设备为手机或照相机，图像处理软件为ImageJ或PS，所述的颜色强度数据为比色芯片区的颜色强度数据。
本发明方法与液相色谱-质谱方法相比，省去了复杂的样品前处理过程，方法简单、快速；与传统的酶联免疫吸附实验相比，以低成本的纸芯片替代高价的96孔板，成本低廉；与商品化的检测试纸相比，将反应区域与显色区域分离，调整了颜色信号输出与检测物浓度的比例关系，能够更加准确、清晰的体现出藻毒素的真实含量，不易造成混淆。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：
1、本发明将喷蜡打印技术和生物修饰方法相结合制备纸芯片器件，基于d-ELISA原理，样品中的藻毒素与酶标记藻毒素竞争结合捕获抗体中的结合位点，过量的酶标记藻毒素被洗涤至比色芯片中，加入TMB/H2O2显色底物溶液后发生反应，产生颜色变化，且显色深浅与藻毒素的含量成正比，不易造成结果混淆，整个检测过程不超过10min，单个检测的成本不超过1RMB。
2、本方法中，由于反应区域和比色区域分为两个独立的区域，背景信号低，信噪比高，因此，检测灵敏度高，检测下限可低至0.1μg/L，检测下限低于世界卫生组织对饮用水中藻毒素要求的含量(1μg/L)。
3、与传统的藻毒素检测方法相比，本发明解决了样品前处理复杂、检测成本高、耗时长、需要复杂的检测仪器等问题，实现了藻毒素的现场快速定量检测。
4、本方法中，反应芯片与捕获抗体结合之后，对反应芯片表面未反应的羧基进行封闭，从而减少了其对酶标记藻毒素的非特异性吸附，提高了方法的准确性。
5、本方法采用的检测元件为纸，材料环保、便携，方法简单、易于操作。
6、经过实验条件优化，该方法的线性范围为0.01～104μg/mL，高达6个数量级。
7、本发明还可将芯片分成不同区域，实现多种目标分子同时检测。
8、本方法通过建立标准曲线，可定量分析水中的藻毒素。
附图说明
图1为本发明实施例1中一种基于纸芯片的现场快速定量检测水中藻毒素的方法的原理图。
图2为本发明实施例1中的纸芯片器件使用的流程图；图中，1、反应芯片区，2、比色芯片区，3、第一层矩形通道，4、第二次矩形通道，5、折叠线。
图3为本发明的纸芯片器件中固定抗体浓度优化的结果图。
图4为本发明的藻毒素检测方法中酶标记藻毒素浓度优化的结果图。
图5为本发明的藻毒素检测方法中藻毒素的标准曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，通过实施例和应用例对本发明进行说明。本发明所列的这些具体实施例和应用例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1制备纸芯片器件
a、如图2所示，一种纸芯片器件，所述纸芯片器件为在滤纸(纤维素纸或硝化纤维素纸)的同一平面上设有两个相离的圆形区域，分别为反应芯片区和比色芯片区；滤纸上有一条折叠线可将滤纸对折，所述折叠线在反应芯片区和比色芯片区之间，且当滤纸沿折叠线对折时，反应芯片区和比色芯片区被折叠到不同平面上；
所述反应芯片区和比色芯片区之间设有两层矩形通道，第一层矩形通道与反应芯片区在同一平面内，且与反应芯片区相连，与比色芯片区相离；第二层矩形通道与比色芯片区相连；当反应芯片区和分析芯片区位于同一平面时，第二层矩形通道位于第一层矩形通道正上方且使第一层矩形通道位于第二层矩形通道区域内；当反应芯片区和分析芯片区通过折叠线折叠到不同平面时，与比色芯片区相连的第二层矩形通道与反应芯片区及第二层矩形通道相分离，上述芯片的使用流程图见图2；
所述反应芯片区和比色芯片区的直径均为5mm，颜色为白色，两层矩形通道的颜色也都为白色，滤纸上除了反应芯片区、比色芯片区和两侧矩形通道外的其余部分为黑色，所述两层矩形通道宽度均为2mm，长度均为4mm，当两层矩形通道重叠时，矩形通道可以使反应芯片中的液体能够流入到比色芯片。
b、用喷蜡打印机打印纸芯片图案(包括反应芯片区、比色芯片区、第一层矩形通道和第二层矩形通道)，圆形内部及两层矩形通道为白色的亲水区域，圆形外部为黑色的疏水区域，再将打印的纸芯片器件置于加热板上，加热温度是120℃，加热时间1min，冷却至室温即可。
c、将反应芯片表面包被抗藻毒素的单克隆抗体(北京普华仁生物技术开发有限公司，货号：MC8C10)，对单克隆抗体的孵育浓度进行优化，稀释倍数的优化范围是1:10～1:5000，测定的结果如图3所示，随着单克隆抗体浓度增加，信号强度增加，在稀释度为1：100时，信号强度已经达到最高值，继续增加单克隆抗体浓度，信号强度无明显增加，因此，最终单克隆抗体的稀释度为1:100(体积比)，吸取10μL单克隆抗体于反应芯片区中，包被10min，包被完成后用1×PBS缓冲溶液清洗两次，干燥处理，再将反应芯片区浸入体积分数为2％的BSA溶液中，封闭20min，封闭完成后用1×PBS缓冲溶液清洗两次，干燥处理并保存于4℃。
实施例2定量检测河水的中藻毒素
a、将实施例1制备的纸芯片水平放置，首先将反应芯片区和比色芯片区背靠背对折，反应芯片区一面朝上，移取10μL待测溶液并加入5μL的辣根过氧化物酶标记的藻毒素(HRP-藻毒素)，其稀释度为范围为1:50～1:8000(体积比)，实验优化结果如图4所示，随着酶标记的藻毒素浓度增加，信号强度增加，当MC-LR-HRP稀释倍数达到2000倍时，其S/B(信号背景比)已经达到2，并且显色时间可以控制，若MC-LR-HRP浓度再高时，显色时间将大幅度缩短，造成背景颜色偏高，使结果信号读取发生偏差，从而导致纸芯片器件的准确度降低，因此，最佳的酶标记藻毒素的稀释度为1:2000(体积比)混合后滴加至反应芯片区中，室温反应8min；所述待测溶液包括空白溶液、含有藻毒素标准品的标准溶液以及经样品前处理后的实际水样(实际水样经过0.45μm滤膜过滤)；
b、反应结束后，向反应芯片区中滴加40μL的1×PBS缓冲溶液，并用移液枪反复吸打，使过量的HRP-藻毒素进入到1×PBS缓冲溶液中，此时溶液分布于第一层矩形通道和反应芯片区内。再将纸芯片展开平铺，使反应芯片区和比色芯片区位于同一平面内，在纸芯片的毛细作用力会使溶液逐渐吸入到第二层矩形通道进而进入比色芯片区中；
c、把反应芯片区背靠背折在比色芯片区下面，将3μL的TMB/H2O2显色液滴加至比色芯片区中，进行酶催化反应，显色反应2min，记录每个比色芯片区中的颜色变化，加入空白溶液的对照组的颜色趋于白色，加入含有藻毒素样品组的颜色趋于蓝色，即显色的深浅与藻毒素的含量成正比；
d、用图片采集设备对显色后的比色芯片进行图片采集，即用手机拍照，再通过图像处理软件ImageJ分析获得各个比色芯片的颜色强度数据，以标准溶液中藻毒素的浓度为横坐标，标准溶液的浓度范围是0.01～104μg/mL，对应的颜色强度数据为纵坐标，如图5所示，绘制工作曲线并拟合得到标准曲线方程，由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测样品溶液中藻毒素的含量。

Claims (10)

1.一种纸芯片器件，其特征在于，所述纸芯片器件用于现场即时定量检测水中的藻毒素，所述纸芯片器件为在滤纸的同一平面上设有两个相离的圆形区域，分别为反应芯片区(1)和比色芯片区(2)；滤纸上有一条折叠线(5)可将滤纸对折，所述折叠线在反应芯片区(1)和比色芯片区(2)之间，且当滤纸沿折叠线(5)对折时，反应芯片区(1)和比色芯片区(2)被折叠到不同平面上；所述反应芯片区(1)和比色芯片区(2)之间设有两层矩形通道，第一层矩形通道(3)与反应芯片区(1)在同一平面内，且与反应芯片区(1)相连，与比色芯片区(2)相离；第二层矩形通道(4)位于第一层矩形通道(3)正上方且与比色芯片区(2)相连；反应芯片区(1)包被抗藻毒素的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的纸芯片器件，其特征在于，所述滤纸的材质包括纤维素纸或硝化纤维素纸；反应芯片区(1)、比色芯片区(2)、第一层矩形通道(3)和第二层矩形通道(4)均为亲水区，纸芯片器件上除了反应芯片区(1)、比色芯片区(2)以及两层矩形通道外的区域均采用喷蜡打印机打印一层蜡，以形成疏水区。
3.根据权利要求2所述的纸芯片器件，其特征在于，用喷蜡打印机打印一层蜡后，将纸芯片器件置于120～150℃的加热板上，加热1～3min后冷却至室温。
4.根据权利要求1所述的纸芯片器件，其特征在于，当反应芯片区(1)和比色芯片区(2)位于同一平面时，第二层矩形通道(4)位于第一层矩形通道(3)正上方且使第一层矩形通道(3)位于第二层矩形通道(4)区域内；当反应芯片区(1)和比色芯片区(2)通过折叠线(5)折叠到不同平面时，与比色芯片区(2)相连的第二层矩形通道(4)与反应芯片区(1)及第二层矩形通道(4)相分离，使第一层矩形通道(3)与第二次矩形通道(4)处于不同平面内。
5.根据权利要求1所述的纸芯片器件，其特征在于，反应芯片区(1)包被的抗藻毒素的单克隆抗体的稀释度为1:10～1:5000v/v；反应芯片区(1)中加入抗藻毒素的单克隆抗体的体积为5～20μL，包被反应时间为5～15min；包被完成后用磷酸盐缓冲溶液洗涤后干燥，再将反应芯片区(1)浸入体积分数为1～5％的BSA溶液中封闭15～30min，封闭完成后用磷酸盐缓冲溶液洗涤、干燥。
6.权利要求1-5中任一项所述的纸芯片器件的应用，其特征在于，在现场即时定量检测水中藻毒素中的应用；首先通过喷蜡打印技术结合免疫修饰法制备纸芯片器件，基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的藻毒素与酶标记藻毒素竞争结合捕获抗体上的结合位点，过量的酶标记藻毒素被洗涤至比色芯片区中，在比色芯片区加入TMB/H2O2显色液后发生反应，产生颜色变化，显色深浅与藻毒素的含量成正比。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
a、将纸芯片器件沿折叠线对折，使反应芯片区朝上，显色芯片区朝下，取待测溶液并向待测水中加入酶标记藻毒素，混合后滴加至反应芯片区中，室温反应；所述待测溶液为不含藻毒素的空白溶液、含有藻毒素标准品的标准溶液以及经样品前处理后的实际水样；
b、反应结束后，向反应芯片区中加入洗涤液并反复吸打，使过量的酶标记藻毒素进入到洗涤液中，再将纸芯片器件展开平铺，使反应芯片区与显色芯片区在同一水平面，在毛细作用力下，洗涤液逐渐吸入到第二次矩形通道中，进而进入比色芯片区中；
c、把反应芯片区背靠背折在比色芯片区下面，将TMB/H2O2显色液滴加至比色芯片区中，进行酶催化反应，显色反应，记录每个比色芯片中的颜色变化，待测溶液为不含藻毒素的空白溶液的比色芯片区的颜色趋于白色，含有藻毒素样品的比色芯片区颜色趋于蓝色，即显色的深浅与藻毒素的含量成正比；
d、用图片采集设备对显色后的比色芯片区进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个比色芯片区的颜色强度数据，以含有藻毒素标准品的标准溶液中藻毒素的浓度为横坐标，对应的颜色强度数据为纵坐标，绘制工作曲线并拟合得到标准曲线方程，由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测溶液中藻毒素的含量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤a中反应时间为5～10min，酶标记藻毒素为辣根过氧化物酶标记的藻毒素，酶标记藻毒素的稀释度为1:50～1:8000v/v；待测溶液：酶标记藻毒素的体积比为2～5:1；经样品前处理后的实际水样为经滤膜过滤处理的实际水样。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤b中的洗涤液为磷酸盐缓冲溶液；步骤c中加入TMB/H2O2显色液的体积为3～5μL，显色反应的时间为1～5min。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤d中图片采集设备为手机或照相机，图像处理软件为ImageJ或PS，所述的颜色强度数据为比色芯片区的颜色强度数据。
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