CN110205236A - 一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片 - Google Patents
一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110205236A CN110205236A CN201910505357.8A CN201910505357A CN110205236A CN 110205236 A CN110205236 A CN 110205236A CN 201910505357 A CN201910505357 A CN 201910505357A CN 110205236 A CN110205236 A CN 110205236A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluidic chip
- nucleic acid
- paper micro
- layer
- paper
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 76
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 74
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 48
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 35
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 19
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 19
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 7
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- -1 alkyl ketene dimer Chemical compound 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 3
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 241000233647 Phytophthora nicotianae var. parasitica Species 0.000 description 18
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 15
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 15
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000222978 Leptosphaeria biglobosa Species 0.000 description 2
- 241000228457 Leptosphaeria maculans Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000003790 Foot Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于RPA技术快速检测核酸的纸微流控芯片。该纸微流控芯片包括层A和层B;层A和层B的材质为纸;该纸微流控芯片由至少一个反应单元组成;每一个反应单元包括设置在层A上的N个反应垫(3)和设置在层B上的1个点样区域(4);每一个反应单元中,点样区域覆盖全部的反应垫;反应垫和点样区域由亲水材料制成;除反应垫和点样区域外,纸微流控芯片均覆盖疏水材料。反应垫上含有检测目标核酸的成套试剂。实验证明,本发明提供的纸微流控芯片可以快速检测目标核酸,且成本低廉、准确率高。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于RPA技术快速检测核酸的纸微流控芯片。
背景技术
无论是植物、动物还是人体都有病原物的危害。核酸作为生命最重要的生物大分子物质之一,携带遗传物质,因此可通过对核酸的检测和分析来检测病原物的存在和含量。由于生物细胞中核酸含量低,从植物、动物和人体组织中检测痕量病原物,往往需要高灵敏的核酸检测。目前经常采用的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)必须经过变性、退火、延伸三个步骤,用时在90min左右,PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是一种核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。
常见的等温扩增包括环介导核酸等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)、重组酶聚合酶扩增(recombinase ploymerase amplification,RPA)等。LAMP是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物,利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)孵育30-60min,即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比,不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点。RPA采用的酶活性最适温度在37℃-42℃之间,无需变性,在常温下即可进行。此外,由于不需要温控设备,RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。
纸微流控芯片作为一种新发展的技术手段,为病原物的快速检测提供了一种新的工具。纸微流控芯片具有成本更低、分析系统易微型化和便携化、后处理简单和无污染的优点,在临床诊断、食品质量控制和环境监测等领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是快速检测核酸。
本发明首先保护一种纸微流控芯片。该纸微流控芯片可包括层A 1和层B 2;层A和层B的材质可为纸;该纸微流控芯片可由至少一个反应单元组成;每一个反应单元可包括设置在层A上的N个反应垫3和设置在层B上的1个点样区域4;每一个反应单元中,点样区域覆盖全部的反应垫;反应垫和点样区域可由亲水材料制成;除反应垫和点样区域外,纸微流控芯片均覆盖疏水材料。
纸可为滤纸。
层A和层B可以连接,也可以分别独立。连接可为折叠连接。
纸微流控芯片具体可由层A和层B组成。
纸微流控芯片可用于检测目标核酸。
亲水材料可为滤纸、玻璃纤维或聚醚砜。
疏水材料可为石蜡、光刻胶、聚苯乙烯或烷基烯酮二聚体。
反应垫上含有检测目标核酸的成套试剂。
检测目标核酸的成套试剂可包括引物对X和探针X。
检测目标核酸的成套试剂具体可由引物对X和探针X组成。
引物对X可由引物F和引物R组成。引物F和引物R均可为30-35个(如30-33个、33-35个、30个、31个、32个、33个、34个或35个)核苷酸组成的单链DNA分子。引物对X的靶序列的长度可为100-200bp(如100-130bp、130-170bp、170-200bp、100bp、130bp、170bp或200bp),与部分目标核酸相同或互补。
探针X可为45-60个(如45-50个、50-55个、55-60个、45个、50个、55个或60个)核苷酸组成的单链DNA分子。探针X从5’至3’依次可包括DNA片段甲、外切酶exo的切断位点和DNA片段乙。探针X从5’至3’依次可由DNA片段甲、外切酶exo的切断位点和DNA片段乙组成。DNA片段甲可为30-40个(如30-35个、35-40个、30个、35个或40个)核苷酸组成的单链DNA分子,与引物对X的靶序列上的区段甲部分相同。DNA片段乙与引物对X的靶序列上的区段乙部分相同。区段甲和区段乙在引物对X的靶序列上无重叠。
外切酶exo的切断位点可为四氢呋喃。
DNA片段甲的末端具有荧光标记(即DNA片段甲末端的脱氧核糖核苷酸具有荧光标记)。更具体的,DNA片段甲3’末端的脱氧核糖核苷酸具有荧光标记。
荧光标记具体可为FAM荧光标记。
DNA片段乙的一个末端具有荧光淬灭基团,另一个末端具有封闭基团。具体的,DNA片段乙的一个末端的脱氧核糖核苷酸具有荧光淬灭基团,另一个末端的脱氧核糖核苷酸具有封闭基团。更具体的,DNA片段乙5’末端的脱氧核糖核苷酸具有荧光淬灭基团,3’末端的脱氧核糖核苷酸具有封闭基团。
荧光淬灭基团具体可为BHQ1荧光淬灭基团。
封闭基团具体可为C3-spacer、磷酸盐、生物素-TEG或胺。
检测目标核酸的成套试剂还可包括RPA酶。
检测目标核酸的成套试剂可由引物对X、探针X和RPA酶组成。
纸微流控芯片具体可由两个反应单元、一个反应单元或三个反应单元组成。
当纸微流控芯片由一个反应单元组成时,进行目标核酸检测时,反应单元的点样区域中滴加待测溶液。
当纸微流控芯片由两个反应单元组成时,进行目标核酸检测时,一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,另一个反应单元的点样区域中滴加阴性对照或阳性对照。
当纸微流控芯片由三个反应单元组成时,进行目标核酸检测时,第一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,第二个反应单元的点样区域中滴加阴性对照,第三个反应单元的点样区域中滴加阳性对照。
本发明还保护制备检测目标核酸的纸微流控芯片的方法,可包括如下步骤:
(1)制备上述任一所述纸微流控芯片;
(2)制备上述任一所述的检测目标核酸的成套试剂;
(3)向步骤(1)制备的纸微流控芯片的反应垫上滴加步骤(2)制备的检测目标核酸的成套试剂,30-40℃(如30-35℃、35-40℃、30℃、35℃或40℃)烘干20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min),得到检测目标核酸的纸微流控芯片。
本发明还保护采用上述任一所述的纸微流控芯片(已含有检测目标核酸的成套试剂)检测目标核酸的方法,可包括如下步骤:
(1)取上述任一所述的纸微流控芯片,向其中一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,然后使层A和层B紧密接触,37-42℃(如37-39℃、39-42℃、37℃、39℃或42℃)反应20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min);
(2)完成步骤(1)后,取所述纸微流控芯片,进行如下判断:如果滴加待测溶液的反应垫呈现荧光,则待测溶液中含有目的核酸,否则待测溶液中不含有目的核酸。
本发明还保护采用上述任一所述的纸微流控芯片(未含有检测目标核酸的成套试剂)检测目标核酸的方法,可包括如下步骤:
(1)取上述任一所述的纸微流控芯片,向反应垫上滴加上述任一所述“检测目标核酸的成套试剂”,30-40℃(如30-35℃、35-40℃、30℃、35℃或40℃)烘干20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min);
(2)完成步骤(1)后,取所述纸微流控芯片,向其中一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,然后使层A和层B紧密接触,37-42℃(如37-39℃、39-42℃、37℃、39℃或42℃)反应20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min);
(3)完成步骤(2)后,取所述纸微流控芯片,进行如下判断:如果滴加待测溶液的反应垫呈现荧光,则待测溶液中含有目的核酸,否则待测溶液中不含有目的核酸。
上述任一所述方法中,如果所述纸微流控芯片由两个反应单元组成,则一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,另一个反应单元的点样区域中滴加阴性对照(或阳性对照),进行结果判断的原则如下:如果滴加待测溶液的反应垫呈现荧光且相应的滴加阴性对照的反应垫无荧光(或相应的滴加阳性对照的反应垫呈现荧光),则待测溶液中含有目的核酸,否则待测溶液中不含有目的核酸。
上述任一所述方法中,如果所述纸微流控芯片由三个反应单元组成,则第一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,第二个反应单元的点样区域中滴加阴性对照,第三个反应单元的点样区域中滴加阳性对照,进行结果判断的原则如下:如果滴加待测溶液的反应垫呈现荧光、相应的滴加阴性对照的反应垫无荧光且相应的滴加阳性对照的反应垫呈现荧光,则待测溶液中含有目的核酸,否则待测溶液中不含有目的核酸。
上文中,层A中反应垫上的“检测目标核酸的成套试剂”可以相同(用于检测相同的目标核酸),也可以不同(用于检测不同的目标核酸)。
上文中,待测溶液包括待测核酸、醋酸镁水溶液和再生水化液。
待测溶液具体可由待测核酸、醋酸镁水溶液、再生水化液和水组成。
待测溶液具体可由0.6体积份待测核酸和24.4体积份混合溶液组成。
阴性对照具体可由0.6体积份水和24.4体积份混合溶液组成。
48.8体积份混合溶液具体可由2.5体积份醋酸镁水溶液(浓度为280mM)、29.5体积份再生水化液和16.8体积份水组成。
再生水化液具体可为TwistDX公司的产品。
实验证明,本发明提供的纸微流控芯片可以快速检测目标核酸,且成本低廉、准确率高。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为由一个反应单元组成的快速检测目标核酸的纸微流控芯片的结构示意图。
图2为由两个反应单元组成的快速检测目标核酸的纸微流控芯片的结构示意图。
图3为由三个反应单元组成的快速检测目标核酸的纸微流控芯片的结构示意图。
图4为快速检测油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌的纸微流控芯片的结构示意图。
图5为实施例2中步骤四2的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中,亲水材料为玻璃纤维、滤纸或聚醚砜。
下述实施例中,疏水材料为石蜡、光刻胶、聚苯乙烯或烷基烯酮二聚体。
含RPA酶的干粉为TwistDX公司的产品,产品目录号为TAEXO02KIT。
实施例1、快速检测目标核酸的纸微流控芯片的制备
一、引物和探针的合成
根据目标核酸的序列,设计基于RPA技术的引物和探针,设计原则如下:
(1)上游引物和下游引物的长度均为30-35bp;引物对由上游引物和下游引物组成;
(2)探针长度为45-60bp,从5’至3’依次包括DNA片段甲、四氢呋喃(Tetrahydrofuran,THF)(四氢呋喃为外切酶exo的切断位点)和DNA片段乙;DNA片段甲为30-40个核苷酸组成的单链DNA分子;DNA片段甲和DNA片段乙分别与引物对的靶序列上的两个区段部分相同且两个区段在靶序列上无重叠;四氢呋喃上游紧挨的脱氧核糖核苷酸具有荧光标记,四氢呋喃下游紧挨的脱氧核糖核苷酸具有荧光淬灭基团BHQ1;探针3’末端的脱氧核糖核苷酸具有封闭基团C3标记(目的为阻断探针延伸);
(3)两个引物和探针的序列尽可能不重叠,以避免出现引物和探针的二聚体结构和二级结构,扩增产物长度在100-200bp之间,以达到最佳扩增效率。
人工合成上游引物、下游引物和探针。
二、引物探针溶液的制备
将2.1μL上游引物(浓度为10μM)、2.1μL下游引物(浓度为10μM)和0.6μL探针(浓度为10μM)和45.2μL水混合,然后加入适量含RPA酶的干粉,充分溶解,得到引物探针溶液。
三、制备快速检测目标核酸的纸微流控芯片
快速检测目标核酸的纸微流控芯片的结构示意图见图1(由一个反应单元组成)、图2(由两个反应单元组成)和图3(由三个反应单元组成)。
制备图2所示的快速检测目标核酸的纸微流控芯片。
快速检测目标核酸的纸微流控芯片包括层A和层B,层A和层B折叠连接。
层A上设置2N个(N为1以上的自然数)圆形反应垫(由亲水材料制作而成),圆形反应垫分为两列,每列N个;除圆形反应垫外,层A的其余位置覆盖疏水材料。每行的2个反应垫上均滴加同一种引物探针溶液,37℃烘干0.5h。各行反应垫上滴加的引物探针溶液可以相同(用于检测相同的目标核酸),也可以不同(用于检测不同的目标核酸)。
层B上设置两个点样区域,其中一个点样区域完全覆盖层A上的一列圆形反应垫,另一个点样区域则完全覆盖层A上的另一列圆形反应垫。点样区域由亲水材料制作而成;除两个点样区域外,层B的其余位置覆盖疏水材料。
使用时,层B的一个点样区域中滴加待测溶液,另一个点样区域滴加水(阴性对照),然后折叠层A和层B,用小夹子夹住四周(目的为使层A和层B紧密接触),39℃静止30min;之后在暗处用便携式荧光观测镜观察圆形反应垫,进行如下判断:如果滴加待测溶液的反应垫呈现荧光且相应的滴加水的反应垫无荧光,则待测溶液中含有目的核酸,否则待测溶液中不含有目的核酸。
具体的,快速检测目标核酸的纸微流控芯片的层A和层B规格均为30mm×30mm。
实施例2、快速检测油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌的纸微流控芯片的制备及其应用
一、引物和探针的合成
1、油菜茎基溃疡病菌的引物和探针的合成
根据油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculans(L.maculans))的核酸序列和实施例1中步骤一的设计原则,设计的引物和探针的核苷酸序列如下:
引物L.maculans-F:5’-ACTGCCGCCTCGATCAGTGGCGGCAGTCTAC-3’;
引物L.maculans-R:5’-TTGCAAGTGGTTTTAGGGGATCCAATTGGTG-3’;
探针L.maculans-P:5’
-ACTGCCGCCTCGATCAGTGGCGGCAGTCTAC-THF-TGATTCTGCCCATGT(C3 spacer)-3’。
上述探针L.maculans-P中,自5’末端起第32位所示的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(方框所示)具有FAM荧光标记,第33位所示的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(双下划线所示)具有BHQ1荧光淬灭基团;3’末端的C3 spacer为用封闭基团C3封闭以阻断探针L.maculans-P延伸。
人工合成引物L.maculans-F、引物L.maculans-R和探针L.maculans-P。
2、油菜黑胫病菌的引物和探针的合成
根据油菜黑胫病菌Leptosphaeriabiglobosa(L.biglobosa)的核酸序列和实施例1中步骤一的设计原则,设计的引物和探针的核苷酸序列如下:
引物L.biglobosa-F:5’-CCCTTCTATCAGGGGATTGGTGTCAGCATTTCGG-3’;
引物L.biglobosa-R:5’-TTACAAGTGGTTTGAATTGTCCTTTTGGCAGGC-3’;
探针L.biglobosa-P:5’
-CCCTTCTATCAGGGGATTGGTGTCAGCATTTCGGCCTTT-THF-TGCTTACTTTCTGGC(C3spacer)-3’。
上述探针L.biglobosa-P中,自5’末端起第40位所示的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(方框所示)具有FAM荧光标记,第41位所示的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(双下划线所示)具有BHQ1荧光淬灭基团;3’末端的C3 spacer为用封闭基团C3封闭以阻断探针L.biglobosa-P延伸。
人工合成引物L.biglobosa-F、引物L.biglobosa-R和探针L.biglobosa-P。
二、引物探针溶液的制备
1、油菜茎基溃疡病菌引物探针溶液的制备
将2.1μL引物L.maculans-F(浓度为10μM)、2.1μL引物L.maculans-R(浓度为10μM)和0.6μL探针L.maculans-P(浓度为10μM)和45.2μL水混合,然后加入适量含RPA酶的干粉,充分溶解,得到油菜茎基溃疡病菌引物探针溶液。
2、油菜黑胫病菌引物探针溶液的制备
将2.1μL引物L.biglobosa-F(浓度为10μM)、2.1μL引物L.biglobosa-R(浓度为10μM)和0.6μL探针L.biglobosa-P(浓度为10μM)和45.2μL水混合,然后加入适量含RPA酶的干粉,充分溶解,得到油菜黑胫病菌引物探针溶液。
三、快速检测油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌的纸微流控芯片的制备
快速检测油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌的纸微流控芯片的结构示意图见图4。
快速检测油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌的纸微流控芯片包括层A和层B,层A和层B折叠连接。层A上设置4个圆形反应垫(由亲水材料制作而成),分别命名为a1、a0、b1和b0,圆形反应垫分为两列,每列2个;除圆形反应垫外,层A的其余位置覆盖疏水材料。在a1和a0上分别滴加24μL油菜茎基溃疡病菌引物探针溶液,在b1和b0上分别滴加24μL油菜黑胫病菌引物探针溶液,37℃烘干0.5h。
层B上设置两个点样区域,分别命名为点样区域0和点样区域1,点样区域0完全覆盖层A上的一列圆形反应垫(包括a1和b1),点样区域1则完全覆盖层A上的另一列圆形反应垫(包括a0和b0)。两个点样区域由亲水材料制作而成;除两个点样区域外,层B的其余位置覆盖疏水材料。
四、采用实施例3制备的纸微流控芯片检测待测油菜是否感染油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌
48.8μL混合溶液由2.5μL醋酸镁水溶液(浓度为280mM)、29.5μL再生水化液(TwistDX公司的产品)和16.8μL水组成。
1、采用实施例3制备的纸微流控芯片检测待测油菜是否感染油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌的方法
(1)将0.6μL待测油菜的基因组DNA和24.4μL混合溶液混匀,得到待测样品反应液。将0.6μL水和24.4μL混合溶液混匀,得到空白反应液(作为对照)。
(2)完成步骤(1)后,取实施例3制备的纸微流控芯片,向点样区域0滴加25μL待测样品反应液,向点样区域1滴加25μL空白反应液,然后折叠层A和层B,用小夹子夹住四周(目的为使层A和层B紧密接触),39℃静止30min。
(3)完成步骤(2)后,取所述纸微流控芯片,在暗处用便携式荧光观测镜观察a、a0、b和b0,然后进行如下判断:如果a1呈现荧光且a0无荧光,则待测油菜感染油菜茎基溃疡病菌,否则待测油菜没有感染油菜茎基溃疡病菌;如果b1呈现为荧光且b0无荧光,则待测油菜感染油菜黑胫病菌,否则待测油菜没有感染油菜黑胫病菌。
2、准确性实验
(1)取感染油菜黑胫病菌的油菜,按照步骤1的方法进行检测。
检测结果见图5中A,该油菜感染油菜黑胫病菌,与预期结果完全一致。
(2)取感染油菜茎基溃疡病菌和油菜黑胫病菌的油菜,按照步骤1的方法进行检测。
检测结果见图5中B,该油菜感染茎基溃疡病菌和油菜黑胫病菌,与预期结果完全一致。
由此可见,采用步骤1的方法检测待测油菜是否感染油菜茎基溃疡病菌和/或油菜黑胫病菌具有较高的准确率。
Claims (10)
1.一种纸微流控芯片,其特征在于:该纸微流控芯片包括层A(1)和层B(2);层A和层B的材质为纸;
该纸微流控芯片由至少一个反应单元组成;
每一个反应单元包括设置在层A上的N个反应垫(3)和设置在层B上的1个点样区域(4);每一个反应单元中,点样区域覆盖全部的反应垫;
反应垫和点样区域由亲水材料制成;
除反应垫和点样区域外,纸微流控芯片均覆盖疏水材料。
2.如权利要求1所述纸微流控芯片,其特征在于:层A和层B可以连接,也可以分别独立。
3.如权利要求1所述纸微流控芯片,其特征在于:亲水材料为滤纸、玻璃纤维或聚醚砜;疏水材料为石蜡、光刻胶、聚苯乙烯或烷基烯酮二聚体。
4.如权利要求1所述纸微流控芯片,其特征在于:反应垫上含有检测目标核酸的成套试剂;
检测目标核酸的成套试剂包括引物对X和探针X;
引物对X由引物F和引物R组成;引物F和引物R均为30-35个核苷酸组成的单链DNA分子;引物对X的靶序列的长度为100-200bp,与部分目标核酸相同或互补;
探针X为45-60个核苷酸组成的单链DNA分子,从5’至3’依次包括DNA片段甲、外切酶exo的切断位点和DNA片段乙;DNA片段甲为30-40个核苷酸组成的单链DNA分子,与引物对X的靶序列上的区段甲部分相同;DNA片段乙与引物对X的靶序列上的区段乙部分相同;区段甲和区段乙在引物对X的靶序列上无重叠。
5.如权利要求4所述纸微流控芯片,其特征在于:外切酶exo的切断位点为四氢呋喃。
6.如权利要求4所述纸微流控芯片,其特征在于:DNA片段甲的末端具有荧光标记;DNA片段乙的一个末端具有荧光淬灭基团,另一个末端具有封闭基团。
7.如权利要求1至6任一所述纸微流控芯片,其特征在于:纸微流控芯片由两个反应单元、一个反应单元或三个反应单元组成。
8.制备检测目标核酸的纸微流控芯片的方法,包括如下步骤:
(1)制备权利要求1至3任一所述的纸微流控芯片;
(2)制备权利要求4至6中任一所述的检测目标核酸的成套试剂;
(3)向步骤(1)制备的纸微流控芯片的反应垫上滴加步骤(2)制备的检测目标核酸的成套试剂,30-40℃烘干20-40min,得到检测目标核酸的纸微流控芯片。
9.权利要求4至8任一所述的纸微流控芯片检测目标核酸的方法,包括如下步骤:
(1)取权利要求4至8任一所述的纸微流控芯片,向其中一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,然后使层A和层B紧密接触,37-42℃反应20-40min;
(2)完成步骤(1)后,取所述纸微流控芯片,进行如下判断:如果滴加待测溶液的反应垫呈现荧光,则待测溶液中含有目的核酸,否则待测溶液中不含有目的核酸。
10.权利要求1、2、3或7所述的纸微流控芯片检测目标核酸的方法,包括如下步骤:
(1)取权利要求1、2、3或7所述的纸微流控芯片,向反应垫上滴加权利要求4至6中任一所述的检测目标核酸的成套试剂,30-40℃烘干20-40min;
(2)完成步骤(1)后,取所述纸微流控芯片,向其中一个反应单元的点样区域中滴加待测溶液,然后使层A和层B紧密接触,37-42℃反应20-40min;
(3)完成步骤(2)后,取所述纸微流控芯片,进行如下判断:如果滴加待测溶液的反应垫呈现荧光,则待测溶液中含有目的核酸,否则待测溶液中不含有目的核酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910505357.8A CN110205236A (zh) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910505357.8A CN110205236A (zh) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110205236A true CN110205236A (zh) | 2019-09-06 |
Family
ID=67792175
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910505357.8A Pending CN110205236A (zh) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110205236A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112266971A (zh) * | 2020-09-25 | 2021-01-26 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | Raa荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针、试剂盒及方法 |
CN114720653A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-07-08 | 武汉正元环境科技股份有限公司 | 基于微流控制芯片的水质检测方法及装置 |
Citations (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060252058A1 (en) * | 2004-03-18 | 2006-11-09 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Chip for detection of nucleic acid |
CN103131778A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-05 | 内蒙古农牧业科学院 | 一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法 |
CN103389303A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-13 | 苏州扬清芯片科技有限公司 | 一种多指标分析纸芯片及其制备方法 |
US20150110689A1 (en) * | 2012-05-02 | 2015-04-23 | Industry-University Cooperation Foundation Sogang University | Method for manufacturing modular microfluidic paper chips using inkjet printing |
CN105203535A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-30 | 济南大学 | 一种纸基可视化分子印迹生物传感器检测农药残留的方法 |
US20160008809A1 (en) * | 2014-07-10 | 2016-01-14 | University Of Texas At El Paso | Methods and compositions for paper-based and hybrid microfluidic devices integrated with nucleic acid amplification for disease diagnosis |
CN205528801U (zh) * | 2016-01-31 | 2016-08-31 | 苏州博尔达生物科技有限公司 | 一种微流控器件和液滴检测系统 |
CN106018373A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 济南大学 | 三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及atp检测 |
CN205741047U (zh) * | 2016-01-31 | 2016-11-30 | 苏州博尔达生物科技有限公司 | 一种离心式微流体芯片及病菌检测系统 |
CN106353287A (zh) * | 2016-08-25 | 2017-01-25 | 济南大学 | 癌细胞内过氧化氢检测比色/荧光纸芯片的制备 |
CN106442516A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-02-22 | 复旦大学 | 一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法 |
CN107099613A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-08-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法 |
CN107354224A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-11-17 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法 |
CN107589113A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-01-16 | 济南大学 | 一种纸基双模式检测铅离子的方法 |
CN108918872A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-11-30 | 济南大学 | 一种检测凝血酶的纸基光致电化学免疫传感器的构建方法 |
CN108949916A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-07 | 华中农业大学 | 油菜黑胫病菌特异性序列及lamp检测引物和应用 |
CN109055501A (zh) * | 2018-10-19 | 2018-12-21 | 浙江省农业科学院 | 一种检测转基因大豆gst40-3-2的引物、探针及试剂盒和方法 |
CN109136340A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-01-04 | 浙江省农业科学院 | 一种检测转基因油菜Oxy-235的引物、探针及试剂盒和方法 |
CN109161585A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-01-08 | 浙江省农业科学院 | 一种检测转基因玉米mir604的引物、探针及试剂盒和方法 |
CN109477133A (zh) * | 2016-06-09 | 2019-03-15 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于纸基免疫测定的生物标志物浓缩和信号放大以及用于提取、浓缩和扩增dna的单一平台 |
CN109628557A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-16 | 济南大学 | 双重信号增强纸基生物传感器在miRNA检测中的应用 |
CN109666760A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-04-23 | 华中农业大学 | 油菜黑胫病菌加拿大亚种Lbc的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用 |
-
2019
- 2019-06-12 CN CN201910505357.8A patent/CN110205236A/zh active Pending
Patent Citations (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060252058A1 (en) * | 2004-03-18 | 2006-11-09 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Chip for detection of nucleic acid |
US20150110689A1 (en) * | 2012-05-02 | 2015-04-23 | Industry-University Cooperation Foundation Sogang University | Method for manufacturing modular microfluidic paper chips using inkjet printing |
CN103131778A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-05 | 内蒙古农牧业科学院 | 一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法 |
CN103389303A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-13 | 苏州扬清芯片科技有限公司 | 一种多指标分析纸芯片及其制备方法 |
US20160008809A1 (en) * | 2014-07-10 | 2016-01-14 | University Of Texas At El Paso | Methods and compositions for paper-based and hybrid microfluidic devices integrated with nucleic acid amplification for disease diagnosis |
CN105203535A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-30 | 济南大学 | 一种纸基可视化分子印迹生物传感器检测农药残留的方法 |
CN205528801U (zh) * | 2016-01-31 | 2016-08-31 | 苏州博尔达生物科技有限公司 | 一种微流控器件和液滴检测系统 |
CN205741047U (zh) * | 2016-01-31 | 2016-11-30 | 苏州博尔达生物科技有限公司 | 一种离心式微流体芯片及病菌检测系统 |
CN109477133A (zh) * | 2016-06-09 | 2019-03-15 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于纸基免疫测定的生物标志物浓缩和信号放大以及用于提取、浓缩和扩增dna的单一平台 |
CN106018373A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 济南大学 | 三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及atp检测 |
CN106353287A (zh) * | 2016-08-25 | 2017-01-25 | 济南大学 | 癌细胞内过氧化氢检测比色/荧光纸芯片的制备 |
CN106442516A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-02-22 | 复旦大学 | 一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法 |
CN107099613A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-08-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法 |
CN107354224A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-11-17 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法 |
CN107589113A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-01-16 | 济南大学 | 一种纸基双模式检测铅离子的方法 |
CN108918872A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-11-30 | 济南大学 | 一种检测凝血酶的纸基光致电化学免疫传感器的构建方法 |
CN108949916A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-07 | 华中农业大学 | 油菜黑胫病菌特异性序列及lamp检测引物和应用 |
CN109055501A (zh) * | 2018-10-19 | 2018-12-21 | 浙江省农业科学院 | 一种检测转基因大豆gst40-3-2的引物、探针及试剂盒和方法 |
CN109136340A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-01-04 | 浙江省农业科学院 | 一种检测转基因油菜Oxy-235的引物、探针及试剂盒和方法 |
CN109161585A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-01-08 | 浙江省农业科学院 | 一种检测转基因玉米mir604的引物、探针及试剂盒和方法 |
CN109628557A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-16 | 济南大学 | 双重信号增强纸基生物传感器在miRNA检测中的应用 |
CN109666760A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-04-23 | 华中农业大学 | 油菜黑胫病菌加拿大亚种Lbc的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用 |
Non-Patent Citations (11)
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112266971A (zh) * | 2020-09-25 | 2021-01-26 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | Raa荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针、试剂盒及方法 |
CN114720653A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-07-08 | 武汉正元环境科技股份有限公司 | 基于微流控制芯片的水质检测方法及装置 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1851337B1 (en) | Dna purification and analysis on nanoengineered surfaces | |
CN102373273B (zh) | 一种结核分枝杆菌核酸的检测试剂盒 | |
US20170304816A1 (en) | Simplified device for nucleic acid amplification adn method for using same | |
CN112094948B (zh) | 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒 | |
CN110205236A (zh) | 一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片 | |
CN105199940A (zh) | 一种防污染便携式基因检测方法及装置 | |
CN107619775A (zh) | 一种适用于pcr层析法的便携式核酸检测平台 | |
CN108588277A (zh) | 一种犬瘟热病毒可视化核酸检测方法 | |
CN105181981A (zh) | 一种应用于快速现场高灵敏定量检测的方法 | |
CN102827933B (zh) | 一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法 | |
CN107974514A (zh) | 一种用于猪a型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用 | |
CN106442516B (zh) | 一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法 | |
CN107513494A (zh) | 一种核酸检测卡及其使用方法 | |
CN104561375A (zh) | 一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
CN101705300B (zh) | 鉴定马尔尼菲青霉菌的专用探针与基因芯片 | |
CN105331718A (zh) | 检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒 | |
WO2022236193A2 (en) | Viral variant detection | |
CN104313179A (zh) | 一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
CN105861750A (zh) | 一种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因芯片及试剂盒 | |
CN106086166A (zh) | 检测石蜡切片dna质量的试剂及其制备方法与应用 | |
CN103525946B (zh) | 人季节性流感病毒H1N1(HuH1N1)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
CN203569116U (zh) | 多重pcr检测试剂盒 | |
Planchais et al. | Protocols for studying protein stability in an Arabidopsis protoplast transient expression system | |
CN105296643A (zh) | 一种鸭肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
CN108728579A (zh) | 一种采用植物微组织直接rt-pcr检测多种植物病毒的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190906 |