ES2939842T3 - Concentración de biomarcadores y amplificación de la señal para su uso en inmunoensayos en papel - Google Patents

Concentración de biomarcadores y amplificación de la señal para su uso en inmunoensayos en papel Download PDF

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Abstract

En diversas realizaciones se proporcionan métodos y dispositivos para la detección y/o cuantificación de un analito. En ciertas realizaciones, se proporciona un dispositivo que comprende un sistema acuoso de dos fases (ATPS) que comprende una solución de fase mixta que se separa en una solución de primera fase y una segunda fase donde, en uso, dicha solución de primera fase se convierte en una fase principal y dicha solución de segunda fase la solución se convierte en una fase rezagada; un ensayo de flujo lateral (LFA); y una sonda y/o un reactivo de desarrollo, cuando en uso, dicha sonda se asocia con dicha solución de primera fase en dicha fase principal de dicho ATPS y/o dicho reactivo de desarrollo se asocia con dicha solución de segunda fase en dicha fase retrasada de dicho ATPS. En ciertas realizaciones, se proporciona un sistema de "un solo recipiente" para purificar y amplificar un ácido nucleico utilizando, por ejemplo, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Concentración de biomarcadores y amplificación de la señal para su uso en inmunoensayos en papel
Antecedentes
Se han utilizado ensayos para detectar la presencia o la concentración de diversas sustancias o patógenos en fluidos biológicos. En un inmunoensayo en fase sólida, un receptor, normalmente un anticuerpo que es específico para el ligando que se va a detectar, está inmovilizado sobre un soporte sólido. Un fluido de prueba que puede comprender el analito que se va a detectar se pone en contacto con el soporte sólido y se forma un par receptor-analito cuando el analito diana está presente. Para hacer visible el par receptor-ligando, se pueden usar anticuerpos marcados que se unen al par receptor-ligando seguido de detección visual del anticuerpo marcado unido al par receptor-ligando.
El dispositivo de diagnóstico de punto de atención más comercializado es el inmunoensayo de flujo lateral (LFA), por su bajo costo y sencillez. En los llamados ensayos de flujo lateral típicos, un fluido que potencialmente contiene el analito que se va a detectar se aplica a un extremo de una capa de membrana porosa y fluye en dirección lateral a través de la membrana bajo la acción de fuerzas capilares para ser capturado por un "receptor" inmovilizado que es capaz de unirse al analito que se va a detectar. Los LFA a menudo incorporan un llamado inmunoensayo de tipo sándwich, en el que el analito se intercala entre un anticuerpo marcado y un anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido.
El LFA, sin embargo, sufre de una sensibilidad inferior en comparación con los ensayos de laboratorio, tal como ELISA. Si bien se ha realizado un esfuerzo significativo para mejorar la sensibilidad del LFA, muchos de estos enfoques han dependido del uso de costosos lectores electrónicos o han requerido de múltiples pasos por parte del usuario que restan valor a la naturaleza de punto de atención del LFA.
De igual manera, si bien se han realizado esfuerzos para diseñar pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT) fáciles de usar para el punto de atención para la detección de ADN, estas a menudo carecen de sensibilidad debido a la simplificación excesiva o sacrifican la facilidad de uso para conservar la precisión de la prueba. Así mismo, las NAAT actuales en el punto de atención (POC) aún requieren normalmente equipos para analizar y procesar muestras. Por tanto, no hay NAAT para POC comercializadas que sean completamente independientes o portátiles.
El documento WO 2015/134938 A1 se refiere a dispositivos y métodos que usan sistemas acuosos de dos fases y ensayos de flujo lateral para detectar analitos diana en una muestra. Estos dispositivos y métodos pueden usarse para diagnosticar una enfermedad o condición en una muestra biológica, tal como sangre o suero. Además, estos dispositivos y métodos pueden usarse para detectar alérgenos en muestras de alimentos o contaminantes, tal como toxinas ambientales, en muestras de agua.
Chiu et. al., (2015). PLoS ONE 10(11):e0142654 se refiere a un LFA con un sistema acuoso de dos fases que emplea el enfoque de concentrar nanopartículas de oro, un indicador colorimétrico de LFA común.
El documento WO2011159537A3 se refiere a un método y un dispositivo del punto de atención para detectar analitos mediante la combinación de un sistema de fluidos complejo con el inmunoensayo de flujo lateral.
Mashayekhi, Foad, et al. Concentration of mammalian genomic DNA using two-phase aqueous micellar systems. Biotechnology and bioengineering 102.6 (2009): 1613-1623 estudiaron el comportamiento de partición de fragmentos de ADN genómico de mamíferos en un sistema micelar acuoso de dos fases.
Mashayekhi, Foad, et al. Enhancing the lateral-flow immunoassay for viral detection using an aqueous two-phase micellar system. Analytical and bioanalytical chemistry 398.7 (2010): 2955-2961 estudiaron un sistema micelar acuoso de dos fases que comprende el tensioactivo no iónico Triton X-114 para concentrar un virus modelo antes del ensayo inmunológico de flujo lateral.
Sumario
La invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto, se proporciona un dispositivo para la detección y/o cuantificación de un analito en una muestra, en donde
(a) dicho dispositivo comprende:
un sistema acuoso de dos fases (ATPS) que comprende una solución de fase mixta que se separa en una solución de primera fase y una solución de segunda fase donde, durante su uso, dicha solución de primera fase se convierte en una fase avanzada y dicha solución de segunda fase se convierte en una fase retrasada; un ensayo de flujo lateral (LFA) o un ensayo de flujo continuo; y
una sonda que se asocia con dicha solución de primera fase en dicha fase avanzada de dicho ATPS y un reactivo de revelado que se asocia con dicha solución de segunda fase en dicha fase retrasada de dicho ATPS; o
(b) dicho dispositivo comprende:
un sistema de flujo continuo que comprende:
un componente de concentración que comprende un sistema acuoso de dos fases (ATPS) que comprende una solución de fase mixta donde, durante su uso, dicha solución de primera fase se convierte en una fase avanzada y dicha solución de segunda fase se convierte en una fase retrasada;
una sonda que se asocia con dicha solución de primera fase en dicha fase avanzada de dicho ATPS; y
un reactivo de desarrollo que se asocia con dicha solución de segunda fase en dicha fase retrasada de dicho ATPS; y
un componente de detección dispuesto debajo de dicho componente de concentración;
en donde, para el dispositivo (a) y el dispositivo (b), dicha sonda comprende una enzima decorada en la superficie de dicha sonda y dicho reactivo de revelado comprende un sustrato que reacciona con dicha enzima para formar un producto visible, o dicha sonda está decorada con un sustrato enzimático y dicho reactivo de revelado comprende una enzima que reacciona con dicho sustrato enzimático para formar un producto visible, o dicho reactivo de revelado comprende un reactivo que reacciona con dicha sonda para formar una señal visible.
En una realización, dicha sonda comprende una enzima decorada en la superficie de dicha sonda donde dicha enzima comprende fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante u otra, o glucosa oxidasa, y dicho reactivo de revelado comprende un sustrato para dicha enzima; o
dicho reactivo de revelado comprende una enzima donde dicha enzima comprende fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante u otra, o glucosa oxidasa, y dicha sonda comprende un sustrato para dicha enzima; o
dicha sonda comprende una partícula de oro y dicho reactivo de revelado comprende plata.
En una realización, el LFA comprende una matriz porosa que está configurada para recibir y/o contener dicho ATPS o los componentes del mismo y dicha sonda y dicho reactivo de revelado.
En una realización, dicho LFA comprende una almohadilla de conjugado, una línea de prueba que comprende un anticuerpo que se une a dicho analito, opcionalmente, una línea de control que comprende un anticuerpo secundario, opcionalmente una almohadilla absorbente y opcionalmente una almohadilla de muestra.
En una realización, dicho componente de concentración comprende una o más capas de un papel.
En una realización, dicho componente de detección comprende una almohadilla de conjugado, una almohadilla de reacción y, opcionalmente, un sumidero.
En una realización, dicho dispositivo está configurado para que dicho ATPS se combine con dicha muestra antes de la aplicación a dicho dispositivo.
En una realización, dicho ATPS se deshidrata en el ensayo de flujo lateral o en un componente de concentración de un ensayo de flujo continuo antes de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra y dicha sonda se deshidrata en el ensayo de flujo lateral o en un componente de concentración de un ensayo de flujo continuo antes de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra y dicho reactivo de revelado se deshidrate en el ensayo de flujo lateral o en un componente de concentración de un ensayo de flujo continuo antes de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra.
En una realización, el ATPS comprende una solución de fase mixta que se separa en una solución de primera fase hidrófila y una solución de segunda fase hidrófoba después de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra y dicha sonda se selecciona para dividirse extremadamente en dicha fase hidrófila de dicho ATPS, y dicho reactivo de revelado se selecciona para una partición extrema en dicha fase hidrófoba de dicho ATPS.
En una realización, dicho ATPS se selecciona del grupo que consiste en un ATPS de polímero/sal, un ATPS de polímero/polímero, un ATPS micelar/polímero y un ATPS micelar.
En una realización, dicha solución de primera fase de dicho ATPS comprende un Componente 1 de la Tabla 1.
En una realización, dicha solución de segunda fase de dicho ATPS comprende un Componente 2 de la Tabla 1. En una realización, dicha solución de primera fase de dicho ATPS comprende un Componente 1 de la Tabla 1 y solución de segunda fase de dicho ATPS comprende un Componente 2 de la Tabla 1.
En una realización, dicho ATPS es un ATPS de polímero/sal.
En una realización, dicho ATPS es un ATPS de PEG/sal.
En una realización, dicho ATPS es un ATPS de PEG/sal y dicha sonda se divide en una fase rica en sal de dicho ATPS de polímero/sal y dicho reactivo de revelado se divide en una fase rica en polímero de dicho ATPS de polímero/sal.
En una realización, dicho ATPS es un ATPS micelar y dicha sonda se divide en una fase pobre en micelas de dicho ATPS y dicho reactivo de revelado se divide en una fase rica en micelas de dicho ATPS.
En una realización, dicha sonda comprende una fracción de unión que se une a dicho analito diana, que se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una lectina, un ácido nucleico y un aptámero.
Dicho analito diana puede comprender una fracción seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un ácido nucleico, un azúcar o lectina, y un microorganismo, en donde opcionalmente dicho analito diana puede comprender un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en una bacteria, un protozoario, un hongo, un virus y un alga.
Dicho analito diana puede comprender un biomarcador para un microorganismo, en donde opcionalmente dicho analito diana puede comprender un biomarcador para un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en una bacteria, un protozoario, un hongo, un virus y un alga o un biomarcador de una enfermedad, un biomarcador de la inocuidad (o peligro) de los alimentos, o un biomarcador para un agente bioterrorista.
En una realización, dicha sonda comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
En una realización, dicha sonda comprende un material seleccionado del grupo que consiste en un polímero sintético, un metal, un mineral, un vidrio, un cuarzo, una cerámica, un polímero biológico, y un plástico, opcionalmente en donde dicha sonda comprende un material seleccionado del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, celulosa, quitina, nailon, polioximetileno, politetrafluoroetileno o cloruro de polivinilo, dextrano, polipropileno o polietilenglicol, o dicha sonda comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en oro, plata, hierro, platino, paladio, cerio y titanio, o dicha sonda comprende una nanopartícula.
En una realización, dicha sonda comprende un recubrimiento que tiene afinidad por la solución de primera fase de dicho ATPS, opcionalmente en donde dicho recubrimiento comprende un material seleccionado del grupo que consiste en polipropilenglicol, polietilenglicol, dextrano y una proteína hidrófila.
En otro aspecto, se proporciona un sistema acuoso de dos fases (ATPS) que comprende:
(a) una solución de fase mixta que es capaz de separarse en una solución de primera fase que es una solución de fase avanzada y una solución de segunda fase que es una fase retrasada, para su uso en un LFA o ensayo de flujo continuo;
(b) una sonda que se asocia con dicha solución de primera fase en dicha fase avanzada de dicho ATPS; y (c) un reactivo de revelado que se asocia con dicha solución de segunda fase en dicha fase retrasada de dicho ATPS.
En una realización en el sistema acuoso de dos fases, dicho ATPS se selecciona del grupo que consiste en un ATPS de polímero/sal, un ATPS de polímero/polímero, un ATPS micelar/polímero y un ATPS micelar. Por ejemplo, la solución de primera fase de dicho ATPs puede comprender un Componente 1 de la Tabla 1 y la solución de segunda fase de dicho ATPS comprende un Componente 2 de la Tabla 1.
En una realización, dicho ATPS es un ATPS de polímero/sal, por ejemplo, un ATPS de PEG/sal. La sonda puede dividirse en una fase rica en sal de dicho ATPS de polímero/sal y dicho reactivo de revelado puede dividirse en una fase rica en polímero de dicho ATPS de polímero/sal.
En una realización, dicho ATPS es un ATPS micelar. Dicha sonda puede dividirse en una fase pobre en micelas de dicho ATPS y dicho reactivo de revelado puede dividirse en una fase rica en micelas de dicho ATPS.
En la realización del sistema acuoso de dos fases, dicha sonda puede comprender una fracción de unión que se une a dicho analito diana, dicho ATPS se puede disponer en un medio poroso, dicho ATPS se puede disponer en un papel, dicho ATPS se puede disponer en un ensayo de flujo lateral (LFA), y/o dicho ATP se puede disponer en un sistema de flujo continuo.
En otro aspecto, se proporciona un método para detectar y/o cuantificar un analito, comprendiendo dicho método:
(a) aplicar una muestra a un sistema acuoso de dos fases (ATPS) para concentrar dicho analito, si está presente en dicha muestra, en una fase del ATPS para proporcionar una fase que contiene analito usando un dispositivo de acuerdo con el primer aspecto de la invención, donde dicha sonda se une a dicho analito y, a continuación, dicha sonda se pone en contacto con dicho reactivo de revelado para proporcionar una señal mejorada; y
(b) detectar y/o cuantificar dicha señal para indicar la presencia y/o cantidad de dicho analito en dicha muestra.
Definiciones
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural.
Los términos "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales en el presente documento se refieren a al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un ácido nucleico de la presente invención es preferentemente monocatenario o bicatenario y generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se describe a continuación, se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternas, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10): 1925) y referencias en el mismo; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Jolley et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; y Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 141 9), fosforotioato (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; y la patente de Estados Unidos N.° 5.644.048, fosforoditioato (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321, enlaces de O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", Oxford University Press), y enlaces y cadenas principales de ácidos nucleicos peptídicos (véase Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc.
114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008; Nielsen (1993) Nature, 365: 566; Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con cadenas principales positivas (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097; cadenas principales no iónicas (Patentes de Ee . UU. N.° 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y cadenas principales sin ribosa, incluidas las descritas en las patentes de EE. UU. N.° 5.235.033 y 5.034.506, y los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos. (véase Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. págs.
169-176). Varios análogos de ácidos nucleicos se describen en Rawls, C & E News 2 de junio de 1997 página 35. Estas modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato se pueden realizar para facilitar la adición de fracciones adicionales, tales como marcadores, o para aumentar la estabilidad y la semivida de dichas moléculas en entornos fisiológicos. Además, es posible que los ácidos nucleicos de la presente invención puedan ser alternativamente de triple cadena.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de la región variable de la inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Se sabe que una unidad estructural típica de la inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. Las expresiones cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente.
Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como una cantidad de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 por un enlace disulfuro. El F(ab) '2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra convirtiendo de este modo el dímero (Fab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, "Fundamental Immunology", W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Si bien varios fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos Fab' pueden sintetizarse de novo ya sea químicamente o usando la metodología del ADN recombinante. Por tanto, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de cadena sencilla (anticuerpos que existen como una sola cadena polipeptídica), más preferentemente anticuerpos Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) en los que una cadena pesada variable y una cadena ligera variable se unen (directamente o a través de un conector peptídico) para formar un polipéptido continuo. El anticuerpo Fv de cadena sencilla es un heterodímero Vh-Vl unido covalentemente que puede expresarse a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias codificantes de Vh y Vl unidas directamente o unidas por un conector codificante de péptido. Houston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883. Aunque Vh y Vl están conectados entre sí como una sola cadena polipeptídica, los dominios Vh y Vl se asocian de forma no covalente. Las primeras moléculas de anticuerpos funcionales que se expresaron en la superficie de los fagos filamentosos fueron las de Fv de cadena sencilla (scFv), sin embargo, las estrategias de expresión alternativas también han tenido éxito. Por ejemplo, las moléculas de Fab se pueden mostrar en el fago si una de las cadenas (pesada o ligera) se fusiona con la proteína de la cápside g3 y la cadena complementaria se exporta al periplasma como una molécula soluble. Las dos cadenas pueden codificarse en el mismo o en diferentes replicones; el punto importante es que las dos cadenas de anticuerpo en cada molécula de Fab se ensamblan después de la traducción y el dímero se incorpora a la partícula del fago a través del enlace de una de las cadenas para, por ejemplo, g3p (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.°: 5733743). Los anticuerpos scFv y una serie de otras estructuras que convierten las cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas de origen natural agregadas, pero químicamente separadas, de una región V de anticuerpo en una molécula que se pliega en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno son conocidos por los expertos en la materia. (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.091.513, 5.132.405 y 4.956.778). Los anticuerpos particularmente preferidos deben incluir todos los que se han mostrado en el fago (por ejemplo, scFv, Fv, Fab y Fv enlazado por disulfuro (Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8: 1323-1331).
Un aptámero es un análogo de anticuerpo formado a partir de ácidos nucleicos. Una aptazima es un análogo de enzima, formado a partir de ácidos nucleicos. En concreto, una aptazima puede funcionar para cambiar la configuración para capturar una molécula específica, sólo en presencia de un segundo analito específico. Es posible que los aptámeros ni siquiera requieran de la unión del primer marcador para ser detectados en algunos ensayos, como nano-CHEM-FET, donde la reconfiguración se detectaría directamente.
La expresión "fracción de unión" o miembro de un "par de unión" se refiere a moléculas que se unen específicamente a otras moléculas, células, microorganismos, y similares para formar un complejo de unión tal como anticuerpoantígeno, lectina-carbohidrato, ácido nucleico-ácido nucleico, biotina-avidina, etc. Dichas fracciones de unión incluyen, pero sin limitación, ácidos nucleicos monoméricos o poliméricos, aptámeros, aptazimas, proteínas, polisacáridos, azúcares, lectinas y similares (véase, por ejemplo, Haugland, "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" (Sexta edición)), y cualquiera de las moléculas capaces de formar un par de unión como se ha descrito anteriormente.
La expresión "se une específicamente" indica que la molécula se une preferentemente a la diana de interés o se une con mayor afinidad a la diana (analito) que a otras moléculas. Por ejemplo, un anticuerpo se unirá selectivamente al antígeno contra el que se generó. Una molécula de ADN se unirá a una secuencia sustancialmente complementaria y no a secuencias no relacionadas en condiciones estrictas. La unión específica puede referirse a una reacción de unión que determina la presencia de una diana en una población heterogénea de moléculas (por ejemplo, proteínas y otros productos biológicos). Por tanto, en condiciones designadas (por ejemplo, condiciones de inmunoensayo en el caso de un anticuerpo o condiciones de hibridación estrictas en el caso de un ácido nucleico), el ligando o anticuerpo específico se une a su molécula "diana" particular y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en la muestra.
La expresión moléculas orgánicas pequeñas se refiere a moléculas de un tamaño comparable a las moléculas orgánicas generalmente usadas en productos farmacéuticos. La expresión excluye macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían en tamaño hasta aproximadamente 5.000 Da, más preferentemente hasta 2.000 Da, y lo más preferentemente hasta aproximadamente 1.000 Da.
El término analito se refiere a cualquier fracción que se va a detectar. Los analitos incluyen, pero sin limitación, biomoléculas particulares (proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos), bacterias o componentes de las mismas, virus o componentes de los mismos (por ejemplo, proteínas de la cubierta), hongos o componentes de los mismos, protozoos o componentes de los mismos, fármacos, toxinas, patógenos alimentarios, y similares.
El término "papel", como se usa en el presente documento, aunque no se limita a láminas delgadas de pulpa de madera u otras sustancias vegetales fibrosas, en determinadas realizaciones, se contempla el uso de dichos papeles en los dispositivos descritos en el presente documento. Los papeles más generalmente se refieren a materiales porosos a menudo en forma de lámina, pero no de forma limitativa, que permiten el paso de un fluido.
En algunas realizaciones, la matriz porosa es lo suficientemente porosa para permitir que la solución de fase mixta, solución de primera fase y/o solución de segunda fase de un sistema acuoso de dos fases (ATPS) y/o el analito diana, fluyan a través del LFA. En algunas realizaciones, la matriz porosa es lo suficientemente larga y/o lo suficientemente profunda para que la solución de fase mixta, la solución de primera fase y/o la solución de segunda fase y/o el analito diana, fluyan vertical y/u horizontalmente a través del LFA o del dispositivo de ensayo de manchas. En algunas realizaciones, la solución de primera fase fluye a través de la matriz porosa a una primera velocidad y la solución de segunda fase fluye a través de la matriz porosa a una segunda velocidad, donde la primera velocidad y la segunda velocidad son diferentes. En algunas realizaciones del LFA o ensayo de manchas, la matriz porosa comprende, entre otras cosas, un material tal como una cerámica de vidrio sinterizado, un mineral, celulosa, una fibra de vidrio, una nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno, un nailon, un nailon modificado por carga, una poliétersulfona, combinaciones de los mismos y similares.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un esquema de una tira reactiva típica del inmunoensayo de flujo lateral (arriba) y el formato tipo sándwich de un inmunoensayo de flujo lateral (abajo).
La Figura 2 ilustra esquemáticamente una realización de la separación del sistema acuoso de dos fases (ATPS) en papel usado junto con un ensayo de flujo lateral (LFA) para concentrar un analito diana (por ejemplo, un biomarcador) y administrar reactivos de revelado para mejorar la señal. Como se muestra, una tira de LFA se sumerge en una solución de ATPS (1) que contiene el analito diana (por ejemplo, un biomarcador), una sonda (por ejemplo, una sonda colorimétrica), y uno o más reactivos de revelado. El ATPS se separará en fase avanzada y retrasada. En primer lugar, la fase avanzada (2) suministra los analitos diana concentrados (por ejemplo, biomarcadores) y las sondas colorimétricas a la región de detección. Esto es seguido por el flujo de la fase retrasada (3) que fluye a través de la zona de detección, que suministra el reactivo de revelado para mejorar la señal de LFA. El rosa corresponde a la sonda colorimétrica, mientras que el amarillo representa el reactivo de desarrollo.
La Figura 3 muestra la partición de ALP-GNP extremadamente en la parte inferior, fase rica en sal de un ATPS de PEG-sal (izquierda) y la partición de NBT/BCIP extremadamente en la parte superior, fase rica en PEG de un ATPS de PEG/sal (derecha).
La Figura 4 ilustra la detección de la proteína modelo transferrina a baja concentración solo con LFA (izquierda) en comparación con el nuevo diseño de LFA ATPS NBT/BCIP que muestra una mejora de la señal con éxito sin ningún paso adicional por parte del usuario.
La Figura 5 muestra una demostración visual de la partición de la sangre en un ATPS de PEG-Dextrano.
La Figura 6 muestra la concentración de ADN eluido de manchas secas de sangre en el ATPS de PEG/Dextrano. Las concentraciones de ADN medidas usando el ensayo de fluorescencia Quant-iT™ mostraron una concentración de ADN significativamente mayor en la fase inferior en comparación con la fase superior del ATPS de PEG/Dextrano (p < 0,01, n = 3). Estos resultados muestran la elución de ADN de manchas secas de sangre (DBS) hechas en papel de fibra de vidrio tratado con trehalosa y albúmina de suero bovino (BSA).
La Figura 7 ilustra una comparación de la concentración de ADN en la parte inferior, fase rica en dextrano de ATPS de PEG/Dextrano, y ambas fases de ATPS de UCON/Dextrano, antes y después de la amplificación. La amplificación se logró en todas las composiciones de fase ensayadas. Las relaciones de 9:1 y 1:9 indican las relaciones de volumen entre las fases superior e inferior.
La Figura 8 muestra el número medio de ciclos de amplificación de qPCR de ADN con y sin la presencia de polímeros de ATPS. Las gráficas de amplificación (mostradas en púrpura) para ADN en agua y ADN en la parte inferior, la fase rica en dextrano de un ATPS de PEG/dextrano se generaron a partir de la intensidad de fluorescencia del colorante indicador. La línea verde en el gráfico indica el umbral de intensidad de fluorescencia del colorante indicador. El número de ciclo en la intersección de las curvas de amplificación púrpuras y el umbral de fluorescencia, también conocido como el ciclo umbral, indica la concentración de ADN diana en la reacción de qPCR. El umbral medio de los números de ciclo para la amplificación de ADN en agua y la amplificación de ADN en la fase rica en dextrano del ATPS de PEG/dextrano son de 32 y 31, respectivamente. Los números de ciclo se compararon usando una prueba t de Student (p < 0,01, n=3) y no mostró significancia estadística entre los dos métodos.
La Figura 9 ilustra un esquema de una realización de la amplificación de ADN usando una reacción de ATPS y tHDA en un recipiente.
La Figura 10 muestra una comparación de una reacción de ATPS y tHDA en un recipiente con la reacción de solo tHDA. El carril 1 no muestra amplificación de 7,7 x 104 células con solo tHDA. Los carriles 2-4 muestran una amplificación exitosa de un producto diana de 100 pb usando la reacción de un recipiente con muestras que contienen 7,7 x 104, 1,6 x 104 células, y 1,7 x 103 células, respectivamente. En los carriles 5 y 6, la reacción de un recipiente se realizó con 102 células, donde el carril 6 muestra con precisión la presencia de la banda diana de 100 pb. La banda secundaria que aparece en los carriles 5 y 6 es un subproducto de artefacto no específico de la realización de la amplificación cuando el número de células cae por debajo de un valor de umbral.
La Figura 11 muestra una realización esquemática de una prueba de manchas todo en uno para la detección de analitos diana (por ejemplo, biomoléculas). Los componentes de ATPS y el indicador colorimétrico (u otro) se deshidratan sobre el componente de concentración y la almohadilla de conjugado, respectivamente. El usuario puede simplemente aplicar la solución muestra al dispositivo, después de lo cual, los componentes se rehidratan y la concentración de las biomoléculas diana se produce dentro del componente de concentración. Posteriormente, los analitos se unirán al indicador colorimétrico en la almohadilla de conjugado y los complejos indicador-diana resultantes se capturarán en la almohadilla de reacción como se será mostrado por una mancha visible.
La Figura 12 muestra los coeficientes de partición de tres tipos de ADN en el sistema de un recipiente. El ADN genómico y el fragmento de ADN de 100 pb se dividieron preferentemente hacia la fase superior, mientras que el fragmento de ADN más pequeño de 25 pb se dividió uniformemente entre las dos fases.
La Figura 13 muestra los resultados de la amplificación de ADN con solo tHDA (izquierda) y con la plataforma de un recipiente (derecha). La reacción de solo tHDA amplificó con éxito el ADN de una muestra que contenía 106 ufc/ml de E. coli, mientras que la plataforma de un recipiente amplificó con éxito el ADN de muestras que contenían 106 y 105 ufc/ml de E. coli. "L" indica los carriles que contienen la escalera de ADN.
La Figura 14 muestra imágenes de series temporales de la automatización, LFA con señal mejorada llevado a cabo a 3,2 ng/pl de CT. El oscurecimiento de las líneas de prueba y control a lo largo del tiempo con una señal de fondo mínima indica la capacidad del ATPS para automatizar las reacciones de mejora de la señal.
La Figura 15 muestra que el LFA con ATPS y mejora de señal logró una mejora de 30 veces en el límite de detección de CT. El LFA convencional detectó CT a 10 ng/pl, mientras que el LFA mejorado detectó CT a 0,32 ng/pl.
Descripción detallada
En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos y dispositivos que aumentan significativamente la sensibilidad del ensayo de flujo lateral. En varias realizaciones, la sensibilidad de LFA (o ensayo de flujo continuo) aumenta significativamente mediante la integración del sistema acuoso de dos fases (ATPS) y las reacciones de mejora de la señal. En determinadas realizaciones, el ATPS cumple una doble función para concentrar el biomarcador diana, así como para administrar secuencialmente reactivos de mejora de la señal a través de la zona de detección de LFA (o análisis de flujo). Esta novedosa integración de tecnologías permite mejorar la sensibilidad de LFA (o ensayo de flujo continuo) mientras mantiene un solo paso de aplicación por parte del usuario y un dispositivo de bajo costo.
En el presente documento también se proporcionan métodos y dispositivos para pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT) simples y efectivas. Los métodos reducen significativamente los pasos para producir una NAAT portátil mediante la combinación de sistemas acuosos de dos fases (ATPS) con amplificación de ADN. El producto final es una plataforma única que combina la preparación de la muestra y la amplificación del ADN en un solo paso. A pesar de la simplificación, estas pruebas tienen una mayor sensibilidad y precisión en comparación con las NAAT actuales que requieren múltiples pasos complejos, equipos y personal capacitado para lograr el mismo resultado. Así mismo, con esta plataforma de un solo paso, los parámetros se pueden ajustar fácilmente para ampliar su aplicación para la detección de diversas enfermedades infecciosas, convirtiéndolo en un diagnóstico NAAT verdaderamente independiente para su uso en países en desarrollo.
En determinadas realizaciones, los métodos y dispositivos descritos en el presente documento se pueden proporcionar para la recogida, extracción, concentración y detección de analitos para aplicaciones clínicas. En determinadas realizaciones, los métodos y los dispositivos permiten la rápida detección y/o cuantificación de bacterias, hongos y virus en muestras biológicas (por ejemplo, fluido oral o muestra de tejido, orina, sangre o fracción de sangre, líquido cefalorraquídeo, linfa, biopsias de tejido, muestras vaginales, y similares), muestras de alimentos, muestras ambientales y similares.
En determinadas realizaciones, los ensayos y dispositivos proporcionados en el presente documento son precisos, sensibles, portátiles, desechables y muy adecuados para su uso en el punto de atención, para pruebas ambientales de campo, pruebas de campo de alimentos y similares, con mínimo entrenamiento o equipo.
Métodos y dispositivos que aumentan la sensibilidad del LFA (o análisis de flujo).
En varias realizaciones, las capacidades de concentración del ATPS se pueden usar junto con el LFA (o ensayo de flujo continuo) para lograr mejoras significativas (por ejemplo, 10-100 veces o más) en el límite de detección de LFA (o análisis de flujo), acercándose a la sensibilidad de los ensayos de laboratorio, tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (véase, por ejemplo, Número de publicación PCT: WO 2015/134938 (PCT/US2015/019297), y solicitud en trámite USSN 62/214.801, presentada el 4 de septiembre de 2015 para los métodos y dispositivos divulgados en la misma. Para usar el ATPS para la concentración de analito, la muestra de interés normalmente se aplica al ATPS donde se distribuyen, o dividen, los analitos agregados, entre las dos fases acuosas en función de diferentes propiedades físicas y químicas, tal como el tamaño y la hidrofilicidad. Los analitos que se dividen de manera extrema en una de las dos fases se pueden concentrar en esa fase al disminuir drásticamente su volumen. La naturaleza acuosa del sistema también puede proporcionar un entorno suave para las biomoléculas, estabilizando su estructura y actividades biológicas.
Es común que muchas proteínas se dividan de manera bastante uniforme entre las dos fases de un ATPS, dando como resultado una mala capacidad de concentración. Con el fin de mejorar la capacidad del ATPS para concentrar proteínas (u otros analitos), pueden usarse varias sondas (por ejemplo, nanosondas de oro (GNP) recubiertas con anticuerpos específicos para la diana de interés), que pueden capturar la proteína diana (u otro analito), las lleva a la fase deseada para su concentración, y pueden, opcionalmente, servir como un indicador colorimétrico para LFA. Adicionalmente, la separación de ATPS en papel, proporciona un método que puede mejorar y acelerar en gran medida el proceso de separación de fases. Cuando se aplica una solución de ATPs bien mezclada a un papel poroso, puede separarse en sus respectivas fases a medida que fluye a través del papel, siendo la fase menos viscosa la fase avanzada, y siendo la fase más viscosa la fase retrasada. Para un sistema de ATPS de PEG-sal, esto corresponde a una fase avanzada rica en sal y una fase retrasada rica en PEG. Adicionalmente, el uso de una mecha de papel 3-D da como resultado una mejora adicional de la separación de ATPS en papel. Al colocar una tira de LFA posterior a la mecha 3-D, hemos integrado a la perfección los pasos de concentración y detección en un solo dispositivo.
Un LFA típico consiste en al menos tres componentes: una almohadilla de muestra donde se aplica la muestra a la tira reactiva, una zona de detección donde hay unión y donde se pueden observar los resultados, y una almohadilla absorbente que actúa como sumidero para el exceso de muestra (Figura 1, parte superior). En un formato del ensayo tipo sándwich, se añaden primero a la muestra el indicador de LFA (que puede ser colorimétrico, fluorescente, radioactivo, etc.) decorado con moléculas de unión (a menudo anticuerpos, aptámeros, ADN monocatenario, etc.). Si el analito diana está presente, se unirá al indicador decorado con los anticuerpos. Cuando estos complejos se aplican a la tira reactiva de LFA, por ejemplo, a través de la almohadilla de muestra, fluyen a través de la tira hacia la almohadilla absorbente. Si el analito diana está presente, el analito se unirá a las moléculas de unión inmovilizadas en la línea de prueba y quedará atrapado entre el indicador y la membrana. Si el indicador es colorimétrico, el indicador colorimétrico presentará un color fuerte y se formará una banda visual a medida que el complejo analito-indicador se acumula en la línea de prueba, indicando un resultado positivo. Como alternativa, si no hay analito presente, el indicador no se adhiere a la línea de prueba y la ausencia de la línea de prueba indica un resultado negativo. Independientemente de la presencia del analito, la molécula de unión decorada en el indicador puede unirse y acumularse en una línea de control (cuando está presente). Una banda en la línea de control significa que la muestra ha fluido a través de la tira, indicando una prueba válida. Por lo tanto, un resultado positivo se indica mediante dos bandas, uno en la línea de prueba y otro en la línea de control, mientras que un resultado negativo se indica mediante una sola banda en la línea de control.
Como se describe en el presente documento, el límite de detección de nuestro anterior dispositivo de LFA y ATPS integrado se mejora mediante la adición de una estrategia de mejora de la señal que no requiere pasos adicionales por parte del usuario. El protocolo típico para la mejora de la señal de LFA requiere primero que se aplique una solución de muestra a la tira de LFA junto con una sonda colorimétrica durante 10-20 minutos. Acto seguido, se aplica un reactivo de revelado a la tira reactiva de LFA para mejorar la señal producida por la sonda. En determinadas realizaciones, esta mejora puede proporcionar una mejora de 10 a 50 veces en el límite de detección del caso de solo LFA.
En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos y dispositivos en el presente documento para la combinación de la extracción de ATPS manual con la mejora de la señal en varios pasos. Cuando se agrega un analito y se concentra en una de las fases libre del ATPS, esa fase se puede extraer manualmente (o robóticamente) y aplicarse al LFA para su detección. Después, por ejemplo, 10-20 minutos, el usuario (o robot) puede aplicar el reactivo de revelado para mejorar la señal de LFA. Debido a las mejoras compuestas en el límite de detección de la concentración de ATPS y la mejora de la señal, este enfoque de varios pasos puede mejorar el límite de detección de LFA en 100­ 1000 veces. Es importante que las soluciones de la sonda colorimétrica y del reactivo de revelado permanezcan separadas entre sí, ya que la mezcla puede causar un revelado prematuro que da como resultado una alta señal de fondo. Si bien el enfoque anterior mantiene con éxito los reactivos separados, la necesidad de múltiples pasos cronometrados aumenta la variabilidad de la prueba y disminuye la facilidad de uso.
Con el fin de eliminar la necesidad de múltiples pasos para el usuario y al mismo tiempo mantener separados la sonda colorimétrica y los reactivos de revelado, determinadas realizaciones explotan los comportamientos de partición opuestos de la sonda y los reactivos de revelado en distintos ATPS, así como, en determinadas realizaciones, el fenómeno de la separación de ATPS en papel. En este enfoque, pueden diseñarse sondas (por ejemplo, sondas colorimétricas) para dividirse extremadamente en la fase más hidrófila y menos concurrida del ATPS al aumentar su tamaño y/o hidrofilicidad. Esto corresponde a la fase rica en sal en un ATPS de polímero/sal o la fase pobre en micelas en un ATPS micelar. Por el contrario, el pequeño tamaño y la hidrofobicidad relativa de los reactivos en desarrollo dan como resultado la partición en la fase más hidrófoba y concurrida del ATPS. Esto corresponde a la fase rica en polímero de un ATPS de polímero/sal o la fase rica en micelas del ATPS micelar. La aplicación del ATPS a un sustrato de papel dará como resultado una separación de fases acelerada y la formación de una fase avanzada más hidrófila y una fase retrasada más hidrófoba. Para un ATPS de polímero/sal, esto corresponde a una fase avanzada rica en sal y una fase retrasada rica en polímeros, mientras que para un ATPS micelar, hay una fase avanzada pobre en micelas y una fase rica en micelas retrasada. La fase avanzada suministrará el biomarcador concentrado y la sonda colorimétrica a la zona de detección del LFA. Esta será seguida por la fase de retraso que suministrará el reactivo de revelado para iniciar la mejora de la señal (Figura 2).
Hemos demostrado la viabilidad de este enfoque que usa un sistema enzimático basado en el desarrollo de nitro-azul tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-inodilo fosfato (NBT/BCIP) por la enzima fosfatasa alcalina (ALP) para la detección de una proteína modelo transferrina (Tf). Los anticuerpos ALP y anti-Tf se conjugaron en nanopartículas de oro para formar nanosondas de fosfatasa alcalina-oro (ALP-GNP). Estas ALP-GNP pueden capturar Tf en solución y conducirla a una fase de ATPS deseada para la concentración. También sirven como indicador colorimétrico para el LFA, pero con la capacidad adicional de poder reaccionar con la solución de sustrato NBT/BCIP para producir un precipitado púrpura. Tras la adición a un ATPS de PEG-sal, las ALP-GNP se dividen en la parte inferior, fase rica en sal, mientras que el sustrato NBT/BCIP se divide en la parte superior, fase rica en PEG (Figura 3). Cuando el ATPS se aplica a nuestro papel 3-D bien con una tira reactiva de LFA posterior, las ALP-PNB, junto con el biomarcador de interés, se concentrarán en la fase avanzada rica en sal y se suministrará a la zona de detección. A esto le seguirá la fase rica en PEG que fluye a través de la zona de detección, suministrando el sustrato NBT/BCIP. El sustrato se convertirá en un precipitado púrpura por cualquier ALP-GNP que se haya unido a la zona de detección, mejorando de este modo la señal (Figura 4). Si bien hemos demostrado la viabilidad de este enfoque usando un ATPS de PEG-sal con la reacción enzimática ALP con NBT/BCIP, esta técnica se puede aplicar a otros sistemas ATPS (por ejemplo, PPG-sal, PEG-dextrano, Tritón x-114, C10Y4, etc.) y sistemas de mejora de la señal (peroxidasa de rábano picante y nanopartículas similares a la peroxidasa con TMB o DAB, mejora de oro y plata, etc.). Se cree que este enfoque puede lograr mejoras de 100 a 1.000 veces en el límite de detección sobre el L F a tradicional con solo un paso de aplicación por parte del usuario.
Si bien los métodos anteriores se describen con referencia a LFA, se reconocerá que también se pueden aplicar fácilmente a ensayos de flujo continuo, por ejemplo, ensayos tales como el que se muestra en la Figura 11.
Si bien en determinadas realizaciones, el ATP, las sondas y el(los) reactivo(s) de revelado se selecciona(n) de modo que las sondas estén en una fase avanzada y los reactivos de desarrollo se proporcionen en una fase retrasada, también se contemplan realizaciones en donde la(s) sonda(s) se localiza(n) en la interfase entre las dos fases y el(los) reactivo(s) de desarrollo se proporcionan en la fase retrasada.
Combinación de la amplificación de ácidos nucleicos con la concentración y preconcentración de ácidos nucleicos.
Se proporcionan métodos y dispositivos que combinan la tecnología de amplificación de ADN con los pasos de extracción y preconcentración de ADN, todo en una plataforma unificada. Esta plataforma consiste en un sistema acuoso de dos fases (ATPS), que, a concentraciones y temperaturas de componentes dadas, permitirá que la mezcla de ATPS se separe en dos fases distintas. Ambas fases son acuosas y proporcionan un entorno estable para las biomoléculas.
Los ATPS tienen diversas propiedades y se adaptan a una rango de fines biológicos, tales como la purificación de muestras y la lisis celular, así como la separación de biomoléculas, la clasificación y la concentración. Por ejemplo, un ATPS micelar elaborado con tensioactivo Triton puede dividir biomoléculas, como el ADN, extremadamente a una fase. Así mismo, también se sabe que el tensioactivo Triton tiene una capacidad de lisis celular inherente. Como alternativa, se puede usar un ATPS hecho de polietilenglicol (PEG) y dextrano para volver a solubilizar manchas de sangre seca y dividir las células sanguíneas en una fase. (véase, por ejemplo, la Figura 5). El ADN de las células sanguíneas resolubilizadas puede concentrarse posteriormente en la parte inferior, fase rica en dextrano (Figura 6). A menudo, la preparación y extracción de ADN de una muestra biológica compleja para su amplificación requiere la lisis de estas células, pasos de purificación y concentración de ADN. Debido a que estos resultados se pueden lograr con un ATPS, esto convierte al ATPS en una plataforma de manipulación de muestras biológicas apropiada para integrarse con la amplificación de ADN y/u otros protocolos.
En un enfoque ilustrativo para integrar la extracción/preconcentración de ADN de ATPS y la amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) puede extraerse una de las fases de ATPS o la interfase que contiene el concentrado nucleico y agregarse directamente a una reacción de amplificación de ácido nucleico que contiene reactivos tampón, soluciones de sal, bases de nucleótidos, enzimas y cebadores específicos para amplificar un ácido nucleico diana (por ejemplo, molde de ADN). En un ejemplo, se usó una polimerasa compatible con la sangre para amplificar con éxito el ADN directamente de una fase rica en dextrano y una fase rica en UCON. Tras la amplificación, se logró un aumento de 2 a 7 veces en la concentración de ADN, indicando que la polimerasa era compatible con los sistemas de ATPS probados (Figura 7). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa convencional (qPCR) también se realizó directamente en el ADN en una fase rica en dextrano y pudo proceder con tanto éxito como la amplificación del ADN en agua pura (Figura 8).
Otro enfoque ilustrativo, pero no limitante, implica la combinación de todos los componentes necesarios tanto para el ATPS como para el ácido nucleico (por ejemplo, ADN) amplificación en una mezcla. De manera especial, este método normalmente puede usar ácido nucleico isotérmico (por ejemplo, amplificación de ADN). Mientras que el método de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) comúnmente usado pasa por diferentes temperaturas para cada paso del proceso de amplificación de ADN, la amplificación isotérmica permite que todo el proceso de amplificación de ADN se realice a una temperatura determinada. Un ejemplo de esto es la amplificación dependiente de helicasa termófila (tHDA), que usa helicasa para separar el ADN bicatenario en lugar del ciclo de calor, permitiendo que la amplificación se realice isotérmicamente en, por ejemplo, 65 °C. Puesto que hay ATPS micelares que también se separan en fase a esta temperatura, se pueden combinar con los componentes de reacción de tHDA para facilitar la concentración y la amplificación simultáneas del ADN.
Para hacer esto, se puede agregar una muestra de células enteras a la solución combinada, sobre la cual, a continuación, se puede mezclar toda la solución para formar un ATPS micelar. A continuación, la mezcla se calienta a, por ejemplo, 65 °C durante 1 hora, lo que permite que se produzca tanto la separación de fases como la amplificación del ADN (Figura 9). El ácido nucleico (por ejemplo, ADN) se divide en una de las dos fases, de la cual, a continuación, se puede extraer el ADN amplificado. La capacidad de concentrar y amplificar un ácido nucleico al mismo tiempo en esta plataforma de un recipiente permite lograr la amplificación a partir de muestras con menos células de las que es posible con la tecnología de tHDA actual sola. La tecnología de tHDA actual amplifica con éxito el ADN de una muestra con 10.000+ células. Por el contrario, nuestros resultados preliminares han demostrado que el ADN se puede amplificar con éxito a partir de una muestra con tan solo 100 células usando el sistema de un recipiente combinado de Triton X-100 ATPS y tHDA (Figura 10). Al mismo tiempo, el propio sistema de tHDA solo puede lograr este mismo límite de detección bajo cuando una muestra de células se lisa por separado y el ADN se purifica y concentra a través de kits comerciales y otros equipos de laboratorio. Por tanto, la sensibilidad y la simplicidad mejoradas de nuestra plataforma de un recipiente la convierten en un candidato competitivo para la detección de enfermedades basada en la prueba de amplificación de ácido nucleico (NAAT) en el punto de atención. Nuestra invención también es muy versátil ya que hay muchos ATPS posibles y reactivos de amplificación isotérmicos que pueden usarse.
Concentración de las biomoléculas diana
En varias realizaciones de los ensayos descritos en el presente documento, los analitos (por ejemplo, biomoléculas diana) pueden concentrarse usando un sistema acuoso de dos fases (ATPS). En varias realizaciones, el ATPS puede realizarse en forma de líquido libre (por ejemplo, en un recipiente), o mientras la solución de muestra fluye en un ensayo de flujo lateral o un ensayo de flujo continuo, por ejemplo, en membranas de papel.
Concentración en ATPS líquido
Una muestra recogida, (por ejemplo, una muestra de tejido, un fluido biológico tal como la orina, la saliva y la sangre, esputo, fluido vaginal, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo, linfa, hisopado endocervical, placa de los dientes, una muestra de alimentos, una muestra ambiental y similares), puede, opcionalmente, combinarse con una solución de suspensión (por ejemplo, un tampón) o combinarse directamente con una solución de ATPS o aplicarse directamente a un papel o una solución de suspensión que contiene la muestra aplicada a un papel para rehidratar los componentes de ATPS que se secaron previamente sobre el papel. En algunos casos, puede ser necesario que el usuario lo mezcle para lograr una solución bien mezclada, homogénea. En varias realizaciones ilustrativas, pero no limitantes, se puede usar ATPS de polímero/sal, polímero/polímero, micelar/polímero o micelar.
Concentración a medida que el fluido fluye sobre el papel
En varias realizaciones, el paso de concentración también se puede acelerar con el papel. Por ejemplo, la muestra recogida puede mezclarse con componentes de ATPS e introducirse en un dispositivo de papel que puede facilitar, mejorar y acelerar la separación de fases. Las biomoléculas diana pueden concentrarse en el frente avanzado del flujo en la membrana de papel y se pueden introducir sin problemas en el componente de detección posterior.
Como alternativa, los componentes de ATPS pueden deshidratarse previamente sobre las membranas de papel. En este caso, la muestra recogida puede aplicarse directamente a la membrana de papel sin mezclarla previamente con los componentes de ATPS.
Sistema acuoso de dos fases (ATPS)
En determinadas realizaciones, los dispositivos descritos en el presente documento están configurados para funcionar junto con un sistema acuoso de dos fases (ATPS), por ejemplo, en una jeringa u otro recipiente, o están configurados para admitir un sistema acuoso de dos fases (ATPS). En algunas realizaciones, el ATPS comprende una solución de fases. La expresión "solución de fases" generalmente se refiere a una solución de primera fase o una solución de segunda fase del ATPS. En algunas realizaciones, la solución de fases está en una solución mixta (por ejemplo, con la solución de primera/segunda fase). En algunas realizaciones, la solución de fases es la solución de primera/segunda fase después de que se divida de la solución mixta del ATPS. En algunas realizaciones, la solución de fases es la solución de primera/segunda fase después de que se divida de la solución mixta en el LFA o el ensayo de flujo continuo. En determinadas realizaciones, la solución de fases puede referirse a la solución de segunda fase mientras está en un estado mezclado (por ejemplo, con la solución de primera fase). En algunas realizaciones, la solución de fase es un fluido avanzado en el LFA o ensayo de flujo continuo. En algunas realizaciones, la solución de fases es un fluido retrasado en el LFA o ensayo de flujo continuo.
En algunas realizaciones, el ATPS comprende dos soluciones acuosas, una solución de primera fase y una solución de segunda fase que se mezclan inicialmente (por ejemplo, una solución de fase mixta). En algunas realizaciones, la solución de fase mixta es una solución homogénea, mientras que en determinadas otras realizaciones, la solución de primera fase y la solución de segunda fase son inmiscibles. En algunas realizaciones, la solución de primera fase y la solución de segunda fase son inmiscibles, pero los dominios de la solución de primera fase se mezclan con los dominios de la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, la inmiscibilidad es impulsada por cambios en la temperatura y/o cambios en las concentraciones de los diferentes componentes, como la sal. En algunas realizaciones, las soluciones de primera/segunda fase comprenden componentes, tales como, micelas, sales y/o polímeros. En algunas realizaciones, el analito diana (por ejemplo, biomolécula, bacteria (o fragmento de la misma), hongo (o fragmento del mismo), o virus y similares) en contacto con el ATPS, se distribuye, se divide y/o se concentra preferentemente en la solución de primera fase sobre la solución de segunda fase, o viceversa, en función de sus propiedades físicas y químicas, tales como la talla, la forma, la hidrofobicidad y la carga. En algunas realizaciones, el analito diana (por ejemplo, una bacteria, hongo, virus, etc.) se divide predominantemente (o extremadamente) en la solución de primera o segunda fase del ATPS y, por lo tanto, se concentra en el ATPS. En algunas realizaciones, el analito diana se concentra ajustando la relación de volúmenes entre la solución de primera fase y la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, el analito diana se concentra reduciendo el volumen de la fase en la que se divide el analito. A modo de ilustración, en algunas realizaciones, el analito diana se concentra 10 veces en la solución de primera fase, por ejemplo, usando una relación de volumen de 1:9 entre la solución de primera fase y la solución de segunda fase, puesto que el volumen de la fase en la que se divide extremadamente el analito es de 1/10 del volumen total.
En algunas realizaciones, otras concentraciones se obtienen usando otras relaciones. Por tanto, en algunas realizaciones, la relación entre la solución de primera fase y la solución de segunda fase comprende una relación de aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:9, o aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relación entre la solución de primera fase y la solución de segunda fase comprende una relación de aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:60, aproximadamente 1:70, aproximadamente 1:80, aproximadamente 1:90, o aproximadamente 1:100. En algunas realizaciones, la relación entre la solución de primera fase y la solución de segunda fase comprende una relación de aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:300, aproximadamente 1:400, aproximadamente 1:500, aproximadamente 1:600, aproximadamente 1:700, aproximadamente 1:800, aproximadamente 1:900, o aproximadamente 1:1.000.
En algunas realizaciones, la relación entre la solución de segunda fase y la solución de primera fase comprende una relación de aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:9, o aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relación entre la solución de segunda fase y la solución de primera fase comprende una relación de aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:60, aproximadamente 1:70, aproximadamente 1:80, aproximadamente 1:90, o aproximadamente 1:100. En algunas realizaciones, la relación entre la solución de segunda fase y la solución de primera fase comprende una relación de aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:300, aproximadamente 1:400, aproximadamente 1:500, aproximadamente 1:600, aproximadamente 1:700, aproximadamente 1:800, aproximadamente 1:900, o aproximadamente 1:1.000.
En algunas realizaciones, el analito se divide de manera sustancialmente uniforme entre la solución de primera fase y la solución de segunda fase, impidiendo la concentración del analito. En dichos sistemas, la concentración del analito diana se logra mediante la introducción de un componente adicional, tal como una sonda que captura el analito diana, y en donde la sonda se divide predominantemente en una fase, mejorando de este modo el comportamiento de partición del analito diana para permitir la concentración. En algunas realizaciones, la solución de primera/segunda fase que contiene el analito concentrado se recoge y se aplica al LFA o al dispositivo de ensayo de flujo continuo.
En algunas realizaciones, la solución de primera/segunda fase comprende una solución micelar. En algunas realizaciones, la solución micelar comprende un tensioactivo no iónico. En algunas realizaciones, la solución micelar comprende un detergente. En algunas realizaciones, la solución micelar comprende Triton-X. En algunas realizaciones, la solución micelar comprende un polímero similar a Triton-X, tal como Igepal CA-630 y Nonidet P-40, y similares, a modo de ejemplo no limitante. En algunas realizaciones, la solución micelar consiste esencialmente en Triton-X.
En algunas realizaciones, la solución micelar tiene una viscosidad (a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 5.000 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 4.500 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 4.000 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 3.500 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 3.000 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 2.500 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 2.000 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 1.500 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 1.000 centipoise, o aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 500 centipoise. En algunas realizaciones, la solución micelar tiene una viscosidad a temperatura ambiente de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 450 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 400 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 350 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 300 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 250 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 200 centipoise, de aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 150 centipoise, o aproximadamente 0,01 centipoise a aproximadamente 100 centipoise.
En algunas realizaciones, la solución de primera/segunda fase rehidratada comprende un polímero (por ejemplo, solución de polímero). En determinadas realizaciones, el polímero comprende uno o más polímeros seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), copolímero de etileno/propileno (por ejemplo, un polímero UCON™), propilenglicol (PPG), metoxipolietilenglicol, polivinilpirrolidona y similares. En determinadas realizaciones, el polímero es un polietilenglicol (PEG). En diversas realizaciones, el PEG puede tener un peso molecular entre 1.000 y 100.000. En determinadas realizaciones, el PEG comprende PEG-4600, PEG-8000 o PEG-20.000. En determinadas realizaciones, el polímero es polipropilenglicol (PPG). En diversas realizaciones, el PPG puede tener un peso molecular entre 100 y 10.000. En determinadas realizaciones, el PPG comprende PPG 425. En determinadas realizaciones, el polímero es dextrano. En diversas realizaciones, el dextrano puede tener un peso molecular entre 1.000 y 1.000.000. En determinadas realizaciones, el dextrano comprende dextrano 6000, dextrano 9000, dextrano-35.000 o dextrano-200.000. En determinadas realizaciones, el polímero comprende un copolímero de etileno/propileno (por ejemplo, un polímero UCON™). Los copolímeros de etileno/propileno ilustrativos, pero no limitantes, incluyen, pero sin limitación, UCON™ 50-HB-5100, UCON™ 50-HB-3520, UCON™ 50-HB-2000, UCON™ 50-HB-660, UCON™ 50-HB-400, UCON™ 50-HB-260, UCON™ 50-HB-170, UCON™ 50-HB-100, UCON™ 60-H-5300, UCON™ 60-H2300, UCON™ 60-H-1600, UCON™ 60-H-1100, UCON™ 60-H-760, UCON™ 60-H-340, UCON™ 75-H-9500, UCON™ 75-H-1400, UCON™ 75-H-450 y similares.
En algunas realizaciones, la solución de polímero rehidratado comprende una solución de polímero que es de aproximadamente el 0,01 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,05 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,1 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,15 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,2 % p /w polímero, o aproximadamente el 0,25 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,3 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,35 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,4 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,45 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,5 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,55 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,6 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,65 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,7 % p/p de polímero, o aproximadamente e. 0,75 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,8 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,85 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,9 % p/p de polímero, o aproximadamente el 0,95 % p/p de polímero, o aproximadamente el 1 % p/p de polímero. En algunas realizaciones, la solución de polímero comprende una solución de polímero que es de aproximadamente el 1 % p/p de polímero, o aproximadamente el 2 % p/p de polímero, o aproximadamente el 3 % p/p de polímero, o aproximadamente el 4 % p/p de polímero, o aproximadamente el 5 % p/p w polímero, o aproximadamente el 6 % p/p de polímero, o aproximadamente el 7 % p/p de polímero, o aproximadamente el 8 % p/p de polímero, o aproximadamente el 9 % p/p de polímero, o aproximadamente el 10 % p/p de polímero, o aproximadamente el 11 % p/p de polímero, o aproximadamente el 12 % p/p de polímero, o aproximadamente el 13 % p/p de polímero, o aproximadamente el 14 % p/p de polímero, o aproximadamente el 15 % p/p de polímero, o aproximadamente el 16 % p/p polímero, o aproximadamente el 17 % p/p de polímero, o aproximadamente el 18 % p/p de polímero, o aproximadamente el 19 % p/p de polímero, o aproximadamente el 20 % p/p de polímero, o aproximadamente el 21 % p/p de polímero, o aproximadamente el 22 % p/p de polímero, o aproximadamente el 23 % p/p de polímero, o aproximadamente el 24 % p/p de polímero, o aproximadamente el 25 % p/p de polímero, o aproximadamente el 26 % p/p de polímero, o aproximadamente el 27 % p/p de polímero, o aproximadamente el 28 % p/p de polímero, o aproximadamente el 29 % p/p de polímero, o aproximadamente el 30 % p/p de polímero, o aproximadamente el 31 % p/p de polímero, o aproximadamente el 32 % p/p de polímero, o aproximadamente el 33 % p/p de polímero, o aproximadamente el 34 % p/p de polímero, o aproximadamente el 35 % p/p de polímero, o aproximadamente el 36 % p/p de polímero, o aproximadamente el 37 % p/p de polímero, o aproximadamente el 38 % p/p de polímero, o aproximadamente el 39 % p/p de polímero, o aproximadamente el 40 % p/p de polímero, o aproximadamente el 41 % p/p polímero, o aproximadamente el 42 % p/p de polímero, o aproximadamente el 43 % p/p de polímero, o aproximadamente el 44 % p/p de polímero, o aproximadamente el 45 % p/p de polímero, o aproximadamente el 46 % p/p de polímero, o aproximadamente el 47 % p/p de polímero, o aproximadamente el 48 % p/p de polímero, o aproximadamente el 49 % p/p de polímero, o/y aproximadamente el 50 % p/p de polímero. En algunas realizaciones, la solución de polímero comprende una solución de polímero que es de aproximadamente el 10 % p/p de polímero, o aproximadamente el 20 % p/p de polímero, o aproximadamente el 30 % p/p de polímero, o aproximadamente el 40 % p/p de polímero, o aproximadamente el 50 % p/p w polímero, o aproximadamente el 60 % p/p de polímero, o aproximadamente el 70 % p/p de polímero, o aproximadamente el 80 % p/p de polímero, o aproximadamente el 90 % p/p de polímero. En algunas realizaciones, la solución de polímero comprende una solución de polímero que es de aproximadamente el 10 % p/p de polímero a aproximadamente el 80 % p/p de polímero. En algunas realizaciones, la solución de polímero rehidratado comprende una solución de polímero que es de aproximadamente el 1 % p/p a aproximadamente el 30 % p/p, o de aproximadamente el 5 % p/p hasta aproximadamente el 25% p/p, o de aproximadamente el 10 % p/p hasta aproximadamente el 25 % p/p, o desde aproximadamente el 10 % p/p hasta aproximadamente el 20 % p/p de polímero.
En algunas realizaciones, la solución rehidratada de primera y/o segunda fase comprende una sal y de este modo forma una solución salina. En algunas realizaciones, el analito diana (por ejemplo, bacteria, hongo, virus, etc.) y/o un complejo de sonda-analito se divide en la solución salina. En determinadas realizaciones, la solución salina comprende una sal cosmotrópica. En algunas realizaciones, la solución salina comprende una sal caotrópica. En algunas realizaciones, la sal comprende uno o más de una sal de magnesio, una sal de litio, una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de cesio, una sal de zinc y una sal de aluminio. En algunas realizaciones, la sal comprende una sal de bromuro, una sal de yoduro, una sal de fluoruro, una sal de carbonato, una sal de sulfato, una sal de citrato, una sal de carboxilato, una sal de borato o una sal de fosfato. En algunas realizaciones, la sal es fosfato de potasio. En algunas realizaciones, la sal es sulfato de amonio.
En algunas realizaciones, la solución salina rehidratada comprende una solución salina que comprende aproximadamente el 0,01 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,05 % p/p de sal, aproximadamente el 0,1 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,15 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,2 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,25 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,3 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,35 % p/p sal, o aproximadamente el 0,4 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,45 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,5 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,55 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,6 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,65 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,7 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,75 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,8 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,85 % p/p de sal, o aproximadamente el 0,9 % p/p sal, o aproximadamente el 0,95 % p/p de sal, o aproximadamente o aproximadamente el 1 % p/p de sal. En algunas realizaciones, la solución salina rehidratada comprende una solución salina que es de aproximadamente el 1 % p/p de sal, o aproximadamente el 2 % p/p de sal, o aproximadamente el 3 % p/p de sal, o aproximadamente el 4 % p/p de sal, o aproximadamente el 5 % p/p sal, o aproximadamente el 6 % p/p de sal, o aproximadamente el 7 % p/p de sal, o aproximadamente el 8 % p/p de sal, o aproximadamente el 9 % p/p de sal, o aproximadamente el 10 % p/p de sal, o aproximadamente el 11 % p/p de sal, o aproximadamente el 12 % p/p de sal, o aproximadamente el 13 % p/p de sal, o aproximadamente el 14 % p/p de sal, o aproximadamente el 15 % p/p de sal, o aproximadamente el 16 % p/p de sal, o aproximadamente el 17 % p/p de sal, o aproximadamente el 18 % p/p de sal, o aproximadamente el 19 % p/p de sal, o aproximadamente el 20 % p/p de sal, o aproximadamente el 21 % p/p de sal, o aproximadamente el 22 % p/p de sal, o aproximadamente el 23 % p/p de sal, o aproximadamente el 24 % p/p de sal, o aproximadamente el 25 % p/p de sal, o aproximadamente el 26 % p/p de sal, o aproximadamente el 27 % p/p sal, o aproximadamente el 28 % p/p de sal, o aproximadamente el 29 % p/p de sal, o aproximadamente el 30 % p/p de sal, o aproximadamente el 31 % p/p de sal, o aproximadamente el 32 % p/p de sal, o aproximadamente el 33 % p/p de sal, o aproximadamente el 34 % p/p de sal, o aproximadamente el 35 % p/p de sal, o aproximadamente el 36 % p/p de sal, o aproximadamente el 37 % p/p de sal, o aproximadamente el 38 % p/p de sal, o aproximadamente el 39 % p/p de sal, o aproximadamente el 40 % p/p sal, o aproximadamente el 41 % p/p de sal, o aproximadamente el 42 % p/p de sal, o aproximadamente el 43 % p/p de sal, o aproximadamente el 44 % p/p de sal, o aproximadamente el 45 % p/p de sal, o aproximadamente el 46 % p/p de sal, o aproximadamente el 47 % p/p de sal, o aproximadamente el 48 % p/p de sal, o aproximadamente el 49 % p/p de sal, o/y aproximadamente el 50 % p/p. En algunas realizaciones, la solución salina rehidratada comprende una solución salina que oscila desde aproximadamente el 0,1 % p/p hasta aproximadamente el 40 % p/p, o desde aproximadamente el 1 % p/p hasta aproximadamente el 30 % p/p, o desde aproximadamente el 5 % p/p hasta aproximadamente el 25 % p/p, o desde aproximadamente el 10 % p/p hasta aproximadamente el 20 % p/p. En algunas realizaciones, la solución salina rehidratada comprende una solución salina que es de aproximadamente el 0,1 % p/p a aproximadamente el 10 %. En algunas realizaciones, la solución salina es de aproximadamente el 1 % p/p a aproximadamente el 10 %.
En algunas realizaciones, la solución de primera/segunda fase comprende un disolvente que es inmiscible en agua. En algunas realizaciones, el disolvente comprende un disolvente orgánico no polar. En algunas realizaciones, el disolvente comprende un aceite. En algunas realizaciones, el disolvente comprende pentano, ciclopentano, benceno, 1,4-dioxano, éter dietílico, diclorometano, cloroformo, tolueno o hexano.
En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende una solución micelar y la solución de segunda fase comprende un polímero. En algunas realizaciones, la solución de segunda fase comprende una solución micelar y la solución de primera fase comprende un polímero. En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende una solución micelar y la solución de segunda fase comprende una sal. En algunas realizaciones, la solución de segunda fase comprende una solución micelar y la solución de primera fase comprende una sal. En algunas realizaciones, la solución micelar es una solución Triton-X. En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende un primer polímero y la solución de segunda fase comprende un segundo polímero. En algunas realizaciones, el primer/segundo polímero comprende polietilenglicol y/o dextrano. En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende un polímero y la solución de segunda fase comprende una sal. En algunas realizaciones, la solución de segunda fase comprende un polímero y la solución de primera fase comprende una sal. En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende polietilenglicol y la solución de segunda fase comprende fosfato de potasio. En algunas realizaciones, la solución de segunda fase comprende polietilenglicol y la solución de primera fase comprende fosfato de potasio. En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende una sal y la solución de segunda fase comprende una sal. En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende una sal cosmotrópica y la solución de segunda fase comprende una sal caotrópica. En algunas realizaciones, la solución de segunda fase comprende una sal cosmotrópica y la solución de primera fase comprende una sal caotrópica.
En algunas realizaciones, la solución de primera fase comprende un Componente 1 de la Tabla 1 y la solución de segunda fase comprende un Componente 2 de la Tabla 1. En algunas realizaciones, la solución de segunda fase comprende un Componente 1 de la Tabla 1 y la solución de segunda fase comprende un Componente 2 de la Tabla 1.
En algunas realizaciones, los componentes de la Tabla 1 se suspenden o disuelven en un tampón. En algunas realizaciones, los componentes de la Tabla 1 se suspenden/disuelven en un tampón compatible con un sistema biológico del que procede la muestra. En algunas realizaciones, los componentes de la Tabla 1 se suspenden/disuelven en una solución salina. En algunas realizaciones, los componentes de la Tabla 1 se suspenden/disuelven en PBS. En algunas realizaciones, los componentes de la Tabla 1 se suspenden/disuelven en agua. En algunas realizaciones, los componentes de la Tabla 1 se suspenden/disuelven en el fluido biológico.
Tabla 1. Sistemas ilustrativos de extracción/concentración de dos fases acuosas.
Figure imgf000015_0001
continuación
Figure imgf000016_0002
Se observará que los polímeros UCON™ comprenden copolímeros de etileno/propileno producidos al hacer reaccionar una cantidad igual en peso de óxido de etileno y óxido de propileno con alcohol butílico usando un catalizador alcalino a temperaturas de aproximadamente 100 °C a aproximadamente 150 °C. El UCON™ 50-HB resultante es un copolímero aleatorio con la estructura general:
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Se reconocerá que los sistemas y componentes de ATPS descritos anteriormente son ilustrativos y no limitantes. Usando los hallazgos proporcionados en el presente documento, muchos otros sistemas y componentes de ATPS estarán disponibles para un experto en la materia.
En algunas realizaciones, los dispositivos descritos en el presente documento (por ejemplo, un LFA o un dispositivo de ensayo de flujo) puede comprender además un colector configurado para ponerse en contacto con el ATPS, en donde el analito diana se divide en una interfase del colector y la solución de primera fase y/o la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, el colector comprende un material que es un plástico, un material mesoporoso, una sílice, un polipropileno, un imán, una partícula magnética, una partícula paramagnética, un material con un poro, un material con una ranura y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el colector comprende polipropileno. En algunas realizaciones, el colector está optimizado para aumentar la recogida del analito diana. En algunas realizaciones, el colector comprende un poro para maximizar el área superficial. En algunas realizaciones, el ancho del poro es de aproximadamente 1 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 15 |jm, aproximadamente 20 pm, aproximadamente 25 pm, aproximadamente 30 pm, aproximadamente 35 pm, aproximadamente 40 pm, aproximadamente 45 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 55 pm, aproximadamente 60 pm, aproximadamente 65 pm, aproximadamente 70 pm, aproximadamente 75 pm, aproximadamente 80 pm, aproximadamente 85 pm, aproximadamente 90 pm, aproximadamente 95 pm, o aproximadamente 100 pm. En algunas realizaciones, el ancho del poro es de aproximadamente 100 pm, aproximadamente 200 pm, aproximadamente 300 pm, aproximadamente 400 pm, aproximadamente 500 pm, aproximadamente 600 pm, aproximadamente 700 pm, aproximadamente 800 pm, aproximadamente 900 pm, o aproximadamente 1 mm. En algunas realizaciones, la profundidad del poro es de aproximadamente 1 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 15 pm, aproximadamente 20 pm, aproximadamente 25 pm, aproximadamente 30 pm, aproximadamente 35 pm, aproximadamente 40 pm, aproximadamente 45 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 55 pm, aproximadamente 60 pm, aproximadamente 65 pm, aproximadamente 70 pm, aproximadamente 75 pm, aproximadamente 80 pm, aproximadamente 85 pm aproximadamente 90 pm, aproximadamente 95 pm, o aproximadamente 100 pm. En algunas realizaciones, la profundidad del poro es de aproximadamente 100 pm, aproximadamente 200 pm, aproximadamente 300 pm, aproximadamente 400 pm, aproximadamente 500 pm, aproximadamente 600 pm, aproximadamente 700 pm, aproximadamente 800 pm, aproximadamente 900 pm, o aproximadamente 1 mm
Detección de analitos diana (por ejemplo, biomoléculas)
En varias realizaciones, el componente de detección basado en papel puede tener la forma de una tira reactiva de flujo lateral (véase, por ejemplo, Figura 1) o un dispositivo de flujo continuo (prueba de manchas) (véase, por ejemplo, la Figura 11). En varias realizaciones, ambos factores de forma pueden contener uno o más de los siguientes componentes:
Almohadilla de muestra
En determinadas realizaciones, una almohadilla de muestra, cuando está presente, puede conectar el componente de concentración con el componente de detección. Puede actuar como un filtro que puede eliminar los desechos, contaminantes y mucosidad del líquido recogido. También puede almacenar reactivos secos y, cuando se rehidratan, estos reactivos pueden (i) ajustar la solución para condiciones de detección óptimas (pH, fuerza iónica, etc.); y (ii) descomponer la mucosidad, glicoproteínas y otros materiales viscosos en la muestra recogida que pueden afectar la detección. Los materiales ilustrativos para la almohadilla de muestra incluyen, pero sin limitación, celulosa, nitrocelulosa, fibra de vidrio, algodón, papel tejido o no tejido, etc. Los reactivos en la almohadilla pueden incluir, pero sin limitación, tensioactivos como Triton X-100, Tween 20, o dodecilsulfato de sodio, etc.; polímeros tales como polietilenglicol, poloxámero, polivinilpirrolidona (PVP), etc.; tampones tales como solución salina tamponada con fosfato, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), Tris(hidroximetil)aminometano (Tris), borato de sodio, TRICINA, etc.; proteínas tales como la albúmina, etc.; enzimas tales como la proteasa, etc.; sales tales como el cloruro de sodio, fosfato de sodio, colato de sodio, fosfato de potasio, etc. En varias realizaciones, estos reactivos pueden aplicarse a la almohadilla de muestra (i) empapando el material de papel en la solución de reactivo, o (ii) a través de la absorción capilar de la membrana a través del flujo capilar. La almohadilla de muestra tratada puede secarse mediante (i) secado al aire (dejar reposar a temperatura ambiente); (ii) hornear (colocar a alta temperatura usando un horno o dispositivo de calentamiento); (iii) vacío; o (iv) liofilización.
Almohadilla de conjugado
En varias realizaciones, una almohadilla de conjugado, cuando está presente, puede contener indicadores colorimétricos deshidratados decorados con fracciones de unión que se unen al (a los) analito(s) diana. En determinadas realizaciones, las fracciones de unión son fracciones de unión específicas que tienen una alta afinidad hacia el(los) analito(s) diana (por ejemplo., bacteria, hongo, virus, proteínas, ADN, etc.). Cuando la solución de muestra llega a la almohadilla de conjugado, los indicadores colorimétricos se rehidratan. A continuación, las fracciones de unión en los indicadores colorimétricos pueden unirse al(los) analito(s) diana y los complejos resultantes pueden fluir a la almohadilla de reacción. En determinadas realizaciones, los indicadores colorimétricos pueden comprender partículas metálicas tales como oro, partículas de plata, partículas poliméricas tales como perlas de látex y partículas de poliestireno que encapsulan tintes visibles o fluorescentes. Los materiales ilustrativos para la almohadilla de conjugado incluyen, pero sin limitación, celulosa, nitrocelulosa, fibra de vidrio, algodón, papel tejido o no tejido etc. En determinadas realizaciones, los indicadores colorimétricos pueden aplicarse y deshidratarse sobre la almohadilla como se ha descrito anteriormente.
Almohadilla de reacción
En determinadas realizaciones, la almohadilla de reacción, cuando está presente, puede comprender reactivos inmovilizados, y cuando los reactivos inmovilizados reaccionan con la solución de muestra, pueden producir señales (por ejemplo, señales visuales) para indicar la presencia o ausencia o cantidad del(de los) analito(s) diana. Los materiales ilustrativos para la almohadilla de reacción incluyen, pero sin limitación, celulosa, nitrocelulosa, fibra de vidrio, algodón, papel tejido o no tejido etc.
Formato de flujo lateral
En determinadas realizaciones para una tira reactiva de flujo lateral, los reactivos en la almohadilla de reacción se inmovilizarán en forma de líneas perpendiculares a la dirección del flujo para garantizar que todas las muestras puedan interactuar con los reactivos inmovilizados. Las concentraciones de los reactivos pueden optimizarse para controlar las intensidades de la señal y, por tanto, controlar la sensibilidad del ensayo. Por ejemplo, se puede diseñar un ensayo semicuantitativo inmovilizando múltiples líneas del mismo reactivo con diferentes concentraciones. Por lo tanto, cada línea producirá señales solo cuando se alcance una concentración específica de biomoléculas diana. La concentración de las biomoléculas diana puede interpretarse contando el número de líneas que son visibles (véase, por ejemplo, la Figura 2).
Además, se pueden inmovilizar múltiples líneas de diferentes reactivos en la misma tira para detectar múltiples analitos diana. Esto permite el desarrollo de ensayos múltiples.
Formato de flujo continuo
En determinadas realizaciones para la prueba de flujo continuo, en lugar de líneas, los reactivos pueden inmovilizarse en toda la almohadilla de reacción. Si el analito diana está presente, se unirá al indicador colorimétrico en la almohadilla de conjugado y quedará atrapado en la almohadilla de reacción cuando el complejo indicador-diana se una al reactivo inmovilizado. Por lo tanto, aparecería una mancha visible si la biomolécula diana está presente. Esta prueba puede usarse si el volumen de la muestra es demasiado bajo para ser absorbido por capilaridad por una tira reactiva de flujo lateral. La intensidad del color de la mancha visible se correlaciona con la concentración de las biomoléculas diana, mientras que el tamaño de la mancha se correlaciona con el volumen de la muestra. En determinadas realizaciones, el componente de concentración puede colocarse directamente por encima de la prueba de flujo continuo para eliminar la necesidad de extraer y aplicar las muestras concentradas al componente de detección.
En varias realizaciones, los reactivos inmovilizados pueden comprender un anticuerpo específico contra el analito diana (anticuerpo primario), anticuerpos contra el anticuerpo primario (anticuerpo secundario), antígenos, proteínas o conjugados antígeno-proteína. Los materiales ilustrativos para la almohadilla de reacción incluyen, pero sin limitación, celulosa, nitrocelulosa, fibra de vidrio, algodón, papel tejido y no tejido, etc. En varias realizaciones, los reactivos pueden aplicarse y deshidratarse sobre la almohadilla como se ha descrito anteriormente.
Sumidero
En determinadas realizaciones, el sumidero, cuando está presente, puede comprender una almohadilla absorbente que recoge el exceso de líquido y evita el reflujo que puede afectar al rendimiento de la prueba. Los materiales ilustrativos para el sumidero incluyen, pero sin limitación, celulosa, nitrocelulosa, fibra de vidrio, algodón, papel tejido y no tejido, etc.
Mejora de la señal
Como se ha descrito anteriormente, en varias realizaciones, la intensidad de la señal visible puede mejorarse para mejorar la sensibilidad y/o la precisión del ensayo de detección. Esto puede realizarse introduciendo reactivos de revelado adicionales (mejora de la señal) en la almohadilla de reacción después del ensayo de detección inicial (unión del analito). Como se ha explicado anteriormente, las sondas y el ATPS pueden diseñarse para suministrar primero las sondas a una zona de detección (por ejemplo, en una fase avanzada o interfase de un ATPS) seguido de la administración posterior de un reactivo de revelado (por ejemplo, en una fase retrasada de un ATPS).
En determinadas realizaciones, el reactivo de mejora de la señal puede comprender un sustrato que reacciona con una enzima que está decorada en la superficie de, por ejemplo, el indicador colorimétrico para formar un producto fuerte y visible. A modo de ejemplo, si el indicador colorimétrico comprende una sonda de oro, la mejora de la señal se puede lograr mediante la marcación de la mejora de plata, donde puede aplicarse un reactivo de mejora que contiene iones de plata a la almohadilla de reacción donde la sonda de oro se une a la línea/mancha inmovilizada. En este contexto, las sondas de oro pueden actuar como sitios de nucleación para que la plata pueda depositarse sobre la partícula, dando como resultado una mayor intensidad de la señal. En estos ejemplos, los reactivos de mejora de la señal pueden agregarse por separado después del ensayo de detección inicial o se pueden almacenar/deshidratar en el dispositivo de papel para liberarlos de forma automática/manual.
En otras realizaciones ilustrativas, pero no limitantes, el reactivo de revelado puede ser un sustrato para una enzima (por ejemplo, de fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante (u otra), glucosa oxidasa, etc.) que reacciona con la enzima correspondiente asociada o unida a la(s) sonda(s) para producir una señal detectable mejorada. Como alternativa, el reactivo de revelado puede comprender la enzima mientras el sustrato está unido o asociado a la(s) sonda(s).
Los componentes y formatos de ensayo anteriores son ilustrativos y no limitantes. Usando los hallazgos y los ejemplos, proporcionados en el presente documento, muchos otros dispositivos de ensayo y configuraciones estarán disponibles para un experto en la materia y algunas consideraciones de diseño y componentes adicionales se describen a continuación.
Ensayo de flujo lateral (LFA) o ensayo de flujo continuo (de manchas)
Como se ha explicado anteriormente, en determinadas realizaciones, los dispositivos y los sistemas descritos en el presente documento están configurados para proporcionar un ensayo de flujo lateral (LFA) o un ensayo de flujo continuo (de manchas) para la detección del analito diana en una muestra, donde el LFA o el ensayo de manchas se usa solo o junto con un sistema acuoso de dos fases (ATPS). En algunas realizaciones, el LFA o ensayo de manchas comprende una matriz porosa en la que se dispone el ATPS o los componentes del mismo, donde la matriz porosa está configurada y tiene la porosidad suficiente para permitir que el ATPS o los componentes del mismo fluyan a través de la matriz porosa cuando el ATPS o los componentes del mismo están en una fase fluida. Dichos l Fa poroso o dispositivos de ensayo de manchas se denominan en el presente documento papel o dispositivos fluídicos de papel y estos términos se usan indistintamente.
El término "papel", como se usa en el presente documento, aunque no se limita a láminas delgadas de pulpa de madera u otras sustancias vegetales fibrosas, en determinadas realizaciones, se contempla el uso de dichos papeles en los dispositivos descritos en el presente documento. Los papeles más generalmente se refieren a materiales porosos a menudo en forma de lámina, pero no de forma limitativa, que permiten el paso de un fluido.
En algunas realizaciones, la matriz porosa es lo suficientemente porosa para permitir que la solución de fase mixta, la solución de primera fase y/o la solución de segunda fase del ATPS, y/o el analito diana, fluyan a través del LFA. En algunas realizaciones, la matriz porosa es lo suficientemente larga y/o lo suficientemente profunda para que la solución de fase mixta, la solución de primera fase y/o la solución de segunda fase y/o el analito diana, fluyan vertical y/u horizontalmente a través del LFA o del dispositivo de ensayo de manchas. En algunas realizaciones, la solución de primera fase fluye a través de la matriz porosa a una primera velocidad y la solución de segunda fase fluye a través de la matriz porosa a una segunda velocidad, donde la primera velocidad y la segunda velocidad son diferentes. En algunas realizaciones del LFA o ensayo de manchas, la matriz porosa comprende, entre otras cosas, un material tal como una cerámica de vidrio sinterizado, un mineral, celulosa, una fibra de vidrio, una nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno, un nailon, un nailon modificado por carga, una poliétersulfona, combinaciones de los mismos y similares.
Concentrado a medida que fluye
Se descubrió que los ATPS pueden separarse en fases a medida que la solución fluye a través de un sustrato poroso (por ejemplo, un papel) que hemos denominado "concentrado a medida que fluye". Además, también se descubrió que el flujo a través del papel acelera significativamente el proceso de concentración. Basándose en este fenómeno, los dispositivos de ensayo de flujo lateral y los dispositivos de ensayo de flujo continuo descritos en el presente documento pueden comprender un componente fluídico de papel que integre completamente los componentes necesarios para una concentración de ATPS combinada con LFA o detección por flujo continuo. Se descubrió que cuando se aplica una solución mixta de ATPS a determinados materiales de papel, la separación de fases y la concentración del analito se producen a medida que fluye la solución. También demostramos que este fenómeno se conserva incluso cuando se produjo un ATPS que tenía relaciones de volumen variables, por ejemplo, volumen de la fase superior dividido por el de la fase inferior.
En algunas realizaciones, el LFA o el ensayo de manchas (por ejemplo, el componente de concentración del ensayo de manchas) comprende un papel. En algunas realizaciones, el papel comprende una lámina de material poroso que permite que el fluido fluya a través de él. En algunas realizaciones, el papel comprende una pluralidad de láminas de material poroso que permiten que el fluido fluya a través de ellas. En algunas realizaciones, el papel comprende uno o más materiales tales como celulosa, fibra de vidrio, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno, nylon modificado con carga, poliéter sulfona y similares. En algunas realizaciones, el papel es una membrana HI-FLOW PLUS®.
En algunas realizaciones, el papel es un papel tejido. En algunas realizaciones, el papel es un papel Whatman. En algunas realizaciones, el papel Whatman comprende Whatman S17, Whatman MF1, Whatman VF1, Whatman Fusion 5, Whatman GF/DVA, Whatman LF1, Whatman CF1 y/o Whatman CF4.
En algunas realizaciones, el papel concentra el analito diana a medida que el analito diana fluye a través del LFA o a través del componente de concentración de un ensayo de flujo continuo (por ejemplo, un dispositivo basado en "concentrado a medida que fluye"). En algunas realizaciones, el papel concentra el analito diana a medida que el analito diana fluye horizontalmente a través del LFA. En algunas realizaciones, el papel concentra el analito diana a medida que el analito diana fluye a través del LFA o fluye a través del ensayo verticalmente.
En algunas realizaciones, el papel tiene una propiedad que influye en qué fase de la solución se convertirá en el "fluido avanzado". A modo de ejemplo no limitante, cuando se usa ATPs de PEG-sal, agregar la solución al papel de fibra de vidrio hará que la fase salina se convierta en la solución avanzada, mientras que el uso de papel de celulosa hará que la fase PEG se convierta en la solución avanzada. En algunas realizaciones, la separación de fases dentro del papel acelera la separación de fases. También, a modo de ejemplo no limitante, un ATPS micelar normalmente tarda varias horas en separarse en fases en un ATPS estancado, pero si se aplica a una tira de papel, esta separación de fases se produce en minutos. Esto acelera el proceso de diagnóstico al permitir que los ATPS, que son tradicionalmente el paso determinante de la velocidad en el proceso, se conviertan en opciones más viables para nuestros ensayos de diagnóstico rápido en papel. En algunas realizaciones, el dispositivo de 'concentrado a medida que fluye' comprende un ATPS de PEG-sal (por ejemplo, como se ilustra en los Ejemplos). En algunas realizaciones, el dispositivo de 'concentrado a medida que fluye' comprende un ATPS micelar. En algunas realizaciones, el dispositivo de LFA o el dispositivo de ensayo de flujo continuo comprende papel de fibra de vidrio o papel de nitrocelulosa.
En determinadas realizaciones, el LFA o el dispositivo de ensayo de flujo continuo comprende un filtro que elimina los desechos (por ejemplo, células sanguíneas u otras partículas), una almohadilla de muestra donde la muestra que comprende el analito diana se aplica al dispositivo, una zona de detección (por ejemplo, línea de prueba y línea de control) donde el analito diana se une y se detecta, y una almohadilla de absorbancia (por ejemplo, un papel receptor seco) que puede absorber el exceso de muestra y/o soluciones aplicadas al LFA o al dispositivo de flujo (véase, por ejemplo, las Figuras 1 y 11). En algunas realizaciones, la línea de control y/o la línea de prueba no es una línea per se, sino una región o una mancha.
En algunas realizaciones, el LFA comprende una tira de LFA. Las expresiones "LFA" y "tira de LFA" se usan en el presente documento de indistintamente. En algunas realizaciones, la tira de LFA tiene una longitud mayor que su ancho y profundidad. En algunas realizaciones, el LFA es rectangular. En algunas realizaciones, el LFA tiene una forma que es redonda, ovoide, cuadrada, poligonal o de forma irregular. En algunas realizaciones, el LFA comprende una pluralidad de rutas y/o intersecciones. En algunas realizaciones, la tira de LFA comprende la almohadilla de muestra, la zona de detección y la almohadilla de absorbancia. En algunas realizaciones, la zona de detección está ubicada entre la almohadilla de muestra y la almohadilla de absorbancia, la almohadilla de absorbancia absorbe por capilaridad la muestra con el analito diana alejándola de la almohadilla de muestra y hacia la zona de detección.
Ensayo de tipo sándwich
En algunas realizaciones, el dispositivo de ensayo LFA o de flujo continuo (de manchas) está configurado para proporcionar o llevar a cabo un ensayo de tipo sándwich (véase, por ejemplo, la Figura 1, en el presente documento, y la Figura 1, abajo a la izquierda, en la solicitud PCT en tramitación N.°: PCT/US2015/019297, presentada el 6 de marzo de 2015 para las configuraciones de LFA descritas en la misma). En algunas realizaciones, el ensayo de tipo sándwich comprende una fracción de captura que se une al analito diana. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una sonda. En algunas realizaciones, la sonda comprende una propiedad detectable (colorimétrica, fluorescente, radioactiva, etc.). En algunas realizaciones, la sonda comprende una fracción de unión que interactúa con el analito diana (por ejemplo, un anticuerpo). En algunas realizaciones, la sonda se agrega a la muestra y se une al analito diana para formar un complejo de sonda-analito.
Ensayo de competencia
En algunas realizaciones, el LFA comprende un ensayo de competencia. En algunas realizaciones, la sonda se agrega a la muestra y se une al analito diana para formar un complejo de sonda-analito. En algunas realizaciones, el LFA comprende el analito diana inmovilizado en la línea de prueba. En algunas realizaciones, la sonda está saturada por el analito diana en la muestra y la sonda no se unirá al analito diana inmovilizado en la línea de prueba. En algunas realizaciones, la ausencia de la señal detectable en la línea de prueba indica un resultado positivo. En algunas realizaciones, no hay ningún analito diana presente en la muestra y la sonda se une al analito diana en la línea de prueba, indicando un resultado negativo. En algunas realizaciones, el LFA comprende una fracción de captura de sonda en una línea de control que interactúa directamente con la sonda, e independientemente de la presencia del analito diana en la muestra, la sonda puede unirse a la fracción de captura de la sonda y acumularse en la línea de control. En algunas realizaciones, la sonda llega a inmovilizarse y detectarse en la línea de control, indicando una prueba válida. En algunas realizaciones, un resultado positivo (por ejemplo, el analito diana está presente en la muestra) se indica mediante una señal detectable en la línea de prueba y la línea de control. En algunas realizaciones, un resultado negativo se indica mediante una señal detectable en la línea de control.
En algunas realizaciones, el complejo de sonda-analito se aplica a la almohadilla de muestra y fluye a través del LFA o a través del dispositivo de flujo continuo hacia la almohadilla de absorbancia. En algunas realizaciones, el analito diana del complejo de sonda-analito se une a la fracción de captura. En algunas realizaciones, la fracción de captura se inmoviliza en una línea de prueba o una región de prueba (por ejemplo, una capa de prueba en un dispositivo de flujo continuo) y el complejo de sonda-analito llega a inmovilizarse en la línea de prueba o en la región de prueba. En algunas realizaciones, la sonda es colorimétrica y la línea de prueba o la región de prueba mostrará un color fuerte (por ejemplo, señal detectable) cuando el complejo de sonda-analito se acumule en la línea de prueba o en la región de prueba, indicando un resultado positivo. En algunas realizaciones, no hay ningún analito diana presente en la muestra, y la sonda del complejo de sonda-analito no interactúa con la fracción de captura, y la ausencia de la línea o señal de prueba en la región de prueba indica un resultado negativo. En algunas realizaciones, el LFA comprende una fracción de captura de sonda en una línea de control (o en una región de control, por ejemplo, de un dispositivo de ensayo de flujo continuo) que interactúa directamente con la sonda y/o la fracción de unión y, por tanto, independientemente de la presencia del analito diana en la muestra, la fracción de unión/sonda se une a la fracción de captura de la sonda y se acumula en la línea de control o en la región de control. En algunas realizaciones, la fracción de captura de la sonda es un anticuerpo secundario que se une a la fracción de unión, en donde la fracción de unión es un anticuerpo primario que se une a ese analito diana. En algunas realizaciones, la sonda llega a inmovilizarse y detectarse en la línea de control o en la región de control, indicando una prueba válida. En algunas realizaciones, un resultado positivo (por ejemplo, el analito diana está presente en la muestra) se indica mediante una señal detectable en la línea de prueba (o región de prueba) y la línea de control (o región de control). En algunas realizaciones, un resultado negativo se indica mediante una señal detectable en la línea de control o en la región de control.
ATPS deshidratado en LFA o dispositivo de ensayo de flujo continuo (de manchas).
En algunas realizaciones, el ATPS o los componentes del mismo y/o las sondas y/o los reactivos de revelado se deshidratan sobre y/o en al menos una primera porción de la matriz porosa que comprende un LFA o en el componente de concentración de un dispositivo de ensayo de flujo continuo. En algunas realizaciones, la aplicación de la muestra al dispositivo hidrata el ATpS y/o las sondas y/o el(los) reactivo(s) de revelado convirtiendo de este modo el ATPS o los componentes del mismo y/o las sondas y/o el(los) reactivo(s) de revelado en una fase fluida. La deshidratación puede hacer que el dispositivo sea más fácil de usar, ya que el usuario solo necesita agregar la muestra (por ejemplo, saliva, sangre, orina, fluido vaginal, líquido seminal, esputo, líquido cefalorraquídeo, linfa o líquido similar) al dispositivo. En algunas realizaciones, un usuario solo tiene que aplicar una solución de la muestra a la tira para detectar la presencia/ausencia del analito diana o para cuantificar el analito. En algunas realizaciones, la solución de la muestra fluye a través del LFA o del dispositivo de flujo continuo y el ATPS se vuelve a solubilizar, desencadenando la separación de fases dentro del LFA o dispositivo de flujo continuo y posterior concentración del analito diana.
En algunas realizaciones, todos los componentes necesarios para un ATPS dado se mezclan para formar una solución mixta, se aplican al papel que comprende el dispositivo (por ejemplo, de LFA o ensayo de flujo continuo (de manchas) y, a continuación, se deshidrata. Cuando la solución de muestra se agrega al papel deshidratado, los componentes de ATPS se rehidratan a medida que fluye la muestra, dando como resultado la separación de fases. En algunos ATPS donde la fase que contiene el analito concentrado es menos viscosa, esa fase fluirá más rápido y el analito concentrado emergerá en el fluido avanzado y alcanzará la zona de detección del LFA o el ensayo de flujo continuo para iniciar la detección. Adicionalmente, la longitud (o espesor) y la concentración del segmento del componente de ATPS deshidratado se pueden ajustar para diferentes aplicaciones.
En algunas realizaciones, ambos (todos) componentes del ATPS se deshidratan en el LFA o en el ensayo de flujo continuo (por ejemplo, en el componente de separación). En algunas realizaciones, un primer componente de ATPS se deshidrata sobre (o en) el LFA o en el ensayo de flujo continuo. En algunas realizaciones, un segundo componente de ATPS se deshidrata sobre o en el LFA o el ensayo de flujo continuo. En algunas realizaciones, el componente de la solución de primera fase y/o el primer componente de ATPS se deshidrata en una primera parte del LFA o en una primera capa del ensayo de flujo continuo (componente de separación). En algunas realizaciones, el componente de solución de segunda fase y/o el segundo componente de ATPS se deshidrata en una segunda parte del LFA o en una segunda capa del ensayo de flujo continuo (componente de separación). En algunas realizaciones, la primera parte y la segunda parte son iguales. En algunas realizaciones, la primera parte y la segunda parte son diferentes. A modo de ejemplo no limitante, en un ATPS de PEG-sal, las soluciones de PEG y sal pueden deshidratarse por separado en diferentes partes o segmentos de papel (véase, por ejemplo, la Figura 16 de la solicitud PCT en tramitación N.°: PCT/US2015/019297, presentada el 6 de marzo de 2015 para las configuraciones de LFA descritas en la misma) o en capas separadas que comprenden, por ejemplo, el componente de separación de un ensayo de flujo continuo (véase, por ejemplo, la Figura 11). En algunas realizaciones, la deshidratación de la solución de primera/segunda fase y/o el componente de ATPS en diferentes partes del LFA o en diferentes capas del ensayo de flujo continuo proporciona una concentración más uniforme de los componentes de la solución de primera/segunda fase o los componentes de ATPS. En algunas realizaciones, la deshidratación de los componentes de la solución de primera/segunda fase y/o los componentes del ATPS en diferentes partes permite que la solución de primera fase o el componente del ATPS fluya en una primera dirección después de la hidratación y la solución de segunda fase y/o el componente del ATPS fluya en una segunda dirección después de la hidratación, en donde las direcciones primera y segunda son diferentes. En algunas realizaciones, el analito diana se concentra en la primera dirección, pero no en la segunda dirección. En algunas realizaciones, el analito diana se concentra en la segunda dirección, pero no en la primera dirección. En algunas realizaciones, la deshidratación de los componentes de la primera/segunda fase y/o los componentes del ATPS en diferentes partes permite que el analito diana fluya en la primera/segunda dirección sin requerir que la muestra fluya en la primera/segunda dirección. En algunas realizaciones, la deshidratación de los componentes de la primera/segunda fase y/o los componentes del ATPS en diferentes partes permite que el analito diana fluya más rápido, dando como resultado una detección más temprana. En algunas realizaciones, la deshidratación de los componentes de la primera/segunda fase y/o los componentes del ATPS en diferentes partes permite una mayor fiabilidad de los resultados. En algunas realizaciones, la deshidratación de los componentes de la primera/segunda fase y/o los componentes del ATPS en diferentes partes evita la agregación de los componentes de la solución de primera/segunda fase y/o los componentes del ATPs (por ejemplo, ATPS de PEG-sal). En algunas realizaciones, el componente de la primera/segunda fase y/o el componente del ATPS se deshidrata en múltiples segmentos. En algunas realizaciones, el componente de la primera/segunda fase y/o el componente del ATPS se deshidrata en múltiples segmentos, en donde el componente de la primera/segunda fase y/o el componente del ATPS comprende una solución salina. En algunas realizaciones, el componente de la primera/segunda fase y/o el componente del ATPS se deshidrata en múltiples segmentos, en donde el componente de la primera/segunda fase y/o el componente del ATPS no comprende un polímero (por ejemplo, PEG). En algunas realizaciones, el PEG deshidratado no se ubica cerca de la zona de detección debido a que la fase rica en PEG puede ralentizar el flujo dentro de la membrana de detección. En algunas realizaciones, la tira de LFA o el ensayo de flujo continuo pueden comprender un espaciador en blanco cerca de la zona de detección que no contiene PEG ni sal.
En algunas realizaciones, una sonda (por ejemplo, una fracción de unión al analito y el reactivo/material de detección asociado) se proporciona en un tampón de sonda. En algunas realizaciones, el tampón de sonda se deshidrata en el LFA o en el ensayo de flujo continuo.
En algunas realizaciones, la deshidratación de los componentes del ATPS mejora el límite de detección en comparación con un dispositivo en el que los componentes del ATPS se agregan en forma líquida. En algunas realizaciones, la adición de los componentes del ATPs en forma líquida diluye la solución de muestra del sujeto. En algunas realizaciones, la deshidratación de los componentes del ATPS permite que se desarrolle una solución de primera fase distinta y/o una solución de segunda fase distinta durante el flujo, concentrando el analito diana o el complejo sonda-analito en un pequeño volumen en el frente del fluido avanzado que alcanzará las líneas de prueba y control o el componente de detección de un ensayo de flujo continuo. En algunas realizaciones, la concentración del analito diana y/o el complejo sonda-analito en el frente del fluido avanzado reducirá el período de tiempo necesario para la detección.
Sondas
En determinadas realizaciones, los sistemas y/o los dispositivos descritos en el presente documento y/o los métodos descritos en el presente documento usan una sonda, donde la sonda comprende una fracción de unión que se une al analito diana para formar un complejo de sonda-analito.
En algunas realizaciones, el analito diana solo se divide preferentemente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, el analito diana solo se divide extremadamente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase.
En algunas realizaciones, el analito diana solo no se divide preferentemente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, el analito diana solo no se divide extremadamente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase.
En algunas realizaciones, el complejo sonda-analito se divide preferentemente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase, provocando de este modo que el analito diana (del complejo sonda-analito) se divida preferentemente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase.
En algunas realizaciones, el complejo sonda-analito se divide extremadamente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase, provocando de este modo que el analito diana (del complejo sonda-analito) se divida extremadamente en la solución de primera fase o la solución de segunda fase o la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase.
En algunas realizaciones, la expresión "se divide preferentemente", cuando se usa con respecto a la partición del analito diana (o complejo de sonda-analito) en una solución de primera/segunda fase del ATPS, indica que una mayor cantidad del analito diana llega a depositarse en una solución de fase preferida que en otra solución de fase del ATPs .
En algunas realizaciones, la expresión "se divide extremadamente", cuando se usa con respecto a la partición del analito diana (o complejo de sonda-analito) en una solución de primera/segunda fase del ATPS, indica que aproximadamente el 90 % o más del analito diana llega a depositarse en una solución de fase preferida que en otra solución de fase del ATPS.
En algunas realizaciones, una mayor cantidad del analito diana se divide en la solución de primera fase. En algunas realizaciones, más de aproximadamente el 50 %, o más de aproximadamente el 55 %, o más de aproximadamente el 60 %, o más de aproximadamente el 65 %, o más de aproximadamente el 70 %, o más de aproximadamente el 75 %, o más de aproximadamente el 80 %, o más del 85 %, o más del 90 %, o más del 95 %, o más del 98 %, o más del 99 % del analito diana se divide en la solución de primera fase. En algunas realizaciones, más de aproximadamente el 99 %, o más de aproximadamente el 99,1 %, o más de aproximadamente el 99,2 %, o más de aproximadamente el 99.3 %, o más de aproximadamente el 99,4 %, o más de aproximadamente el 99,5 %, o más de aproximadamente el 99.6 %, o más del 99,7 %, o más del 99,8 %, o más del 99,9 % del analito diana se divide en la solución de primera fase.
En algunas realizaciones, una mayor cantidad del analito se divide en la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, más de aproximadamente el 50 %, o más de aproximadamente el 55 %, o más de aproximadamente el 60 %, o más de aproximadamente el 65 %, o más de aproximadamente el 70 %, o más de aproximadamente el 75 %, o más de aproximadamente el 80 %, o más del 85 %, o más del 90 %, o más del 95 %, o más del 98 %, o más del 99 % del analito diana se divide en la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, más de aproximadamente el 99 %, o más de aproximadamente el 99,1 %, o más de aproximadamente el 99,2 %, o más de aproximadamente el 99.3 %, o más de aproximadamente el 99,4 %, o más de aproximadamente el 99,5 %, o más de aproximadamente el 99.6 %, o más de aproximadamente el 99,7 %, o más de aproximadamente el 99,8 %, o más de aproximadamente el 99,9 % del analito diana se divide en la solución de segunda fase.
En algunas realizaciones, una mayor cantidad del analito se divide en la interfase de la solución de primera fase y la solución de segunda fase. En algunas realizaciones, más de aproximadamente el 50 %, o más de aproximadamente el 55 %, o más de aproximadamente el 60 %, o más de aproximadamente el 65 %, o más de aproximadamente el 70 %, o más de aproximadamente el 75 %, o más de aproximadamente el 80 %, o más del 85 %, o más del 90 %, o más del 95 %, o más del 98 %, o más del 99 % del analito diana se divide en la interfase. En algunas realizaciones, más de aproximadamente el 99 %, o más de aproximadamente el 99,1 %, o más de aproximadamente el 99,2 %, o más de aproximadamente el 99,3 %, o más de aproximadamente el 99,4 %, o más de aproximadamente el 99,5 %, o más de aproximadamente el 99,6 %, o más del 99,7 %, o más del 99,8 %, o más del 99,9 % del analito diana se divide en la interfase.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende o está configurado para utilizarse y/o el ensayo realizado en el dispositivo utiliza una sonda (sondas dirigidas a un único analito). En algunas realizaciones, el dispositivo comprende o está configurado para utilizarse y/o el ensayo realizado en el dispositivo utiliza al menos dos sondas diferentes (cada una dirigida a un analito diferente), o al menos 3 sondas diferentes, o al menos 4 sondas diferentes, o al menos 5 sondas diferentes, o al menos 7 sondas diferentes, o al menos 10 sondas diferentes, o al menos 15 sondas diferentes, o al menos 20 sondas diferentes.
En algunas realizaciones, la sonda comprende uno o más de un polímero sintético, un metal, un mineral, un vidrio, un cuarzo, una cerámica, un polímero biológico, un plástico y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la sonda comprende un polímero que comprende un polietileno, polipropileno, nailon (DELRIN®), politetrafluoroetileno (TEFLON®), dextrano y cloruro de polivinilo. En algunas realizaciones, el polietileno es polietilenglicol. En algunas realizaciones, el polipropileno es polipropilenglicol. En algunas realizaciones, la sonda comprende un polímero biológico que comprende uno o más de un colágeno, celulosa y/o quitina. En algunas realizaciones, la sonda comprende un metal (por ejemplo, que comprende uno o más de oro, plata, platino, paladio, cerio, titanio, acero inoxidable, aluminio o sus aleaciones). En algunas realizaciones, la sonda comprende una nanopartícula (por ejemplo, una nanopartícula de oro, una nanopartícula de plata, etc.).
En algunas realizaciones, la sonda comprende además un recubrimiento. En algunas realizaciones, el recubrimiento comprende polietilenglicol o polipropilenglicol. En algunas realizaciones, el recubrimiento comprende polipropileno. En algunas realizaciones, el recubrimiento comprende polipropilenglicol. En algunas realizaciones, el recubrimiento comprende dextrano. En algunas realizaciones, el recubrimiento comprende una proteína hidrófila. En algunas realizaciones, el recubrimiento comprende albúmina sérica. En algunas realizaciones, el recubrimiento tiene afinidad por la solución de primera fase o la solución de segunda fase.
En algunas realizaciones, la cantidad de analito diana en la muestra es muy baja, de modo que el analito necesita estar sustancialmente concentrado para permitir la detección mediante LFA o ensayo de flujo continuo. En determinadas realizaciones, se logra una concentración sustancial en una interfase, puesto que el grado de concentración del analito depende del volumen de una fase en la que el analito se divide, o se concentra, y el "volumen" en la interfase es muy pequeño en relación con las fases libres.
En algunas realizaciones, la sonda se divide preferentemente (o extremadamente) en la interfase para conducir el analito diana hacia una interfase. En algunas realizaciones, la sonda se divide preferentemente (o extremadamente) en la interfase debido a la química de su superficie, en donde la química de la superficie se optimiza para conducir la sonda a la interfase. A modo de ejemplo no limitante, para conducir el complejo de sonda-analito a la interfase de un sistema de ATPS de sal-polímero, tal como el sistema de polietilenglicol-fosfato de potasio (PEG/sal), las sondas se conjugan con PEG (o se someten a PEGilación) para promover la interacción PEG-PEG con la fase rica en PEG y/o se decoran con proteínas hidrófilas para promover interacciones hidrófilas con la fase pobre en PEG. Usando dicha sonda optimizada decorada con anticuerpos específicos u otras moléculas capaces de unirse a la diana, el analito diana se captura y se recoge en la interfase. Puesto que el volumen de la interfase es muy pequeño, los analitos están altamente concentrados y se aplican al LFA posterior o a la región de detección del ensayo de flujo continuo.
En algunas realizaciones, se preparan nanosondas de oro (GNP) que son capaces de dividirse en la interfase de un ATPS de PEG/sal, y se optimizan las condiciones de operación para permitir un rápido tiempo de separación de fase con una recuperación muy alta de GNP/analito.
En algunas realizaciones, el complejo sonda-analito se divide en una interfase sólido-líquido en el ATPS. En algunas realizaciones, el sólido es la pared de la cámara que contiene el ATPS. En algunas realizaciones, el sólido es el colector del dispositivo de ensayo. En algunas realizaciones, el sólido comprende un polímero sólido. En algunas realizaciones, el polímero sólido comprende polietileno, celulosa, quitina, nailon, polioximetileno (DELRIN®), politetrafluoroetileno (TEFLON®), cloruro de polivinilo o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el polímero sólido comprende polipropileno. En algunas realizaciones, el complejo de sonda-analito se adhiere al sólido y está muy concentrado, puesto que está presente en un pequeño volumen en la interfase sólido-líquido y no se diluye en el volumen de las fases libres. En algunas realizaciones, la fase libre se elimina sin alterar el analito concentrado y se recoge mediante lavado, con aplicación posterior al LFA o al dispositivo de ensayo de flujo continuo. En algunas realizaciones, este enfoque concentra significativamente el analito y permite la recogida sin usar una fuerza externa (por ejemplo, imán). Como alternativa, la sonda comprende un material magnético y este enfoque se usa con un imán. En algunas realizaciones, estas sondas se modifican para concentrarse en la interfase para una concentración extrema de analito. Como se ha mencionado anteriormente, este enfoque puede proporcionar una separación adicional del analito diana de otros contaminantes, que es concentrado inespecíficamente por ATPS, mediante el uso de un imán. En algunas realizaciones, la concentración por ATPS permite que la sonda magnética funcione de manera más eficiente, puesto que la sonda magnética primero se concentraría en un volumen muy pequeño en una ubicación específica (la interfase). Por consiguiente, se requerirá un imán más pequeño o un campo magnético más débil para recoger el analito concentrado. En algunas realizaciones, la combinación de la concentración en la interfase de ATPS con sondas magnéticas permite el desarrollo de un dispositivo más eficaz, rápido y más económico en comparación con el estado actual de la técnica.
Fracción de unión
En algunas realizaciones, la fracción de unión es una molécula que se une al analito diana (por ejemplo, bacteria, hongo, virus, lectina, azúcar, proteína, ADN, etc.). En algunas realizaciones, la fracción de unión es una molécula que se une específicamente al analito diana. En algunas realizaciones, "se une específicamente" indica que la molécula se une preferentemente al analito diana o se une con mayor afinidad al analito diana que a otras moléculas. A modo de ejemplo no limitante, un anticuerpo se unirá selectivamente a un antígeno contra el que surgió. También, a modo de ejemplo no limitante, una molécula de ADN se unirá a una secuencia sustancialmente complementaria y no a secuencias no relacionadas en condiciones estrictas. En algunas realizaciones, "unión específica" puede referirse a una reacción de unión que determina la presencia de un analito diana en una población heterogénea de moléculas (por ejemplo, proteínas y otros productos biológicos). En algunas realizaciones, la fracción de unión se une a su analito diana particular y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en la muestra.
En algunas realizaciones, la fracción de unión comprende un anticuerpo, una lectina, una proteína, una glicoproteína, un ácido nucleico, ácido nucleico monomérico, un ácido nucleico polimérico, un aptámero, una aptazima, una pequeña molécula, un polímero, una lectina, un hidrato de carbono, un polisacárido, un azúcar, un lípido o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la fracción de unión es una molécula capaz de formar un par de unión con el analito diana.
En algunas realizaciones, la fracción de unión es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, Fv', Fd, Fd', scFv, hsFv, anticuerpos camélidos, diacuerpos y otros fragmentos descritos anteriormente.
En determinadas realizaciones, la fracción de unión comprende un aptámero. En algunas realizaciones, el aptámero comprende un análogo de anticuerpo formado a partir de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el aptámero no requiere de la unión de un marcador para ser detectado en algunos ensayos, como nano-CHEM-FET, donde la reconfiguración se detectaría directamente. En algunas realizaciones, la fracción de unión comprende una aptazima. En algunas realizaciones, la aptazima comprende un análogo enzimático, formado a partir de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la aptazima funciona para cambiar la configuración para capturar una molécula específica, sólo en presencia de un segundo analito específico.
En algunas realizaciones, la sonda comprende un marcador detectable. Los marcadores detectables incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles ilustrativos incluyen, pero sin limitación, nanopartículas fluorescentes (por ejemplo, puntos cuánticos (Qdots)), nanopartículas metálicas, que incluyen, pero sin limitación, nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, nanopartículas de platino, colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína fluorescente verde y similares, véase, por ejemplo, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru, 62Cu, 64lCu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag y similares), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras comúnmente usadas en un ELISA), diferentes marcadores colorimétricos, marcadores magnéticos o paramagnéticos (por ejemplo, nanopartículas magnéticas y/o paramagnéticas), marcadores espín, marcadores radioopacos y similares.
Como alternativa o adicionalmente, la sonda puede unirse a otra partícula que comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, las sondas proporcionan una señal detectable en la zona de detección (por ejemplo, línea de prueba, línea de control, región de prueba, región de control). En algunas realizaciones, el marcador/propiedad detectable comprende uno o más de un marcador/propiedad colorimétrica, un marcador/propiedad fluorescente, un marcador/propiedad enzimática, un marcador/propiedad colorigénica y/o un marcador/propiedad radiactiva. En algunas realizaciones, la sonda es una nanopartícula de oro y la propiedad detectable es un color. En algunas realizaciones, el color es naranja, rojo o púrpura.
Amplificación isotérmica.
En determinadas realizaciones, los métodos y/o los dispositivos descritos en el presente documento proporcionan la amplificación de un ácido nucleico diana sin ciclos térmicos (por ejemplo, amplificación isotérmica). Se pueden aplicar métodos isotérmicos de amplificación de ácidos nucleicos a ADN bicatenario. Sin embargo, las moléculas de ácido nucleico diana no necesitan limitarse a dianas de ADN bicatenario. Por ejemplo, el ADN bicatenario para su uso en los métodos de amplificación isotérmica descritos en el presente documento puede prepararse a partir de ARN vírico, o ARNm, u otras fuentes diana de ARN monocatenario, por transcriptasa inversa. En otro ejemplo, el ADN bicatenario para su uso en los métodos de amplificación sin ciclos descritos en el presente documento puede prepararse a partir de dianas de ADN monocatenario mediante ADN polimerasa. En varias realizaciones, dichos métodos pueden aplicarse como un paso inicial, antes de la aplicación de los métodos de amplificación isotérmica que se analizan a continuación.
Los métodos de amplificación isotérmica son bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, una reacción de secuencia autosostenida (3SR), un ensayo de transcripción basado en ácido nucleico (NASBA), una amplificación mediada por transcripción (TMA), una amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), una amplificación dependiente de helicasa (HDA), una amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación de bucle-tallo, amplificación mediada por señal de la tecnología de ARN (SMART), amplificación isotérmica de desplazamiento múltiple (IMDA), una amplificación isotérmica de un solo cebador (SPIA) y una amplificación dependiente de helicasa circular (cHDA) (véase, por ejemplo, Notomi et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28: e63; patente de Estados Unidos N.° 6.743.605; Gill and Ghaemi (2008) Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 27: 224-243 y similares), Amplificación de polimerasa de recombinasa (RPA) (véase, por ejemplo, Rohrman and Richards-Kortum (2012) Lab Chip, 12: 3082-3088, Wang et al. (2017) PLoS ONE 12(1): e0166903, y similares).
Los componentes (por ejemplo, enzimas) y kits para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos están disponibles comercialmente. Los kits ilustrativos incluyen, pero sin limitación, kit ISOAMP® III Universal tHDA de BIOHELIX®, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMp ) y amplificación de polimerasa y recombinasa (RPA) TWISTAMP® de TwistDx.
Recogida de muestra
En varias realizaciones, la muestra que se analizará usando los dispositivos y los métodos descritos en el presente documento comprende una muestra biológica, una muestra ambiental, una muestra de comida, etc. Las muestras biológicas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, biofluidos tales como sangre o fracciones de sangre, linfa, líquido cefalorraquídeo, líquido seminal, orina, fluido bucal, fluido vaginal y similares, muestras de tejido, muestras de placa, muestras de hisopado endocervical, muestras de células, biopsias o aspirados de tejidos u órganos, especímenes histológicos, y similares.
Cuando la muestra biológica comprenda un tejido, en determinadas realizaciones, el tejido puede ser lisado, homogeneizado, y/o molido y, opcionalmente suspendido en una solución de muestra. Cuando la muestra biológica comprenda un fluido biológico, el fluido puede analizarse directamente o suspenderse en una solución de muestra antes del ensayo. En determinadas realizaciones, la solución de muestra puede actuar para conservar o estabilizar la muestra biológica o los componentes del mismo, y/o puede actuar para extraer o concentrar la muestra biológica o sus componentes. En determinadas realizaciones, la solución de muestra puede comprender un tampón, que contienen opcionalmente conservantes y/o enzimas (proteasa, nucleasa, etc.), y/o tensioactivos, y/o componentes del ATPS.
En determinadas realizaciones, en particular en las realizaciones del punto de atención, la muestra puede aplicarse al dispositivo de ensayo inmediatamente o después de un intervalo de tiempo modesto. En determinadas realizaciones, la muestra puede administrarse a una instalación de prueba remota donde se realiza el ensayo.
Los métodos y los dispositivos para recoger las muestras biológicas son bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se ilustra a continuación:
Recogida de fluidos orales
El fluido oral puede recogerse babeando en un vial vacío, transfiriendo, a continuación, el fluido al componente de concentración del ensayo.
El fluido oral también puede recogerse usando un hisopo y/o una almohadilla de recolección. Por ejemplo, se puede colocar un hisopo o una almohadilla de recogida en la boca del usuario para absorber el fluido oral. El hisopo o la almohadilla de recogida pueden contener compuestos, tales como extracto de menta, o un extracto agrio, para estimular la producción de fluidos orales. El hisopo o la almohadilla de recogida también pueden actuar como un filtro para eliminar los restos de comida, los contaminantes o la mucosidad que pueden afectar a los pasos posteriores de concentración y detección. En determinadas realizaciones, el fluido oral en el hisopo o la almohadilla de recogida puede extraerse y mezclarse con componentes acuosos de dos fases (ATPS) para la concentración. La extracción del fluido oral del dispositivo de recogida se puede conseguir, por ejemplo, aplicando presión física al hisopo/almohadilla para expulsar el líquido, o mediante acción capilar para introducir el líquido en el componente de concentración. Otra configuración corresponde a los componentes de ATPS que se deshidratan posteriores al hisopo o la almohadilla de recogida para que no sea necesaria más interacción del usuario.
Recogida de placas
La placa se puede recoger con cepillos, hisopos o palillos en las superficies de los dientes, debajo de la encía o entre los dientes. En determinadas realizaciones, la placa recogida puede mezclarse en tampón o en una solución de ATPS para su posterior concentración.
Recogida de orina
En varias realizaciones, la orina puede obtenerse con una copa de recogida. A continuación, la orina recogida puede mezclarse en una solución de ATPS para su posterior concentración, o aplicarse directamente en el dispositivo si los componentes de ATPS están deshidratados en el componente de concentración. En un sujeto cateterizado, la orina puede obtenerse del catéter o de la bolsa receptora del catéter.
Hisopado vaginal/endocervical
Los analitos diana en la superficie vaginal o cervical y/o en el fluido vaginal pueden recogerse con hisopos disponibles en el mercado. El hisopo recogido puede colocarse en un tampón para liberar la diana o colocarse en la solución de ATPS para la concentración directa de las biomoléculas diana.
Extracción de sangre
La sangre puede extraerse mediante pinchazo con alfiler (lanceta) y recogida en un tubo capilar, por jeringa y similares.
Analitos ilustrativos.
Aunque esencialmente cualquier analito puede detectarse y/o cuantificarse usando los dispositivos y los métodos de ensayo descritos en el presente documento, en determinadas realizaciones, el analito es un analito clínicamente relevante (por ejemplo, una bacteria, un hongo, un protozoario, una ameba, un virus y similares).
Las dianas clínicamente relevantes son bien conocidas por los expertos en la materia.
Bacterias clínicamente importantes en los fluidos vaginales
El hallazgo de Tricomonas vaginalis, vaginosis bacteriana e infecciones por Actinomyces en fluidos vaginales o muestras de tejido, pruebas de Papanicolaou pueden considerarse un indicio de tratamiento sin realizar otras pruebas de diagnóstico. El tratamiento de infecciones asintomáticas puede prevenir complicaciones en pacientes seleccionados. Candida puede ser una bacteria comensal en la vagina, por lo tanto, los pacientes asintomáticos pueden no requerir tratamiento. La detección de una mayor tasa de infección por Trichomonas vaginalis y Candida en usuarias de DIU muestra que los DIU pueden aumentar el riesgo de infecciones vaginales y complicaciones asociadas. La gonorrea es una infección bacteriana causada por el organismo Neisseria gonorrheae y es un patógeno clínicamente importante. De igual manera, clamidia, causada por Chlamydia trachomatis y sífilis, causada por Treponema pallidum son importantes enfermedades de transmisión sexual cuyo rápido diagnóstico es deseable. Bacterias clínicamente importantes en la orina
Escherichia coli y Proteus sp. son patógenos bacterianos que, cuando se encuentran en la orina, normalmente son indicativos de infecciones del tracto urinario.
Bacterias clínicamente importantes en la cavidad bucal
Los anaerobios orales gramnegativos se han asociado frecuentemente con la enfermedad periodontal, algunas especies con más frecuencia que otras. Tales anaerobios incluyen, pero sin limitación, las especies de Prevotella (por ejemplo, Pr. intermedia, Pr. nigrescens, Pr. melaninogenica, Pr. veroralis, y similares) y especies de Porphyromonas (por ejemplo, Porph. gingivalis).
Además, Streptococcus mutans ha sido implicado en la formación de caries dental. Otras bacterias clínicamente importantes de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, Actinomyces viscosus, Lactobacillus casei, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Lactobacillus acidophilus, Capnocytophaga gingivalis, Fusobacterium nucleatum o Bacteriodes fortsythus.
Se reconocerá que estos patógenos son ilustrativos y no limitantes. Un experto reconocerá que los dispositivos y los métodos de ensayo descritos en el presente documento pueden usarse para detectar y/o cuantificar muchos otros analitos que incluyen, pero sin limitación, toxinas alimentarias y/o patógenos, toxinas ambientales y/o patógenos, y similares. Por tanto, por ejemplo, los métodos y los dispositivos descritos en el presente documento pueden usarse para detectar contaminación por E. coli de vegetales u otros alimentos y/o cualquier otro patógeno alimentario que incluye, pero sin limitación, los ilustrados en la Tabla 2.
Tabla 2. Los patógenos alimentarios ilustrativos, pero no limitantes, que pueden detectarse usando los métodos y los i iiv ri n l r n m n .
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continuación
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.
Ejemplo 1
Resultados de la amplificación de ADN
Materiales y métodos
Preparación de la reacción de solo tHDA y la plataforma de un recipiente
Tanto la reacción de solo tHDA como el sistema de un recipiente se diseñaron para detectar Escherichia coli (E.coli) O157:H7. La reacción convencional de solo tHDA, que contiene tampón, sales, bases de nucleótidos, cebadores específicos de genes y una mezcla de enzimas de helicasa y polimerasa, se preparó como una reacción de 50 pl, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las células de E. coli también se agregaron directamente a la reacción. La suspensión se calentó a 65 °C durante 1 hora antes de extraer una muestra y analizarla mediante electroforesis en gel. Para la plataforma de un recipiente, se combinó el tensioactivo Triton X-100 con los componentes de reacción de tHDA en un solo tubo. También se agregaron todas las células de E. coli, y la suspensión se mezcló para formar un sistema acuoso de dos fases (ATPS) micelar mixto. La suspensión se calentó a 65 °C durante 1 hora, lo que permitió que ocurriera tanto la separación de fases como la amplificación del ADN. La fase superior, pobre en micelas, a continuación, se extrajo y se analizó mediante electroforesis en gel para confirmar la amplificación satisfactoria.
Determinación de los coeficientes de partición del ADN en el sistema de un recipiente
Se realizó un estudio cuantitativo de la partición del ADN para comparar la concentración de ADN en ambas fases del ATPS. Para este estudio, se seleccionaron ADN genómico de E. coli O157:H7, un fragmento de ADN de 100 pb y un fragmento de ADN de 25 pb como modelos que imitaban los ADN relevantes para el sistema de un recipiente. Se preparó un ATPS micelar mixto combinando el tensioactivo Triton X-100, las sales pertinentes para la reacción de tHDA y los ADN bicatenarios. Se prepararon individualmente ATPS mixtos para cada uno de los tres tipos de ADN. Estas suspensiones se calentaron a 65 °C durante 1 hora para inducir la separación de fases. Tras la separación de fases, se extrajeron tanto la fase superior pobre en micelas como la fase inferior rica en micelas y se agregó el colorante de unión fluorescente Quant-iT dsDNA. A continuación, se midió la intensidad de la fluorescencia en un lector de placas. Usando una curva estándar hecha con concentraciones conocidas de ADN, se extrapolaron las concentraciones de ADN en las fases superior e inferior.
Resultados y discusiones
Partición del ADN en la plataforma de un recipiente
A partir de la realización del estudio de partición del ADN, determinamos los coeficientes de partición de cada tipo de ADN en el sistema de un recipiente. El coeficiente de partición se calculó dividiendo la concentración de ADN en la fase superior por la concentración de ADN en la fase inferior. De los tres tipos de ADN analizados, el ADN genómico más grande y el fragmento de ADN de 100 pb tenían coeficientes de partición similares que resultaron ser mayores que 1 (Figura 11). Esto indicó que el ADN se dividió preferentemente en la fase superior, pobre en micelas y, por lo tanto, se concentró en esa fase. Al mismo tiempo, el fragmento de ADN más pequeño de 25 pb tenía un coeficiente de partición más pequeño cercano al valor de 1, indicando que el fragmento de ADN de 25 pb se dividió más uniformemente entre las dos fases.
Mejora en la amplificación y la detección de E. coli en la plataforma de un recipiente
Se encontró que la reacción de tHDA era compatible con el ATPS micelar, dando como resultado la demostración con éxito de la plataforma de un recipiente. La amplificación exitosa se determinó tras la realización de electroforesis en gel, indicada por la presencia de una banda de 100 pb correspondiente al tamaño esperado de la región de ADN amplificada. Para demostrar la mejora en la amplificación y la detección usando el sistema de un recipiente, la amplificación con la reacción convencional de solo tHDA se comparó con la amplificación realizada en la plataforma de un recipiente. Como se visualiza en la Figura 12, la reacción convencional de solo tHDA amplificó con éxito el ADN de muestras de células que contenían 106 ufc/ml; sin embargo, la amplificación no se logró a concentraciones celulares inferiores. Como alternativa, la plataforma de un recipiente amplificó con éxito el ADN de muestras de células que contenían 105 ufc/ml, demostrando una mejora de 10 veces en el límite de detección.
Ejemplo 2
Resultados para la mejora de la señal enzimática
Materiales y métodos
Preparación de los componentes de ensayo
Los sistemas acuosos de dos fases (ATPS) estaban hechos de poli(etilenglicol-ran-propilenglicol) y sal de sulfato de sodio en un tampón Tris 0,1 M (pH 9). Fosfatasa alcalina (ALP) y anticuerpos específicos para Chlamydia trachomatis (CT) se conjugaron con nanopartículas de oro para crear nanosondas de fosfatasa alcalina-oro (ALP-GNP). Las tiras reactivas de LFA en formato de ensayo tipo sándwich se construyeron imprimiendo anticuerpos anti-CT como línea de prueba y proteína A como línea de control en la membrana de nitrocelulosa. Las ALP-GNp se deshidrataron en almohadillas de fibra de vidrio de 3 x 10 mm para crear almohadillas de conjugado, que se colocaron inmediatamente antes de la membrana. Se colocó una almohadilla absorbente de fibra de algodón posterior a la membrana de nitrocelulosa. En el LFA convencional, se colocó una sola almohadilla de muestra de fibra de vidrio de 3 x 10 mm antes de la almohadilla de conjugado. En el LFA mejorado, una mecha de papel 3-D compuesta de cuatro capas (7 x 15 mm) de almohadillas de fibra de vidrio se colocó antes de la almohadilla de conjugado.
Demostración de la mejora de la señal automatizada por ATPS
Para ejecutar el ensayo de mejora de la señal, se sumergió una tira reactiva de LFA con una mecha de papel 3-D en un ATPS que se enriqueció con CT para obtener una concentración general de 3,2 ng/pl y los sustratos de ALP nitroazul tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT/BCIP). Se tomaron fotos a los 10, 30 y 50 minutos.
Mejora de la detección de CT usando ATPS y mejora de la señal
Para ejecutar el LFA convencional, se sumergió una tira reactiva en una solución de diferentes concentraciones de CT inactivada en PBS. Para ejecutar el ensayo de mejora de la señal, se sumergió una tira reactiva de LFA con una mecha de papel 3-D en un ATPS que se enriqueció con diferentes concentraciones de CT inactivada y los sustratos ALP nitroazul tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT/BCIP). Se tomaron fotos a los 30 minutos.
Resultados y discusiones
Demostración de la mejora de la señal automatizada
Cuando la tira reactiva de LFA con una mecha de papel 3-D se sumergió en un ATPS que contenía CT y los sustratos de NBT/BCIP, el ATPS se separaba en sus dos fases macroscópicas a medida que fluía a través de la tira reactiva. En primer lugar, la fase avanzada, fase rica en sal que contenía las bacterias CT concentradas solubilizó las ALP-GNP y las suministró a la zona de prueba de LFA donde podían unirse a las líneas de prueba y de control, visualizado por la aparición de dos líneas después de 10 minutos. Esta fue seguida por la fase retrasada, fase rica en polímeros que suministró los sustratos NBT/BCIP para iniciar la reacción de mejora de la señal, lo que dio como resultado el oscurecimiento de las líneas de prueba y de control a los 30 y 50 minutos (Figura 14). Puesto que los sustratos NBT/BCIP se dividieron favorablemente en la fase rica en polímeros, se evitó la mejora prematura de la señal.
Mejora de la detección por LFA de CT usando la mejora de la señal automatizada
Después de demostrar la capacidad del ATPS para automatizar una reacción de mejora de la señal en el LFA con un mínimo desarrollo de ruido, quisimos determinar si este ensayo tenía un límite de detección mejorado respecto al LFA convencional. En primer lugar, identificamos el límite de detección del LFA convencional sin los pasos de preconcentración de biomarcadores y mejora de la señal analizando diluciones de CT inactivada en PBS. Debido a que una prueba positiva se indica mediante la presencia de dos líneas en el formato de ensayo tipo sándwich, nuestro LFA convencional pudo detectar con éxito CT a 10 ng/pl, Para mejorar el límite de detección del LFA convencional, a continuación, combinamos el LFA con el paso de preconcentración de biomarcadores y mejora de la señal automatizado por ATPS. Cuando se prueba con diferentes diluciones de CT, el LFA mejorado pudo detectar CT a 0,32 ng/pl, demostrando una mejora de 30 veces sobre el LFA convencional (Figura 15). Esta mejora de 30 veces en el límite de detección es el resultado de las mejoras combinadas de la preconcentración de biomarcadores y la mejora de la señal. Con una mayor optimización tanto de la preconcentración de biomarcadores como de los componentes de mejora de la señal, se puede superar la mejora de 30 veces.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo para la detección y/o la cuantificación de un analito en una muestra, en donde
(a) dicho dispositivo comprende:
un sistema acuoso de dos fases (ATPS) que comprende una solución de fase mixta que se separa en una solución de primera fase y una solución de segunda fase donde, durante su uso, dicha solución de primera fase se convierte en una fase avanzada y dicha solución de segunda fase se convierte en una fase retrasada; un ensayo de flujo lateral (LFA) o un ensayo de flujo continuo; y
una sonda que se asocia con dicha solución de primera fase en dicha fase avanzada de dicho ATPS; y un reactivo de desarrollo que se asocia con dicha solución de segunda fase en dicha fase retrasada de dicho ATPS; o
(b) dicho dispositivo comprende:
un sistema de flujo continuo que comprende:
un componente de concentración que comprende un sistema acuoso de dos fases (ATPS) que comprende una solución de fase mixta donde, durante su uso, dicha solución de primera fase se convierte en una fase avanzada y dicha solución de segunda fase se convierte en una fase retrasada;
una sonda que se asocia con dicha solución de primera fase en dicha fase avanzada de dicho ATPS; y un reactivo de desarrollo que se asocia con dicha solución de segunda fase en dicha fase retrasada de dicho ATPS; y
un componente de detección dispuesto debajo de dicho componente de concentración;
en donde, para el dispositivo (a) y el dispositivo (b), dicha sonda comprende una enzima decorada en la superficie de dicha sonda y dicho reactivo de revelado comprende un sustrato que reacciona con dicha enzima para formar un producto visible, o dicha sonda está decorada con un sustrato enzimático y dicho reactivo de revelado comprende una enzima que reacciona con dicho sustrato enzimático para formar un producto visible, o dicho reactivo de revelado comprende un reactivo que reacciona con dicha sonda para formar una señal visible.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde:
dicha sonda comprende una enzima decorada en la superficie de dicha sonda donde dicha enzima comprende fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante u otra, o glucosa oxidasa, y dicho reactivo de revelado comprende un sustrato para dicha enzima; o
dicho reactivo de revelado comprende una enzima donde dicha enzima comprende fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante u otra, o glucosa oxidasa, y dicha sonda comprende un sustrato para dicha enzima; o dicha sonda comprende una partícula de oro y dicho reactivo de revelado comprende plata.
3. El dispositivo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde:
(a) el LFA comprende una matriz porosa que está configurada para recibir y/o contener dicho ATPS o los componentes del mismo y dicha sonda y dicho reactivo de desarrollo; o
(b) dicho componente de concentración comprende una o más capas de un papel.
4. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:
(a) dicho LFA comprende una almohadilla de conjugado, una línea de prueba que comprende un anticuerpo que se une a dicho analito, opcionalmente, una línea de control que comprende un anticuerpo secundario, opcionalmente una almohadilla absorbente y opcionalmente una almohadilla de muestra; o
(b) en donde dicho componente de detección comprende una almohadilla de conjugado, una almohadilla de reacción y, opcionalmente, un sumidero.
5. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:
(a) dicho dispositivo está configurado para que dicho ATPS se combine con dicha muestra antes de la aplicación a dicho dispositivo; o
(b) dicho ATPS se deshidrata en el ensayo de flujo lateral o en un componente de concentración de un ensayo de flujo continuo antes de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra y dicha sonda se deshidrata en el ensayo de flujo lateral o en un componente de concentración de un ensayo de flujo continuo antes de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra; y dicho reactivo de revelado se deshidrata en el ensayo de flujo lateral o en un componente de concentración de un ensayo de flujo continuo antes de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra.
6. El dispositivo de la reivindicación 5, en donde:
(a) el ATPS comprende una solución de fase mixta que se separa en una solución de primera fase hidrófila y una solución de segunda fase hidrófoba después de que el dispositivo se ponga en contacto con la muestra; y (b) dicha sonda se selecciona para una partición extrema en dicha fase hidrófila de dicho ATPS; y
(c) dicho reactivo de revelado se selecciona para una partición extrema en dicha fase hidrófoba de dicho ATPS.
7. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho ATPS se selecciona del grupo que consiste en un ATPS de polímero/sal, un ATPS de polímero/polímero, un ATPS micelar/polímero y un ATPS micelar, opcionalmente en donde
(a) una solución de primera fase de dicho ATPS comprende un Componente 1 de la Tabla 1; o
(b) una solución de segunda fase de dicho ATPS comprende un Componente 2 de la Tabla 1; o
(c) una solución de primera fase de dicho ATPS comprende un Componente 1 de la Tabla 1 y una solución de segunda fase de dicho ATPS comprende un Componente 2 de la Tabla 1; o
(d) dicho ATPS es un ATPS de polímero/sal, opcionalmente en donde dicho ATPS es un ATPS de PEG/sal.
8. El dispositivo de la reivindicación 7, en donde:
(a) dicho ATPS es un ATPS de polímero/sal y dicha sonda se divide en una fase rica en sal de dicho ATPS de polímero/sal y dicho reactivo de revelado se divide en una fase rica en polímero de dicho ATPS de polímero/sal; o (b) dicho ATPS es un ATPS micelar y dicha sonda se divide en una fase pobre en micelas de dicho ATPS y dicho reactivo de revelado se divide en una fase rica en micelas de dicho ATPS.
9. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde:
(a) dicha sonda comprende una fracción de unión que se une a dicho analito diana; o
(b) dicha sonda comprende una fracción de unión que se une a dicho analito diana en donde dicha fracción de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una lectina, un ácido nucleico y un aptámero; y/o
(c) dicha sonda comprende un material seleccionado del grupo que consiste en un polímero sintético, un metal, un mineral, un vidrio, un cuarzo, una cerámica, un polímero biológico, y un plástico, opcionalmente en donde
(i) dicha sonda comprende un material seleccionado del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, celulosa, quitina, nailon, polioximetileno, politetrafluoroetileno o cloruro de polivinilo, dextrano, polipropileno o polietilenglicol; o
(ii) dicha sonda comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en oro, plata, hierro, platino, paladio, cerio y titanio;
y/o
(d) dicha sonda comprende una nanopartícula;
(e) dicha sonda comprende un recubrimiento que tiene afinidad por la solución de primera fase de dicho ATPS; o (f) dicha sonda comprende un recubrimiento que tiene afinidad por la solución de primera fase de dicho ATPS, en donde dicho recubrimiento comprende un material seleccionado del grupo que consiste en polipropilenglicol, polietilenglicol, dextrano y una proteína hidrófila.
10. El dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en donde dicha sonda comprende una fracción de unión que se une a dicho analito diana y dicho analito diana comprende una fracción seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un ácido nucleico, un azúcar o lectina, y un microorganismo opcionalmente en donde:
(a) dicho analito diana comprende un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en una bacteria, un protozoario, un hongo, un virus y un alga; o
(b) dicho analito diana comprende un biomarcador para un microorganismo, opcionalmente en donde
(i) dicho analito diana comprende un biomarcador para un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en una bacteria, un protozoario, un hongo, un virus y un alga; o
(ii) dicho analito diana comprende un biomarcador para una enfermedad, un biomarcador de la inocuidad (o peligro) de los alimentos, o un biomarcador para un agente bioterrorista.
11. Un sistema acuoso de dos fases (ATPS) que comprende:
(a) una solución de fase mixta que es capaz de separarse en una solución de primera fase que es una solución de fase avanzada y una solución de segunda fase que es una fase retrasada, para su uso en un LFA o ensayo de flujo;
(b) una sonda que se asocia con dicha solución de primera fase en dicha fase avanzada de dicho ATPS; y (c) un reactivo de revelado que se asocia con dicha solución de segunda fase en dicha fase retrasada de dicho ATPS.
12. El sistema acuoso de dos fases de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:
(a) dicho ATPS es un ATPS de polímero/sal y dicha sonda se divide en una fase rica en sal de dicho ATPS de polímero/sal y dicho reactivo de revelado se divide en una fase rica en polímero de dicho ATPS de polímero/sal; o (b) dicho ATPS es un ATPS micelar y dicha sonda se divide en una fase pobre en micelas de dicho ATPS y dicho reactivo de revelado se divide en una fase rica en micelas de dicho ATPS.
13. Un método para detectar y/o cuantificar un analito, comprendiendo dicho método:
(a) aplicar una muestra a un sistema acuoso de dos fases (ATPS) para concentrar dicho analito, si está presente en dicha muestra, en una fase del ATPS para proporcionar una fase que contiene analito usando un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde dicha sonda se une a dicho analito y, a continuación, dicha sonda se pone en contacto con dicho reactivo de revelado para proporcionar una señal mejorada; y
(b) detectar y/o cuantificar dicha señal para indicar la presencia y/o la cantidad de dicho analito en dicha muestra.
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