CN105675597A - 一种三维比色和光电化学纸基设备的制备及其在过氧化氢检测中的应用 - Google Patents

一种三维比色和光电化学纸基设备的制备及其在过氧化氢检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三维比色和光电化学纸基设备的制备方法及其在过氧化氢检测中的应用。利用蜡打印技术在纸上制备疏水区域、亲水区域，通过激光切割机切割通道，采用丝网印刷的方法，在纸上印制相应的参比、对电极和工作电极，再对工作区域进行功能化以及前处理区储备液的滴加，进而癌细胞的固定；将制备好的纸芯片进行折叠，依次完成比色反应和光电化学反应。通过合理的设计纸芯片通道，首次实现了癌细胞中低含量的H2O2分子的高灵敏、可视化检测。

Description

一种三维比色和光电化学纸基设备的制备及其在过氧化氢检测中的应用
技术领域
本发明涉及过氧化氢检测技术领域，更具体地说是一种能够用于过氧化氢检测的三维比色和光电化学纸基设备的制备。
背景技术
活性氧簇，是一种含氧的化学活性分子，它包含一些羟基自由基（·OH），超氧阳离子（O2 ·-），过氧化氢（H2O2）等。H2O2，是活性氧簇中稳定性最好的一种，它在生命过程中发挥着重要作用。随着H2O2浓度的改变，其在细胞内的作用也会随之发生转变。低浓度下，H2O2作为一种信使分子，不仅能够起到信号转化的作用，而且还对细胞起着保护作用；相反，H2O2浓度过高会导致细胞发生病变，如细胞发生癌变、老化等。因此，细胞内H2O2的高灵敏检测变得尤为重要。
目前，检测细胞内H2O2的方法主要有化学发光、毛细管电泳化学发光法以及荧光方法等。这些检测方法所需仪器比较昂贵，操作过程繁琐，不适合在偏远贫困地区进行检测。因此，研制一种廉价的、携带方便且能够实现细胞内低浓度H2O2的检测设备已成为科研工作者奋斗的目标。
近年来，纸基免疫设备以其廉价、可折叠、储量丰厚且便于修饰和携带等优点而备受科学家的关注。自怀特赛兹课题组报道了微流体纸基分析设备以来，不同种类的纸基设备应运而生。到目前为止，纸基免疫设备已经成功应用于各种分析检测中，包括蛋白质检测、DNA检测、金属离子的检测以及一些生物小分子的检测等领域。光电化学生物传感器，因其激发光源和检测信号是独立的，因此具有高的选择性和灵敏性，有望实现细胞内低含量H2O2的定量检测，但是光电化学检测方法不能给出一种直观的检测结果；而比色生物传感器，能够对待测物进行直观的、可视化的检测，但因其灵敏度较低，只能对待测物进行定性或半定量检测。因此，迫切需要开发一种特异性强、灵敏度高、检测范围宽的分析检测方法以同时实现细胞内H2O2的定量和定性检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是制作一种操作简单、易于修饰、制作成本低的纸基设备，用于细胞内低浓度的H2O2的高灵敏且可视化的检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种三维比色和光电化学纸基设备的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)在计算机上设计比色和光电化学纸芯片的疏水蜡批量打印图案，样式如附图1所示，至左向右，依次包含蜡打印图案A，蜡打印图案B，蜡打印图案C；
(2)将纸剪裁成A4大小的纸，利用蜡打印技术将步骤（1）中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将纸片取出，放置到烘箱中，在130~150oC下加热2min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水区；
(3)利用激光切割机，对印有蜡打印图案A的纸芯片进行切割，制备溶液入口，样式如图2数字1所示，制备显色通道，样式如图2数字2所示，对印有蜡打印图案C的纸芯片进行切割，制备孔洞，样式如图2数字3所示；
(4)采用丝网印刷技术，将工作电极印刷图案印刷到步骤（3）中得到的纸上，具体印刷位置是附图2中数字4所示位置，随后再依次将Ag/AgCl参比电极、碳对电极印刷图案印刷到步骤（3）中得到的纸上的反面区域，具体印刷位置是附图3中数字1和2所示位置；
所述丝网印刷电极所用的纸材料为一级色谱纸或者普通滤纸；
(5)对步骤（4）中纸芯片的亲水的工作区域，亦即附图3中数字3所示位置，功能化，将伴刀豆球蛋白A，生物标签复合物及细胞固定在亲水区域；
所述亲水区域功能化，包括以下步骤：
在纸芯片上生长一层致密的Pt纳米粒子层：将10.0μL10.0mM的H2PtCl6溶液滴加到纸芯片的亲水区域，随后滴加2.0μL3.0mM的NaBH4溶液，室温下静置10min，用超纯水冲洗掉松散的Pt纳米粒子，随后将纸芯片再次室温下干燥；采用电沉积法在生长有Pt纳米粒子层的纸芯片上生长竹节状的ZnO：将长有Pt纳米粒子层的纸芯片放于烘箱中，向此纸芯片上滴加40.0mM的Zn(CH3COO)2·2H2O，作为ZnO的种子溶液，随后将纸芯片130oC下干燥5min，将滴加种子溶液和加热干燥的步骤重复3次，即可在长有Pt纳米粒子层的纸芯片表面附着上ZnO种子，随后将此纸芯片放于20.0mMZn(NO3)2·6H2O与25.0mM六次甲基四胺水溶液中，85oC下，电镀5000~9000s即可；将伴刀豆球蛋白A固定在亲水区域；制备生物标签复合物，首先先制备花状的三维多孔Pd：向5.0mL,1.0mMH2PdCl4溶液中加入0.2mL,0.1M的抗坏血酸溶液，室温下震荡12h；随后利用巯基与Pd间相互作用力，将巯基修饰的单链DNA连接在三维多孔Pd上，而后将10.0μg·mL-1的石墨烯量子点加入到修饰有单链DNA的Pd纳米粒子复合物中，室温下反应两个小时，石墨烯量子点则通过与单链DNA间π-π作用力附着在Pd纳米粒子表面，生物标签复合物制备完成；将10.0μL生物标签复合物滴加到纸芯片表面，随后用5.0μL1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位点，室温下孵育50min；最后将细胞滴加到纸芯片表面，用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面未成功连接的细胞；
(6)向显色反应溶剂储备区中，亦即附图3中数字4所示位置上，滴加显色剂和一定量的H2O2，作为显色反应的储备液供后续显色反应使用；
所述显色剂为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺；
所加H2O2的具体用量为5μL2%~10%的H2O2；
(7)将（6）所得的印有蜡打印图案A的纸芯片和蜡打印图案B的纸芯片进行对折，通过溶液入口，滴加10.0μL的佛波酯溶液，室温下反应2min后完成显色反应，随后将印有蜡打印图案A的纸芯片打开，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗工作电极表面，将印有蜡打印图案B的纸芯片和印有蜡打印图案C的纸芯片进行对折，向纸芯片的亲水区域滴加40.0μL包含有抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行光电化学测试，其中抗坏血酸和磷酸缓冲液的浓度均为0.1M。
本发明所述比色和光电化学纸芯片的疏水蜡批量打印图案设计如下：溶液入口是直径为2.0~3.0mm的孔，显色区域直径为3.0mm，显色通道宽度为0.5~1.0mm，总长度为5.0~6.0mm，与溶液入口处相连的显色通道入口部分为亲水区，长度为2.0~3.0mm，其它显色通道为中空通道；工作区域直径为6.0mm，参比和对电极所在区域直径为8.0mm；蜡打印图案C上的孔洞是为了将工作电极连接到电化学工作站所设计的，且其直径为2.0~3.0mm。
本发明的有益效果：
（1）通过在纸芯片表面生长一层致密的Pt纳米粒子以及后续生长竹节状的ZnO，使得光电流信号强度大幅度提高；
（2）通过精巧地设计纸芯片，实现了癌细胞内低含量的H2O2高灵敏且可视化的检测。
附图说明
图1：疏水蜡批量打印图案；
图2：放大后的疏水蜡批量打印图案，其中，1为溶液入口，2为显色通道，3为孔洞，4为工作电极所在区域；
图3：放大后的疏水蜡批量打印图案的反面样式，其中，1和2分别为参比电极、对电极所在区域，3为纸芯片亲水的工作区域，4为显色反应溶剂储备区。
具体实施方式
实施实例1
一种三维比色和光电化学纸基设备的制备及其在过氧化氢检测中的应用：
(1)在计算机上设计比色和光电化学纸芯片的疏水蜡批量打印图案，它包含蜡打印图案A，蜡打印图案B，蜡打印图案C；
(2)将纸剪裁成A4大小的纸，利用蜡打印技术将步骤（1）中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将纸片取出，放置到烘箱中，在130~150oC下加热2min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水区；
(3)利用激光切割机，对印有蜡打印图案A的纸芯片进行切割，制备溶液入口，显色通道以及孔洞；
(4)采用丝网印刷技术，将工作电极印刷图案印刷到步骤（3）中得到的纸上，随后再依次将Ag/AgCl参比电极、碳对电极印刷图案印刷到步骤（3）中得到的纸上的反面区域；
(5)对步骤（4）中纸芯片的亲水区域功能化，将伴刀豆球蛋白A，生物标签复合物及细胞固定在亲水区域；
所述亲水区域功能化，包括以下步骤：
在纸芯片上生长一层致密的Pt纳米粒子层：将10.0μL10.0mM的H2PtCl6溶液滴加到纸芯片的亲水区域，随后滴加2.0μL3.0mM的NaBH4溶液，室温下静置10min，用超纯水冲洗掉松散的Pt纳米粒子，随后将纸芯片再次室温下干燥；采用电沉积法在生长有Pt纳米粒子层的纸芯片上生长竹节状的ZnO：将长有Pt纳米粒子层的纸芯片放于烘箱中，向此纸芯片上滴加40mM的Zn(CH3COO)2·2H2O的种子溶液，随后将纸芯片130oC干燥5min，将滴加种子溶液和加热干燥的步骤重复3次，即可在长有Pt纳米粒子层的纸芯片表面附着上ZnO种子，随后将此纸芯片放于20mMZn(NO3)2·6H2O与25mM六次甲基四胺的水溶液中，85oC下，电镀5000~9000s即可；将伴刀豆球蛋白A固定在亲水区域；制备生物标签复合物，首先先制备花状的三维多孔Pd：向5.0mL,1.0mMH2PdCl4溶液中加入0.2mL,0.1M的抗坏血酸溶液，室温下震荡12h；随后利用巯基与Pd间相互作用力，将巯基修饰的单链DNA，亦即5′-NH2-AAAGAAAGAAA-GAAAGAAAG-SH-3′连接在三维多孔Pd上，随后将10.0μg·mL-1的石墨烯量子点加入到修饰有DNA链的Pd纳米粒子复合物中，室温下反应两个小时，石墨烯量子点则通过与DNA链间π-π作用力成功附着在Pd纳米粒子表面，生物标签复合物制备完成；随后将10.0μL生物标签复合物滴加到纸芯片表面；用5.0μL1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位点，室温下孵育50min；最后将MCF-7乳腺癌细胞滴加到电极表面，用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面未成功连接的细胞；
(6)向显色反应溶剂储备区中滴加3，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色剂和5.0μL2%~10%的H2O2，作为显色反应的储备液供后续显色反应使用；
(7)将（6）所得的印有蜡打印图案A的纸芯片和蜡打印图案B的纸芯片进行对折，通过溶液入口，滴加10.0μL的佛波酯溶液，室温下反应2min后完成显色反应，随后将印有蜡打印图案A的纸芯片打开，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗工作电极表面，而后将印有蜡打印图案B的纸芯片和印有蜡打印图案C的纸芯片进行对折，向纸芯片的亲水区域滴加40.0μL包含有抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行光电化学测试，其中抗坏血酸和磷酸缓冲液的浓度均为0.1M。
实施实例2
纸芯片的设计及功能化步骤同例1，不同之处是在纸芯片表面固定的细胞是SK-BR-3乳腺癌细胞。

Claims (2)

1.一种三维比色和光电化学纸基设备的制备：
1.1在计算机上设计比色和光电化学纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
1.2将纸剪裁成A4大小的纸，利用蜡打印技术将步骤1.1中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将纸片取出，放置到烘箱中，在130~150oC下加热2min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水区；
1.3利用激光切割机，对印有蜡打印图案A的纸芯片进行切割，制备溶液入口，显色通道，对印有蜡打印图案C的纸芯片进行切割，制备孔洞；
1.4采用丝网印刷技术，将工作电极印刷图案印刷到步骤1.3中得到的纸上，随后再依次将Ag/AgCl参比电极、碳对电极印刷图案印刷到步骤1.3中得到的纸上的反面区域；
所述丝网印刷电极所用的纸材料为一级色谱纸或者普通滤纸；
1.5对步骤1.4中纸芯片的亲水的工作区域功能化，将伴刀豆球蛋白A，生物标签复合物及细胞固定在亲水区域；
所述亲水区域功能化，包括以下步骤：
在纸芯片上生长一层致密的Pt纳米粒子层：将10.0μL10.0mM的H2PtCl6溶液滴加到纸芯片的亲水区域，随后滴加2.0μL3.0mM的NaBH4溶液，室温下静置10min，用超纯水冲洗掉松散的Pt纳米粒子，随后将纸芯片再次室温下干燥；采用电沉积法在生长有Pt纳米粒子层的纸芯片上生长竹节状的ZnO：将长有Pt纳米粒子层的纸芯片放于烘箱中，向此纸芯片上滴加40.0mM的Zn(CH3COO)2·2H2O，作为ZnO的种子溶液，随后将纸芯片130oC下干燥5min，将滴加种子溶液和加热干燥的步骤重复3次，即可在长有Pt纳米粒子层的纸芯片表面附着上ZnO种子，随后将此纸芯片放于20.0mMZn(NO3)2·6H2O与25.0mM六次甲基四胺水溶液中，85oC下，电镀5000~9000s即可；将伴刀豆球蛋白A固定在亲水区域；制备生物标签复合物，首先先制备花状的三维多孔Pd：向5.0mL,1.0mMH2PdCl4溶液中加入0.2mL,0.1M的抗坏血酸溶液，室温下震荡12h；随后利用巯基与Pd间相互作用力，将巯基修饰的单链DNA连接在三维多孔Pd上，而后将10.0μg·mL-1的石墨烯量子点加入到修饰有单链DNA的Pd纳米粒子复合物中，室温下反应两个小时，石墨烯量子点则通过与单链DNA间π-π作用力附着在Pd纳米粒子表面，生物标签复合物制备完成；将10.0μL生物标签复合物滴加到纸芯片表面，随后用5.0μL1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位点，室温下孵育50min；最后将细胞滴加到纸芯片表面，用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面未成功连接的细胞；
1.6向显色反应溶剂储备区中滴加显色剂和一定量的H2O2，作为显色反应的储备液供后续显色反应使用；
所述显色剂为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺；
所加H2O2的具体用量为5μL2%~10%的H2O2；
将1.6所得的印有蜡打印图案A的纸芯片和蜡打印图案B的纸芯片进行对折，通过溶液入口，滴加10.0μL的佛波酯溶液，室温下反应2min后完成显色反应，随后将印有蜡打印图案A的纸芯片打开，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗工作电极表面，将印有蜡打印图案B的纸芯片和印有蜡打印图案C的纸芯片进行对折，向纸芯片的亲水区域滴加40.0μL包含有抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液，在紫外灯的照射下，连接电化学设备进行光电化学测试，其中抗坏血酸和磷酸缓冲液的浓度均为0.1M。
2.根据权利1所述一种三维比色和光电化学纸基设备的制备，其特征在于该纸基设备的疏水蜡批量打印图案的设计上：溶液入口是直径为2.0~3.0mm的孔，显色区域直径为3.0mm，显色通道宽度为0.5~1.0mm，总长度为5.0~6.0mm，与溶液入口处相连的显色通道入口部分为亲水区，长度为2.0~3.0mm，其它显色通道为中空通道；工作区域直径为6.0mm，参比和对电极所在区域直径为8.0mm；蜡打印图案C上的孔洞是为了将工作电极连接到电化学工作站所设计的，且其直径为2.0~3.0mm。
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