CN101539576A - 乙型肝炎病毒前s1抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种乙型肝炎病毒前S1抗原测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括：1)乙肝病毒前S1抗原校准品；2)亲和素化的载体；3)生物素化的乙肝病毒前S1单克隆抗体；4)吖啶酯标记的抗－HBs单克隆抗体；5)化学发光启动剂；以及6)浓缩洗涤液。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以乙肝病毒前S1纯品配制校准品；2)以亲和素包被载体；3)使乙肝病毒前S1单抗生物素化；4)以吖啶酯标记抗－HBs单抗；5)配制化学发光启动剂；6)配制浓缩洗涤液；7)分装上述校准品、生物素化抗体、吖啶酯标记物、化学发光启动剂和浓缩洗涤液；以及8)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Description

乙型肝炎病毒前S1抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种乙型肝炎病毒前S1抗原测定试剂盒及其制备方法，结合了生物素-亲和素间接包被技术和化学发光免疫分析技术。

背景技术

乙型肝炎病毒属嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且和肝癌的发生密切相关。中国是乙型肝炎的高流行区，但目前尚无有效的抗病毒方法治疗乙型肝炎病毒慢性感染，因此病毒的预防和检测就是避免感染的重要手段，对病毒感染的动态监测也能为乙肝的发展、预后提供重要的信息。

乙肝病毒表面抗原是乙型肝炎病毒的外膜蛋白，由乙型肝炎病毒基因组的S区所编码。乙型肝炎病毒表面抗原依靠三个启动子进行表达后，产物分别为大蛋白(LHBs，包括前S1，前S2和S)；中蛋白(MHBs，包括前S2和S)；小蛋白(SHBs，包括S)，我们通常检测的乙肝表面抗原实际指的是小蛋白(SHBs)。

乙型肝炎病毒可以分泌三种病毒颗粒：小球形颗粒(直径约22nm)，主要由MHBs和SHBs组成，管状颗粒(直径约22nm，长度约100-1000nm)，由LHBs，MHBs和SHBs组成；Dane颗粒，其外膜结构蛋白组成与管状颗粒一致，Dane颗粒包含有乙型肝炎病毒DNA。完整病毒颗粒外膜的组成依赖于LHBs，MHBs和SHBs三种蛋白的共同作用，而在LHBs缺失的情况下，后两者只能形成小球形颗粒，因此LHBs的表达实际上起着调节病毒外膜组装能力的作用。只有当LHBs蛋白表达达到一定的量时，病毒颗粒才能以有包膜的形式(包括管状颗粒和Dane颗粒)被释放。因此，检测LHBs，实际反应的是体内管状颗粒和Dane颗粒的实际水平，由于Dane颗粒代表着病毒基因在血液中的实际存在，因此LHBs的存在实际上不仅因意味着病毒基因，也代表着无病毒基因管状颗粒形式的存在。而临床的慢性肝炎病人中，血液中和肝细胞中都有管状颗粒，其浓度甚至是真病毒颗粒的上万倍。因此可以根据检测血液中LHBs的含量，判断病毒携带者体内的乙型肝炎病毒是否进行复制。

近年来，临床开始出现前S1抗原诊断试剂盒，其利用单独表达前S1片段制备单克隆抗体，进行免疫学检测血清中前S1蛋白的存在，但是临床数据显示这种试剂盒存在诸多不足，最显著的就是漏检，临床已经发现大量PCR检测乙型肝炎病毒DNA阳性的标本使用前S1抗原诊断试剂盒检测是阴性。

化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合发展起来的一项新的免疫分析技术。利用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒前S1抗原，具有极高的特异性，可以迅速的从血清中高度特异的识别相应的抗原。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相上(塑料管，磁颗粒等)会存在单抗用量大、活性损失大、批间批内精密性差等缺点，而且工艺优化较为繁琐，而将亲和素包被于固相载体上，使捕获抗体生物素化，以上问题即可迎刃而解而且生产过程更易于监控，本发明利用亲和素固相，与生物素化单抗和待测样本中前S1抗原反应形成固相亲和素-生物化抗体-前S1抗原复合物，再与吖啶酯标记的抗-HBs反应形成固相亲和素-生物素化抗体-前S1抗原-吖啶酯标记抗-HBs夹心复合物，然后加入化学发光启动剂，利用化学发光仪检测相对发光强度，就可以定量分析反映血清中乙型肝炎病毒前S1的含量，进而体现乙型肝炎病毒的感染水平。

本发明的目的正是为了解决目前临床上用前S1单克隆抗体作为乙型肝炎大蛋白指标检测手段的不足，本发明的乙型肝炎病毒前S1化学发光测定试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，与PCR检测乙型肝炎病毒DNA结果符合度极高，提高了乙型肝炎病毒大蛋白前S区的检出率，辅助临床在蛋白水平上观察病毒复制的水平，为尽早采取有效综合治疗方案，预防肝硬化和肝癌的发生。

另外，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒采用化学发光免疫分析技术结合生物素-亲和素系统，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明将生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光技术与乙型肝炎病毒前S1的免疫分析学有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测乙型肝炎病毒前S1的试剂盒及其制备方法，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光免疫分析测定乙型肝炎病毒前S1的试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。本发明的试剂盒包括：1)乙型肝炎病毒前S1抗原校准品；2)亲和素化的固相载体；3)生物素化的乙型肝炎病毒前S1单克隆抗体；4)吖啶酯标记的抗-HBs单克隆抗体；5)上述吖啶酯发光所需的化学发光启动剂；以及6)浓缩洗涤液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述亲和素化的固相载体为塑料管、塑料珠或磁性颗粒。

根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光启动剂为过氧化脲或过氧化氢。

根据本发明的试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液的配方为：含16％NaCl、0.4％KCl的0.2M pH7.4 Tris-HCl缓冲液。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)以乙型肝炎病毒前S1纯品配制乙型肝炎病毒前S1校准品；

2)以亲和素包被固相载体；

3)使乙型肝炎病毒前S1单克隆抗体生物素化；

4)用吖啶酯标记抗-HBs单克隆抗体；

5)配制化学发光启动剂；

6)配制浓缩洗涤液；

7)分装上述乙型肝炎病毒前S1校准品、生物素化的乙型肝炎病毒S1单克隆抗体、吖啶酯标记的抗-HBs单克隆抗体、化学发光启动剂和浓缩洗涤液；以及

8)组装为成品。

根据本发明的方法，其中，所述亲和素包被固相载体的步骤2)采用以下方法：

用0.046M pH值为4.6的柠檬酸冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。

根据本发明的方法，其中，所述亲和素包被的固相载体为塑料管、塑料珠或磁性颗粒。

根据本发明的方法，其中，所述化学发光启动剂为过氧化脲或过氧化氢。

根据本发明的方法，其中，所述浓缩洗涤液的配方为：含16％NaCl、0.4％KCl的0.2M pH7.4 Tris-HCl缓冲液。

本发明的“乙型肝炎病毒前S1化学发光免疫分析测定试剂盒”可以准确的诊断出乙型肝炎病毒的复制感染情况。本发明的试剂盒显示出极高的灵敏度，没有交叉反应，特异性良好，便于产业化及质量控制。该试剂盒可以根据乙型肝炎病毒前S1含量的多少判断治疗效果及其病情的变化，具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该乙型肝炎病毒前S1测定试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到酶联免疫分析试剂盒的分析法水平。

本发明的试剂盒应用过氧化脲或过氧化氢在碱性条件下启动吖啶酯化学发光，通过检测吖啶酯产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而临床符合率大大提高。

并且，本发明以吖啶酯标记抗-HBs单克隆抗体检测样本中的前S1抗原，避免了酶免试剂存在的灵敏度低、反应易受温度和酸碱度变化的影响、内源性酶干扰、底物大部分有毒或为致癌等缺点，具有反应速度快、光信号不受温度变化影响、成本低、易储存等优势。

根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒既有效地利用了化学发光技术原理，又确保了检测的灵敏度。另外，这种模式还便于操作和生产。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒校准曲线的线性图。

具体实施方式

实施例1制备本发明的乙型肝炎病毒前S1抗原化学发光免疫分析测定试剂盒

一、吖啶酯标记抗体制备和生物素偶联抗体的制备

1、吖啶酯标记方法

(1)将1mg/ml的待标记抗体500μl(pH7.20.050M PBS)加入棕色玻璃瓶；

(2)将10μl的吖啶酯(5mM DMF溶液)加入上述棕色玻璃瓶，与待标记抗体室温避光反应30min；

(3)加入30mg/ml的赖氨酸溶液100μl终止反应；

(4)采用硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶柱分离、纯化吖啶酯标记抗体；

(5)将标记抗体加入1％BSA、50％甘油分装冻存。

2、生物素偶联乙型肝炎病毒前S1单克隆抗体的制备

(1)用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)配成1mg/mL；

(2)用0.1mol/LpH值为9.0的NaHCO₃将纯化的乙型肝炎病毒前S1单克隆抗体稀释为1～2mg/mL；

(3)按BNHS与抗体容积比为1∶8或重量比1∶7左右混合，室温搅拌下反应2～4h；

(4)装入透析对0.05mol/L pH值为7.2的PBS，4℃透析过夜，结合物加等体积甘油，小量分装，-20℃以下保存备用。

3、标记单抗稀释液配制

Tris    12.120g

BSA     5g

Proclin 300    1mL

双蒸水         1000mL

4、生物素化单抗和吖啶酯标记单抗工作液的配制

将制备的生物素化单抗、吖啶酯标记单抗分别用标记抗体稀释液稀释成不同的稀释度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度为分别为1∶5000、1∶3000。

二、乙型肝炎病毒前S1校准品的制备

用乙型肝炎病毒前S1纯品配制校准品，浓度分别为0、2、5、20、50、100ng/mL，分装6瓶。

三、亲和素化的塑料管制备

(1)包被

采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的亲和素混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

具体地，所述包被方法包括

柠檬酸            4.44g

柠檬酸三钠        7.3g

去离子水          1000mL

溶解混匀后，调整pH值至4.6，加入5.0mg亲和素混匀，然后将110μL加入塑料管中，4℃过夜。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭

NaH₂PO₄·2H₂O     0.2g

Na₂HPO₄·12H₂O    2.9g

BSA               10g

Proclin 300       1mL

双蒸水            定容至1000mL

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，测定pH值为7.0。

将封闭液300μL加入塑料管，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2～8℃保存。

四、化学发光启动剂A

65％HNO₃          10.0mL

过氧化脲          2.0g

Proclin 300       1mL

双蒸水            1000mL

五、化学发光启动剂B

Na₂OH             10.0g

Triton X-100      20mL

Proclin 300       1mL

双蒸水            1000mL

六、浓缩洗涤液

Tris               24g

NaCl               160g

KCl                4g

HCl                15mL

去离子水           1000mL

调整pH值至7.4。

使用时用双蒸水20倍稀释。

七、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成乙型肝炎病毒前S1测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，包括吖啶酯标记抗体与生物素化抗体的活性、亲和素化载体的吸附性能和精密性以及吖啶酯的发光强度等。然后对亲和素化载体的方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和封闭液进行试验，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，通过亲和素不同包被浓度试验找到最佳的浓度条件。对于生物素偶联抗体和对于吖啶酯的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比试验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对生物素偶联抗体和吖啶酯标记物使用的稀释液进行了长期的考察试验，配制出了能够使生物素偶联抗体和吖啶酯标记物长期保持活性而稳定的稀释液。

利用本发明的试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查。

实施例2制备本发明的乙型肝炎病毒前S1化学发光免疫分析测定试剂盒

除以塑料珠作为固相载体，其余均以与实施例1相同的方法制备乙型肝炎病毒前S1化学发光免疫分析测定试剂盒。

实施例3制备本发明的乙型肝炎病毒前S1化学发光免疫分析测定试剂盒

除以磁性颗粒作为载体、通过戊二醛偶联法制备磁颗粒固相化亲和素外，其余均以与实施例1相同的方法制备乙型肝炎病毒前S1化学发光免疫分析测定试剂盒。

实施例4本发明的试剂盒的使用方法

以上实施例1制备的乙型肝炎病毒前S1化学发光免疫分析测定试剂盒的具体操作如下：

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟；

2)分别将各浓度点校准品和待测样本50μL加入相应塑料管，然后加生物素化的抗体50μL；

3)37℃温育30分钟；

4)用稀释后的洗涤液洗5次，注满洗涤液，每次浸泡10秒；

5)将吖啶酯标记物50μl加入塑料管，37℃温育30分钟；

6)用稀释后的洗涤液洗5次，注满洗涤液，每次浸泡10秒；

5)加入化学发光启动剂A、B各50μl，直接测量其发光强度(RLU)，测量时间1秒/管。

6)以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该样本的前S1抗原浓度。

实施例5本发明的试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果见下表1：

表1试剂盒的技术指标检测结果

检验项目	检验标准	检验结果
			准确性	平均回收率在90.0～110.0％	95.8％
特异性	与其类似物的交叉反应率≤0.01％	＜0.01％
			精密性CV(％)	≤15％(n＝10)	5.4％
灵敏度	≤0.5ng/mL	0.1ng/mL
			稳定性	各试剂组分置37℃至少7天	符合以上指标

以上结果表明“乙肝前S1化学发光免疫分析测定试剂盒”的准确性、特异性、精密性、灵敏度和稳定性是完全符合要求的。

实施例6使用本发明的试剂盒与市场上的酶联免疫试剂盒对病人血样测值的比较

使用本发明的试剂盒和酶联免疫大蛋白检测试剂盒同时检测45份乙肝大三阳病人标本，两种试剂盒的比较结果见下表2：

表2本试剂盒与酶联试剂盒检测对比结果

从所列检测结果数据分析，本发明试剂盒在45份大三阳标本中检出34份阳性，阳性率为76％，而酶免试剂盒检出30份阳性，阳性率为67％。结果显示本试剂盒的检测结果与临床具有更高的符合率，更便于推广应用，安全可靠。

Claims (9)

1、一种乙型肝炎病毒前S1抗原化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)乙型肝炎病毒前S1抗原校准品；

2)亲和素化的固相载体；

3)生物素化的乙型肝炎病毒前S1单克隆抗体；

4)吖啶酯标记的抗-HBs单克隆抗体；

5)上述吖啶酯发光所需的化学发光启动剂；以及

6)浓缩洗涤液。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素化的固相载体为塑料管、塑料珠或磁性颗粒。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光启动剂为过氧化脲或过氧化氢。

4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的配方为：含16％NaCl、0.4％KCl的0.2M pH7.4Tris-HCl缓冲液。

5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以乙型肝炎病毒前S1纯品配制乙型肝炎病毒前S1校准品；

2)以亲和素包被固相载体；

3)使乙型肝炎病毒前S1单克隆抗体生物素化；

4)用吖啶酯标记抗-HBs单克隆抗体；

5)配制化学发光启动剂；

6)配制浓缩洗涤液；

7)分装上述乙型肝炎病毒前S1校准品、生物素化的乙型肝炎病毒S1单克隆抗体、吖啶酯标记的抗-HBs单克隆抗体、化学发光启动剂和浓缩洗涤液；以及

8)组装为成品。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述亲和素包被固相载体的步骤2)采用以下方法：

用0.046M pH值为4.6的柠檬酸冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。

7、如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述亲和素包被的固相载体为塑料管、塑料珠或磁性颗粒。

8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学发启动剂为过氧化脲或过氧化氢。

9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述浓缩洗涤液的配方为：含16％NaCl、0.4％KCl的0.2M pH7.4Tris-HCl缓冲液。

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