CN111672544B - 一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，包括：将待存储的生化试剂溶于水两相系统溶液，之后将水两相系统溶液滴加于纸芯片的试剂存储区域，溶剂挥发诱导水两相系统发生相分离，形成含水双层薄膜。生化试剂选择性分布于下层薄膜，上层薄膜抑制下层薄膜的水分挥发，避免了试剂与外界环境的直接接触，提高了生化试剂的存储稳定性。之后将加载试剂的纸芯片封存于真空密封袋中，可于4℃或常温保存。本发明的基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法以水两相系统作为试剂存储介质，充分利用其生物相容性好、可控相分离的特点，实现了生化试剂的稳定存储。

Description

一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法
技术领域
本发明涉及现场及时检验(POCT)领域，具体涉及一种适用于便携式微型器件及现场即时检测技术的基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法。
背景技术
便捷式即时检测技术对发展中国家尤其是基础设施缺乏、医疗人员短缺的国家具有重要意义，也是分析化学和医学领域的交叉热点。
纸基微流控芯片是即时检测分析领域最具潜力的技术，其利用纸纤维的毛细效应驱动流体沿特定线路运动，实现分析检测功能，具有试剂消耗好、成本低廉、轻便易携带、操作简单等特点，已经应用于环境检测、食品安全、医疗筛查等方面。基于纸的微流控设备因其廉价易得且具有亲水性和生物相适性而备受关注。但是纸芯片在使用过程中仍需配备专门的试剂盒，需多次添加试剂，增加了试剂保存的成本，限制了纸芯片的及时检测应用。为解决上述问题，人们尝试将测试相关的试剂整合并存储到纸芯片中，增加用户便利性。尽管已经发展多种纸芯片的试剂存储技术，包括冻干技术、液态试剂存储、凝胶存储等，但是现有存储试剂仍然存在问题：(1)试剂种类繁多，不同试剂需要不同存储方法，特别是具有生物活性的大分子很难储存；(2)纸芯片属于开放体系，试剂直接与环境接触，易受环境因素的影响(如湿度、温度)。因此，如何在纸芯片上稳定存储生化试剂仍然存在挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种科用于现场即时检测领域的简单可靠的生化试剂稳定存储的方法，以解决现有的纸芯片及其他便携式微器件的试剂存储不便的问题。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：
一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，包括：
将生化试剂溶于水两相系统溶液；
将溶有生化试剂的水两相系统溶液滴加于纸芯片的试剂存储区域，之后水两相系统溶液中的溶剂挥发诱导水两相系统发生相分离形成含水双层薄膜，其中，生化试剂分布于含水双层薄膜的下层薄膜中；
将加载试剂的纸芯片存储于密封环境中。
进一步的，所述水两相系统是聚合物/聚合物系统、聚合物/盐系统、聚合物/表面活性剂系统中的至少一种。
进一步的，所述聚合物/聚合物系统是聚乙二醇/葡聚糖、葡聚糖/聚蔗糖、葡聚糖/环氧乙烷-环氧丙烷中的至少一种。
进一步的，所述纸芯片是由惰性纤维素组成的多孔网状结构材料。
进一步的，所述多孔网状结构材料是滤纸或硝酸纤维素膜。
进一步的，所述生化试剂是蛋白质、核酸、糖类、微生物、病毒中的至少一种。
进一步的，所述存储方法还包括：根据纸芯片存储区域的大小调节纸芯片中的生化试剂存储量。
进一步的，所述生化试剂的存储量是1皮克～1克。
进一步的，纸芯片存储的密封环境的温度是-80℃～50℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，以水两相系统作为试剂存储介质，充分利用其生物相容性好、可控相分离的特点，实现了生化试剂的稳定存储。该方法不涉及任何昂贵和复杂仪器，操作简单，适用范围广，有望解决便携式微型检测器件的试剂存储难题，有利于现场及时检测技术的商业推广。
附图说明
图1溶液组成对辣根过氧化物酶活性影响；
图2铁-乙二胺四乙酸络合物添加量对辣根过氧化物酶活性影响；
图3右旋糖苷保存的酶活性表征；
图4酶标检测抗体的选择性分布示意图；
图5聚乙二醇和右旋糖苷相的酶标检测抗体显色反应结果；
图6纸芯片上试剂装载及保存示意图；
图7纸芯片免疫分析流程图；
图8纸芯片癌胚抗原检测的标准曲线；
图9室温(1)和4℃(2)存储的纸芯片在不同时间点测得的活性对比图。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1辣根过氧化物酶在右旋糖苷相的存储
辣根过氧化物酶分别溶解于5％(w/v)的右旋糖苷溶液和10mM磷酸缓冲液(pH7.4)，终浓度均为0.05μg/mL。3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢水溶液按1：6的体积比混合，形成底物溶液。取10μL上述两种酶溶液于两个离心管中，分别加入70μL底物溶液，反应15分钟，加入10μL硫酸溶液(2M)停止反应，采用分光光度法测量两种反应液的紫外可见光谱(图1)。实验表明溶液中的右旋糖苷不会导致酶活性降低。
取四份上述右旋糖苷酶溶液(每份1mL)，每份溶液加入不同量的铁-乙二胺四乙酸络合物溶液，使得溶液中铁-乙二胺四乙酸的终浓度分别为0、10、50、100μM。将添加铁-乙二胺四乙酸络合物的酶溶液移入离心管中，每管装25μL，真空干燥约35分钟，离心管中的溶液变为干胶状。离心管置于真空密封袋，4℃冰箱存储3小时。取出离心管，用25μL，5％(w/v)的右旋糖苷溶液重新水化干胶，加入175μL底物溶液，反应1分钟，然后每隔1分钟测量一次混合液在650nm处的吸收值。吸收值与显色时间呈线性关系，直线的斜率即为初始反应速率，作为酶活性的评价参数。实验证明50μM铁-乙二胺四乙酸络合物有利于保持酶的活性(图2)。
在离心管中加入25μL，0.05μg/mL的辣根过氧化物酶溶液(包含5％(w/v)右旋糖苷溶液、50μM铁-乙二胺四乙酸络合物)，真空干燥形成干胶，封存于真空密封袋，4℃冰箱分别存储30、60、90、120天，取出离心管，重新水化测量初始反应速率。存储酶再水化溶液与新配酶溶液的初始反应速率的比值随时间的变化趋势如图3所示。
实施例2存储试剂的纸芯片用于癌胚抗原的现场即时检测
辣根过氧化物酶标记的检测抗体溶于均相聚乙二醇/右旋糖苷溶液，溶剂挥发诱导相分离，形成两层溶液，下层为右旋糖苷相，上层为聚乙二醇相。辣根过氧化物酶标记的检测抗体在相分离的过程会选择性分布于下层的右旋糖苷相中，如图4所示。分别取出相分离后的聚乙二醇相和右旋糖苷相，加入底物反应，硫酸溶液终止反应后测量反应液的吸收光谱曲线，如图5所示。实验证明辣根过氧化物酶标记的检测抗体主要分布于右旋糖苷相。
纸芯片主要利用聚乙二醇/右旋糖苷系统的相分离过程将抗体存储于右旋糖苷相中，聚乙二醇相主要起隔离保护，抑制糖苷相水分挥发的作用。纸芯片装载抗体过程如下(图6)：纸芯片的捕获抗体存储区域滴加5μL，0.25mg/mL的壳聚糖溶液，干燥，2.5％(v/v)的戊二醛溶液活化2小时，去离子水清洗，滴加1μg/mL的癌胚抗原捕获抗体溶液(含5％右旋糖苷溶液、5％聚乙二醇和50μM铁-乙二胺四乙酸络合物)，孵育30分钟，室温干燥。纸芯片的酶标检测抗体存储区域采用1％(w/v)的牛血清白蛋白液溶液封闭15分钟，去离子水清洗，室温干燥，滴加一定体积的15μg/mL的酶标检测抗体溶液(含5％右旋糖苷、5％聚乙二醇和50μM铁-乙二胺四乙酸络合物)，室温干燥。
癌胚抗原的现场即时检测流程如图7所示。磷酸缓冲溶液清洗捕获抗体区域，除去游离的捕获抗体，1％(w/v)的牛血清白蛋白封闭液封闭15分钟，0.05(v/v)吐温20磷酸缓冲溶液清洗，滴加3μL癌胚抗原(浓度可变)，孵育30分钟，0.05％(v/v)吐温20的磷酸缓冲溶液清洗，室温干燥，封闭纸芯片存储区域底部，翻折纸芯片，使酶标检测抗体的存储区域与捕获抗体的存储区域对应接触，去离子水重新水化酶标检测抗体，室温反应30分钟，0.05％(v/v)吐温20的磷酸缓冲溶液清洗，滴加底物溶液，反应3分钟，手机拍摄显色照片。ImageJ处理显色照片，测量显色区域的RGB值，计算Blue/Red值，并作为免疫检测信号。最佳实验条件下，癌胚抗原检测的标准曲线如图8所示。
实施例3纸芯片上抗体存储实验
将装载抗体的纸芯片置于真空密封袋，分别于4℃和室温(25℃左右)下存储，在特定的时间点取出纸芯片，采用上述癌胚抗原检测流程测量20ng/mL的癌胚抗原的Blue/Red值，并与未经保存的纸芯片测得的Blue/Red值进行比较，结果如图9所示。实验表明：经过4℃和室温存储104天，纸芯片的检测效果分别保持在90％和70％左右。

Claims (9)

1.一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，包括：
将生化试剂溶于水两相系统溶液；
将溶有生化试剂的水两相系统溶液滴加于纸芯片的试剂存储区域，之后水两相系统溶液中的溶剂挥发诱导水两相系统发生相分离形成含水双层薄膜，其中，生化试剂分布于含水双层薄膜的下层薄膜中；
将加载试剂的纸芯片存储于密封环境中。
2.根据权利要求1中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，所述水两相系统是聚合物/聚合物系统、聚合物/盐系统、聚合物/表面活性剂系统中的至少一种。
3.根据权利要求2中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，所述聚合物/聚合物系统是聚乙二醇/葡聚糖、葡聚糖/聚蔗糖、葡聚糖/环氧乙烷-环氧丙烷中的至少一种。
4.根据权利要求1中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，所述纸芯片是由惰性纤维素组成的多孔网状结构材料。
5.根据权利要求4中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，所述多孔网状结构材料是滤纸。
6.根据权利要求1中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，所述生化试剂是蛋白质、核酸、糖类、微生物中的至少一种。
7.根据权利要求1中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，还包括：根据纸芯片存储区域的大小调节纸芯片中的生化试剂存储量。
8.根据权利要求7中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，所述生化试剂的存储量是1皮克～1克。
9.根据权利要求1中所述的一种基于水两相系统的纸基生化试剂存储方法，其特征在于，纸芯片存储的密封环境的温度是-80℃～50℃。
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