CN109477133A - 用于纸基免疫测定的生物标志物浓缩和信号放大以及用于提取、浓缩和扩增dna的单一平台 - Google Patents

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Abstract

在各种实施方案中，提供了用于检测和/或量化分析物的方法和装置。在某些实施方案中，提供了一种装置，所述装置包括：包含混合相溶液的双水相体系(ATPS)，所述混合相溶液分离成第一相溶液和第二相，其中在使用中，所述第一相溶液成为前导相并且所述第二相溶液成为滞后相；侧流测定(LFA)；以及探针和/或显色试剂，其中在使用中，所述探针与所述ATPS的所述前导相中的所述第一相溶液缔合和/或所述显色试剂与所述ATPS的所述滞后相中的所述第二相溶液缔合。在某些实施方案中，提供了利用例如ATPS和等温扩增试剂来纯化和扩增核酸的“一锅法”体系。

Description

用于纸基免疫测定的生物标志物浓缩和信号放大以及用于提 取、浓缩和扩增DNA的单一平台
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月9日提交的USSN 62/348,038的权益和优先权，该文献全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
政府支持声明
[不适用]
背景技术
已经使用多种测定法来检测生物流体中各种物质或病原体的存在或浓度。在固相免疫测定中，将受体(通常是对于待检测的配体具有特异性的抗体)固定在固体载体上。将可包含待检测分析物的测试流体与固体载体接触，并且当存在目标分析物时形成受体-分析物对。为了使受体-配体对可见，可使用与受体-配体对结合的标记的抗体，然后目视检测与受体-配体对结合的标记的抗体。
大多数商业化护理点(point-of-care)诊断装置采用侧流免疫测定(LFA)，这是因为侧流免疫测定具有低成本和简便性。在典型的所谓的侧流测定中，将可能含有待检测分析物的流体施加到多孔膜层的一端，并且在毛细管力的作用下沿侧向方向流过膜，以便被能够结合待检测分析物的固定“受体”捕获。LFA通常结合所谓的夹心免疫测定，在夹心免疫测定中，分析物被夹在标记的抗体与固定于固体载体上的抗体之间。
然而，与基于实验室的测定(例如，ELISA)相比，LFA的灵敏度较差。虽然已经为提高LFA灵敏度作出了很多努力，但这些方法中的许多方法依赖于使用昂贵的电子读取器或者需要多个用户步骤，这减损了LFA的护理点性质。
类似地，虽然已在设计用于DNA检测的护理点友好核酸扩增测试(NAAT)方面作出很多努力，但这些测试通常由于过度简化而缺乏灵敏度，或者为了保持测试准确性而牺牲了易用性。此外，当前护理点(POC)NAAT仍然通常需要设备来分析和处理样品。因此，没有完全独立或便携的商业化POC NAAT。
发明内容
本文设想的各种实施方案可包括但不必限于下列中的一种或多种：
实施方案1：一种用于检测和/或量化样品中的分析物的装置，所述装置包括：
包含混合相溶液的双水相体系(ATPS)，所述混合相溶液分离成第一相溶液和第二相，其中在使用中，所述第一相溶液成为前导相并且所述第二相溶液成为滞后相；
侧流测定(LFA)或流通测定；以及
探针和/或显色试剂，其中在使用中，所述探针与所述ATPS的所述前导相中的所述第一相溶液缔合和/或所述显色试剂与所述ATPS的所述滞后相中的所述第二相溶液缔合。
实施方案2：根据实施方案1所述的装置，其中所述LFA包含多孔基质，所述多孔基质被构造成接纳和/或包含所述ATPS或其组分和/或所述探针、和/或所述显色试剂。
实施方案3：根据实施方案1至2中任一项所述的装置，其中所述LFA包括缀合垫、包含结合所述分析物的抗体的测试线、任选的包含二级抗体的对照线、任选的吸收垫以及任选的样品垫。
实施方案4：一种用于检测和/或量化样品中的分析物的装置，所述装置包括：
流通系统，所述流通系统包括：
浓缩部件，所述浓缩部件包括含有混合相溶液的双水相体系(ATPS)，其中在使用中，所述第一相溶液成为前导相并且所述第二相溶液成为滞后相；
探针和/或显色试剂，其中在使用中，所述探针与所述ATPS的所述前导相中的所述第一相溶液缔合和/或所述显色试剂与所述ATPS的所述滞后相中的所述第二相溶液缔合；以及
检测部件，所述检测部件设置在所述浓缩部件下方。
实施方案5：根据实施方案4所述的装置，其中所述浓缩部件包括一层或多层纸。
实施方案6：根据实施方案4至5中任一项所述的装置，其中所述检测部件包括缀合垫、反应垫和任选的槽。
实施方案7：根据实施方案1至6中任一项所述的装置，其中所述探针设置在所述ATPS中。
实施方案8：根据实施方案7所述的装置，其中所述探针与所述ATPS的所述第一相溶液缔合。
实施方案9：根据实施方案1至8中任一项所述的装置，其中所述显色试剂设置在所述ATPS中。
实施方案10：根据实施方案9所述的装置，其中所述显色试剂与所述ATPS的所述第二相溶液缔合。
实施方案11：根据实施方案1至10中任一项所述的装置，其中所述装置被配置用于使所述ATPS在施加到所述装置之前与所述样品组合。
实施方案12：根据实施方案1至11中任一项所述的装置，其中在所述装置与所述样品接触之前，所述ATPS在所述侧流测定上或在流通测定的浓缩部件中脱水。
实施方案13：根据实施方案12所述的装置，其中在所述装置与所述样品接触之前，所述探针在所述侧流测定上或在流通测定的浓缩部件中脱水。
实施方案14：根据实施方案12至13中任一项所述的装置，其中在所述装置与所述样品接触之前，所述显色试剂在所述侧流测定上或在流通测定的浓缩部件中脱水。
实施方案15：根据实施方案12至14中任一项所述的装置，其中ATPS包含混合相溶液，所述混合相溶液在所述装置与所述样品接触之后分离成第一相溶液和第二相溶液。
实施方案16：根据实施方案1至15中任一项所述的装置，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
实施方案17：根据实施方案1至15中任一项所述的装置，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
实施方案18：根据实施方案1至17中任一项所述的装置，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
实施方案19：根据实施方案1至17中任一项所述的装置，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
实施方案20：根据实施方案1至19中任一项所述的装置，其中所述ATPS选自聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS。
实施方案21：根据实施方案20所述的装置，其中所述ATPS的第一相溶液包含表1的组分1。
实施方案22：根据实施方案20所述的装置，其中所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
实施方案23：根据实施方案20所述的装置，其中所述ATPS的第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
实施方案24：根据实施方案20所述的装置，其中所述ATPS是聚合物/盐ATPS。
实施方案25：根据实施方案24所述的装置，其中所述ATPS是PEG/盐ATPS。
实施方案26：根据实施方案24至25中任一项所述的装置，其中所述探针分配到所述聚合物/盐ATPS的富盐相中，并且所述显色试剂分配到所述聚合物/盐ATPS的富聚合物相中。
实施方案27：根据实施方案20所述的装置，其中所述ATPS是胶束ATPS。
实施方案28：根据实施方案27所述的装置，其中所述探针分配到所述ATPS的贫胶束相中，并且所述显色试剂分配到所述ATPS的富胶束相中。
实施方案29：根据实施方案1至28中任一项所述的装置，其中所述探针包含结合至所述目标分析物的结合部分。
实施方案30：根据实施方案29所述的装置，其中所述目标分析物包含选自蛋白质、核酸、糖或凝集素的部分以及微生物。
实施方案31：根据实施方案30所述的装置，其中所述目标分析物包含选自细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类的微生物。
实施方案32：根据实施方案30所述的装置，其中所述目标分析物包含微生物的生物标志物。
实施方案33：根据实施方案32所述的装置，其中所述目标分析物包含选自细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类的微生物的生物标志物。
实施方案34：根据实施方案32所述的装置，其中所述目标分析物包含疾病状况的生物标志物、食品安全(或危害)的生物标志物或生物恐怖剂的生物标志物。
实施方案35：根据实施方案29至34中任一项所述的方法，其中所述结合部分选自抗体或抗体片段、凝集素、核酸和适体。
实施方案36：根据实施方案35所述的装置，其中所述探针包含抗体或抗体片段。
实施方案37：根据实施方案1至36中任一项所述的装置，其中所述探针包含选自合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物和塑料的材料。
实施方案38：根据实施方案37所述的装置，其中所述探针包含选自聚乙烯、聚丙烯、纤维素、几丁质、尼龙、聚甲醛、聚四氟乙烯、或聚氯乙烯、葡聚糖、聚丙烯、或聚乙二醇的材料。
实施方案39：根据实施方案37所述的装置，其中所述探针包含选自金、银、铁、铂、钯、铈和钛的金属。
实施方案40：根据实施方案1至39中任一项所述的装置，其中所述探针包含纳米颗粒。
实施方案41：根据实施方案1至40中任一项所述的装置，其中所述探针包含可与所述显色试剂反应以产生可检测信号的试剂。
实施方案42：根据实施方案41所述的装置，其中所述试剂包含与底物反应以形成强可见信号的酶。
实施方案43：根据实施方案42所述的装置，其中所述显色试剂包含所述底物。
实施方案44：根据实施方案42所述的装置，其中所述显色试剂包含结合所述酶的抗体。
实施方案45：根据实施方案41所述的装置，其中所述试剂包含与酶反应以形成强可见产物的底物。
实施方案46：根据实施方案45所述的装置，其中所述显色试剂包含所述酶。
实施方案47：根据实施方案42和46中任一项所述的装置，其中所述酶选自碱性磷酸酶、辣根(或其他)过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。
实施方案48：根据实施方案1至47中任一项所述的装置，其中所述探针包含对所述ATPS的所述第一相溶液或所述第二相溶液具有亲和力的涂层。
实施方案49：根据实施方案48所述的装置，其中所述涂层包含选自聚丙二醇、聚乙二醇、葡聚糖、亲水性蛋白和疏水性蛋白的材料。
实施方案50：根据实施方案1至49中任一项所述的装置，其中所述装置包括两种或更多种探针，每种探针与不同的分析物相互作用。
实施方案51：根据实施方案50所述的装置，其中所述装置包括至少两种不同的探针、或至少3种不同的探针、或至少4种不同的探针、或至少5种不同的探针、或至少7种不同的探针、或至少10种不同的探针、或至少15种不同的探针、或至少20种不同的探针。
实施方案52：根据实施方案1至51中任一项所述的装置，其中所述装置被配置成执行夹心测定。
实施方案53：一种双水相体系(ATPS)，包含：
混合相溶液，所述混合相溶液分离成第一相溶液和第二相，其中，在LFA或其他多孔介质中使用时，所述第一相溶液成为前导相并且所述第二相溶液成为滞后相；以及
探针和/或显色试剂，所述探针与所述第一相溶液缔合，并且所述显色试剂与所述第二相溶液缔合。
实施方案54：根据实施方案53所述的双水相体系，其中所述ATPS选自聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS。
实施方案55：根据实施方案54所述的双水相体系，其中所述ATPS的第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
实施方案56：根据实施方案54所述的双水相体系，其中所述ATPS是聚合物/盐ATPS。
实施方案57：根据实施方案56所述的双水相体系，其中所述ATPS是PEG/盐ATPS。
实施方案58：根据实施方案56至57中任一项所述的双水相体系，其中所述探针分配到所述聚合物/盐ATPS的富盐相中，并且所述显色试剂分配到所述聚合物/盐ATPS的富聚合物相中。
实施方案59：根据实施方案54所述的双水相体系，其中所述ATPS是胶束ATPS。
实施方案60：根据实施方案59所述的双水相体系，其中所述探针分配到所述ATPS的贫胶束相中，并且所述显色试剂分配到所述ATPS的富胶束相中。
实施方案61：根据实施方案1至60中任一项所述的双水相体系，其中所述探针包含结合至所述目标分析物的结合部分。
实施方案62：根据实施方案1至61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在多孔介质中。
实施方案63：根据实施方案1至61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在纸中。
实施方案64：根据实施方案1至61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在侧流测定(LFA)中。
实施方案65：根据实施方案1至61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在流通系统中。
实施方案66：一种检测和/或量化分析物的方法，所述方法包括：
将样品施加到双水相体系(ATPS)中以使若存在于所述样品中的所述分析物浓缩到所述ATPS的一个相中，从而提供含有分析物的相；
将所述含有分析物的相施加到侧流测定(LFA)或流通测定中，其中检测探针在所述LFA或流通测定中结合所述分析物；
将显色试剂施加到所述LFA或流通测定中，以增强由所述检测探针产生的信号；以及
检测和/或量化所述信号以指示所述样品中所述分析物的存在和/或量。
实施方案67：根据实施方案66所述的方法，其中所述侧流测定或流通测定是侧流测定。
实施方案68：根据实施方案66所述的方法，其中所述侧流测定或流通测定是流通测定。
实施方案69：根据实施方案66至68中任一项所述的方法，其中所述ATPS施加到纸上，并且当所述ATPS流过所述纸时相分离，从而提供“流动时浓缩的”ATPS。
实施方案70：根据实施方案69所述的方法，其中当施加到纸上时，所述ATPS产生更具疏水性的前导相和更具亲水性的滞后相。
实施方案71：根据实施方案69所述的方法，其中当施加到纸上时，所述ATPS产生更具亲水性的前导相和更具疏水性的滞后相。
实施方案72：根据实施方案66至71中任一项所述的方法，其中所述LFA或流通测定是其中结合部分捕获所述分析物并且其中所述检测探针结合所述捕获的分析物的测定。
实施方案73：根据实施方案66至72中任一项所述的方法，其中从所述ATPS手动地或机械地移除所述含有分析物的相，然后将其施加到所述侧流测定。
实施方案74：根据实施方案73所述的方法，其中提供所述检测探针作为所述LFA或流通测定的组分。
实施方案75：根据实施方案73至74中任一项所述的方法，其中随后将所述显色试剂独立于所述ATPS而施加到所述侧流测定。
实施方案76：根据实施方案66至72中任一项所述的方法，其中所述探针和所述显色试剂均施加到所述ATPS上或提供于所述ATPS中，并且所述ATPS的所述组分被选择为基本上将所述探针分配到所述ATPS的第一相中，并且将所述显色试剂分配到所述ATPS的第二相中。
实施方案77：根据实施方案76所述的方法，其中当施加到纸基质上时，所述ATPS形成前导相和滞后相，并且所述前导相将所述浓缩分析物和所述探针递送至LFA测试条或流通测定，然后所述滞后相稍后将所述显色试剂递送至所述测试条或流通测定。
实施方案78：根据实施方案76至77中任一项所述的方法，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
实施方案79：根据实施方案76至77中任一项所述的方法，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
实施方案80：根据实施方案76至79中任一项所述的方法，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
实施方案81：根据实施方案76至79中任一项所述的方法，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
实施方案82：根据实施方案66至81中任一项所述的方法，其中所述ATPS选自聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS。
实施方案83：根据实施方案82所述的方法，其中所述ATPS的所述第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
实施方案84：根据实施方案82所述的方法，其中所述ATPS是聚合物/盐ATPS。
实施方案85：根据实施方案84所述的方法，其中所述ATPS是PEG/盐ATPS。
实施方案86：根据实施方案84至85中任一项所述的方法，其中所述探针分配到所述聚合物/盐ATPS的富盐相中，并且所述显色试剂分配到所述聚合物/盐ATPS的富聚合物相中。
实施方案87：根据实施方案82所述的方法，其中所述ATPS是胶束ATPS。
实施方案88：根据实施方案87所述的方法，其中所述探针分配到所述ATPS的贫胶束相中，并且所述显色试剂分配到所述ATPS的富胶束相中。
实施方案89：根据实施方案66至88中任一项所述的方法，其中所述探针包含结合至所述目标分析物的结合部分。
实施方案90：根据实施方案89所述的方法，其中所述目标分析物包含选自蛋白质、核酸、糖或凝集素的部分以及微生物。
实施方案91：根据实施方案90所述的方法，其中所述目标分析物包含选自细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类的微生物。
实施方案92：根据实施方案90所述的方法，其中所述目标分析物包含微生物的生物标志物。
实施方案93：根据实施方案92所述的方法，其中所述目标分析物包含选自细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类的微生物的生物标志物。
实施方案94：根据实施方案89至92中任一项所述的方法，其中所述结合部分选自抗体或抗体片段、凝集素、核酸和适体。
实施方案95：根据实施方案94所述的方法，其中所述探针包含抗体或抗体片段。
实施方案96：根据实施方案66至95中任一项所述的方法，其中所述探针包含选自合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物和塑料的材料。
实施方案97：根据实施方案96所述的方法，其中所述探针包含选自聚乙烯、聚丙烯、纤维素、几丁质、尼龙、聚甲醛、聚四氟乙烯、或聚氯乙烯、葡聚糖、聚丙烯、或聚乙二醇的材料。
实施方案98：根据实施方案96所述的方法，其中所述探针包含选自金、银、铁、铂、钯、铈和钛的金属。
实施方案99：根据实施方案66至98中任一项所述的装置，其中所述探针包含纳米颗粒。
实施方案100：根据实施方案66至99中任一项所述的方法，其中所述探针包含可与所述显色试剂反应以产生可检测信号的试剂。
实施方案101：根据实施方案100所述的方法，其中所述试剂包含与底物反应以形成强可见信号的酶。
实施方案102：根据实施方案101所述的方法，其中所述显色试剂包含所述底物。
实施方案103：根据实施方案101所述的方法，其中所述显色试剂包含结合所述酶的抗体。
实施方案104：根据实施方案100所述的方法，其中所述试剂包含与酶反应以形成强可见产物的底物。
实施方案105：根据实施方案104所述的方法，其中所述显色试剂包含所述酶。
实施方案106：根据实施方案101和105中任一项所述的方法，其中所述酶选自碱性磷酸酶、辣根(或其他)过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。
实施方案107：根据实施方案66至106中任一项所述的装置，其中所述探针包含对所述ATPS的所述第一相溶液或所述第二相溶液具有亲和力的涂层。
实施方案108：根据实施方案107所述的装置，其中所述涂层包含选自聚丙二醇、聚乙二醇、葡聚糖、亲水性蛋白和疏水性蛋白的材料。
实施方案109：根据实施方案66至108中任一项所述的方法，其中所述方法使用根据实施方案1至52中任一项所述的装置进行。
实施方案110：一种用于检测和/或量化分析物的试剂盒，所述试剂盒包含：根据实施方案1至52中任一项所述的装置；以及用于收集样品的收集装置。
实施方案111：根据实施方案110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于收集口腔液的装置。
实施方案112：根据实施方案110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于收集血液的装置。
实施方案113：根据实施方案110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括尿液收集装置。
实施方案114：根据实施方案110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于收集阴道液或子宫颈内拭子的装置。
实施方案115：根据实施方案110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于环境样品的装置。
实施方案116：一种纯化和扩增核酸的方法，所述方法包括：提供包含混合相溶液的双水相体系(ATPS)，所述混合相溶液分离成第一相溶液和第二相溶液，其中所述ATPS是核酸将分配到所述第一相溶液或所述第二相溶液中的ATPS，或者所述ATPS是核酸将定位于所述第一相溶液与所述第二相溶液之间的界面中的ATPS；将包含核酸的样品引入所述ATPS中，其中所述核酸分配到所述第一相溶液或所述第二相溶液或所述第一相溶液与所述第二相溶液之间的所述界面中，从而得到浓缩核酸；以及在核酸扩增反应中扩增所述浓缩核酸以产生扩增的核酸。
实施方案117：根据实施方案116所述的方法，其中所述核酸是DNA。
实施方案118：根据实施方案116所述的方法，其中所述核酸是RNA。
实施方案119：根据实施方案116所述的方法，其中所述核酸是从RNA逆转录的DNA。
实施方案120：根据实施方案116至119中任一项所述的方法，其中所述ATPS选自聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS。
实施方案121：根据实施方案120所述的方法，其中所述ATPS的所述第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
实施方案122：根据实施方案116至121中任一项所述的方法，其中所述扩增包括：从所述第一相回收所述浓缩核酸，方法包括从所述第一相溶液或所述第二相溶液或所述第一相溶液与所述第二相溶液之间的所述界面回收所述核酸，从而得到回收的浓缩核酸；以及将所述回收的浓缩核酸引入核酸扩增反应中以扩增所述核酸。
实施方案123：根据实施方案122所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)反应体系。
实施方案124：根据实施方案122所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括等温扩增体系。
实施方案125：根据实施方案124所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括选自自持序列反应(3SR)、基于核酸的转录测定(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、茎环扩增、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、等温多重置换扩增(IMDA)、单引物等温扩增(SPIA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)的扩增体系。
实施方案126：根据实施方案116至121中任一项所述的方法，其中所述扩增包括将用于等温核酸扩增的试剂与所述ATPS组合。
实施方案127：根据实施方案126所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括等温扩增体系。
实施方案128：根据实施方案127所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括选自自持序列反应(3SR)、基于核酸的转录测定(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、茎环扩增、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、等温多重置换扩增(IMDA)、单引物等温扩增(SPIA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)的扩增体系。
实施方案129：根据实施方案127至128中任一项所述的方法，其中所述方法包括在室温下或在低于室温的温度下进行所述等温扩增。
实施方案130：根据实施方案127至128中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包含用于等温扩增的试剂的所述ATPS加热至基本上恒定的温度。
实施方案131：根据实施方案127至130中任一项所述的方法，其中所述扩增包括解旋酶依赖性扩增，并且在约65℃的恒定温度下进行。
实施方案132：根据实施方案126至131中任一项所述的方法，其中所述方法在单个容器中进行。
实施方案133：根据实施方案126至131中任一项所述的方法，其中对多个核酸样品进行所述方法，且不同的样品各置于多孔板的孔中。
实施方案134：根据实施方案133所述的方法，其中所述多个样品包括至少2个样品、或至少4个样品、或至少8个样品、或至少16个样品、或至少32个样品、或至少64个样品、或至少128个样品。
实施方案135：根据实施方案126至131中任一项所述的方法，其中所述方法在微流体系统(例如，芯片实验室)的腔室或通道中进行。
实施方案136：根据实施方案116至135中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞裂解物。
实施方案137：根据实施方案116至135中任一项所述的方法，其中所述样品是核酸。
实施方案138：根据实施方案116至135中任一项所述的方法，其中所述样品包含完整细胞，并且所述ATPS是裂解细胞的ATPS。
实施方案139：根据实施方案116至138中任一项所述的方法，其中所述ATPS是胶束ATPS。
实施方案140：根据实施方案116至138中任一项所述的方法，其中所述样品包含血液或血斑，并且所述ATPS是重新溶解血斑的ATPS。
实施方案141：根据实施方案140所述的方法，其中所述ATPS包含PEG/葡聚糖ATPS。
实施方案142：根据实施方案140所述的方法，其中所述ATPS包含UCON/葡聚糖ATPS。
实施方案143：一种用于纯化和扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
包含双水相体系(ATPS)的组分的容器；以及
包含等温核酸扩增体系的一种或多种组分的容器。
实施方案144：根据实施方案143所述的试剂盒，其中包含ATPS组分的所述容器和包含等温核酸扩增体系组分的所述容器是同一容器。
实施方案145：根据实施方案143所述的试剂盒，其中包含ATPS组分的所述容器和包含等温核酸扩增体系组分的所述容器是不同容器。
实施方案146：根据实施方案143至145中任一项所述的试剂盒，其中包含等温核酸扩增体系的一种或多种组分的所述容器包含选自自持序列反应(3SR)、基于核酸的转录测定(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、茎环扩增、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、等温多重置换扩增(IMDA)、单引物等温扩增(SPIA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)的扩增体系的一种或多种组分。
实施方案147：根据实施方案146所述的试剂盒，其中所述一种或多种组分包含进行所述核酸扩增反应的酶。
实施方案148：根据实施方案146所述的试剂盒，其中所述一种或多种组分包括解旋酶。
实施方案149：根据实施方案143至148中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS选自聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS。
实施方案150：根据实施方案149所述的试剂盒，其中所述ATPS的所述第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
实施方案151：根据实施方案143至149中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS包含胶束ATPS。
实施方案152：根据实施方案143至149中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS包含PEG/葡聚糖ATPS。
实施方案153：根据实施方案143至149中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS包含UCON/葡聚糖ATPS。
实施方案154：根据实施方案143至153中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含说明材料，所述说明材料提供用于执行根据实施方案126至142中任一项所述的方法的方案。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
本文中的术语“核酸”或“寡核苷酸”或语法等同物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸优选地为单链或双链的，并且通常将含有磷酸二酯键，但在一些情况下，如下所述，包含可具有交替主链的核酸类似物，包括例如磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron 49(10):1925及其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35:3800；Sprinzl等人(1977)Eur.J.Biochem.81:579；Letsinger等人(1986)Nucl.AcidsRes.14:3487；Sawai等人(1984)Chem.Lett.805，Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470；以及Pauwels等人(1986)Chemica Scripta 26:141 9)、硫代磷酸酯(Mag等人(1991)Nucleic Acids Res.19:1437；以及美国专利No.5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321)、O-甲基亚氨基磷酸酯(O-methylphophoroamidite)键(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,Oxford University Press)以及肽核酸主链和连接(参见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895；Meier等人(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31:1008；Nielsen(1993)Nature,365:566；Carlsson等人(1996)Nature 380:207)。其他类似核酸包括具有正电荷主链(positive backbone)(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097；非离子主链(美国专利No.5,386,023、No.5,637,684、No.5,602,240、No.5,216,141和No.4,469,863；Angew.(1991)Chem.Intl.Ed.English 30:423；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470；Letsinger等人(1994)Nucleoside&Nucleotide 13:1597；ASCSymposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research"，第2章和第3章，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编辑；Mesmaeker等人(1994),Bioorganic&MedicinalChem.Lett.4:395；Jeffs等人(1994)J.Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非核糖主链的核酸，包括美国专利No.5,235,033和No.5,034,506，以及ASCSymposium Series 580,Carbohydrate Modifications in Antisense Research，第6章和第7章，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编辑中所述的那些。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(参见Jenkins等人(1995),Chem.Soc.Rev，第169-176页)。若干核酸类似物在Rawls,C&E News，1997年6月2日第35页中有所描述。可以进行核糖-磷酸主链的这些修饰以促进额外部分(例如，标记)的添加，或增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。此外，本发明的核酸也可以是三链的。
如本文所用，“抗体”是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其又分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每个链的N-末端限定约100个至110个或更多个氨基酸的可变区，该可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体以完整的免疫球蛋白或以通过用各种肽酶消化产生的多个充分表征的片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下消化抗体以产生F(ab)'2，即Fab的二聚体，其本身是通过二硫键接合至VH-CH1的轻链。F(ab)'2可在温和条件下还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将(Fab')2二聚体转化成Fab'单体。Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab(关于其他抗体片段的更详细描述，参见Fundamental Immunology，W.E.Paul编辑，Raven Press,N.Y.(1993))。虽然各种抗体片段是根据完整抗体的消化进行的定义，但技术人员将会知道，此类Fab'片段可以通过化学方法或利用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用的术语抗体还包括通过修饰整个抗体产生的抗体片段或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。优选的抗体包括单链抗体(以单个多肽链形式存在的抗体)，更优选单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变重链和可变轻链接合在一起(直接或通过肽接头)以形成连续多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-VL异源二聚体，其可以由包括直接接合或通过肽编码接头接合的VH-和VL-编码序列的核酸表达。Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883。虽然VH和VL彼此连接成单个多肽链，但VH和VL结构域非共价缔合。在丝状噬菌体表面上表达的第一个功能性抗体分子是单链Fv's(scFv)，然而，替代性表达策略也已获得成功。例如，如果其中一个链(重链或轻链)与g3衣壳蛋白融合且互补链作为可溶性分子输出到周质，那么可以在噬菌体上展示Fab分子。这两条链可以在相同或不同的复制子上编码；重要的是，每个Fab分子中的两个抗体链在翻译后组装，并且通过将一个链连接到例如g3p，将二聚体掺入噬菌体颗粒中(参见例如美国专利No:5733743)。scFv抗体以及将天然聚集但化学上分离的轻多肽链和重多肽链从抗体V区转化为折叠成基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构的分子的许多其他结构是本领域的技术人员已知的(参见例如美国专利No.5,091,513、No.5,132,405和No.4,956,778)。特别优选的抗体应包括已在噬菌体上展示的所有抗体(例如，scFv、Fv、Fab和二硫键连接的Fv(Reiter等人(1995)Protein Eng.8:1323-1331)。
适体是由核酸形成的抗体类似物。适体酶是由核酸形成的酶类似物。具体地讲，仅在存在第二种特异性分析物的情况下，适体酶可用于改变构型以捕获特定分子。在一些将直接检测重构的测定(例如，纳米CHEM-FET)中，适体甚至可能不需要结合待检测的第一标记。
术语“结合部分”或“结合对”的成员是指特异性结合其他分子、细胞、微生物等以形成结合复合物的分子，所述结合复合物诸如抗体-抗原、凝集素-碳水化合物、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白等。“此类结合部分包括但不限于单体或聚合核酸、适体、适体酶、蛋白质、多糖、糖、凝集素等(参见例如Haugland,"Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals"(第六版))，以及能够形成如上所述的结合对的任何分子。
短语“特异性结合”表示分子优先结合感兴趣的靶标或以高于其他分子的亲和力结合靶标(分析物)。例如，抗体将选择性地结合使其产生的抗原。DNA分子将在严格条件下与基本上互补的序列结合，而不与不相关的序列结合。特异性结合可以指能够确定异源分子群体(例如，蛋白质和其他生物制剂)中靶标的存在的结合反应。因此，在指定条件(例如，就抗体而言的免疫测定条件或就核酸而言的严格杂交条件)下，特异性配体或抗体与其特定“靶标”分子结合并且不以显著量结合样品中存在的其他分子。
术语小有机分子是指大小与药物中通常使用的那些有机分子相当的分子。该术语不包括生物大分子(例如，蛋白质、核酸等)。优选的小有机分子的大小高达约5000Da，更优选高达2000Da，最优选高达约1000Da。
术语分析物是指待检测的任何部分。分析物包括但不限于特定生物分子(蛋白质、抗体、核酸)、细菌或其成分、病毒或其成分(例如，衣壳蛋白)、真菌或其成分、原生动物或其成分、药物、毒素、食物病原体等。
如本文所用，术语“纸”不限于来自木材或其他纤维植物物质的浆液的薄片，但在某些实施方案中，可设想在本文所述的装置中使用这种纸。纸更一般地是指允许流体流过的通常为片状的多孔材料，但不限于此。
在一些实施方案中，多孔基质足够多孔以允许双水相体系(ATPS)的混合相溶液(第一相溶液和/或第二相溶液)和/或目标分析物流过LFA。在一些实施方案中，多孔基质足够长和/或足够深以使混合相溶液(第一相溶液和/或第二相溶液)和/或目标分析物垂直和/或水平地流过LFA或斑点测定装置。在一些实施方案中，第一相溶液以第一速率流过多孔基质，第二相溶液以第二速率流过多孔基质，其中第一速率和第二速率不同。在LFA或斑点测定的一些实施方案中，多孔基质尤其包含诸如烧结玻璃陶瓷、矿物、纤维素、玻璃纤维、硝化纤维、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜、它们的组合等材料。
附图说明
图1示出典型的侧流免疫测定测试条(上)和侧流免疫测定的夹心形式(下)的示意图。
图2示意性地示出双水相体系(ATPS)纸上分离与侧流测定(LFA)结合使用以浓缩目标分析物(例如，生物标志物)并递送显色试剂以增强信号的一个实施方案。如图所示，将LFA条浸入含有目标分析物(例如，生物标志物)、探针(例如，比色探针)和一种或多种显色试剂的ATPS溶液(1)中。ATPS将相分离成前导相和滞后相。首先，前导相(2)将一种或多种浓缩的目标分析物(例如，生物标志物)和比色探针递送至检测区域。然后使滞后相(3)流过检测区，以递送显色试剂，从而增强LFA信号。粉红色对应于比色探针，而黄色代表显色试剂。
图3示出极端地分配到PEG盐ATPS的底部富盐相中的ALP-GNP(左)和极端地分配到PEG-盐ATPS的顶部富PEG相中的NBT/BCIP(右)。
图4示出在检测低浓度的模型蛋白质转铁蛋白时，采用新的LFA+ATPS+NBT/BCIP设计与仅采用LFA(左)相比显示出成功的信号增强而无需任何额外的用户步骤。
图5示出PEG-葡聚糖ATPS中血液分配的视觉证明。
图6示出PEG/葡聚糖ATPS中由干血斑洗脱的DNA的浓度。使用Quant-iTTM荧光测定测得的DNA浓度表明，与PEG/葡聚糖ATPS的顶相相比，底相中的DNA浓度显著较高(p<0.01，n＝3)。这些结果显示了在用海藻糖和牛血清白蛋白(BSA)处理过的玻璃纤维纸上制备的来自干血斑(DBS)的DNA洗脱。
图7示出在扩增之前和之后PEG/葡聚糖ATPS的底部富葡聚糖相和UCON/葡聚糖ATPS的两个相中的DNA浓度的比较。在所有测试的相组合物中实现扩增。9:1和1:9比率表示顶相与底相的体积比。
图8示出在存在和不存在ATPS聚合物的情况下DNA的平均qPCR扩增循环数。由报告染料的荧光强度生成水中DNA和PEG/葡聚糖ATPS的底部富葡聚糖相中DNA的扩增曲线(以紫色显示)。图中的绿线表示报告染料的阈值荧光强度。紫色扩增曲线与荧光阈值的交叉处的循环数也称为阈值循环，表示qPCR反应中目标DNA的浓度。用于扩增水中的DNA和扩增PEG/葡聚糖ATPS的富葡聚糖相中的DNA的平均阈值循环数分别为32和31。使用斯氏t检验(student t-test)比较循环数(p<0.01，n＝3)，并且两种方法之间未显示出统计学显著性。
图9示出使用一锅法ATPS和tHDA反应进行的DNA扩增的一个实施方案的示意图。
图10示出一锅法ATPS和tHDA反应与仅tHDA反应的比较。泳道1显示采用仅tHDA使7.7×104个细胞未扩增。泳道2-4显示采用一锅法反应，使用分别含有7.7×104个细胞、1.6×104个细胞和1.7×103个细胞的样品成功扩增100bp目标产物。在泳道5和6中，用102个细胞进行一锅法反应，其中泳道6准确显示100bp目标条带的存在。出现在泳道5和6中的第二条带是当细胞数量下降到低于阈值时进行扩增的非特异性人工副产物。
图11示出用于检测目标分析物(例如，生物分子)的一体化斑点测试的一个示意性实施方案。ATPS组分和比色(或其他)指示剂分别脱水到浓缩部件和缀合垫上。用户可以简单地将样品溶液施加到装置上，之后，将组分再水合且在浓缩部件内进行目标生物分子的浓缩。随后，分析物将与缀合垫上的比色指示剂结合，并且所得的指示剂-靶标复合物将被捕获在反应垫上，如可见斑点所示。
图12示出一锅法体系中三种DNA类型的分配系数。基因组DNA和100bp DNA片段优先分配到顶相，而较小的25bp DNA片段在两个相之间均匀分配。
图13示出采用仅tHDA(左)和一锅法平台(右)的DNA扩增结果。仅tHDA反应成功从含有106cfu/mL大肠杆菌(E.coli)的样品中扩增了DNA，而一锅法平台成功从含有106和105cfu/mL大肠杆菌的样品扩增了DNA。“L”表示含有DNA梯状条带的泳道。
图14示出在3.2ng/μL CT下运行的自动信号增强LFA的时间序列图像。随着时间的推移，测试线和对照线变暗，背景信号最小，表明ATPS能够用于使信号增强反应自动化。
图15示出具有ATPS和信号增强的LFA实现了CT检出限的30倍的提高。常规的LFA检测到10ng/μL的CT，而增强的LFA检测到0.32ng/μL的CT。
具体实施方式
在某些实施方案中，提供了显著提高侧流测定灵敏度的方法和装置。在各种实施方案中，通过整合双水相体系(ATPS)和信号增强反应，LFA(或流通测定)灵敏度显著提高。在某些实施方案中，ATPS起到浓缩目标生物标志物以及跨LFA(或流通测定)检测区顺序递送信号增强试剂的双重作用。这种新颖的技术整合允许在维持单个用户应用步骤和低成本装置的同时提高LFA(或流通测定)灵敏度。
在某些实施方案中，还提供了用于简单且有效的核酸扩增测试(NAAT)的方法和装置。在某些实施方案中，所述方法通过将双水相体系(ATPS)与DNA扩增相结合，大大减少了便携式NAAT的步骤。最终得到将样品制备和DNA扩增结合到一个步骤中的单一平台。尽管进行了简化，但与目前需要多个复杂步骤、设备和训练有素的人员以获得相同结果的NAAT相比，这些测试具有提高的灵敏度和准确性。此外，通过此一步法平台，可以轻松调整参数以扩大其检测各种感染性疾病的应用范围，使其成为适用于发展中国家的真正独立的NAAT诊断。
在某些实施方案中，可以提供本文所述的方法和装置用于临床应用的分析物收集、提取、浓缩和检测。在某些实施方案中，所述方法和设备允许快速检测和/或量化生物样品(例如，口腔液或组织样品、尿液、血液或血液级分、脑脊液、淋巴液、组织活检、阴道样品等)、食物样品、环境样品等中的细菌、真菌和病毒。
在某些实施方案中，本文提供的测定和装置是准确的、灵敏的、便携的、一次性的，并且非常适于在护理点用于现场环境测试、现场食物测试等，而且只需很少的培训或设备。
提高LFA(或流通测定)灵敏度的方法和装置。
在各种实施方案中，ATPS的浓缩能力可以与LFA(或流通测定)结合使用以实现LFA(或流通测定)检出限的显著(例如，10-100倍或更大)提高，以接近基于实验室的测定诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)的灵敏度(参见例如PCT公布No:WO 2015/134938(PCT/US2015/019297)和2015年9月4日提交的共同待决的申请USSN 62/214,801，这两篇申请中公开的方法和装置均以引用方式并入本文。为了将ATPS用于分析物浓缩，通常将感兴趣的样品施加到ATPS中，其中添加的分析物基于各种物理和化学性质(例如，大小和亲水性)分布或分配在两个水相之间。通过大大降低其体积，可以使极端地分配到两相之一的分析物在该相中浓缩。该体系的含水性质还可以为生物分子提供温和的环境，从而稳定其结构和生物活性。
许多蛋白质常常会在ATPS的两个相之间相当均匀地分配，导致浓缩能力差。为了增强ATPS浓缩蛋白质(或其他分析物)的能力，可捕获目标蛋白质(或其他分析物)的各种探针(例如，涂覆有特异于感兴趣靶标的抗体的金纳米探针(GNP))会使蛋白质进入期望的相以进行浓缩，并且可以任选地用作LFA的比色指示剂。另外，ATPS纸上分离提供了一种可以大大增强和加速相分离过程的方法。当将充分混合的ATPS溶液施加到多孔纸上时，它可以在其流过纸时分离成相应的相，其中粘度较低的相是前导相，而粘度较高的相是滞后相。对于PEG-盐ATPS体系，这对应于富盐前导相和富PEG滞后相。此外，使用3-D纸芯可以进一步增强ATPS纸上分离。通过将LFA条带放置在3-D芯下游，我们将浓缩和检测步骤无缝整合到一个装置中。
典型的LFA由至少三个组成部分组成：样品垫，其中样品被施加到测试条上；检测区，其中存在结合并且可观察到结果；以及吸收垫，其用作过量样品的槽(图1，上图)。在夹心测定形式中，首先将用结合分子(通常是抗体、适体、单链DNA等)修饰的LFA指示剂(可为比色、荧光、放射性等)添加到样品中。如果存在目标分析物，它将与用抗体修饰的指示剂结合。当将这些复合物例如通过样品垫施加到LFA测试条上时，它们朝向吸收垫流过测试条。如果存在目标分析物，则分析物将与固定在测试线上的结合分子结合并夹在指示剂与膜之间。如果指示剂是比色的，则比色指示剂将呈现强烈的颜色，并且当分析物-指示剂复合物在测试线处积聚时形成视觉条带，指示阳性结果。另选地，如果不存在分析物，则指示剂不附着到测试线，并且缺少测试线表示阴性结果。无论分析物是否存在，在指示剂上修饰的结合分子都可以结合并积聚在对照线(当存在时)上。对照线上的条带表示样品已流过测试条，表明测试有效。因此，阳性结果由两个条带指示，其中一个条带在测试线上，一个条带在对照线上，而阴性结果由对照线上的单个条带指示。
如本文所述，通过添加不需要额外用户步骤的信号增强策略，提高了我们先前的集成LFA和ATPS装置的检出限。用于LFA信号增强的典型方案首先需要将样品溶液与比色探针一起施加到LFA条上保持10-20分钟。接下来，将显色试剂施加到LFA测试条上以增强探针产生的信号。在某些实施方案中，这种增强可以使仅LFA实例的检出限提高10-50倍。
在某些实施方案中，本文提供了用于手动ATPS提取与多步骤信号增强的组合的方法和装置。当将分析物添加到ATPS的一个体相中并进行浓缩时，可以手动地(或机械地)提取该相并将其施加到LFA中以进行检测。在例如10-20分钟之后，用户(或机器人)可以施加显色试剂以增强LFA信号。由于通过ATPS浓缩和信号增强实现检出限的复合改善，这种多步骤方法可以将LFA的检出限提高100-1000倍。重要的是比色探针和显色试剂溶液彼此保持分离，因为混合会引起过早显色，导致高背景信号。虽然上述方法成功地使试剂分离，但是对多个定时步骤的需求增加了测试可变性并降低了用户友好性。
为了在保持比色探针和显色试剂分离的同时消除对多个用户步骤的需要，某些实施方案利用探针和显色试剂在各种ATPS中的相反分配行为，并且在某些实施方案中利用ATPS纸上分离的现象。在该方法中，探针(例如，比色探针)可被工程改造为通过增加它们的大小和/或亲水性而极端地分配到ATPS的更具亲水性且较不紧密的相中。这对应于聚合物-盐ATPS中的富盐相或胶束ATPS中的贫胶束相。相反，一种或多种显色试剂的小尺寸和相对疏水性导致分配到ATPS的更具疏水性且紧密的相中。这对应于聚合物-盐ATPS的富聚合物相或胶束ATPS的富胶束相。将ATPS施加到纸基材上将导致加速相分离并且形成更具亲水性的前导相和更具疏水性的滞后相。对于聚合物-盐ATPS，这对应于富盐前导相和富聚合物滞后相，而对于胶束ATPS，存在贫胶束前导相和富胶束滞后相。前导相将浓缩的生物标志物和比色探针递送至LFA的检测区。接下来是滞后相，其将递送显色试剂以引发信号增强(图2)。
我们已经证明了这种使用基于通过碱性磷酸酶(ALP)使硝基蓝四唑鎓/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(NBT/BCIP)显色的酶体系来检测模型蛋白质转铁蛋白(Tf)的方法的可行性。将ALP和抗Tf抗体缀合到金纳米颗粒上，以形成碱性磷酸酶-金纳米探针(ALP-GNP)。这些ALP-GNP可以捕获溶液中的Tf并使其进入期望的ATPS相中以进行浓缩。它们还可作为LFA的比色指示剂，但具有能够与NBT/BCIP底物溶液反应以产生紫色沉淀的额外能力。加入PEG-盐ATPS后，ALP-GNP分配到底部富盐相中，而NBT/BCIP底物分配到顶部富PEG相中(图3)。当使用下游LFA测试条将ATPS施加到我们的3-D纸孔中时，ALP-GNP以及感兴趣的生物标志物将在富盐前导相中浓缩并递送至检测区。然后，富PEG相流过检测区，以递送NBT/BCIP底物。底物将通过结合到检测区的任何ALP-GNP转化为紫色沉淀，从而增强信号(图4)。虽然我们已经证明这种使用PEG-盐ATPS与具有NBT/BCIP的ALP酶促反应的方法的可行性，但该技术也可应用于其他ATPS体系(例如，PPG-盐、PEG-葡聚糖、Triton X-114、C10E4等)和信号增强体系(具有TMB或DAB的辣根过氧化物酶和过氧化物酶样纳米颗粒、金和银增强等)。据信，只需单个用户应用步骤，这种方法就可以实现与传统LFA相比提高100-1000倍的检出限。
虽然参考LFA描述了前述方法，但应认识到这些方法也可以容易地应用于流通测定，例如图11所示的测定。
虽然在某些实施方案中，ATPS、探针和一种或多种显色试剂被选择为使得探针处于前导相中并且一种或多种显色试剂在滞后相中提供，但还设想了其中一个或多个探针定位在两相之间的界面处并且一种或多种显色试剂在滞后相中提供的实施方案。
核酸扩增与核酸浓缩和预浓缩的组合。
在某些实施方案中，提供了将DNA扩增技术与DNA提取和预浓缩步骤组合成一个统一平台的方法和装置。在某些实施方案中，该平台由双水相体系(ATPS)组成，该ATPS在给定的组分浓度和温度下将使ATPS混合物分离成两个不同的相。两相均为水性，并且为生物分子提供了稳定的环境。
ATPS具有多种不同的特性，适用于一系列生物学目的，诸如样品纯化和细胞裂解，以及生物分子分离、分选和浓缩。例如，用Triton表面活性剂制成的胶束ATPS可以将生物分子(如DNA)极端地分配到一个相。此外，还已知Triton表面活性剂具有固有的细胞裂解能力。另选地，由聚乙二醇(PEG)和葡聚糖制成的ATPS可用于重新溶解干血斑并将血细胞分配到一个相中(参见例如图5)。来自重新溶解的血细胞的DNA随后可以浓缩到底部富葡聚糖相中(图6)。通常，由复杂的生物样品制备和提取DNA以便进行扩增需要这些细胞裂解、DNA纯化和浓缩步骤。因为这些结果可通过ATPS实现，这使得ATPS成为与DNA扩增和/或其他方案整合的合适的生物样品操纵平台。
在整合ATPS DNA提取/预浓缩和核酸(例如，DNA)扩增的一种示例性方法中，可以提取ATPS相之一或包含浓缩核酸的界面，并将其直接添加到含有缓冲试剂、盐溶液、核苷酸碱基、酶和专用于扩增目标核酸(例如，DNA模板)的引物的核酸扩增反应中。在一个实例中，血液相容性聚合酶用于直接从富葡聚糖相和富UCON相成功扩增DNA。扩增后，可实现DNA浓度的2-7倍增加，表明聚合酶与测试的ATPS体系相容(图7)。常规的量化聚合酶链反应(qPCR)也能对富葡聚糖相中的DNA直接进行，并且能够如纯水中的DNA扩增一样成功地进行(图8)。
另一种示例性但非限制性的方法涉及将ATPS和核酸(例如，DNA)扩增所需的所有组分合并成一种混合物。值得注意的是，所述方法通常可以利用等温核酸(例如，DNA扩增)。常用的聚合酶链反应(PCR)扩增方法在DNA扩增过程的每个步骤的不同温度下循环，而等温扩增允许整个DNA扩增过程在一个设定温度下进行。其实例是嗜热解旋酶依赖性扩增(tHDA)，其使用解旋酶来分离双链DNA而不是热循环，从而允许在例如65℃下进行等温扩增。由于胶束ATPS在该温度下也会相分离，因此其可与tHDA反应组分组合，以有利于同时进行DNA浓缩和扩增。
为此，可将全细胞样品添加到合并的溶液中，然后可将整个溶液混合以形成胶束ATPS。接着将混合物在例如65℃下加热1小时，以进行相分离和DNA扩增(图9)。将核酸(例如，DNA)分配到两个相中的一个中，然后可以从中提取扩增的DNA。在该一锅法平台中同时浓缩和扩增核酸的能力允许从含有比单独的当前tHDA技术可能的细胞更少的细胞的样品实现扩增。当前的tHDA技术成功地从含有10,000+细胞的样品扩增DNA。相反，我们的初步结果表明，使用组合的Triton X-100ATPS和tHDA一锅法体系，可以从含有少至100个细胞的样品成功扩增DNA(图10)。同时，当单独裂解细胞样品并经由商业试剂盒和其他实验室设备纯化和浓缩DNA时，tHDA体系本身只能达到同样的低检出限。因此，我们的一锅法平台提高了灵敏度和简便性，使其成为基于护理点核酸扩增测试(NAAT)的疾病检测的竞争性候选者。我们的发明也很具通用性，这是因为可以使用许多可能的ATPS和等温扩增试剂。
目标生物分子的浓缩
在本文所述的测定的各种实施方案中，可使用双水相体系(ATPS)浓缩分析物(例如，目标生物分子)。在各种实施方案中，ATPS可以大量液体形式(例如，在容器中)进行，或者在样品溶液在侧流测定或流通测定中流动(例如，在纸膜中流动)时进行。
液体ATPS中的浓缩
收集的样品(例如，组织样品、生物流体如尿液、唾液和血液，痰液、阴道液、精液、脑脊液、淋巴液、子宫颈内拭子、牙菌斑、食物样品和环境样品等)可任选地与悬浮溶液(例如，缓冲液)组合或直接施加到纸上或将含有样品的悬浮溶液施加到纸上以使先前在纸上干燥的ATPS组分再水合。在一些情况下，可能需要由用户混合以实现充分混合的均匀溶液。在各种示例性但非限制性的实施方案中，可以使用聚合物/盐、聚合物/聚合物、胶束/聚合物或胶束ATPS。
流体在纸上流动时的浓缩
在各种实施方案中，浓缩步骤也可以用纸加速。例如，可将收集的样品与ATPS组分混合引入纸装置，该纸装置可以促进、增强和加速相分离。目标生物分子可以在纸膜上的流动前沿浓缩，并且可以无缝地引入随后的检测部件中。
另选地，ATPS组分可以预脱水到纸膜上。在这种情况下，收集的样品可以直接施加到纸膜上，而无需预先与ATPS组分混合。
双水相体系(ATPS)
在某些实施方案中，本文所述的装置被配置成与例如注射器或其他容器中的双水相体系(ATPS)结合使用，或者它们被配置成支持双水相体系(ATPS)。在一些实施方案中，ATPS包含相溶液。术语“相溶液”通常是指ATPS的第一相溶液或第二相溶液。在一些实施方案中，相溶液为混合溶液形式(例如，含有第一相溶液/第二相溶液)。在一些实施方案中，相溶液是从ATPS的混合溶液分配后的第一相溶液/第二相溶液。在一些实施方案中，相溶液是在LFA或流通测定中从混合溶液分配后的第一相溶液/第二相溶液。在某些实施方案中，相溶液可以指第二相溶液，同时它处于混合状态(例如，与第一相溶液)。在一些实施方案中，相溶液是LFA或流通测定中的前导流体。在一些实施方案中，相溶液是LFA或流通测定中的滞后流体。
在一些实施方案中，ATPS包含两种水性溶液，即初始混合的第一相溶液和第一相溶液(例如，混合相溶液)。在一些实施方案中，混合相溶液是均匀溶液，而在某些其他实施方案中，第一相溶液和第二相溶液是不混溶的。在一些实施方案中，第一相溶液和第二相溶液是不混溶的，但第一相溶液的域与第二相溶液的域混合。在一些实施方案中，不混溶性受温度变化和/或不同组分(例如，盐)的浓度变化驱动。在一些实施方案中，第一相溶液/第二相溶液包含诸如胶束、盐和/或聚合物的组分。在一些实施方案中，与ATPS接触的目标分析物(例如，生物分子、细菌(或其片段)、真菌(或其片段)或病毒等)基于其物理和化学性质诸如大小、形状、疏水性和电荷而优先分布、分配和/或浓缩到第一相溶液而非第二相溶液中，反之亦然。在一些实施方案中，目标分析物(例如，细菌、真菌、病毒等)主要(或极端地)分配到ATPS的第一或第二相溶液中，从而在ATPS中浓缩。在一些实施方案中，通过调节第一相溶液与第二相溶液之间的体积比来浓缩目标分析物。在一些实施方案中，通过减少分析物分配的相的体积来浓缩目标分析物。举例来说，在一些实施方案中，目标分析物例如通过使用1:9的第一相溶液与第二相溶液体积比在第一相溶液中浓缩10倍，因为分析物极端地分配到其中的相的体积为总体积的1/10。
在一些实施方案中，通过使用其他比率获得其他浓度。因此，在一些实施方案中，第一相溶液与第二相溶液的比率包括约1:1、约1:2、约1:3，约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10的比率。在一些实施方案中，第一相溶液与第二相溶液的比率包括约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100的比率。在一些实施方案中，第一相溶液与第二相溶液的比率包括约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:600、约1:700、约1:800、约1:900或约1:1000的比率。
在一些实施方案中，第二相溶液与第一相溶液的比率包括约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10的比率。在一些实施方案中，第二相溶液与第一相溶液的比率包括约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100的比率。在一些实施方案中，第二相溶液与第一相溶液的比率包括约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:600、约1:700、约1:800、约1:900或约1:1000的比率。
在一些实施方案中，分析物在第一相溶液和第二相溶液之间基本上均匀地分配，以防止分析物浓缩。在此类体系中，通过引入另外的组分(例如，捕获目标分析物的探针)来实现目标分析物的浓缩，并且其中探针主要分配到一个相中，从而增强目标分析物的分配行为以实现浓缩。在一些实施方案中，收集含有浓缩分析物的第一相溶液/第二相溶液并将其施加到LFA或流通测定装置中。
在一些实施方案中，第一相溶液/第二相溶液包含胶束溶液。在一些实施方案中，胶束溶液包含非离子表面活性剂。在一些实施方案中，胶束溶液包含洗涤剂。在一些实施方案中，胶束溶液包含Triton-X。在一些实施方案中，作为非限制性实例，胶束溶液包含类似于Triton-X的聚合物，例如Igepal CA-630和Nonidet P-40等。在一些实施方案中，胶束溶液基本上由Triton-X组成。
在一些实施方案中，胶束溶液的粘度(在室温(约25℃)下为约0.01厘泊至约5000厘泊、约0.01厘泊至约4500厘泊、约0.01厘泊至约4000厘泊、约0.01厘泊至约3500厘泊、约0.01厘泊至约3000厘泊、约0.01厘泊至约2500厘泊、约0.01厘泊至约2000厘泊、约0.01厘泊至约1500厘泊、约0.01厘泊至约1000厘泊或约0.01厘泊至约500厘泊。在一些实施方案中，胶束溶液在室温下的粘度为约0.01厘泊至约450厘泊、约0.01厘泊至约400厘泊、约0.01厘泊至约350厘泊、约0.01厘泊至约300厘泊、约0.01厘泊至约250厘泊、约0.01厘泊至约200厘泊、约0.01厘泊至约150厘泊或约0.01厘泊至约100厘泊。
在一些实施方案中，再水合的第一相溶液/第二相溶液包含聚合物(例如，聚合物溶液)。在某些实施方案中，所述聚合物包括选自聚乙二醇(PEG)、乙烯/丙烯共聚物(例如，UCONTM聚合物)、丙二醇(PPG)、甲氧基聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等的一种或多种聚合物。在某些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在各种实施方案中，PEG可具有介于1000至100,000之间的分子量。在某些实施方案中，PEG包括PEG-4600、PEG-8000或PEG-20,000。在某些实施方案中，聚合物是聚丙二醇(PPG)。在各种实施方案中，PPG可具有介于100至10,000之间的分子量。在某些实施方案中，PPG包括PPG 425。在某些实施方案中，聚合物是葡聚糖。在各种实施方案中，葡聚糖可具有介于1000至1,000,000之间的分子量。在某些实施方案中，葡聚糖包括葡聚糖6000、葡聚糖9000、葡聚糖-35,000或葡聚糖-200,000。在某些实施方案中，聚合物包括乙烯/丙烯共聚物(例如，UCONTM聚合物)。示例性但非限制性的乙烯/丙烯共聚物包括但不限于UCONTM 50-HB-5100、UCONTM 50-HB-3520、UCONTM 50-HB-2000、UCONTM 50-HB-660、UCONTM 50-HB-400、UCONTM 50-HB-260、UCONTM 50-HB-170、UCONTM 50-HB-100、UCONTM 60-H-5300、UCONTM 60-H2300、UCONTM 60-H-1600、UCONTM 60-H-1100、UCONTM 60-H-760、UCONTM 60-H-340、UCONTM 75-H-9500、UCONTM 75-H-1400、UCONTM 75-H-450等。
在一些实施方案中，再水合的聚合物溶液包括作为约0.01重量％聚合物、或约0.05重量％聚合物、或约0.1重量％聚合物、或约0.15重量％聚合物、或约0.2重量％聚合物、或约0.25重量％聚合物、或约0.3重量％聚合物、或约0.35重量％聚合物、或约0.4重量％聚合物、或约0.45重量％聚合物、或约0.5重量％聚合物、或约0.55重量％聚合物、或约0.6重量％聚合物、或约0.65重量％聚合物、或约0.7重量％聚合物、或约0.75重量％聚合物、或约0.8重量％聚合物、或约0.85重量％聚合物、或约0.9重量％聚合物、或约0.95重量％聚合物、或约1重量％聚合物的聚合物溶液。在一些实施方案中，聚合物溶液包括作为约1重量％聚合物、或约2重量％聚合物、或约3重量％聚合物、或约4重量％聚合物、或约5重量％聚合物、或约6重量％聚合物、或约7重量％聚合物、或约8重量％聚合物、或约9重量％聚合物、或约10重量％聚合物、或约11重量％聚合物、或约12重量％聚合物、或约13重量％聚合物、或约14重量％聚合物、或约15重量％聚合物、或约16重量％聚合物、或约17重量％聚合物、或约18重量％聚合物、或约19重量％聚合物、或约20重量％聚合物、或约21重量％聚合物、或约22重量％聚合物、或约23重量％聚合物、或约24重量％聚合物、或约25重量％聚合物、或约26重量％聚合物、或约27重量％聚合物、或约28重量％聚合物、或约29重量％聚合物、或约30重量％聚合物、或约31重量％聚合物、或约32重量％聚合物、或约33重量％聚合物、或约34重量％聚合物、或约35重量％聚合物、或约36重量％聚合物、或约37重量％聚合物、或约38重量％聚合物、或约39重量％聚合物、或约40重量％聚合物、或约41重量％聚合物、或约42重量％聚合物、或约43重量％聚合物、或约44重量％聚合物、或约45重量％聚合物、或约46重量％聚合物、或约47重量％聚合物、或约48重量％聚合物、或约49重量％聚合物、或约50重量％聚合物的聚合物溶液。在一些实施方案中，聚合物溶液包括作为约10重量％聚合物、或约20重量％聚合物、或约30重量％聚合物、或约40重量％聚合物、或约50重量％聚合物、或约60重量％聚合物、或约70重量％聚合物、或约80重量％聚合物、或约90重量％聚合物的聚合物溶液。在一些实施方案中，聚合物溶液包括作为约10重量％聚合物至约80重量％聚合物的聚合物溶液。在一些实施方案中，再水合的聚合物溶液包括作为约1重量％至约30重量％、或约5重量％至最多约25重量％、或约10重量％至最多约25重量％、或约10重量％至最多约20重量％聚合物的聚合物溶液。
在一些实施方案中，再水合的第一相溶液和/或第二相溶液包含盐，从而形成盐溶液。在一些实施方案中，目标分析物(例如，细菌、真菌、病毒等)和/或探针-分析物复合物分配到盐溶液中。在某些实施方案中，盐溶液包含亲液盐。在一些实施方案中，盐溶液包含离液盐。在一些实施方案中，盐包括镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐和铝盐中的一种或多种。在一些实施方案中，盐包括溴化盐、碘化盐、氟化盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐或磷酸盐。在一些实施方案中，盐是磷酸钾。在一些实施方案中，盐是硫酸铵。
在一些实施方案中，再水合的盐溶液包括包含约0.01重量％盐、或约0.05重量％盐、约0.1重量％盐、或约0.15重量％盐、或约0.2重量％盐、或约0.25重量％盐、或约0.3重量％盐、或约0.35重量％盐、或约0.4重量％盐、或约0.45重量％盐、或约0.5重量％盐、或约0.55重量％盐、或约0.6重量％盐、或约0.65重量％盐、或约0.7重量％盐、或约0.75重量％盐、或约0.8重量％盐、或约0.85重量％盐、或约0.9重量％盐、或约0.95重量％盐、或约1重量％盐的盐溶液。在一些实施方案中，再水合的盐溶液包括作为约1重量％盐、或约2重量％盐、或约3重量％盐、或约4重量％盐、或约5重量％盐、或约6重量％盐、或约7重量％盐、或约8重量％盐、或约9重量％盐、或约10重量％盐、或约11重量％盐、或约12重量％盐、或约13重量％盐、或约14重量％盐、或约15重量％盐、或约16重量％盐、或约17重量％盐、或约18重量％盐、或约19重量％盐、或约20重量％盐、或约21重量％盐、或约22重量％盐、或约23重量％盐、或约24重量％盐、或约25重量％盐、或约26重量％盐、或约27重量％盐、或约28重量％盐、或约29重量％盐、或约30重量％盐、或约31重量％盐、或约32重量％盐、或约33重量％盐、或约34重量％盐、或约35重量％盐、或约36重量％盐、或约37重量％盐、或约38重量％盐、或约39重量％盐、或约40重量％盐、或约41重量％盐、或约42重量％盐、或约43重量％盐、或约44重量％盐、或约45重量％盐、或约46重量％盐、或约47重量％盐、或约48重量％盐、或约49重量％盐、或约50重量％盐的盐溶液。在一些实施方案中，再水合的盐溶液包括在约0.1重量％至约40重量％、或约1重量％至最多约30重量％、或约5重量％至最多约25重量％、或约10重量％至最多约20重量％范围内的盐溶液。在一些实施方案中，再水合的盐溶液包括作为约0.1重量％至约10％的盐溶液。在一些实施方案中，盐溶液为约1重量％至约10％。
在一些实施方案中，第一相溶液/第二相溶液包含与水不混溶的溶剂。在一些实施方案中，溶剂包括非极性有机溶剂。在一些实施方案中，溶剂包括油。在一些实施方案中，溶剂包括戊烷、环戊烷、苯、1,4-二氧杂环己烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿、甲苯或己烷。
在一些实施方案中，第一相溶液包含胶束溶液，并且第二相溶液包含聚合物。在一些实施方案中，第二相溶液包含胶束溶液，并且第一相溶液包含聚合物。在一些实施方案中，第一相溶液包含胶束溶液，并且第二相溶液包含盐。在一些实施方案中，第二相溶液包含胶束溶液，并且第一相溶液包含盐。在一些实施方案中，胶束溶液是Triton-X溶液。在一些实施方案中，第一相溶液包含第一聚合物，并且第二相溶液包含第二聚合物。在一些实施方案中，第一/第二聚合物包含聚乙二醇和/或葡聚糖。在一些实施方案中，第一相溶液包含聚合物，并且第二相溶液包含盐。在一些实施方案中，第二相溶液包含聚合物，并且第一相溶液包含盐。在一些实施方案中，第一相溶液包含聚乙二醇，并且第二相溶液包含磷酸钾。在一些实施方案中，第二相溶液包含聚乙二醇，并且第一相溶液包含磷酸钾。在一些实施方案中，第一相溶液包含盐，并且第二相溶液包含盐。在一些实施方案中，第一相溶液包含亲液盐，并且第二相溶液包含离液盐。在一些实施方案中，第二相溶液包含亲液盐，并且第一相溶液包含离液盐。
在一些实施方案中，第一相溶液包含表1的组分1，并且第二相溶液包含表1的组分2。在一些实施方案中，第二相溶液包含表1的组分1，并且第二相溶液包含表1的组分2。
在一些实施方案中，将表1的组分悬浮或溶解在缓冲液中。在一些实施方案中，将表1的组分悬浮/溶解在与衍生样品的生物体系相容的缓冲液中。在一些实施方案中，将表1的组分悬浮/溶解在盐水溶液中。在一些实施方案中，将表1的组分悬浮/溶解在PBS中。在一些实施方案中，将表1的组分悬浮/溶解在水中。在一些实施方案中，将表1的组分悬浮/溶解在生物流体中。
表1：示例性双水相提取/浓缩体系。
应当注意的是，UCONTM聚合物包含通过使用碱催化剂在约100℃至约150℃的温度下使等重量的环氧乙烷和环氧丙烷与丁醇反应而制备的乙烯/丙烯共聚物。所得的UCONTM50-HB是具有以下通式结构的无规共聚物：
应认识到，上述ATPS体系和组分是示例性的而非限制性的。使用本文提供的教导内容，本领域的技术人员可获得许多其他ATPS体系和组分。
在一些实施方案中，本文所述的装置(例如，LFA或流通测定装置)还可包括被配置成与ATPS接触放置的收集器，其中目标分析物分配在收集器与第一相溶液和/或第二相溶液的界面处。在一些实施方案中，收集器包含塑料、介孔材料、二氧化硅、聚丙烯、磁体、磁性粒子、顺磁性粒子、具有孔的材料、具有凹槽的材料和/或它们的任何组合的材料。在一些实施方案中，收集器包含聚丙烯。在一些实施方案中，收集器被优化为增加目标分析物收集。在一些实施方案中，收集器包括孔以使表面积最大化。在一些实施方案中，孔的宽度为约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm或约100μm。在一些实施方案中，孔的宽度为约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm或约1mm。在一些实施方案中，孔的深度为约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm或约100μm。在一些实施方案中，孔的深度为约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm或约1mm。
目标分析物(例如，生物分子)的检测
在各种实施方案中，纸基检测部件可以是侧流测试条(参见例如图1)或流通装置(斑点测试)(参见例如图11)的形式。在各种实施方案中，两种形状因子可包括下列部件中的一者或多者：
样品垫
在某些实施方案中，样品垫(当存在时)可将浓缩部件连接至检测部件。它可以用作可清除收集的液体中的碎屑、污染物和粘液的过滤器。它还可以储存干燥的试剂，并且当再水合时，这些试剂可以(i)调节溶液以获得最佳检测条件(pH、离子强度等)；以及(ii)分解收集的样品中可能影响检测的粘液、糖蛋白和其他粘性物质。用于样品垫的示例性材料包括但不限于纤维素、硝化纤维素、玻璃纤维、棉、织造或非织造纸等。垫上的试剂可包括但不限于表面活性剂，例如Triton X-100、Tween 20或十二烷基硫酸钠等；聚合物，例如聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、硼酸钠、TRICINE等；蛋白质，例如白蛋白等；酶，例如蛋白酶等；盐，例如氯化钠、磷酸钠、胆酸钠、磷酸钾等。在各种实施方案中，可通过下述方式将这些试剂施加到样品垫上：(i)将纸材料浸泡在试剂溶液中；或(ii)通过经由毛细管流动对膜进行芯吸。经处理的样品垫可通过以下方式进行干燥：(i)风干(置于室温下)；(ii)烘烤(使用烘箱或加热装置而置于高温下)；(iii)真空；或(iv)冻干。
缀合垫
在各种实施方案中，缀合垫(当存在时)可包含用结合一种或多种目标分析物的结合部分修饰的脱水比色指示剂。在某些实施方案中，结合部分是对一种或多种目标分析物(例如，细菌、真菌、病毒、蛋白质、DNA等)具有高亲和力的特异性结合部分。当样品溶液到达缀合垫时，比色指示剂被再水合。然后，比色指示剂的结合部分可以与一种或多种目标分析物结合，并且所得的复合物可以流到反应垫。在某些实施方案中，比色指示剂可包括金属颗粒如金、银颗粒、聚合物颗粒如乳胶珠粒，以及包封可见或荧光染料的聚苯乙烯颗粒。用于缀合垫的示例性材料包括但不限于纤维素、硝化纤维素、玻璃纤维、棉、织造或非织造纸等。在某些实施方案中，可以如上所述将比色指示剂施加并脱水到垫上。
反应垫
在某些实施方案中，反应垫(当存在时)可包含固定的试剂，并且当固定的试剂与样品溶液反应时，它们可产生信号(例如，视觉信号)以指示一种或多种目标分析物的存在或不存在或量。用于反应垫的示例性材料包括但不限于纤维素、硝化纤维素、玻璃纤维、棉、织造或非织造纸等。
侧流形式
在侧流测试条的某些实施方案中，反应垫上的试剂将以垂直于流动方向的线的形式固定，以确保所有样品可与固定的试剂相互作用。试剂的浓度可被优化为控制信号强度，从而控制测定的灵敏度。例如，可通过固定具有多种浓度的相同试剂的多条线来设计半定量测定。因此，每条线仅在达到特定浓度的目标生物分子时才产生信号。然后，可通过计算可见的线数量来解释目标生物分子的浓度(参见例如图2)。
此外，可将不同试剂的多条线固定在同一测试条上以检测一种或多种多目标分析物。这允许开发多重测定。
流通形式
在流通测试的某些实施方案中，可将试剂固定在整个反应垫上而不是线上。如果存在目标分析物，它将与缀合垫上的比色指示剂结合并被捕获在反应垫上，因为指示剂-靶标复合物会与固定的试剂结合。因此，如果存在目标生物分子，则会出现可见斑点。如果样品体积太小而不能吸到侧流测试条上，则可以使用这种测试。可见斑点的颜色强度与目标生物分子的浓度相关，而斑点的大小与样品体积相关。在某些实施方案中，浓缩部件可以直接置于流通测试的顶部，以消除对于将浓缩样品提取并施加到检测部件中的需要。
在各种实施方案中，固定的试剂可包含针对目标分析物的特异性抗体(一级抗体)、针对一级抗体的抗体(二级抗体)、抗原、蛋白质或抗原-蛋白质缀合物。用于反应垫的示例性材料包括但不限于纤维素、硝化纤维素、玻璃纤维、棉、织造和非织造纸等。在各种实施方案中，可以如上所述将试剂施加并脱水到垫上。
槽
在某些实施方案中，槽(当存在时)可包括吸收垫，该吸收垫收集多余的流体并防止可能影响测试性能的回流。用于槽的示例性材料包括但不限于纤维素、硝化纤维素、玻璃纤维、棉、织造和非织造纸等。
信号增强
如上所述，在各种实施方案中，可以增强可见信号强度以提高检测测定的灵敏度和/或准确度。这可以通过在初始检测测定(分析物结合)后将额外的显色(信号增强)试剂引入反应垫来进行。如上所述，探针和ATPS可被设计为首先将探针递送至检测区(例如，在ATPS的前导相或界面中)，随后递送显色试剂(例如，在ATPS的滞后相中)。
在某些实施方案中，信号增强试剂可包含与酶反应的底物，所述酶修饰在例如比色指示剂的表面上以形成强可见产物。举例来说，如果比色指示剂包含金探针，则可通过银增强标记实现信号增强，其中可将含有银离子的增强试剂施加到反应垫上，在此，金探针与固定线/斑点结合。在这种情况下，金探针可以充当成核位点，使得银可以沉积在颗粒上，导致信号强度增加。在这些实例中，信号增强试剂可以在初始检测测定后单独加入，或者储存/脱水到纸装置上以便自动/手动释放。
在其他示例性但非限制性的实施方案中，显色试剂可以是酶(例如，碱性磷酸酶、辣根(或其他)过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等)的底物，该底物与对应的酶反应，所述酶与一个或多个探针缔合或附着到一个或多个探针上以产生增强的可检测信号。另选地，显色试剂可包含酶，而底物附着到一个或多个探针上或与一个或多个探针缔合。
前述部件和测定形式是示例性的而非限制性的。使用本文提供的教导内容和实例，本领域的技术人员可获得许多其他测定装置和配置，并且下面描述了一些进一步的设计考虑因素和部件。
侧流测定(LFA)或流通(斑点)测定
如上所述，在某些实施方案中，本文所述的装置和体系被配置成提供侧流测定(LFA)或流通(斑点)测定以检测样品中的目标分析物，其中LFA或斑点测定单独使用或与双水相体系(ATPS)结合使用。在一些实施方案中，LFA或斑点测定包含多孔基质，ATPS或其组分设置于其中，其中多孔基质被构造成并且具有足够的孔隙率以在ATPS或其组分处于流体相时允许ATPS或其组分流过多孔基质。这种多孔LFA或斑点测定装置在本文中称为纸或纸流体装置，并且这些术语可互换使用。
如本文所用，术语“纸”不限于来自木材或其他纤维植物物质的浆液的薄片，但在某些实施方案中，可设想在本文所述的装置中使用这种纸。纸更一般地是指允许流体流过的通常为片状的多孔材料，但不限于此。
在一些实施方案中，多孔基质足够多孔以允许ATPS的混合相溶液(第一相溶液和/或第二相溶液)和/或目标分析物流过LFA。在一些实施方案中，多孔基质足够长和/或足够深以使混合相溶液(第一相溶液和/或第二相溶液)和/或目标分析物垂直和/或水平地流过LFA或斑点测定装置。在一些实施方案中，第一相溶液以第一速率流过多孔基质，第二相溶液以第二速率流过多孔基质，其中第一速率和第二速率不同。在LFA或斑点测定的一些实施方案中，多孔基质尤其包含诸如烧结玻璃陶瓷、矿物、纤维素、玻璃纤维、硝化纤维、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜、它们的组合等材料。
流动时浓缩
据发现，当溶液流过多孔基质(例如，纸)时，ATPS可以相分离，我们称之为“流动时浓缩”。此外，还发现通过纸的流动显著加速了浓缩过程。基于这种现象，本文所述的侧流测定装置和流通测定装置可包括纸流体组分，其将组合的ATPS浓缩所必需的组分与LFA或流通检测完全整合。据发现，当将混合的ATPS溶液施加到某些纸材料上时，随着溶液流动发生相分离和分析物浓缩。我们还证实，即使在制备具有不同体积比(例如，顶相的体积除以底相的体积)的ATPS时，这种现象也得以保持。
在一些实施方案中，LFA或斑点测定(例如，斑点测定的浓缩部件)包括纸。在一些实施方案中，纸包括允许流体流过的一片多孔材料。在一些实施方案中，纸包括允许流体流过的多片多孔材料。在一些实施方案中，纸包含一种或多种材料，例如纤维素、玻璃纤维、硝化纤维素、聚偏二氟乙烯、电荷改性尼龙、聚醚砜等。在一些实施方案中，纸是HI-FLOW膜。
在一些实施方案中，纸是织造纸。在一些实施方案中，纸是Whatman纸。在一些实施方案中，Whatman纸包括Whatman S17、Whatman MF1、Whatman VF1、Whatman Fusion 5、Whatman GF/DVA、Whatman LF1、Whatman CF1和/或Whatman CF4。
在一些实施方案中，当目标分析物流过LFA或流过流通测定的浓缩部件(例如，基于“流动时浓缩的”的装置)时，纸将目标分析物浓缩。在一些实施方案中，当目标分析物水平地流过LFA时，纸将目标分析物浓缩。在一些实施方案中，当目标分析物垂直地流过LFA或流通测定时，纸将目标分析物浓缩。
在一些实施方案中，纸具有影响哪种相溶液将成为“前导流体”的性质。作为非限制性实例，当使用PEG-盐ATPS时，将溶液添加到玻璃纤维纸中将使盐相成为前导溶液，而使用纤维素纸将使PEG相成为前导溶液。在一些实施方案中，纸内的相分离加速了相分离。同样作为非限制性实例，胶束ATPS通常需要数小时才能在停滞的ATPS中相分离，但如果施加到纸条上，则该相分离在几分钟内发生。这通过允许ATPS(其通常是过程中的速率决定步骤)成为我们的快速纸诊断测定的更可行的选择来加速诊断过程。在一些实施方案中，“流动时浓缩的”装置包含PEG-盐ATPS(例如，如实施例中所示)。在一些实施方案中，“流动时浓缩的”装置包含胶束ATPS。在一些实施方案中，LFA装置或流通测定装置包含玻璃纤维纸或硝化纤维素纸。
在某些实施方案中，LFA或流通测定装置包括：去除碎屑(例如，血细胞或其他颗粒)的过滤器；样品垫，其中将包含目标分析物的样品施加到装置上；检测区(例如，测试线和对照线)，其中目标分析物结合并被检测；以及吸收垫(例如，干燥接收纸)，其可吸收施加到LFA或流通装置上的过量样品和/或溶液(参见例如图1和图11)。在一些实施方案中，对照线和/或测试线本身不是线，而是区域或斑点。
在一些实施方案中，LFA包括LFA条。术语“LFA”和“LFA条”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，LFA条的长度大于其宽度和深度。在一些实施方案中，LFA是矩形的。在一些实施方案中，LFA具有圆形、卵圆形、正方形、多边形或不规则形状的形状。在一些实施方案中，LFA包括多个路径和/或接合部。在一些实施方案中，LFA条包括样品垫、检测区和吸收垫。在一些实施方案中，检测区位于样品垫与吸收垫之间，吸收垫将含有目标分析物的样品背离样品垫并朝向检测区芯吸。
夹心测定
在一些实施方案中，LFA或流通(斑点)测定装置被配置成提供或运行夹心测定(参见例如本文的图1以及2015年3月6日提交的共同待决的PCT申请No:PCT/US2015/019297的图1左下部，该申请中描述的LFA配置据此以引用方式并入。在一些实施方案中，夹心测定包括结合目标分析物的捕获部分。在一些实施方案中，装置包括探针。在一些实施方案中，探针包含可检测的性质(比色、荧光、放射性等)。在一些实施方案中，探针包含与目标分析物(例如，抗体)相互作用的结合部分。在一些实施方案中，探针被添加到样品中并结合目标分析物以形成探针-分析物复合物。
竞争测定
在一些实施方案中，LFA包括竞争测定。在一些实施方案中，探针被添加到样品中并结合目标分析物以形成探针-分析物复合物。在一些实施方案中，LFA包含固定在测试线上的目标分析物。在一些实施方案中，探针被样品中的目标分析物饱和，并且探针不会结合固定在测试线上的目标分析物。在一些实施方案中，测试线上不存在可检测信号指示阳性结果。在一些实施方案中，样品中不存在目标分析物，并且探针与测试线上的目标分析物结合，指示阴性结果。在一些实施方案中，LFA包含在对照线上与探针直接相互作用的探针捕获部分，并且无论样品中是否存在目标分析物，探针都可以结合探针捕获部分并积聚在对照线上。在一些实施方案中，探针在对照线上固定并检测，指示有效测试。在一些实施方案中，阳性结果(例如，样品中存在目标分析物)由测试线和对照线处的可检测信号指示。在一些实施方案中，阴性结果由对照线处的可检测信号指示。
在一些实施方案中，将探针-分析物复合物施加到样品垫上并且通过LFA或通过流通装置流向吸收垫。在一些实施方案中，探针-分析物复合物的目标分析物结合捕获部分。在一些实施方案中，捕获部分固定在测试线或测试区域(例如，流通装置中的测试层)上，并且探针-分析物复合物固定在测试线上或测试区域中。在一些实施方案中，探针是比色的，并且当探针-分析物复合物在测试线处或测试区域中积聚时，测试线或测试区域将呈现强烈颜色(例如，可检测信号)，指示阳性结果。在一些实施方案中，样品中不存在目标分析物，并且探针-分析物复合物的探针不与捕获部分相互作用，并且测试区域中不存在测试线或信号指示阴性结果。在一些实施方案中，LFA包含在对照线上(或在例如流通测定装置的对照区域中)与探针和/或结合部分直接相互作用的探针捕获部分，并且因此，无论样品中是否存在目标分析物，探针/结合部分都可以结合探针捕获部分并积聚在对照线上或对照区域中。在一些实施方案中，探针捕获部分是与结合部分结合的二级抗体，其中结合部分是与该目标分析物结合的一级抗体。在一些实施方案中，探针在对照线上或对照区域中固定并检测，指示有效测试。在一些实施方案中，阳性结果(例如，样品中存在目标分析物)由测试线(或测试区域)和对照线(或对照区域)处的可检测信号指示。在一些实施方案中，阴性结果由对照线处或对照区域中的可检测信号指示。
LFA或流通(斑点)测定装置中的脱水ATPS。
在一些实施方案中，ATPS或其组分和/或探针和/或显色试剂在包含LFA的多孔基质的至少第一部分之上和/或之中和/或流通测定装置的浓缩部件中脱水。在一些实施方案中，将样品施加到装置上使ATPS和/或探针和/或一种或多种显色试剂水合，从而将ATPS或其组分和/或探针和/或一种或多种显色试剂转化为流体相。脱水可以使装置更加用户友好，因为用户只需将样品(例如，唾液、血液、尿液、阴道液、精液、痰液、脑脊液、淋巴液或类似流体)添加到装置中即可。在一些实施方案中，用户只需将样品溶液施加到条上以检测目标分析物的存在/不存在或量化分析物。在一些实施方案中，样品溶液流过LFA或流通装置并且ATPS重新溶解，从而触发LFA或流通装置内的相分离以及目标分析物的后续浓缩。
在一些实施方案中，将给定ATPS的所有必需组分混合以形成混合溶液，施加到包括装置(例如，LFA或流通(斑点)测定)的纸上，然后脱水。当将样品溶液添加到脱水纸上时，ATPS组分在样品流动时再水合，导致相分离。在其中包含浓缩分析物的相的粘度较低的一些ATPS中，该相将更快地流动，浓缩的分析物将出现在前导流体中并将到达LFA或流通测定的检测区以引发检测。另外，可以针对不同的应用来调节脱水的ATPS组分区段长度(或厚度)和浓度。
在一些实施方案中，ATPS的两种(所有)组分在LFA上或在流通测定中(例如，在分离部件中)脱水。在一些实施方案中，第一ATPS组分在LFA上(或在LFA中)或在流通测定中脱水。在一些实施方案中，第二ATPS组分在LFA或流通测定之上或之中脱水。在一些实施方案中，第一相溶液组分和/或第一ATPS组分在LFA的第一部分上或在流通测定的第一层(分离部件)中脱水。在一些实施方案中，第二相溶液组分和/或第二ATPS组分在LFA的第二部分上或在流通测定的第二层(分离部件)中脱水。在一些实施方案中，第一部分和第二部分相同。在一些实施方案中，第一部分和第二部分不同。作为非限制性实例，在PEG盐ATPS中，PEG和盐溶液可以分别脱水到不同的纸部分或区段(参见例如2015年3月6日提交的共同待决的PCT申请No:PCT/US2015/019297的图16，该申请中描述的LFA配置据此以引用方式并入)或者包含例如流通测定的分离部件的单独层(参见例如图11)中。在一些实施方案中，使第一相溶液/第二相溶液和/或ATPS组分在LFA的不同部分上或在流通测定的不同层中脱水会提供第一相溶液/第二相溶液组分或ATPS组分的更均匀浓缩。在一些实施方案中，使第一相溶液/第二相溶液组分和/或ATPS组分在不同部分上脱水允许第一相溶液或ATPS组分在水合后沿第一方向流动，并且第二相溶液和/或ATPS组分在水合后沿第二方向流动，其中第一方向和第二方向不同。在一些实施方案中，目标分析物在第一方向上浓缩，但不在第二方向上浓缩。在一些实施方案中，目标分析物在第二方向上浓缩，但不在第一方向上浓缩。在一些实施方案中，使第一/第二相组分和/或ATPS组分在不同部分上脱水允许目标分析物在第一/第二方向上流动，而不需要样品在第一/第二方向上流动。在一些实施方案中，使第一/第二相组分和/或ATPS组分在不同部分上脱水允许目标分析物更快地流动，从而导致更快地检测。在一些实施方案中，使第一/第二相组分和/或ATPS组分在不同部分上脱水允许提高结果可靠性。在一些实施方案中，使第一/第二相组分和/或ATPS组分在不同部分上脱水能防止第一相溶液/第二相溶液组分和/或ATPS组分(例如，PEG-盐ATPS)的聚集。在一些实施方案中，第一/第二相组分和/或ATPS组分在多个区段中脱水。在一些实施方案中，第一/第二相组分和/或ATPS组分在多个区段中脱水，其中第一/第二相组分和/或ATPS组分包含盐溶液。在一些实施方案中，第一/第二相组分和/或ATPS组分在多个区段中脱水，其中第一/第二相组分和/或ATPS组分不包含聚合物(例如，PEG)。在一些实施方案中，脱水的PEG不位于检测区附近，因为富PEG相可减慢检测膜内的流动。在一些实施方案中，LFA条或流通测定可包括在检测区域附近的不含PEG或盐的空白间隔区。
在一些实施方案中，探针(例如，分析物结合部分和缔合的检测试剂/材料)在探针缓冲液中提供。在一些实施方案中，探针缓冲液在LFA上或在流通测定中脱水。
在一些实施方案中，与其中ATPS组分以液体形式添加的装置相比，ATPS组分的脱水提高了检出限。在一些实施方案中，添加液体形式的ATPS组分会稀释来自受试者的样品溶液。在一些实施方案中，ATPS组分的脱水允许在流动期间形成不同的第一相溶液和/或不同的第二相溶液，从而在将到达测试线和对照线或流通测定的检测部件的前导流体的前部处将目标分析物或探针-分析物复合物浓缩成小体积。在一些实施方案中，在前导流体的前部处浓缩目标分析物和/或探针-分析物复合物将缩短检测所需的时间段。
探针
在某些实施方案中，本文所述的系统和/或装置和/或本文所述的方法利用探针，其中所述探针包含结合目标分析物以形成探针-分析物复合物的结合部分。
在一些实施方案中，单独的目标分析物优先地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中。在一些实施方案中，单独的目标分析物极端地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中。
在一些实施方案中，单独的目标分析物不会优先地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中。在一些实施方案中，单独的目标分析物不会极端地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中。
在一些实施方案中，探针-分析物复合物优先地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中，从而使(探针-分析物复合物的)目标分析物优先地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中。
在一些实施方案中，探针-分析物复合物极端地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中，从而使(探针-分析物复合物的)目标分析物极端地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液与第二相溶液的界面中。
在一些实施方案中，当结合将目标分析物(或探针-分析物复合物)分配到ATPS的第一相溶液/第二相溶液使用时，短语“优先地分配”表示较大量的目标分析物设置在优选的相溶液中，而不是ATPS的另一相溶液中。
在一些实施方案中，当结合将目标分析物(或探针-分析物复合物)分配到ATPS的第一相溶液/第二相溶液使用时，短语“极端地分配”表示约90％或更多的目标分析物设置在优选的相溶液中，而不是ATPS的另一相溶液中。
在一些实施方案中，较大量的目标分析物分配到第一相溶液中。在一些实施方案中，大于约50％、或大于约55％、或大于约60％、或大于约65％、或大于约70％、或大于约75％、或大于约80％、或大于约85％、或大于约90％、或大于约95％、或大于约98％、或大于约99％的目标分析物分配到第一相溶液中。在一些实施方案中，大于约99％、或大于约99.1％、或大于约99.2％、或大于约99.3％、或大于约99.4％、或大于约99.5％、或大于约99.6％、或大于约99.7％、或大于约99.8％、或大于约99.9％的目标分析物分配到第一相溶液中。
在一些实施方案中，较大量的分析物分配到第二相溶液中。在一些实施方案中，大于约50％、或大于约55％、或大于约60％、或大于约65％、或大于约70％、或大于约75％、或大于约80％、或大于约85％、或大于约90％、或大于约95％、或大于约98％、或大于约99％的目标分析物分配到第二相溶液中。在一些实施方案中，大于约99％、或大于约99.1％、或大于约99.2％、或大于约99.3％、或大于约99.4％、或大于约99.5％、或大于约99.6％、或大于约99.7％、或大于约99.8％、或大于约99.9％的目标分析物分配到第二相溶液中。
在一些实施方案中，较大量的分析物分配到第一相溶液与第二相溶液的界面中。在一些实施方案中，大于约50％、或大于约55％、或大于约60％、或大于约65％、或大于约70％、或大于约75％、或大于约80％、或大于约85％、或大于约90％、或大于约95％、或大于约98％、或大于约99％的目标分析物分配到界面中。在一些实施方案中，大于约99％、或大于约99.1％、或大于约99.2％、或大于约99.3％、或大于约99.4％、或大于约99.5％、或大于约99.6％、或大于约99.7％、或大于约99.8％、或大于约99.9％的目标分析物分配到界面中。
在一些实施方案中，装置包括或被配置成利用和/或在装置上运行的测定利用一种探针(针对单个分析物的探针)。在一些实施方案中，装置包括或被配置成利用和/或在装置上运行的测定利用至少两种不同的探针(每种探针针对不同的分析物)、或至少3种不同的探针、或至少4种不同的探针、或至少5种不同的探针、或至少7种不同的探针、或至少10种不同的探针、或至少15种不同的探针、或至少20种不同的探针。
在一些实施方案中，探针包含合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物、塑料和/或它们的组合中的一种或多种。在一些实施方案中，探针包含聚合物，所述聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、尼龙聚四氟乙烯葡聚糖和聚氯乙烯。在一些实施方案中，聚乙烯是聚乙二醇。在一些实施方案中，聚丙烯是聚丙二醇。在一些实施方案中，探针包含生物聚合物，所述生物聚合物包括胶原、纤维素和/或几丁质中的一种或多种。在一些实施方案中，探针包含金属(例如，其包括金、银、铂、钯、铈、钛、不锈钢、铝或它们的合金中的一种或多种)。在一些实施方案中，探针包含纳米颗粒(例如，金纳米颗粒、银纳米颗粒等)。
在一些实施方案中，探针还包含涂层。在一些实施方案中，涂层包含聚乙二醇或聚丙二醇。在一些实施方案中，涂层包含聚丙烯。在一些实施方案中，涂层包含聚丙二醇。在一些实施方案中，涂层包含葡聚糖。在一些实施方案中，涂层包含亲水性蛋白。在一些实施方案中，涂层包含血清白蛋白。在一些实施方案中，涂层对第一相溶液或第二相溶液具有亲和力。
在一些实施方案中，样品中目标分析物的量非常低，使得分析物需要充分浓缩以便通过LFA或流通测定进行检测。在某些实施方案中，在界面处实现显著浓缩，因为分析物浓缩的程度取决于分析物分配或浓缩的相的体积，并且界面处的“体积”相对于体相非常小。
在一些实施方案中，探针优先地(或极端地)分配到界面，以便将朝向界面驱动目标分析物。在一些实施方案中，探针由于其表面化学性质而优先地(或极端地)分配到界面，其中表面化学性质被优化以将探针驱动至界面。作为非限制性实例，为了将探针-分析物复合物驱动至聚合物-盐ATPS体系(例如，聚乙二醇-磷酸钾(PEG/盐)体系)的界面，探针与PEG缀合(或PEG化)以促进PEG-PEG与富PEG相的相互作用，和/或用亲水性蛋白修饰以促进与贫PEG相的亲水性相互作用。使用以特异性抗体或能够结合靶标的其他分子修饰的这种优化探针，在界面处捕获并收集目标分析物。由于界面的体积非常小，因此分析物高度浓缩并被施加到流通测定的后续LFA或检测区域。
在一些实施方案中，制备能够分配到PEG/盐ATPS的界面的金纳米探针(GNP)，并且优化操作条件以实现快速的相分离时间，同时具有非常高的GNP/分析物回收率。
在一些实施方案中，探针-分析物复合物分配到ATPS中的固-液界面。在一些实施方案中，固体是包含ATPS的腔室的壁。在一些实施方案中，固体是测定装置的收集器。在一些实施方案中，固体包含固体聚合物。在一些实施方案中，固体聚合物包括聚乙烯、纤维素、几丁质、尼龙、聚甲醛聚四氟乙烯聚氯乙烯或它们的组合。在一些实施方案中，固体聚合物包括聚丙烯。在一些实施方案中，探针-分析物复合物粘附于固体，并且高度浓缩，因为它在固-液界面处以小体积存在并且不被体相的体积稀释。在一些实施方案中，在不破坏浓缩分析物的情况下去除体相，并通过洗涤收集，随后施加到LFA或流通测定装置中。在一些实施方案中，所述方法显著地浓缩分析物并允许在不使用外力(例如，磁体)的情况下收集。另选地，探针包含磁性材料，并且这种方法与磁体一起使用。在一些实施方案中，这些探针被修饰为在界面处浓缩以实现极端分析物浓缩。如上所述，这种方法可以通过使用磁体提供未通过ATPS特异性地浓缩的目标析物与其他污染物的额外分离。在一些实施方案中，ATPS浓缩使得磁性探针能够更有效地工作，因为磁性探针将首先在特定位置(界面)处浓缩成非常小的体积。因此，将需要较小的磁体或较弱的磁场来收集浓缩的分析物。在一些实施方案中，ATPS界面浓缩与磁性探针的组合允许开发与现有技术相比更有效、快速且更廉价的装置。
结合部分
在一些实施方案中，结合部分是结合目标分析物(例如，细菌、真菌、病毒、凝集素、糖、蛋白质、DNA等)的分子。在一些实施方案中，结合部分是特异性结合目标分析物的分子。在一些实施方案中，“特异性结合”表示分子优先结合目标分析物或以高于其他分子的亲和力结合目标分析物。作为非限制性实例，抗体将选择性结合到针对其产生所述抗体的抗原。而且，作为非限制性实例，DNA分子将在严格条件下与基本上互补的序列结合，而不与不相关的序列结合。在一些实施方案中，“特异性结合”可指对分子的异质群体(例如，蛋白质和其他生物制剂)中目标分析物的存在起决定作用的结合反应。在一些实施方案中，结合部分与其特定的目标分析物结合，并且不以显著量结合样品中存在的其他分子。
在一些实施方案中，结合部分包含抗体、凝集素、蛋白质、糖蛋白、核酸、单体核酸、聚合核酸、适体、适体酶、小分子、聚合物、凝集素、碳水化合物、多糖、糖、脂质或它们的任何组合。在一些实施方案中，结合部分是能够与目标分析物形成结合对的分子。
在一些实施方案中，结合部分是抗体或抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')2、Fv、Fv’、Fd、Fd’、scFv、hsFv片段、骆驼科抗体、双抗体和如上所述的其他片段。
在某些实施方案中，结合部分包含适体。在一些实施方案中，适体包含由核酸形成的抗体-类似物。在一些实施方案中，适体不需要在诸如纳米CHEM-FET的将直接检测重构的一些测定中检测标记的结合。在一些实施方案中，结合部分包含适体酶。在一些实施方案中，适体酶包含由核酸形成的酶类似物。在一些实施方案中，适体酶仅在存在第二种特异性分析物的情况下用于改变构型以捕获特定分子。
在一些实施方案中，探针包含可检测标记。可检测标记包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的任何组合物。示例性有用标记包括但不限于荧光纳米颗粒(例如，量子点(Qdot))；金属纳米颗粒(包括但不限于金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒)；荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿荧光蛋白等，参见例如Molecular Probes,Eugene,Oregon,USA)；放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C、32P、99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、64lCu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh、111Ag等)；酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及常用于ELISA中的其他酶)；各种比色标记；磁性或顺磁性标记(例如，磁性和/或顺磁性纳米颗粒)；自旋标记；不透射线标记等。
另选地或另选地，探针可与包含可检测标记的另一颗粒结合。在一些实施方案中，探针在检测区(例如，测试线、对照线、测试区域、对照区域)处提供可检测信号。在一些实施方案中，可检测标记/特性包括比色标记/特性、荧光标记/特性、酶标记/特性、发色标记/特性和/或放射性标记/特性中的一种或多种。在一些实施方案中，探针是金纳米颗粒，并且可检测的特性是颜色。在一些实施方案中，颜色是橙色、红色或紫色。
等温扩增。
在某些实施方案中，本文所述的方法和/或装置在无需热循环(例如，等温扩增)的情况下提供对目标核酸的扩增。核酸扩增的等温方法可以应用于双链DNA。然而，目标核酸分子不必限于双链DNA靶标。例如，用于本文所述的等温扩增方法中的双链DNA可以通过逆转录酶由病毒RNA或mRNA或其他单链RNA靶标源制备。在进一步的实例中，用于本文所述的非循环扩增方法中的双链DNA可通过DNA聚合酶由单链DNA靶标制备。在各种实施方案中，在应用下文论述的等温扩增方法之前，这些方法可以作为初始步骤应用。
等温扩增方法是本领域的技术人员熟知的。此类方法包括但不限于自持序列反应(3SR)、基于核酸的转录测定(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、茎环扩增、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、等温多重置换扩增(IMDA)、单引物等温扩增(SPIA)和环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)(参见例如Notomi等人(2000)Nucl.Acids Res.28:e63；美国专利No.6,743,605；Gill和Ghaemi(2008)Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids,27:224-243等)、重组酶聚合酶扩增(RPA)(参见例如Rohrman和Richards-Kortum(2012)Lab Chip,12:3082-3088；Wang等人(2017)PLoS ONE 12(1):e0166903等)。
用于等温核酸扩增的组分(例如，酶)和试剂盒可商购获得。示例性试剂盒包括但不限于得自的III Universal tHDA试剂盒、环介导等温扩增(LAMP)和得自TwistDx的重组酶聚合酶扩增(RPA)。
样品收集
在各种实施方案中，使用本文所述的装置和方法测定的样品包括生物样品、环境样品、食物样品等。示例性生物样品包括但不限于生物流体(例如，血液或血液级分、淋巴液、脑脊液、精液、尿液、口腔液、阴道液等)、组织样品、牙菌斑样品、子宫颈内拭子样品、细胞样品、组织或器官活检或抽吸物、组织学标本等。
在生物样品包含组织的情况下，在某些实施方案中，可将组织裂解、均质化和/或研磨，并任选地悬浮在样品溶液中。在生物样品包含生物流体的情况下，可直接测定流体或在测定之前将其悬浮在样品溶液中。在某些实施方案中，样品溶液可用于保存或稳定生物样品或其组分，和/或可用于提取或浓缩生物样品或其组分。在某些实施方案中，样品溶液可包含缓冲液，任选地含有防腐剂，和/或酶(蛋白酶、核酸酶等)，和/或表面活性剂，和/或ATPS组分。
在某些实施方案中，特别是在护理点实施方案中，可立即或在适度的时间间隔后将样品施加到测定装置。在某些实施方案中，可将样品递送至运行测定的远程测试设施。
用于收集生物样品的方法和装置是本领域的技术人员熟知的，例如，如下所示：
口腔液收集
口腔液可通过流涎到空的小瓶中，然后将流体转移到测定的浓缩部件中来收集。
也可以使用拭子和/或收集垫收集口腔液。例如，可将拭子或收集垫放置在用户的口中以吸收口腔液。拭子或收集垫可含有化合物，例如胡椒薄荷提取物或酸提取物，以刺激口腔液的产生。拭子或收集垫还可用作过滤器以去除可能影响下游浓缩和检测步骤的食物碎屑、污染物或粘液。在某些实施方案中，可以提取拭子或收集垫中的口腔液并将其与双水相体系(ATPS)组分混合以进行浓缩。从收集装置提取口腔液可例如通过向拭子/垫施加物理压力以挤出流体或者通过毛细管作用将流体引入浓缩部件来实现。另一种配置对应的是，ATPS组分在拭子或收集垫的下游脱水，使得不需要进一步的用户交互。
牙菌斑收集
牙斑菌可使用刷子、拭子或挑取器在牙齿表面、牙龈下面或牙齿之间收集。在某些实施方案中，然后可将收集的牙菌斑在缓冲液或ATPS溶液中混合以进行随后的浓缩。
尿液收集
在各种实施方案中，可以用收集杯获得尿液。然后可将收集的尿液在ATPS溶液中混合以进行随后的浓缩，或者如果ATPS组分在浓缩部件中脱水，则直接施加到装置上。在插入导管的受试者中，尿液可以从导管或从导管接收袋获得。
阴道/子宫颈内拭子
可使用可商购获得的拭子收集阴道或宫颈表面上和/或阴道液中的目标分析物。收集的拭子可置于缓冲液中以释放靶标，或者置于ATPS溶液中以直接浓缩目标生物分子。
血液收集
可使用注射器等通过在毛细管中针(刺血针)刺并收集，从而收集血液。
示例性分析物。
虽然基本上可使用本文所述的测定装置和方法检测和/或量化任何分析物，但在某些实施方案中，分析物是临床相关的分析物(例如，细菌、真菌、原生动物、变形虫、病毒等)。
临床相关靶标是本领域的技术人员熟知的。
临床上重要的阴道液细菌
在阴道液或组织样品中发现阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、细菌性阴道炎和放线菌感染时，在不进行其他诊断性测试的情况下，子宫颈抹片检查可被视为治疗的指征。无症状感染的治疗可以预防选定患者的并发症。念珠菌(Candida)可以是阴道中的共生细菌，因此无症状的患者可能不需要治疗。在宫内节育器(IUD)使用者中检测到较高比例的阴道毛滴虫和念珠菌感染表明IUD可增加阴道感染和相关并发症的风险。
淋病是由生物体淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)引起的细菌感染，并且是临床上重要的病原体。类似地，由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)引起的衣原体以及由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)引起的梅毒是重要的性传播疾病，对其进行快速诊断是期望的。
临床上重要的尿液细菌
大肠杆菌(Escherichia coli)和变形杆菌属(Proteus sp.)是在尿液中发现的通常指示尿道感染的细菌性病原体。
临床上重要的口腔细菌
革兰氏阴性口腔厌氧菌常常与牙周病相关联，一些菌种与牙周病的关联比其他菌种更频繁。这些细菌包括但不限于普雷沃氏菌(Prevotella)属(例如，中间普雷沃氏菌(Pr.intermedia)、变黑普雷沃氏菌(Pr.Nigrescens)、产黑素普雷沃氏菌(Pr.Melaninogenica)、真口普雷沃氏菌(Pr.Veroralis)等)和卟啉单胞菌属(例如，牙龈卟啉单胞菌(Porph.Gingivalis))。
另外，变异链球菌(Streptococcus mutans)与龋齿的形成有关。本公开的其他临床上重要的细菌包括但不限于粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、牙龈二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)或福赛斯拟杆菌(Bacteriodes fortsythus)。
应认识到，这些病原体是示例性的而非限制性的。技术人员将认识到，本文所述的测定装置和方法可用于检测和/或量化许多其他分析物，包括但不限于食物毒素和/或病原体、环境毒素和/或病原体等。因此，例如，本文所述的方法和装置可用于检测蔬菜或其他食物的大肠杆菌污染和/或任何其他食物病原体，包括但不限于表2中所示的那些。
表2：可使用本文所述的方法和装置检测的示例性但非限制性的食物病原体。
实施例
提供以下实施例来说明而不是限制要求保护的发明。
实施例1
DNA扩增的结果
材料和方法
仅tHDA反应和一锅法平台的制备
仅tHDA反应和一锅法体系均被设计来检测大肠杆菌O157:H7。根据制造商的方案，将含有缓冲液、盐、核苷酸碱基、基因特异性引物以及解旋酶和聚合酶的酶混合物的常规仅tHDA反应物制备成50μL反应物。还将全部大肠杆菌直接加入到反应物中。将悬浮液在65℃下加热1小时，然后提取样品并经由凝胶电泳进行分析。对于一锅法平台，将Triton X-100表面活性剂与tHDA反应组分在单个试管中组合。还加入全部大肠杆菌，并将悬浮液混合以形成混合胶束双水相体系(ATPS)。将悬浮液在65℃下加热1小时，以进行相分离和DNA扩增。然后提取顶部的贫胶束相，并经由凝胶电泳进行分析以确认成功扩增。
确定一锅法体系中的DNA分配系数
进行定量DNA分配研究以比较ATPS的两个相中的DNA浓度。对于这项研究，选择来自大肠杆菌O157:H7的基因组DNA、100bp DNA片段和25bp DNA片段作为模拟与一锅法体系相关的DNA的模型。通过组合Triton X-100表面活性剂、与tHDA反应相关的盐、以及双链DNA来制备混合胶束ATPS。针对三种DNA类型中的每一种单独制备混合ATPS。将这些悬浮液在65℃下加热1小时以诱导相分离。在相分离后，提取贫胶束的顶相和富胶束的底相，并添加Quant-iT dsDNA荧光结合染料。然后在读板器中测量荧光强度。使用通过已知DNA浓度制备的标准曲线来推断顶相和底相中的DNA浓度。
结果和讨论
一锅法平台中的DNA分配
通过进行DNA分配研究，我们确定了一锅法体系中每种DNA类型的分配系数。通过将顶相中的DNA浓度除以底相中的DNA浓度来计算分配系数。在测试的三种DNA类型中，较大的基因组DNA和100bp DNA片段具有相似的分配系数，发现所述分配系数大于1(图11)。这表明DNA优先地分配到顶部的贫胶束相，从而在该相中浓缩。同时，较小的25bp DNA片段具有接近1的较小分配系数，表明25bp DNA片段在两相之间更均匀地分配。
一锅法平台中大肠杆菌的扩增和检测的改善
发现tHDA反应与胶束ATPS相容，从而成功证明了一锅法平台。在进行凝胶电泳时，通过存在对应于扩增的DNA区域的预期大小的100bp条带指示，确定成功扩增。为了证明使用一锅法体系对扩增和检测的改善，将通过常规的仅tHDA反应进行的扩增与在一锅法平台中进行的扩增进行比较。如图12所示，常规的仅tHDA反应从含有106cfu/mL的细胞样品成功扩增DNA；然而，在较低的细胞浓度下未实现扩增。另选地，一锅法平台从含有105cfu/mL的细胞样品成功扩增DNA，证明检出限提高10倍。
实施例2
酶促信号增强的结果
材料和方法
测定部件的制备
由聚(乙二醇-ran-丙二醇)和硫酸钠盐在0.1M Tris缓冲液(pH 9)中制备双水相体系(ATPS)。碱性磷酸酶(ALP)和特异于沙眼衣原体(CT)的抗体与金纳米颗粒缀合，以形成碱性磷酸酶-金纳米探针(ALP-GNP)。通过在硝酸纤维素膜上将抗CT抗体印刷为测试线并将蛋白A印刷为对照线来构建夹心测定形式的LFA测试条。将ALP-GNP脱水到3×10mm玻璃纤维垫上以形成缀合垫，将所述缀合垫直接置于膜的上游。将棉纤维吸收垫放置在硝酸纤维素膜的下游。在常规LFA中，将单个3×10mm玻璃纤维样品垫放置在缀合垫的上游。在增强的LFA中，将由四(7×15mm)层玻璃纤维垫构成的3-D纸芯放置在缀合垫的上游。
ATPS自动信号增强的证明
为了运行信号增强测定，将具有3-D纸芯的LFA测试条浸入掺加有CT的ATPS中，以获得3.2ng/μL的总浓度和ALP底物硝基蓝四唑鎓/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(NBT/BCIP)。在10分钟、30分钟和50分钟拍摄照片。
使用ATPS和信号增强改善CT检测
为了运行常规LFA，将测试条浸入各种浓度的灭活CT在PBS中的溶液中。为了运行信号增强测定，将具有3-D纸芯的LFA测试条浸入掺加有各种浓度的灭活CT和ALP底物硝基蓝四唑鎓/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(NBT/BCIP)的ATPS中。在30分钟拍摄照片。
结果和讨论
自动信号增强的证明
当将具有3-D纸芯的LFA测试条浸入含有CT和NBT/BCIP底物的ATPS中时，ATPS在流过测试条时分离成其两个宏观相。首先，含有浓缩的CT细菌的富盐相溶解ALP-GNP并将其递送到LFA测试区，在该测试区中其可以与测试线和对照线结合，在10分钟后通过两条线的外观可视化。接着是富聚合物滞后相，其递送NBT/BCIP底物以引发信号增强反应，这导致在30和50分钟时测试线和对照线变暗(图14)。由于NBT/BCIP底物有利地分配到富聚合物相中，因此避免了过早的信号增强。
使用自动信号增强改善CT的LFA检测
在证明ATPS能够在LFA上使信号增强反应自动化且形成的背景很小之后，我们想要确定该测定是否具有比常规LFA更高的检出限。首先，我们通过测试PBS中灭活CT的稀释度而鉴定出在无生物标志物预浓缩和信号增强步骤的情况下常规LFA的检出限。因为在夹心测定形式中存在两条线指示阳性测试，所以我们的常规LFA能够成功检测10ng/μL的CT。为了提高常规LFA的检出限，我们于是将LFA与ATPS自动生物标志物预浓缩和信号增强步骤相结合。当用各种稀释度的CT进行测试时，增强的LFA能够检测0.32ng/μL的CT，证明与常规LFA相比有30倍的提高(图15)。这种检出限的30倍提高是通过生物标志物预浓缩和信号增强复合改善的结果。通过进一步优化生物标志物预浓缩和信号增强部件，提高可超过30倍。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将建议本领域技术人员根据它们进行各种修改或变化，这些修改或变化包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均据此全文以引用方式并入以用于所有目的。

Claims (154)

1.一种用于检测和/或量化样品中的分析物的装置，所述装置包括：
包含混合相溶液的双水相体系(ATPS)，所述混合相溶液分离成第一相溶液和第二相，其中在使用中，所述第一相溶液成为前导相并且所述第二相溶液成为滞后相；
侧流测定(LFA)或流通测定；以及
探针和/或显色试剂，其中在使用中，所述探针与所述ATPS的所述前导相中的所述第一相溶液缔合和/或所述显色试剂与所述ATPS的所述滞后相中的所述第二相溶液缔合。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述LFA包含多孔基质，所述多孔基质被构造成接纳和/或包含所述ATPS或其组分和/或所述探针、和/或所述显色试剂。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的装置，其中所述LFA包括缀合垫、包含结合所述分析物的抗体的测试线、任选的包含二级抗体的对照线、任选的吸收垫以及任选的样品垫。
4.一种用于检测和/或量化样品中的分析物的装置，所述装置包括：
流通系统，所述流通系统包括：
浓缩部件，所述浓缩部件包括含有混合相溶液的双水相体系(ATPS)，其中在使用中，所述第一相溶液成为前导相并且所述第二相溶液成为滞后相；
探针和/或显色试剂，其中在使用中，所述探针与所述ATPS的所述前导相中的所述第一相溶液缔合和/或所述显色试剂与所述ATPS的所述滞后相中的所述第二相溶液缔合；以及
检测部件，所述检测部件设置在所述浓缩部件下方。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述浓缩部件包括一层或多层纸。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的装置，其中所述检测部件包括缀合垫、反应垫和任选的槽。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的装置，其中所述探针设置在所述ATPS中。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述探针与所述ATPS的所述第一相溶液缔合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的装置，其中所述显色试剂设置在所述ATPS中。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述显色试剂与所述ATPS的所述第二相溶液缔合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的装置，其中所述装置被配置用于使所述ATPS在施加到所述装置之前与所述样品组合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的装置，其中在所述装置与所述样品接触之前，所述ATPS在所述侧流测定上或在流通测定的浓缩部件中脱水。
13.根据权利要求12所述的装置，其中在所述装置与所述样品接触之前，所述探针在所述侧流测定上或在流通测定的浓缩部件中脱水。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的装置，其中在所述装置与所述样品接触之前，所述显色试剂在所述侧流测定上或在流通测定的浓缩部件中脱水。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的装置，其中所述ATPS包含混合相溶液，所述混合相溶液在所述装置与所述样品接触之后分离成第一相溶液和第二相溶液。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的装置，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的装置，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的装置，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的装置，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的装置，其中所述ATPS选自由聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS组成的组。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述ATPS的第一相溶液包含表1的组分1。
22.根据权利要求20所述的装置，其中所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
23.根据权利要求20所述的装置，其中所述ATPS的第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
24.根据权利要求20所述的装置，其中所述ATPS是聚合物/盐ATPS。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述ATPS是PEG/盐ATPS。
26.根据权利要求24-25中任一项所述的装置，其中所述探针分配到所述聚合物/盐ATPS的富盐相中，并且所述显色试剂分配到所述聚合物/盐ATPS的富聚合物相中。
27.根据权利要求20所述的装置，其中所述ATPS是胶束ATPS。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述探针分配到所述ATPS的贫胶束相中，并且所述显色试剂分配到所述ATPS的富胶束相中。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的装置，其中所述探针包含结合至所述目标分析物的结合部分。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述目标分析物包含选自由蛋白质、核酸、糖或凝集素、以及微生物组成的组的部分。
31.根据权利要求30所述的装置，其中所述目标分析物包含选自由细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类组成的组的微生物。
32.根据权利要求30所述的装置，其中所述目标分析物包含微生物的生物标志物。
33.根据权利要求32所述的装置，其中所述目标分析物包含选自由细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类组成的组的微生物的生物标志物。
34.根据权利要求32所述的装置，其中所述目标分析物包含疾病状况的生物标志物、食品安全(或危害)的生物标志物或生物恐怖剂的生物标志物。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述结合部分选自由抗体或抗体片段、凝集素、核酸和适体组成的组。
36.根据权利要求35所述的装置，其中所述探针包含抗体或抗体片段。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的装置，其中所述探针包含选自由合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物和塑料组成的组的材料。
38.根据权利要求37所述的装置，其中所述探针包含选自由聚乙烯、聚丙烯、纤维素、几丁质、尼龙、聚甲醛、聚四氟乙烯、或聚氯乙烯、葡聚糖、聚丙烯、或聚乙二醇组成的组的材料。
39.根据权利要求37所述的装置，其中所述探针包含选自由金、银、铁、铂、钯、铈和钛组成的组的金属。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的装置，其中所述探针包含纳米颗粒。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的装置，其中所述探针包含可与所述显色试剂反应以产生可检测信号的试剂。
42.根据权利要求41所述的装置，其中所述试剂包含与底物反应以形成强可见信号的酶。
43.根据权利要求42所述的装置，其中所述显色试剂包含所述底物。
44.根据权利要求42所述的装置，其中所述显色试剂包含结合所述酶的抗体。
45.根据权利要求41所述的装置，其中所述试剂包含与酶反应以形成强可见产物的底物。
46.根据权利要求45所述的装置，其中所述显色试剂包含所述酶。
47.根据权利要求42和46中任一项所述的装置，其中所述酶选自由碱性磷酸酶、辣根(或其他)过氧化物酶和葡萄糖氧化酶组成的组。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的装置，其中所述探针包含对所述ATPS的所述第一相溶液或所述第二相溶液具有亲和力的涂层。
49.根据权利要求48所述的装置，其中所述涂层包含选自由聚丙二醇、聚乙二醇、葡聚糖、亲水性蛋白和疏水性蛋白组成的组的材料。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的装置，其中所述装置包括两种或更多种探针，每种探针与不同的分析物相互作用。
51.根据权利要求50所述的装置，其中所述装置包括至少两种不同的探针、或至少3种不同的探针、或至少4种不同的探针、或至少5种不同的探针、或至少7种不同的探针、或至少10种不同的探针、或至少15种不同的探针、或至少20种不同的探针。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的装置，其中所述装置被配置成执行夹心测定。
53.一种双水相体系(ATPS)，其包含：
混合相溶液，所述混合相溶液分离成第一相溶液和第二相，其中，在LFA或其他多孔介质中使用时，所述第一相溶液成为前导相并且所述第二相溶液成为滞后相；以及
探针和/或显色试剂，所述探针与所述第一相溶液缔合，并且所述显色试剂与所述第二相溶液缔合。
54.根据权利要求53所述的双水相体系，其中所述ATPS选自由聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS组成的组。
55.根据权利要求54所述的双水相体系，其中所述ATPS的第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
56.根据权利要求54所述的双水相体系，其中所述ATPS是聚合物/盐ATPS。
57.根据权利要求56所述的双水相体系，其中所述ATPS是PEG/盐ATPS。
58.根据权利要求56-57中任一项所述的双水相体系，其中所述探针分配到所述聚合物/盐ATPS的富盐相中，并且所述显色试剂分配到所述聚合物/盐ATPS的富聚合物相中。
59.根据权利要求54所述的双水相体系，其中所述ATPS是胶束ATPS。
60.根据权利要求59所述的双水相体系，其中所述探针分配到所述ATPS的贫胶束相中，并且所述显色试剂分配到所述ATPS的富胶束相中。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的双水相体系，其中所述探针包含结合至所述目标分析物的结合部分。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在多孔介质中。
63.根据权利要求1-61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在纸中。
64.根据权利要求1-61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在侧流测定(LFA)中。
65.根据权利要求1-61中任一项所述的双水相体系，其中所述ATPS设置在流通系统中。
66.一种检测和/或量化分析物的方法，所述方法包括：
将样品施加到双水相体系(ATPS)中以使若存在于所述样品中的所述分析物浓缩到所述ATPS的一个相中，从而提供含有分析物的相；
将所述含有分析物的相施加到侧流测定(LFA)或流通测定中，其中检测探针在所述LFA或流通测定中结合至所述分析物；
将显色试剂施加到所述LFA或流通测定中，以增强由所述检测探针产生的信号；以及
检测和/或量化所述信号以指示所述样品中所述分析物的存在和/或量。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述侧流测定或流通测定是侧流测定。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述侧流测定或流通测定是流通测定。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中所述ATPS施加到纸上，并且当所述ATPS流过所述纸时相分离，从而提供“流动时浓缩的”ATPS。
70.根据权利要求69所述的方法，其中当施加到纸上时，所述ATPS产生更具疏水性的前导相和更具亲水性的滞后相。
71.根据权利要求69所述的方法，其中当施加到纸上时，所述ATPS产生更具亲水性的前导相和更具疏水性的滞后相。
72.根据权利要求66-71中任一项所述的方法，其中所述LFA或流通测定是其中结合部分捕获所述分析物并且其中所述检测探针结合至所述捕获的分析物的测定。
73.根据权利要求66-72中任一项所述的方法，其中从所述ATPS手动地或机械地移除所述含有分析物的相，然后将其施加到所述侧流测定。
74.根据权利要求73所述的方法，其中提供所述检测探针作为所述LFA或流通测定的组分。
75.根据权利要求73-74中任一项所述的方法，其中随后将所述显色试剂独立于所述ATPS而施加到所述侧流测定。
76.根据权利要求66-72中任一项所述的方法，其中所述探针和所述显色试剂均施加到所述ATPS上或提供于所述ATPS中，并且所述ATPS的所述组分被选择为基本上将所述探针分配到所述ATPS的第一相中，并且将所述显色试剂分配到所述ATPS的第二相中。
77.根据权利要求76所述的方法，其中当施加到纸基质上时，所述ATPS形成前导相和滞后相，并且所述前导相将所述浓缩分析物和所述探针递送至LFA测试条或流通测定，然后所述滞后相稍后将所述显色试剂递送至所述测试条或流通测定。
78.根据权利要求76-77中任一项所述的方法，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
79.根据权利要求76-77中任一项所述的方法，其中所述探针被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的疏水相中。
81.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中所述显色试剂被选择为极端地分配到所述ATPS的亲水相中。
82.根据权利要求66-81中任一项所述的方法，其中所述ATPS选自由聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS组成的组。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述ATPS的所述第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述ATPS是聚合物/盐ATPS。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述ATPS是PEG/盐ATPS。
86.根据权利要求84-85中任一项所述的方法，其中所述探针分配到所述聚合物/盐ATPS的富盐相中，并且所述显色试剂分配到所述聚合物/盐ATPS的富聚合物相中。
87.根据权利要求82所述的方法，其中所述ATPS是胶束ATPS。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述探针分配到所述ATPS的贫胶束相中，并且所述显色试剂分配到所述ATPS的富胶束相中。
89.根据权利要求66-88中任一项所述的方法，其中所述探针包含结合至所述目标分析物的结合部分。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述目标分析物包含选自由蛋白质、核酸、糖或凝集素、以及微生物组成的组的部分。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述目标分析物包含选自由细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类组成的组的微生物。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述目标分析物包含微生物的生物标志物。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述目标分析物包含选自由细菌、原生动物、真菌、病毒和藻类组成的组的微生物的生物标志物。
94.根据权利要求89-92中任一项所述的方法，其中所述结合部分选自由抗体或抗体片段、凝集素、核酸和适体组成的组。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述探针包含抗体或抗体片段。
96.根据权利要求66-95中任一项所述的方法，其中所述探针包含选自由合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物和塑料组成的组的材料。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述探针包含选自由聚乙烯、聚丙烯、纤维素、几丁质、尼龙、聚甲醛、聚四氟乙烯、或聚氯乙烯、葡聚糖、聚丙烯、或聚乙二醇组成的组的材料。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述探针包含选自由金、银、铁、铂、钯、铈和钛组成的组的金属。
99.根据权利要求66-98中任一项所述的装置，其中所述探针包含纳米颗粒。
100.根据权利要求66-99中任一项所述的方法，其中所述探针包含可与所述显色试剂反应以产生可检测信号的试剂。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述试剂包含与底物反应以形成强可见信号的酶。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述显色试剂包含所述底物。
103.根据权利要求101所述的方法，其中所述显色试剂包含结合所述酶的抗体。
104.根据权利要求100所述的方法，其中所述试剂包含与酶反应以形成强可见产物的底物。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述显色试剂包含所述酶。
106.根据权利要求101和105中任一项所述的方法，其中所述酶选自由碱性磷酸酶、辣根(或其他)过氧化物酶和葡萄糖氧化酶组成的组。
107.根据权利要求66-106中任一项所述的装置，其中所述探针包含对所述ATPS的所述第一相溶液或所述第二相溶液具有亲和力的涂层。
108.根据权利要求107所述的装置，其中所述涂层包含选自由聚丙二醇、聚乙二醇、葡聚糖、亲水性蛋白和疏水性蛋白组成的组的材料。
109.根据权利要求66-108中任一项所述的方法，其中所述方法使用根据权利要求1-52中任一项所述的装置进行。
110.一种用于检测和/或量化分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：
根据权利要求1-52中任一项所述的装置；以及
用于收集样品的收集装置。
111.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于收集口腔液的装置。
112.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于收集血液的装置。
113.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括尿液收集装置。
114.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于收集阴道液或子宫颈内拭子的装置。
115.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述收集装置包括用于环境样品的装置。
116.一种纯化和扩增核酸的方法，所述方法包括：
提供包含混合相溶液的双水相体系(ATPS)，所述混合相溶液分离成第一相溶液和第二相溶液，其中所述ATPS是核酸将分配到所述第一相溶液或所述第二相溶液中的ATPS，或者所述ATPS是核酸将定位于所述第一相溶液与所述第二相溶液之间的界面中的ATPS；
将包含核酸的样品引入所述ATPS中，其中所述核酸分配到所述第一相溶液或所述第二相溶液或所述第一相溶液与所述第二相溶液之间的所述界面中，从而得到浓缩核酸；以及
在核酸扩增反应中扩增所述浓缩核酸以产生扩增的核酸。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述核酸是DNA。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述核酸是RNA。
119.根据权利要求116所述的方法，其中所述核酸是从RNA逆转录的DNA。
120.根据权利要求116-119中任一项所述的方法，其中所述ATPS选自由聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS组成的组。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述ATPS的所述第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
122.根据权利要求116-121中任一项所述的方法，其中所述扩增包括：
从所述第一相回收所述浓缩核酸，方法包括从所述第一相溶液或所述第二相溶液或所述第一相溶液与所述第二相溶液之间的所述界面回收所述核酸，从而得到回收的浓缩核酸；以及
将所述回收的浓缩核酸引入核酸扩增反应中以扩增所述核酸。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)反应体系。
124.根据权利要求122所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括等温扩增体系。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括选自由自持序列反应(3SR)、基于核酸的转录测定(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、茎环扩增、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、等温多重置换扩增(IMDA)、单引物等温扩增(SPIA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)组成的组的扩增体系。
126.根据权利要求116-121中任一项所述的方法，其中所述扩增包括将用于等温核酸扩增的试剂与所述ATPS组合。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括等温扩增体系。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括选自由自持序列反应(3SR)、基于核酸的转录测定(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、茎环扩增、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、等温多重置换扩增(IMDA)、单引物等温扩增(SPIA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)组成的组的扩增体系。
129.根据权利要求127-128中任一项所述的方法，其中所述方法包括在室温下或在低于室温的温度下进行所述等温扩增。
130.根据权利要求127-128中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包含用于等温扩增的试剂的所述ATPS加热至基本上恒定的温度。
131.根据权利要求127-130中任一项所述的方法，其中所述扩增包括解旋酶依赖性扩增，并且在约65℃的恒定温度下进行。
132.根据权利要求126-131中任一项所述的方法，其中所述方法在单个容器中进行。
133.根据权利要求126-131中任一项所述的方法，其中对多个核酸样品进行所述方法，且不同的样品各置于多孔板的孔中。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述多个样品包括至少2个样品、或至少4个样品、或至少8个样品、或至少16个样品、或至少32个样品、或至少64个样品、或至少128个样品。
135.根据权利要求126-131中任一项所述的方法，其中所述方法在微流体系统(例如，芯片实验室)的腔室或通道中进行。
136.根据权利要求116-135中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞裂解物。
137.根据权利要求116-135中任一项所述的方法，其中所述样品是核酸。
138.根据权利要求116-135中任一项所述的方法，其中所述样品包含完整细胞，并且所述ATPS是裂解细胞的ATPS。
139.根据权利要求116-138中任一项所述的方法，其中所述ATPS是胶束ATPS。
140.根据权利要求116-138中任一项所述的方法，其中所述样品包含血液或血斑，并且所述ATPS是重新溶解血斑的ATPS。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述ATPS包含PEG/葡聚糖ATPS。
142.根据权利要求140所述的方法，其中所述ATPS包含UCON/葡聚糖ATPS。
143.一种用于纯化和扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
包含双水相体系(ATPS)的组分的容器；以及
包含等温核酸扩增体系的一种或多种组分的容器。
144.根据权利要求143所述的试剂盒，其中包含ATPS组分的所述容器和包含等温核酸扩增体系组分的所述容器是同一容器。
145.根据权利要求143所述的试剂盒，其中包含ATPS组分的所述容器和包含等温核酸扩增体系组分的所述容器是不同容器。
146.根据权利要求143-145中任一项所述的试剂盒，其中包含等温核酸扩增体系的一种或多种组分的所述容器包含选自由自持序列反应(3SR)、基于核酸的转录测定(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、茎环扩增、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、等温多重置换扩增(IMDA)、单引物等温扩增(SPIA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)组成的组的扩增体系的一种或多种组分。
147.根据权利要求146所述的试剂盒，其中所述一种或多种组分包含进行所述核酸扩增反应的酶。
148.根据权利要求146所述的试剂盒，其中所述一种或多种组分包括解旋酶。
149.根据权利要求143-148中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS选自由聚合物/盐ATPS、聚合物/聚合物ATPS、胶束/聚合物ATPS和胶束ATPS组成的组。
150.根据权利要求149所述的试剂盒，其中所述ATPS的所述第一相溶液包含表1的组分1，并且所述ATPS的第二相溶液包含表1的组分2。
151.根据权利要求143-149中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS包含胶束ATPS。
152.根据权利要求143-149中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS包含PEG/葡聚糖ATPS。
153.根据权利要求143-149中任一项所述的试剂盒，其中所述ATPS包含UCON/葡聚糖ATPS。
154.根据权利要求143-153中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含说明材料，所述说明材料提供用于执行根据权利要求126-142中任一项所述的方法的方案。
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