CN106018373A

CN106018373A - 三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及atp检测

Info

Publication number: CN106018373A
Application number: CN201610566988.7A
Authority: CN
Inventors: 梁琳琳; 葛慎光; 于京华; 兰飞飞; 李丽; 刘海云; 任娜
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: CN106018373B

Abstract

本发明公开了一种三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及利用所述的荧光/比色双模传感器测定ATP的方法。利用蜡打印技术在纸芯片上制备疏水区域、亲水区域以及中空通道，通过激光切割机切割中空通道。在1工作区域生长金银纳米星，进而固定荧光信号物质，随后滴加荧光淬灭剂，通过荧光信号“关‑开”，从而实现ATP高灵敏的荧光测定。将制备好的纸芯片折叠，在反应区域滴加过氧化氢，从而实现ATP可视化比色测定。

Description

三维金属增强荧光 / 比色双模纸芯片的制备及 ATP 检测

技术领域

本发明涉及低成本、易于携带、可视化的ATP分析检测技术领域，更具体的说是一种三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，本发明还涉及采用了三维金属增强荧光信号放大技术。

背景技术

一切生命活动都以ATP为直接能源。体内（骨骼肌和红细胞中）ATP的含量变化可直接反映机体的功能状态和运动能力。因而ATP的测定是对运动员进行机能评定的重要内容。ATP是常用的测定指标。其测定方法有荧光法、生物发光法、电泳法和高效液相色谱法。这些方法有的操作复杂；有的仪器昂贵、成本高，因此，建立快速、简便检测ATP含量的方法对于深入研究其功能具有重要意义。

微流控纸芯片，因其具有低花费，携带方便，易操作及响应迅速等特点，引起了广大科研人员越来越多的关注。目前，中空通道的微流控纸芯片因其避免了样品在通道中流动缓慢、耗时长、样品挥发严重等问题，大大提高了检测的灵敏度及准确度，被大量应用在检测中。在此，我们应用中空通道作为开关将荧光和比色两种检测方法很好的结合。但是由于纸纤维基底有很强的背景荧光，使其荧光效应信号较差，限制了它的进一步应用。

银及银合金纳米材料在荧光物质附近时，荧光物质的发射强度通过金属增强荧光效应得到提高。生长有这种银合金纳米材料的纸芯片，不仅增大了纸纤维比表面积和生物相容性，而且有效的降低了纸纤维基底的背景荧光。更为重要的一点是银合金纳米材料有效增强了荧光物质的荧光，使检测的灵敏度得到大大的提高因而广泛应用于各种类型的生物传感器中。

发明内容

本发明的目的是提供一种长有三维金银纳米星的中空通道微流控纸芯片，通过增强荧光/比色双模检测的方法，从而实现ATP的快速、灵敏检测。

为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的中空通道三维金属增强荧光/比色双模纸芯片来实现的，其特征是包括以下步骤：

（1）设计如附图1所示的中空通道纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域；

（2）通过蜡打印机将步骤（1）中设计的纸芯片打印上疏水图案；

（3）将步骤（2）中得到的纸芯片于60-150 ºC下加热1-2分钟，使蜡融化，形成疏水层；

（4）将步骤（3）中得到的纸芯片放于激光切割机上，将灰色区域切掉，形成中空通道；

（5）在步骤（4）中得到的纸芯片的1工作区域上生长三维金银纳米星；

（6）将巯基化的DNA₁-氮掺杂碳点（DNA₁-NCDs）固定在步骤（5）所得的纸芯片的工作区域；

（7）将DNA₂-二氧化铈（DNA₂-CeO₂）固定在步骤（6）所得的纸芯片的工作区域；

（8）将步骤（7）所得的纸芯片放入荧光设备中，在激发波长390 nm和发射波长462 nm下进行精确荧光测定；

（9）如附图2所示，将步骤（7）所得的纸芯片按箭头方向折叠，在2工作区域上滴加过氧化氢，进行可视化比色测定。

本发明所设计三维金属增强荧光/比色双模纸芯片图案用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的疏水蜡打印图案，所用纸芯片的纸为普通滤纸或色谱纸。

本发明所设计的中空通道纸芯片的具体尺寸如附图2所示，右侧纸芯片的亲水区域直径为6 mm，左侧纸芯片灰色区域为与右侧纸芯片的亲水区域完全对应的6 mm 孔洞，连接两个孔洞的是长为5 mm，宽为2 mm的亲水通道。

本发明所述在在步骤（4）中得到的纸芯片的1工作区域上生长三维金银纳米星的步骤为：

（1）合成金种子：量取160 mL的二次水置于三口烧瓶中，加热到90 ºC，随后加入1.6 mL 氯金酸，水浴加热到96 ºC，反应1 min，立即加入5.6 mL 1%柠檬酸钠，并搅拌15 min至溶液变为酒红色；取20 µL 的金种子滴加到荧光层的工作区域，在室温下放置45 min；

（2）生长三维金银纳米星：取50.0 µL 的1%氯金酸和5.0 µL 1 M盐酸滴加到已经有金种子的纸上，随后同时滴加50.0 µL 0.2 M抗坏血酸和 3 mM硝酸银，在室温下生长10 min；最后依次滴加10 μL 0.1 M 硝酸银、抗坏血酸及2 μL 氢氧化铵，在室温下生长10 min；最后，用水彻底清洗，并在室温下干燥30 min。

本发明所述的将巯基化的DNA₁-NCDs固定在步骤（5）所得的纸芯片的工作区域的步骤为：

（1）合成DNA₁-NCDs：以不同配比将0.25 g 柠檬酸和三聚氰胺混合在 5 mL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中，随后将混合物转移到15 mL石英微波反应器中，微波合成在160 ºC下反应15 min，最后将获得的溶液透析72 h亿除去剩余的有机物，之后，将N-CDs分散在3 mL 2.5%的戊二醛溶液中，混合物搅拌2 h，最后将200 µL 10 µM DNA₁ 加入到上述溶液中，室温下反应45 min；

（2）固定巯基化的DNA₁-NCDs：将20 μL巯基化的DNA₁-NCDs固定在金银纳米星修饰过的纸芯片1工作区域上，随后加入20 μL 牛血清白蛋白以封闭活性位点，最后用缓冲溶液冲洗。

本发明所述的将DNA₂-CeO₂固定在步骤（6）所得的纸芯片的工作区域的步骤为：

（1）合成DNA₂-CeO₂：将0.374 g 硝酸铈、0.09 g 六亚甲基四胺及0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在16 mL蒸馏水，之后，将混合物转移到高压釜中，并在180 ºC下保持100 min，然后冷却到室温，离心水洗几次，将合成的CeO₂表面氨基化，然后，将氨基化的CeO₂分散在200 µL 10 µM DNA₂、100 µL 20 mg mL^-1(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺盐酸盐及50 µL 20 mg mL^-1羟基琥珀酰亚胺的混合物中，并搅拌12 h，最后，将产物水洗几次；

（2）固定DNA₂-CeO₂：将20 μL DNA₂-CeO₂固定在步骤（6）所得的纸芯片上，随后用缓冲溶液冲洗几次。

本发明所述ATP精确荧光测定步骤，将纸芯片放入荧光设备中，进行样品的测定，绘制荧光强度与ATP浓度的标准曲线，实现ATP的精确检测。

本发明所述ATP可视化比色测定步骤，将纸芯片按附图2箭头方向折叠，滴加过氧化氢，进行样品的测定，绘制灰度与ATP浓度的标准曲线，实现ATP的可视化检测。

本发明的有益效果

（1）中空通道纸芯片的采用，实现了多种方法联用。

（2）纸上生长金银纳米星，增大了比表面积及有效减少纸的背景荧光，并有效增强了几倍荧光信号，大大提高了检测的灵敏度。

（3）通过增强荧光/比色双模式生物传感器的联用，实现了ATP可视化的比色及精确的荧光测量。

附图说明

图1：纸芯片的疏水蜡打印图案；

图2：纸芯片的尺寸及各层功能；纸芯片的折叠方式。

具体实施方式

实施例1

三维金属增强荧光/比色双模纸芯片在ATP检测中的应用：

（1）设计中空通道纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域，右侧纸芯片的亲水区域直径为6 mm，左侧纸芯片灰色区域为与右侧纸芯片的亲水区域完全对应的6 mm 孔洞，连接两个孔洞的是长为5 mm，宽为2 mm的亲水通道；

（2）通过富士施乐喷蜡打印机将步骤（1）中设计的滤纸纸芯片打印上疏水图案；

（4）将步骤（3）中得到的纸芯片放于激光切割机上，将灰色区域切掉，形成孔洞；

（5）在步骤（4）中得到的纸芯片的1工作区域上生长三维金银纳米星，亦即合成金种子：量取160 mL的二次水置于三口烧瓶中，加热到90 ºC，随后加入1.6 mL 氯金酸，水浴加热到96 ºC，反应1 min，立即加入5.6 mL 1%柠檬酸钠，并搅拌15 min至溶液变为酒红色；取20 µL 的金种子滴加到1工作区域，在室温下放置45 min；

生长三维金银纳米星：取50.0 µL 的1%氯金酸和5.0 µL 1 M盐酸滴加到已经有金种子的纸上，随后同时滴加50.0 µL 0.2 M抗坏血酸和 3 mM硝酸银，在室温下生长10 min；最后依次滴加10 μL 0.1 M 硝酸银、抗坏血酸及2 μL 氢氧化铵，在室温下生长10 min；最后，用水彻底清洗，并在室温下干燥30 min；

（6）将巯基化的DNA₁-NCDs固定在步骤（5）所得的纸芯片的工作区域，亦即合成DNA₁-NCDs：以不同配比将0.25 g 柠檬酸和三聚氰胺混合在 5 mL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中，随后将混合物转移到15 mL石英微波反应器中，微波合成在160 ºC下反应15 min，最后将获得的溶液透析72 h亿除去剩余的有机物，之后，将N-CDs分散在3 mL 2.5%的戊二醛溶液中，混合物搅拌2 h，最后将200 µL 10 µM DNA₁ 加入到上述溶液中，室温下反应45 min；

固定巯基化的DNA₁-NCDs：将20 μL巯基化的DNA₁-NCDs固定在金银纳米星修饰过的纸芯片1工作区域上，随后加入20 μL 牛血清白蛋白以封闭活性位点，最后用缓冲溶液冲洗；

（7）将DNA₂-CeO₂固定在步骤（6）所得的纸芯片的工作区域，亦即合成DNA₂-CeO₂：将0.374 g 硝酸铈、0.09 g 六亚甲基四胺及0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在16 mL蒸馏水中，之后，将混合物转移到高压釜中，并在180 ºC下保持100 min，然后冷却到室温，离心水洗几次，将合成的CeO₂表面氨基化，然后，将氨基化的CeO₂分散在200 µL 10 µM DNA₂、100 µL 20 mg mL^-1(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺盐酸盐及50 µL 20 mg mL^-1羟基琥珀酰亚胺的混合物中，并搅拌12 h，最后，将产物水洗几次；

固定DNA₂-CeO₂：将20 μL DNA₂-CeO₂固定在步骤1.6所得的纸芯片上，随后用缓冲溶液冲洗几次；

（8）将步骤（7）所得的纸芯片放入荧光设备中，进行样品的测定，绘制荧光强度与ATP浓度的标准曲线，实现ATP的精确测定；而后将纸芯片按附图2箭头方向折叠，滴加过氧化氢，进行样品的测定，绘制灰度与ATP浓度的标准曲线，实现ATP的可视化测定。

实施例2

制备步骤同例1，不同之处是：所用纸芯片为色谱纸。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tttttttttt tttttttttt ttttgtattg cggaggaagg t 41

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

accttcctcc gcaatactcc cccaggta 28

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttttacctgg gggagtattg cggaggaagg t 31

Claims

1.三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征是包括以下步骤：

1.1设计中空通道纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域；

1.2通过蜡打印机将步骤1.1中设计的纸芯片打印上疏水图案；

1.3将步骤1.2中得到的纸芯片于60-150 ºC下加热1-2分钟，使蜡融化，形成疏水层；

1.4将步骤1.3中得到的纸芯片放于激光切割机上，将灰色区域切掉，形成孔洞；

1.5在步骤1.4中得到的纸芯片的1工作区域上生长三维金银纳米星；

1.6 将巯基化的DNA₁-氮掺杂碳点（DNA₁-NCDs）固定在步骤1.5所得的纸芯片的工作区域；

1.7 将DNA₂-二氧化铈（DNA₂-CeO₂）固定在步骤1.6所得的纸芯片的工作区域；

1.8 将步骤1.7所得的纸芯片放入荧光设备中，在激发波长390 nm和发射波长462 nm下进行精确荧光测定；

1.9如附图2所示，将步骤1.7所得的纸芯片按箭头方向折叠，在2工作区域上滴加过氧化氢，进行可视化比色测定。

2.根据权利要求书1所述三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征在于，用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的疏水蜡打印图案，所用纸芯片的纸为普通滤纸或色谱纸。

3.根据权利要求书1所述三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征在于，右侧纸芯片的亲水区域直径为6 mm，左侧纸芯片灰色区域为与右侧纸芯片的亲水区域完全对应的6 mm 孔洞，连接两个孔洞的是长为5 mm，宽为2 mm的亲水通道。

4.根据权利要求书1所述三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征在于，在步骤1.4中得到的纸芯片的1工作区域上生长三维金银纳米星，具体步骤如下：

首先合成金种子：

量取160 mL的二次水置于三口烧瓶中，加热到90 ºC，随后加入1.6 mL 氯金酸，水浴加热到96 ºC，反应1 min，立即加入5.6 mL 1%柠檬酸钠，并搅拌15 min至溶液变为酒红色；取20 µL 的金种子滴加到1工作区域，在室温下放置45 min；

生长三维金银纳米星：取50.0 µL 的1%氯金酸和5.0 µL 1 M盐酸滴加到已经有金种子的纸上，随后同时滴加50.0 µL 0.2 M抗坏血酸和 3 mM硝酸银，在室温下生长10 min；最后依次滴加10 μL 0.1 M 硝酸银、抗坏血酸及2 μL 氢氧化铵，在室温下生长10 min；最后，用水彻底清洗，并在室温下干燥30 min。

5.根据权利要求书1所述三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征在于，所述的将巯基化的DNA₁-NCDs固定在步骤1.5所得的纸芯片的工作区域，具体制备步骤如下：

首先合成DNA₁-NCDs：以不同配比将0.25 g 柠檬酸和三聚氰胺混合在 5 mL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中，随后将混合物转移到15 mL石英微波反应器中，微波合成在160 ºC下反应15 min，最后将获得的溶液透析72 h亿除去剩余的有机物，之后，将N-CDs分散在3 mL 2.5%的戊二醛溶液中，混合物搅拌2 h，最后将200 µL 10 µM DNA₁ 加入到上述溶液中，室温下反应45 min；

固定巯基化的DNA₁-NCDs：将20 μL巯基化的DNA₁-NCDs固定在金银纳米星修饰过的纸芯片1工作区域上，随后加入20 μL 牛血清白蛋白以封闭活性位点，最后用缓冲溶液冲洗。

6.根据权利要求书1所述三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征在于，所述的将DNA₂-CeO₂固定在步骤1.6所得的纸芯片的工作区域，具体制备步骤如下：

首先合成DNA₂-CeO₂：将0.374 g 硝酸铈、0.09 g 六亚甲基四胺及0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在16 mL蒸馏水中，之后，将混合物转移到高压釜中，并在180 ºC下保持100 min，然后冷却到室温，离心水洗几次，将合成的CeO₂表面氨基化，然后，将氨基化的CeO₂分散在200 µL 10 µM DNA₂、100 µL 20 mg mL^-1(3-二甲氨基丙基)-乙基碳二亚胺盐酸盐及50 µL 20 mg mL^-1羟基琥珀酰亚胺的混合物中，并搅拌12 h，最后，将产物水洗几次；

固定DNA₂-CeO₂：将20 μL DNA₂-CeO₂固定在步骤1.6所得的纸芯片上，随后用缓冲溶液冲洗几次。

7.根据权利要求书1所述三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征在于，所述的将步骤1.7所得的纸芯片放入荧光设备中，在激发波长390 nm和发射波长462 nm下进行精确荧光测定，具体制备步骤如下：将纸芯片放入荧光设备中，进行样品的测定，绘制荧光强度与ATP浓度的标准曲线，实现ATP的精确测定。

8.根据权利要求书1所述三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及ATP检测，其特征在于，所述的将步骤1.7所得的纸芯片按附图2箭头方向折叠，在2工作区域上滴加过氧化氢，进行可视化比色测定，具体制备步骤如下：将纸芯片按附图2箭头方向折叠，滴加过氧化氢，进行样品的测定，绘制灰度与ATP浓度的标准曲线，实现ATP的可视化测定。