CN104040358A - 微流体装置和使用其测定流体样品的方法 - Google Patents

微流体装置和使用其测定流体样品的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了多方向微流体装置及使用其的方法。本发明内容的方面包括微流体装置，其包括具有分离介质、第一结合介质和第二结合介质的室。另外，所述装置包括流场元件，其被配置成使所述室经过两种以上方向不同的流场。还提供使用所述装置的方法、以及包括所述装置的系统和试剂盒。所述装置、系统和方法可用于各种各样的应用，包括诊断、研究和验证测定。

Description

微流体装置和使用其测定流体样品的方法
引言
各种各样的分析技术可以用来检测给定样品中的特定分析物。例如，Western印迹可以用来检测样品中的蛋白质，其中通过凝胶电泳分离样品中的蛋白质，接着用对于靶蛋白质特异性的抗体进行探测。Southern印迹结合电泳分离的DNA片段转移至过滤膜和随后的通过探针杂交的片段检测。Northern印迹涉及使用电泳通过尺寸分离RNA样品，和用于部分或整个靶序列互补的杂交探针检测。Eastern印迹可以用来检测蛋白质翻译后修饰(PTM)，其中通过使用对于脂质、糖、磷酸化或任何其他蛋白质修饰是特异性的探针分析电泳分离的蛋白质的翻译后修饰。Far-Western印迹类似于Western印迹，但使用非抗体蛋白质结合关注的蛋白质，并因此可以用来检测蛋白质之间的相互作用。SouthWestern印迹是可以用来检测DNA结合蛋白质的技术，其中通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，接着用染色体组DNA片段进行探测。
如上所述，常规的印迹技术，可能达不到要求高通过量样品分析或在资源贫乏环境中操作的应用的性能需要。印迹技术可能要求劳动密集型、耗时、由受训技术人员进行的多步骤程序，并因此可能对于临床环境使用是不实用的。
概述
提供了多方向微流体装置和使用其的方法。本公开内容的方面包括微流体装置，其包括具有分离介质、第一结合介质和第二结合介质的室。另外，所述装置包括流场元件(flow field element)，其被配置成使所述室经过两种以上方向不同的流场。还提供了使用所述装置的方法、以及包括该装置的系统和试剂盒。所述装置、系统和方法可用于各种各样的不同应用，包括诊断、研究和验证测定。
附图简述
图1示出了根据本公开内容的实施方式的配置用于多种非变性蛋白质印迹的微流体装置的示意图。图1(a)示出了具有编号为1-8的储液槽的微通道和微室网络设计的示意图。图1(a)插图示出了室的亮场图像，其显示光图样化凝胶区：大孔尺寸加载凝胶，PAGE分离区，Ab1和Ab2指示离散的印迹区。图1(b)显示根据本公开内容的实施方式的多分析物印迹方案的示意图。步骤1：PAGE分离沿着分离轴（由“i”指示的电流）拆分蛋白质。步骤2：拆分的蛋白质侧向电泳转移至和通过引进区。步骤3：在每个印迹区中的结合至固定化抗体的蛋白质被保留，而所有其他物质移出所述室。
图2示出了根据本公开内容的实施方式的具有离散的印迹区的微流体装置的示意图，所述印迹区能够使独特靶标从单个样品(a)分离、(b)转移和(c)多种印迹。阴性对照(TI)显示与印迹区或界面没有相互作用。在注射/分离期间的E=95V/cm，分离的蛋白质转移至印迹区期间的E=50V/cm。(经由荧光显微镜的图像收集)
图3示出了根据本公开内容的实施方式的与印迹区中的结合的模型化相关的图，其告知选择操作条件以最大化结合效率。图3(a)示出了作为侧场强度的函数的带分布的图（实验结果对刺激）。图3(b)示出了对于给定的芯片几何形状(印迹区宽度和结合位点强度)，作为Da的函数变化的靶标捕获效率的图。
图4示出了显示根据本公开内容的实施方式使得共迁移物质的选择性蛋白质印迹的蛋白质免疫印迹的图像。两种颜色图样合成物显示具有两种共迁移物质（这里的红色标记的蛋白质G(PG)和绿色标记的BSA）的非变性PAGE(27s)。绿色标记的TI充当快速移动阴性对照。最快的红色峰不含染料。侧向转移移动所有物质至单个印迹区(34s和43s)，容纳对于蛋白质G的固定抗体。红色标记的蛋白质G被选择性地结合而BSA和TI移出室外(67s)。
图5示出了根据本公开内容的实施方式的允许检测未标记样品(SNR～38)的夹心测定。图5(a)示出了用于拆分和检测未标记样品的芯片上技术的示意图。图5(b)和图5(c)示出了AF488绿色标记的固定化蛋白质靶标在绿色荧光激发下是可见的；其初始在红色波长下是不可见的直至其用德克萨斯红(Texas Red)(TR)标记的一次抗体温育。
图6示出了根据本公开内容的实施方式，能够制造具有可变物理和功能性质的多个PA凝胶区的多步骤光刻法的示意图。该制造方法形成用于完全自动化的、低样品损失、多分析物非变性Western印迹的装置。
图7示出了根据本公开内容的实施方式在所述装置内的相应印迹区处取得的转移后荧光显微图像。大荧光标记的非靶标分子由于孔径排斥或非特异性结合相互作用而不被保持在印迹凝胶界面处。阳性对照揭示作为在相应印迹区的绿色荧光分布(参见蛋白质G v.抗蛋白质G凝胶和CRP v.抗-CRP凝胶)。阴性对照包括高分子量物质如α-辅肌动蛋白和IgG(分别为100和150kDa)。
图8显示根据本公开内容的实施方式，提出的模型刺激在一系列有限间隔内的两组不同元件之间的Langmuir结合反应。迁移速率决定保留时间步(Δt)，其中每个靶标带元件是与匹配凝胶元件共区域化的或“温育的”。
详述
提供了多方向微流体装置和使用其的方法。本公开内容的方面包括微流体装置，其包括具有分离介质、第一结合介质和第二结合介质的室。另外，所述装置包括流场元件，其被配置成使所述室经过两种以上方向不同的流场。还提供了使用该装置的方法、以及包括该装置的系统和试剂盒。所述装置、系统和方法可用于各种各样的不同应用，包括诊断、研究和验证测定。
以下，首先更详细地描述主题微流体装置。还公开了检测流体样品中的分析物的方法，其中主题微流体装置发现用途。另外，还描述了包括主题微流体装置的系统和试剂盒。
微流体装置
本公开内容的实施方式包括多方向微流体装置。“多方向”是指多于一个方向，如两个以上方向、三个以上方向、四个以上方向等。在某些实施方式中，在单个平面中包括两个以上方向，以使两个以上方向共面。在一些情况下，所述两个以上方向不是共面的，使得两个方向被包含在不同的、相交平面中。在这些情况下，所述两个以上方向可以的多维度的。“多维度的”是指多于一个维度，如二维、三维等。多维度的方向可以占据三维空间的区域。例如，不是共面的两个方向可以各自被包含在不同的、相交平面中，以使包含该两个方向的相交平面占据三维空间的区域。
在某些实施方式中，所述微流体装置被配置成在多于一个方向(例如，微流体装置是多方向的)，如两个以上方向，三个以上方向，四个以上方向等引导流体。例如，所述微流体装置可以被配置成在两个方向、三个方向、四个方向等引导流体。在一些情况下，所述微流体装置是多维度的。例如，所述微流体装置可以被配置成在两个以上方向引导流体，其中所述两个以上方向不是共面的，使得所述两个以上方向被包含在两个以上不同的、相交平面中。在这些情况下，包含两个以上方向的相交平面可以占据三维空间的区域。例如，微流体装置可以包含在基板中，使得所述微流体装置是平面的。微流体装置可以被配置成在该平面内的多个方向上引导流体。在某些实施方式中，微流体装置被配置成在多个维度如三个维度上引导流体。例如，微流体装置可以被配置成在同一平面内的多个方向上引导流体，以及在非共平面内引导流体，以使所述微流体装置被配置成是三维微流体装置。
在某些实施方式中，微流体装置包含分离介质。所述分离介质可以被配置成浆样品中的分析物彼此分离开。在一些情况下，所述分离介质被配置成基于分析物的物理性质分离样品中的分析物。例如，所述分离介质可以被配置成基于分析物的分子量、尺寸、电荷(例如，荷质比)、等电点等分离样品中的分析物。在某些情况下，所述分离介质被配置成基于分析物的分子量分离样品中的分析物。在一些情况下，所述分离介质被配置成基于分析物的等电点(例如，等电点聚焦)分离样品中的分析物。分离介质可以被配置成将样品中的分析物分成分析物的不同可检测带。“带”是指不同的可检测区，其中分析物的浓度显著高于周围区域。分析物的各个带可以包括单个分析物或多个分析物，其中在分析物的单个带中的每个分析物具有基本上类似的物理性质，如上所述。
在某些实施方式中，分离介质被配置成当样品穿过该分离介质时分离样品中的分析物。在一些情况下，分离介质被配置成当样品流过该分离介质时分离样品中的分析物。分离介质的方面包括所述分离介质具有有取向轴的流路。“流路”是指流体样品在其移动时行进的方向。在一些情况下，流路是样品在其穿过介质如分离介质、结合介质等时样品行进的方向。如上所述，分离介质可以具有有取向轴的流路。在一些实施方式中，分离流路的取向轴与分离介质的长度成一直线。在这些实施方式中，样品在分离介质的分离流路的方向上穿过分离介质（例如，样品可以在分离介质的长度穿过分离介质）。在一些情况下，分离介质的长度大于分离介质的宽度，如2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,20倍,50倍,100倍等分离介质的宽度。在一些情况下，分离介质的分离流路由通道如微流体通道限定。分离介质可以包含在微流体通道中，以使样品在样品流过该微流体通道时穿过该分离介质。
在某些实施方式中，分离介质包括聚合物，如聚合物凝胶。聚合物凝胶可以是适用于凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可以包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶等。分离介质的分辨率可以取决于各种因素，如但不限于孔径、总聚合物含量(例如，总丙烯酰胺含量)、交联剂的浓度、施加的电场、测定时间等。例如，分离介质的分辨率可以取决于分离介质的孔径。在一些情况下，孔径取决于分离介质的总聚合物含量和/或分离介质中交联剂的浓度。在某些情况下，分离介质被配置成利用分子量差异为10,000Da以下,如7,000Da以下,包括5,000Da以下,或2,000Da以下,或1,000Da以下,例如500Da以下,或100Da以下来拆分分析物。在一些情况下，分离介质可以包括总丙烯酰胺含量范围为1%至20%,如3%至15%,包括5%至10%的聚丙烯酰胺凝胶。
在一些情况下，微流体装置包括位于分离介质上游的浓缩介质。“上游”是指最接近流体流来源定位。浓缩介质可以被配置成在样品接触分离介质之前浓缩该样品。浓缩介质可以包括聚合物凝胶,如具有小孔径的聚合物凝胶.例如，浓缩介质可以包括这样的聚丙烯酰胺凝胶,其总丙烯酰胺含量的范围为5%至10%,如5%至9%,包括5%至8%,或5%至7%。在一些情况下，浓缩介质的总聚丙烯酰胺含量为6%。在某些实施方式中，浓缩介质包括膜，如尺寸排阻膜。浓缩介质的小孔径可以减慢样品电泳移动通过该浓缩介质，有机在其接触分离介质之前浓缩所述样品。在一些情况下，浓缩膜被配置成将样品的浓度增大2倍以上，4倍以上，10倍以上，25倍以上，50倍以上，100倍以上，500倍以上，1000倍以上，2500倍以上等。
在某些实施方式中，主题微流体装置包括位于分离介质下游的结合介质。“下游”是指在流体流来源的远侧定位。例如，流体流可以首先接触并流过分离介质，接着是结合介质。结合介质可以具有有取向轴的标记流路。在一些情况下，标记流路是当样品或分析物穿过结合介质时样品行进的方向。样品或分析物可以在结合介质的标记流路的方向上穿过结合介质(例如，样品可以沿着结合介质的取向轴穿过分离介质)。结合介质可以具有与分离介质的取向轴相同或不同的取向轴。例如，分离介质可以具有第一取向轴并且结合介质可以具有第二取向轴。第一取向轴可以在与第二取向轴相同的方向成直线（对准，align）。在一些情况下，第一取向轴在与第二取向轴不同的方向上成直线。在其中第一取向轴在与第二取向轴不同的方向上成直线的情况下，微流体装置是多维度的(例如，多方向的)微流体装置，如上所述。例如，相对于第一取向轴，第二取向轴的角度可以为180度以下，如150度以下，135度以下,相对于第一取向轴的120度以下,90度以下,60度以下,45度以下,或30度以下。在某些实施方式中，第二取向轴与第一取向轴是正交的。
在某些情况下，结合介质包括聚合物，如聚合物凝胶或聚合物巨石(polymeric monolith)。巨石是指单个的、连续结构。巨石可以包括具有相同物理和化学组成的单个区域，或者可以包括两个以上在其物理和化学组成方面不同的区域。聚合物凝胶可以是适用于凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可以包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶等。在一些情况下，结合介质可以包括这样的聚丙烯酰胺凝胶，其总丙烯酰胺含量的范围为1%至20%,如3%至15%,包括5%至10%。聚合物巨石可以是适用于色谱法的巨石。聚合物巨石可以包括但不限于丙烯酸酯聚合物、烷基丙烯酸酯聚合物、烷基丙烯酸酯烷基酯聚合物、其共聚物等。在一些情况下，结合介质包括膜。所述膜可以包括硝基纤维素膜、聚合物膜等。在一些情况下，结合介质包括珠子（bead）。所述珠子可以包括硝基纤维素珠子、聚合物珠子、其组合等。
在某些实施方式中，结合介质可以被配置成结合至并保留关注的分析物。在一些情况下，结合至结合介质的分析物有利于分析物的检测。例如，结合介质可以包括与支撑物稳定联合的结合成员。“稳定联合”是指一个部分在标准条件下结合至另一部分或结构或其他方式联合。在某些情况下，支撑物是聚合物凝胶或膜，如上所述。键可以包括共价键和非共价相互作用，如但不限于离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力(例如，London分散力),偶极相互作用等。在某些实施方式中，结合成员可以共价结合至支撑物，如交联或共聚合至支撑物。结合成员和支撑物之间的共价键包括牵涉反应性基团的共价键，如但不限于以下：戊二醛，其利用二官能连接物戊二醛与结合成员和支撑物的氨基/酰胺基形成共价键；甲基丙烯酸缩水甘油酯，其利用缩水甘油基官能团(即，环氧官能团)共价键接至结合成员并且利用甲基丙烯酸酯基团结合至支撑物；甲基丙烯酸4-硝基苯酯，其可以用来酰化结合成员的胺基以共价结合至支撑物；丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-acrylate)，其利用N-羟基琥珀酰亚胺基与结合成员上的氨基相互作用以并入到支撑物中。
结合成员可以是任何分子，其特异地结合至关注的靶分析物，例如，被靶向的蛋白质或核酸序列或生物大分子(例如，关注的分析物)。在一些实施方式中，当它们在结合复合物中彼此特异地结合时，结合成员和其特异地结合的靶分析物之间的亲和性的特征在于KD(离解常数)为10-5M以下,10-6M以下,如10-7M以下,包括10-8M以下,例如，10-9M以下,10-10M以下,10-11M以下,10-12M以下,10-13M以下,10-14M以下,10-15M以下,包括10-16M以下。"亲和性"是指结合强度，增大的结合亲和性与较低的Kd相联合。
取决于分析物的性质，结合成员可以是但不限于(a)与用于核酸检测的靶DNA或RNA序列的独特区域互补的DNA的单链；(b)针对用于检测蛋白质和肽的肽分析物的表位的抗体；(c)任何识别分子，如特异性结合对的成员。例如，合适的特异性结合对包括但不限于：受体/配体对的成员；受体的配体-结合部分；抗体/抗原对的成员；抗体的抗原结合片段；半抗原；凝集素/糖对的成员；酶/底物对的成员；生物素/抗生物素蛋白；生物素/抗生蛋白链菌素；地高辛/抗地高辛药；DNA或RNA适体结合对的成员；肽适体结合对的成员等。
在某些实施方式中，结合成员包括抗体。结合成员抗体可以特异地结合至关注的分析物。在一些情况下，结合成员稳定地与支撑物联合，如上所述。支撑物-结合的结合成员可以被配置成特异地结合至关注的分析物。同样，关注的分析物与支撑物-结合的结合成员的特异结合可以间接地将关注的分析物结合至所述支撑物。关注的分析物与支撑物的结合可以将分析物与支撑物稳定地联合并由此游离在于关注的分析物的检测。
在某些实施方式中，两个以上的不同结合成员稳定地与结合介质联合。所述两个以上的不同结合成员可以特异地结合至相同或不同的分析物。在一些情况下，所述两个以上的不同结合成员可以特异地结合至同一分析物。例如，所述两个以上的不同结合成员可以包括对同一分析物上的不同表位特异的不同抗体。在其他情况下，所述两个以上的不同结合成员可以特异地结合至不同分析物。例如，所述两个以上的结合成员可以包括对于不同分析物上的表位特异的不同抗体。
在某些实施方式中，微流体装置包括一种或多种结合介质，如两种以上结合介质。例如，微流体装置可以包括第一结合介质和第二结合介质。每种结合介质可以相同组成，或在其他实施方式中可以具有不同组成。例如，第一结合介质可以具有与第一结合介质稳定地联合的第一结合成员，并且第二结合介质可以具有与第二结合介质稳定地联合的第二结合成员。在一些情况下，第一和第二结合成员可以特异地结合至不同分析物。在其他情况下，第一和第二结合成员可以特异地结合至同一分析物的不同表位。在实施方式中，在第一和第二结合成员特异地结合至不同分析物的情况下，微流体装置可以被配置成检测样品中的两种以上分析物的存在，其中第一分析物特异地被第一结合介质的第一结合成员结合并且第二分析物特异地被第二结合介质的第二结合成员结合。微流体装置可以包括两种以上的结合介质，每一种配置成特异地结合样品中的不同分析物，使得微流体装置被配置成检测样品中的多个不同分析物。例如，微流体装置可以包括2种以上，或3种以上，或4种以上，或5种以上，或6种以上，或7种以上，或8种以上，或9种以上，或10种以上的结合介质。
在某些实施方式中，微流体装置被配置成在接触第二结合介质之前接触第一结合介质。例如，第一结合介质可以位于分离介质和第二结合介质之间。另外的结合介质可以串联地提供在第二结合介质之后。在某些情况下，结合介质具有相同的取向轴，使得样品沿着该相同取向轴从第一结合介质流至第二结合介质。如上所述，结合介质的取向轴可以与分离介质的取向轴成一个角度，如与分离介质的取向轴正交。
微流体装置的方面包括其中分离介质与结合介质流体联通的实施方式。在某些实施方式中，结合介质布置在分离介质的下游。微流体装置可以被配置成首先引导样品通过分离介质以产生分离的样品。在某些实施方式中，微流体装置被配置成使得分离介质和结合介质彼此直接流体联通。例如，分离介质可以与结合介质直接接触。在一些情况下，分离介质和结合介质彼此结合，如共聚合。其中分离介质与结合介质直接流体联通的实施方式可以在多个部分最小损失下有利于各部分从分离介质转移至结合介质或各部分从结合介质转移至分离介质。在一些情况下，微流体装置被配置成使得各部分定量地从一种介质转移至另一种介质(例如，从分离介质至结合介质，或从结合介质至分离介质)。
在某些实施方式中，微流体装置被配置成引导分离的样品通过结合介质。在一些情况下，微流体装置被配置成使得样品或分析物从分离介质移动至介入(intervening)通道或接枝，然后移动至结合介质。在其他情况下，微流体装置被配置成使得分离介质和结合介质彼此直接流体联通，以使样品或分析物可以直接从分离介质移动至结合介质。如上所述，结合介质可以包括配置成结合至分析物的结合成员以检测分离样品中的关注的分析物。
在一些情况下，微流体装置被配置成使样品经过两种以上方向不同的流场。“流场”是指其中各部分以基本上同一方向通过区域的区域。例如，流场可以包括其中流动部分以基本上同一方向移动通过介质的区域。流场可以包括介质，如分离介质、结合介质、加载介质等，其中各部分如缓冲剂液、分析物、试剂等已基本上同一方向移动通过所述介质。流场可以通过施加电场、压力差、电渗透等诱导。在一些实施方式中，两种以上流场可以在方向上不同。例如，第一流场可以与分离介质的分离流路的取向轴成直线。第一流场可以被配置成沿着分离流路引导样品或分析物通过分离介质。第二流场可以与结合介质的标记流路的取向轴成直线。在一些情况下，第二流场被配置成沿着标记流路引导样品或分析物通过结合介质。第二流场可以被配置成引导样品或分析物通过结合介质以使关注的分析物接触器特异性结合成员。在一些情况下，第二流场被配置成沿着标记流路引导结合成员通过结合介质。第二流场可以被配置成引导结合成员通过结合介质以使结合成员接触器特异性的关注的分析物。如上所述，在某些情况下，标记流路的取向轴与分离流路的取向轴正交。在这些情况下，第二流场可以与第一流场正交。
在某些实施方式中，微流体装置被配置成使样品经过两种以上方向不同的电场。电场可以有利于样品移动通过微流体装置(例如，样品从微流体装置的一个区域电动移动至微流体装置的另一个区域)。电场也可以有利于样品中的分析物通过电泳的分离(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE))，如上所述。例如，电场可以被配置成引导样品中的分析物通过微流体装置的分离介质。电场可以被配置成基于分析物的物理性质有利于样品中的分析物的分离。例如，电场可以被配置成基于分析物的分子量、尺寸、电荷(例如，荷质比)、等电点等有利于样品中的分析物的分离。在某些情况下，电场被配置成基于分析物的分子量有利于样品中的分析物的分离。在一些情况下，电场被配置成基于分析物的等电点有利于羊皮纸的分析物的分离。
在一些实施方式中，两种以上的电场可以在方向上不同。例如，第一电场可以与分离介质的分离流路的取向轴成直线。第一电场可以被配置成沿着分离流路引导样品或分析物通过分离介质。第二电场可以与结合介质的标记流路的取向轴成直线。在一些情况下，第二电场被配置成沿着标记流路引导样品或分析物通过结合介质(例如，两种以上结合介质，如第一结合介质和第二结合介质)。第二电场可以被配置成引导样品或分析物通过第一结合介质和第二结合介质以使关注的分析物接触其在第一和/或第二结合介质中的特异性结合成员。
在一些情况下，第二电场被配置成沿着标记流路引导结合成员通过结合介质。第二电场可以被配置成引导结合成员通过结合介质以使结合成员接触器关注的特异性分析物。如上所述，在某些情况下，标记流路的取向轴与分离流路的取向轴正交。在这些情况下，第二电场可以与第一电场正交。在一些情况下，两种以上结合成员可以沿着标记流路被引导通过结合介质(例如，第一结合介质和第二结合介质)，以使结合成员(例如，第一结合成员和第二结合成员)接触器各种关注的分析物。
在某些实施方式中，微流体装置包括一个或多个被配置以产生电场的电场发生器。电场发生器可以被配置成将电场施加至微流体装置的不同区域，如分离介质、结合介质、加载介质等中的一种或多种。电场发生器可以被配置成电动地将样品中的分析物和各部分传输通过微流体装置中的各种介质。在某些情况下，电场发生器可以在微流体装置的近端，如布置在微流体装置装置上。在一些情况下，电场发生器位于距离微流体装置一定距离。例如，电场发生器可以并入到用于检测分析物的系统中，如以下更详细描述的。
微流体装置可以包括一个或多个通道，其包含分离介质以及第一和第二结合介质，如上所述。微流体装置可以包括结合通道，其包含结合介质，如上所述。在一些情况下，分离通道与结合通道流体联通，使得分离通道中的分离介质与结合通道中的结合介质流体联通。微流体装置的一些实施方式包括分离通道和结合通道，其中分离通道具有第一取向轴并且结合通道具有第二取向轴。第一取向轴和第二取向轴可以彼此在相同方向成直线或者彼此在不同方向成直线。例如，分离通道的取向轴相对于结合通道的角度为180度以下，如150度以下，135度以下，包括相对于结合通道的120度以下,90度以下,60度以下,45度以下,或30度以下。在某些实施方式中，结合通道的取向轴与分离通道的取向轴正交。
微流体通道的实施方式可以由于微流体装置相容且与微流体装置中使用的样品、缓冲液、试剂等相容的任何合适材料制成。在一些情况下，微流体通道由相对于主题微流体装置和方法中使用的样品、缓冲液、试剂等是惰性(例如，不会降解或反应)的材料制成。例如，微流体通道可以由这样的材料制成，如但不限于玻璃、石英、聚合物、弹性体、纸、其组合等。
在某些实施方式中，微流体通道的宽度范围为1μm至500μm,如5μm至300μm,包括10μm至200μm,例如50μm至150μm。在一些情况下，微流体通道的宽度为100μm。在某些实施方式中，微流体通道的深度范围为1μm至200μm,如从5μm至100μm,包括10μm至50μm。在一些情况下，微流体通道的深度为25μm。
在一些情况下，微流体装置包括一个或多个样品入口。样品入口可以被配置成允许样品引入到微流体装置中。样品入口可以与分离介质流体联通。在一些情况下，样品入口与分离介质的上游端流体联通。样品入口可以进一步包括配置成防止流体从样品入口出来的结构。例如，样品入口可以包括帽、阀门、密封件等，其可以例如被刺破或打开以允许样品引入到微流体装置中，然后再密封或封闭以基本上防止流体包括样品和/或缓冲液从样品入口出来。
在一些方面，分离和结合介质提供在单个共用室中。在这些实施方式中，微流体装置包括室。所述室可以包括分离介质和结合介质。如上所述，分离介质可以与结合介质流体联通，如直接物理接触。在一些情况下，分离介质结合至结合介质，如共聚合或交联至结合介质。同样，所述室可以被配置成含有彼此流体联通的分离介质和结合介质二者。所述室可以被配置成含有分离介质和结合介质以使分离介质的分离流路是从结合介质的标记流路的上游。
除了分离介质和结合介质，所述室还可以包括加载介质。加载介质可以与分离介质流体联通。在一些情况下，加载介质与分离介质直接接触。例如，加载介质可以结合至分离介质，如与分离介质交联或共聚合。加载介质可以位于分离介质的上游，以使样品在接触分离介质之前接触加载介质。在某些实施方式中，加载介质有利于样品与分离介质接触。例如，加载介质可以被配置成在样品接触分离介质之前浓缩样品。在某些实施方式中，加载介质可以包括具有不同物理和/或化学性质的两个以上区域。例如，加载介质可以包括加载区域和堆积区域。加载介质可以被配置成包括在堆积区域上游的加载区域。
在某些实施方式中，加载介质包括聚合物，如聚合物凝胶。聚合物凝胶可以是适用于凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可以包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶等。在一些情况下，加载区域包括具有大孔径的聚合物凝胶。例如，加载区域可以包括聚丙烯酰胺凝胶，其具有的总丙烯酰胺含量为5%以下,如4%以下,包括3%以下,或2%以下。在一些情况下，加载区域具有的总聚丙烯酰胺含量为3%。在一些情况下，加载介质的堆积区域可以被配置成在样品接触分离介质之前浓缩样品。堆积区域可以包括具有小孔径的聚合物凝胶(例如，堆积区域可以具有小于加载区域的孔径的孔径)。例如，堆积区域可以包括聚丙烯酰胺凝胶，其具有的总丙烯酰胺含量范围为5%至10%,如5%至9%,包括5%至8%,或5%至7%。例如，堆积区域可以具有比加载区域更大的总聚丙烯酰胺含量。在一些情况下，堆积区域具有的总聚丙烯酰胺含量为6%。堆积区域的小孔径可以减慢样品电泳移动通过堆积区域，由此在样品接触分离介质之前浓缩样品。
在某些情况下，所述室含有加载介质、分离介质和结合介质。所述室可以被配置成含有加载介质、分离介质和结合介质以使加载介质、分离介质和结合介质彼此流体联通，如上所述。例如，所述室可以包括具有各种区域的连续聚合物凝胶。连续聚合物凝胶的各个区域可以可以具有不同物理和/或化学性质。连续聚合物凝胶可以包括具有加载介质的第一区域、具有分离介质的第二区域和具有结合介质第三区域。聚合物凝胶的各个区域的流路可以被配置成使得样品首先接触加载介质，然后接触分离介质，并且最后接触结合介质。
在某些实施方式中，聚合物凝胶具有的宽度范围为0.1mm至5mm,如0.2mm至2.5mm,包括0.5mm至1.5mm。在一些情况下，聚合物凝胶具有的宽度为1.0mm。在一些情况下，聚合物凝胶具有的长度范围为0.5mm至5mm,如0.5mm至3mm,包括1mm至2mm。在某些情况下，聚合物凝胶具有的长度为1.5mm。在某些实施方式中，包括加载介质的聚合物凝胶的第一区域具有的宽度范围为0.1mm至5mm,如0.2mm至2.5mm,包括0.5mm至1.5mm。在一些情况下，包括加载介质的聚合物凝胶的第一区域具有的宽度为0.9mm。在一些情况下，包括加载介质的聚合物凝胶的第一区域具有的长度范围为0.1mm至2mm,如0.1mm至1mm,包括0.1mm至0.5mm.在某些实施方式中，包括加载介质的聚合物凝胶的第一区域具有的长度为0.2mm。在某些情况下，包括分离介质的聚合物凝胶的第二区域具有的宽度范围为0.1mm至5mm,如0.2mm至2.5mm,包括0.5mm至1.5mm。在一些情况下，包括分离介质的聚合物凝胶的第二区域具有的宽度为0.9mm。在一些情况下，包括分离介质的聚合物凝胶的第二区域具有的长度范围为0.5mm至5mm,如0.5mm至3mm,包括1mm至2mm。在某些实施方式中，包括分离介质的聚合物凝胶的第二区域具有的长度为1.3mm。在某些情况下，包括结合介质的聚合物凝胶的第三区域具有的宽度范围为0.01mm至2mm,如0.01mm至1mm,包括0.05mm至0.5mm。在一些情况下，包括结合介质的聚合物凝胶的第三区域具有的宽度为0.1mm。在一些情况下，包括结合介质的聚合物凝胶的第三区域具有的长度范围为0.5mm至5mm,如0.5mm至3mm,包括1mm至2mm。在某些实施方式中，包括结合介质的聚合物凝胶的第三区域具有的长度为1.5mm。
在某些实施方式中，微流体装置具有的宽度范围为10cm至1mm,如5cm至5mm,包括1cm至5mm。在一些情况下，微流体装置具有的长度范围为100cm至1mm,如from50cm至1mm,包括10cm至5mm,或1cm至5mm。在某些方面，微流体装置具有的面积为1000cm2以下,如100cm2以下,包括50cm2以下,例如，10cm2以下,或5cm2以下,或3cm2以下,或1cm2以下,或0.5cm2以下,或0.25cm2以下,或0.1cm2以下。
在某些实施方式中，微流体装置基本上透明。“透明”是指物质允许可见光通过该物质。在一些实施方式中，透明微流体装置有利于检测结合至结合介质的分析物，例如包括可检测标记如荧光标记的分析物。在一些情况下，微流体装置基本上不透明。“不透明”是指物质不允许可见光通过该物质。在某些情况下，不透明微流体装置可以有利于对光敏感的分析物，如在光存在下反应或降解的分析物的分析。
方法
方法的实施方式涉及确定分析物释放在样品中存在，例如，确定样品中是否存在一种或多种分析物。在方法的某些实施方式中，样品中的一种或多种分析物的存在可以定性或定量地确定。定性确定包括其关于样品中分析物存在的是/否结果提供给使用者的确定。定量确定包括其中关于样品中的分析物的量的粗略范围结果例如低、中、高提供给使用者并且其中分析物的浓度的数量测量的精细范围结果提供给使用者的半定量确定。
在某些实施方式中，微流体装置被配置成检测样品中一种或多种分析物的存在。可以用主题微流体装置进行测定的样品可以变化，并且包括简单和复杂样品。简单样品是包括关注的分析物的样品，并且可以包括或可以不包括不是关注的一种或多种分子实体，其中这些非关注分子实体的数量可以低，例如，10以下,5以下等。简单样品可以包括已以某种方式处理，例如，以从样品除去潜在干扰分子实体的初始生物样品或其他样品。“复杂样品”是指可以具有或可以不具有关注的分析物而且包括不是关注的许多不同蛋白质和其他分子的样品。在一些情况下，在主题方法中测定的复制样品是这样的样品，其包括10个以上，如20个以上，包括100个以上，例如，103个以上，104个以上(如15,000;20,000或25,000以上)不同(即，不同的)分子实体，其彼此在分子结构或物理性质(例如，分子量、大小、电荷、等电点等)不同。
在某些实施方式中，关注的样品是生物样品（又称样本），如，但不限于尿液、血液、血清、血浆、唾液、精液、前列腺液、乳头抽出液、泪液、粪便、面颊擦洗液、脑脊髓液、细胞溶解产物样品、羊膜液、胃肠液、生物活检组织(例如，获自激光捕获显微解剖(LCM))等的样品。样品可以是生物样品或使用用于成功提取DNA、RNA、蛋白质和肽的常规方法可以提取自来源于人、动物、植物、真菌、酵母菌、细菌、组织培养物、病毒培养物及其组合的生物样品。在某些实施方式中，样品是流体样品，如在流体中的分析物的溶液。流体可以是含水流体，如，但不限于水、缓冲液等。
如上所述，可以在主题方法中测定的样品可以包括一种或多种关注的分析物。可检测分析物的实例包括但不限于：核酸，例如，双链或单链DNA、双链或单链RNA、DNA-RNA杂交体、DNA适体、RNA适体等；蛋白质和肽，有或没有修饰，例如抗体、双体、Fab片段、DNA或RNA结合蛋白、磷酸化蛋白质(磷酸化蛋白质组学)、肽适体、表位等；小分子如抑制剂、激活剂、配体等；寡糖或多糖；其混合物等。
在一些实施方式中，关注的分析物可以被鉴定使得然后关注的分析物的存在可以被检测。例如，所述方法可以包括评价结合介质(例如，第一和第二结合介质)的两种以上分析物的存在。分析物可以通过本文中描述的任何方法鉴定。例如，可以采用标记试剂，如包括可检测标记的分析物特异的结合成员。可检测标记包括但不限于荧光标记、比色标记、化学发光标记、酶联试剂、多色试剂、抗生物素蛋白-抗生蛋白链菌素联合检测试剂、非可见的可检测标记(例如，放射标记、金粒子、磁性标记、电读出、密度信号等)等。在某些实施方式中，可检测标记是荧光标记。荧光标记是通过荧光检测器可检测的标记部分。例如，荧光标记与关注的分析物的结合可以允许关注的分析物通过荧光检测器检测。荧光标记的实例包括但不限于在接触试剂时发荧光的荧光分子、当用电磁辐射(例如，UV,可见光，x-射线等)照射时发荧光的荧光分子等。
合适的荧光分子(荧光团)包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素的琥珀酰酯、荧光素的琥珀酰酯、荧光素二氯三唑的5-异构体、笼状羧基荧光素-丙氨酸-羧酰胺、Oregon Green488、Oregon Green514；荧光黄（Lucifer Yellow）、吖啶橙、罗丹明、四甲基罗丹明、德克萨斯红(TexasRed)、碘化丙啶、JC-1(5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑基碘化羰化青)、四溴若罗丹明123、罗丹明6G、TMRM(四甲基罗丹明甲酯)、TMRE(四甲基罗丹明乙酯)、四甲基玫瑰胺(tetramethylrosamine)、罗丹明B和4-二甲基氨基四甲基玫瑰胺、绿色荧光蛋白、蓝移的绿色荧光蛋白、蓝绿移的绿色荧光蛋白、红移的绿色荧光蛋白、黄移的绿色荧光蛋白、4-乙酰胺基-4’-异氰酸芪-2,2’二硫酸；吖啶和衍生物，如吖啶、异硫氰酸吖啶；5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS);4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘-酰亚胺-3,5二硫酸酯；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；蒽酰亚胺；4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a,4a二氮杂-5-引达省-3-丙酸BODIPY；级联蓝(cascade blue)；灿烂黄(Brilliant Yellow)；香豆素和衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,Coumarin120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；酞菁染料；焰红染料(cyanosine)；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI);5’,5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红);7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；五乙酸二亚甲基三胺乙酯；4,4’-二异硫氰酸二氢-芪-2-,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸；5-(二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS,丹酰氯);4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物：曙红，异氰酸曙红，赤藓红和衍生物：赤藓红B，赤藓红异硫氰酸酯；胡米胺；荧光素和衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基--荧光素(DTAF),2’,7’二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素、QFITC、(XRITC)；荧光胺；IR144;IR1446;孔雀绿异硫氰酸酯(Malachite Greenisothiocyanate)；4-甲基伞形酮-ferone邻甲酚酜酞;硝基酪氨酸;副玫瑰苯胺(pararosaniline);苯酚红;B-藻红蛋白;邻酚二醛;芘和衍生物：芘，丁酸芘，琥珀酰1-芘；丁酸量子点;反应红4(CibacronTM Brilliant Red3B-A)罗丹明和衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX),6-羧基罗丹明(R6G),丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod),罗丹明B,罗丹明123,罗丹明X异硫氰酸酯,磺基罗丹明B,磺基罗丹明101,罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红);N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA);四甲基罗丹明;四甲基罗丹明异氰酸酯(TRITC);核黄素;5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS),4-(4’-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL),玫红酸;CAL Fluor Orange560;铽螯合物衍生物；Cy3;Cy5;Cy5.5;Cy7;IRD700;IRD800;La Jolla Blue;酞菁;和萘酞菁，香豆素和相关染料，咕吨染料如对甲氨基酚,试卤灵,单溴(bimanes),吖啶类,异吲哚类,丹磺酰染料,氨基邻苯二甲酰肼如鲁米诺,和异鲁米诺衍生物,氨基酞酰亚胺,氨基萘酰亚胺,氨基苯并呋喃,氨基喹啉,二氰基氢醌,荧光铕和铽配合物；其组合等。合适的荧光蛋白和发色蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，包括但不限于来源于多管水母(Aequoria victoria)的GFP活期衍生物，例如，“人源化”衍生物如增强的GFP；来自另一物种的GFP，如海洋腔肠(Renilla reniformis)、瑞尼拉穆勒里(Renilla mulleri),或波利罗萨克斯戈恩依（Ptilosarcus guernyi）;“人源化”重组GFP(hrGFP);来自珊瑚虫物种的各种各样的荧光和有色蛋白的任一种；其组合等。
在某些实施方式中，所述方法包括包括将流体样品引入到微流体装置中。将流体样品引入到微流体装置中可以包括引导样品通过分离介质以产生分离的样品。在一些情况下，分离的样品在样品如上所述经过分离介质时通过凝胶电泳产生。分离的样品可以包括分析物的不同可检测带，其中每个带包括一种或多种基本上具有类似性质的分析物，如分子量,大小,电荷(例如，荷质比),等电点等，这取决于进行凝胶电泳的类型。
所述方法的方面也可以包括将分离的样品转移到结合介质(例如，第一结合介质和第二结合介质)。在某些实施方式中，所述方法包括引导分离的样品通过结合介质(例如，第一和第二结合介质)。在其他实施方式中，分离的样品中的分析物的具体带可以被选择性地转移至结合介质。在一些情况下，所述方法包括使关注的分析物或多种分析物与结合介质中的结合成员接触。结合成员可以特异地结合至分析物，由此将分析物保持在结合介质中。不是关注的部分不会被结合介质中的结合成员特异地结合。例如，微流体装置可以包括如上所述的第一结合介质和第二结合介质。在这些实施方式中，所述方法可以包括使关注的第一分析物与第一结合介质中的第一结合成员接触和使关注的第二分析物与第二结合介质中的第二结合成员接触。
在某些实施方式中，所述方法包括评价结合介质(例如，第一和第二结合介质)的关注的分析物或多种分析物的存在(例如，关注的两种以上分析物)。例如，在一些情况下，所述方法包括引导结合至结合介质的分析物。关注的分析物与结合介质中的结合成员的可检测结合表明样品中存在关注的分析物或多种分析物。经过结合介质并且没有结合至结合介质中的结合成员的不是关注的部分可以被洗掉或转移至第二分析装置如但不限于UV光度计、和IR分光计、质谱仪、HPLC、亲和性测定装置等。
在某些实施方式中，所述方法包括将结合成员(例如，标记剂，如上所述)转移至分离的样品。结合成员可以从结合介质转移至分离的样品中的分析物的特异带。在一些情况下，所述方法包括使结合成员与分离的样品中的关注的分析物接触。在一些情况下，所述方法包括将分离的样品与分离介质稳定地联合。例如，所述方法可以包括将分离的样品结合至分离介质。分离的样品可以化学或物理地结合至分离介质，如通过使分离的样品与化学试剂接触，将分离的样品交联至分离介质等。结合成员可以特异地结合至关注的分析物，由此将结合成员保持在分离介质中，其中结合的结合成员可以随后被检测。不特异地结合至分离的样品中的分析物的结合成员可以转移通过分离介质。
在某些实施方式中，分离的样品接触如上所述的结合介质，例如通过使分离的样品从分离介质流动至结合介质。如上所述，结合介质可以包括与结合介质稳定地联合的一个或多个结合成员，使得关注的分析物或多种分析物被结合成员特异地结合至结合介质。在某些情况下，检测关注的分析物或多种分析物包括使标记剂流过结合介质。标记剂可以是包括可检测标记的分析物特异的结合成员，如上所述。标记剂可以特异地结合至并由此标记关注的特异分析物。在一些情况下，可以使用两种以上的标记剂，例如第一标记剂和第二标记剂可以流过第一和第二结合介质并且可以特异地结合至关注的第一分析物和关注的第二分析物。第一和第二结合介质可以评价两种以上分析物的存在。
在一些情况下，由于结合成员非特异结合至不是关注的部分所致的假阳性信号被最小化。例如，结合成员与不是关注的其他部分的非特异结合可以被最小化并且不是关注的部分将不被检测。不是关注的部分可以在没有结合至结合成员下穿过结合介质。因此，结合成员可以仅特异地结合至关注的分析物。结合成员仅特异结合至关注的分析物可以有利于复合样品中的关注的分析物的特异检测。
在某些实施方式中，所述方法包括在将样品引导通过分离介质之前浓缩、稀释或缓冲液交换样品。浓缩样品可以包括在使样品与分离介质接触之前使样品与浓缩介质接触。如上所述，浓缩介质可以包括小孔径聚合物凝胶、膜(例如，尺寸排阻膜)、其组合等。在使样品与分离介质接触之前浓缩样品可以有利于分离的样品中的分析物的带之间的分辨率增加，因为分析物的每个分离的带可以在样品穿过分离介质时更少分散。稀释样品可以包括在在使样品与分离介质接触之前使样品与另外的缓冲液接触。缓冲液交换样品可以包括在使样品与分离介质接触之前使样品与缓冲液交换介质接触。缓冲液交换介质可以包括不同于样品缓冲液的缓冲液。缓冲液交换介质可以包括但不限于分子筛、多孔树脂等。
在某些实施方式中，所述方法包括将没有被结合介质中的结合成员结合的部分转移离开结合介质。未结合的部分可以被引导至与结合介质的标记流路流体联通的转移流路。在一些情况下，所述方法包括将未结合部分转移至废物储罐。在其他情况下，所述方法包括从结合介质的下游引导未结合部分用于利用二次分析装置进行二次分析，如但不限于UV分光计、和IR分光计、质谱仪、HPLC、亲和性测定装置等。
所述方法的实施方案也可以包括释放结合至结合介质的分析物。释放可以包括使结合的分析物与释放剂接触。释放剂可以被配置成破坏分析物和结合成员之间的结合相互作用。在一些情况下，释放剂是破坏分析物和结合成员之间的结合相互作用的试剂、缓冲等，引起结合成员释放分析物。在从结合成员释放分析物之后，所述方法可以包括将分析物转移离开结合介质。例如，所述方法可以包括从结合介质的下游引导释放的分析物用于利用二次分析装置进行二次分析，如但不限于UV分光计、和IR分光计、质谱仪、HPLC、亲和性测定装置等。
在一些实施方式中，所述方法包括样品中的分析物的单工分析。“单工分析”是指样品被分析已检测样品中的一种分析物的存在。例如，样品可以包括关注的分析物和不适关注的其他分子实体的混合物。在一些情况下，所述方法包括样品的单工分析已确定样品混合物中关注的分析物的存在。
某些实施方式包括样品中的两种以上分析物的多任务分析。“多任务分析(multiplex analysis)”是指确定存在两种以上不同的分析物，其中该两种以上分析物彼此不同。例如，分析物可以包括它们的分子量、大小、电荷(例如，质荷比)等电点等的可检测差异。在一些情况下，分析物的数量大于2,如4以上，6以上，8以上等，多至20以上，例如，50以上，包括100以上不同的分析物。在某些实施方式中，所述方法包括2至100种不同分析物，如4至50不同分析物，包括4至20种不同分析物的多任务分析。
在某些实施方式中，所述方法是自动化方法。同样，所述方法可以包括在将样品引入到微流体装置中后最少的与微流体装置和系统的使用者相互作用。例如，引导样品通过分离介质以产生分离的样品和将分离的样品转移至结合介质的步骤可以通过微流体装置和系统进行，使得使用者不需要手动进行这些步骤。在一些情况下，所述自动化方法可以有利于减少总测定时间。例如，所述方法的实施方式包括样品中的分析物的分离和检测，可以在30min以下,如20min以下,包括15min以下,或10min以下,或5min以下,或2min以下,或1min以下内进行。
系统
某些实施方式的方面包括用于检测样品中的分析物的系统。在一些情况下，所述系统包括如本文中所述的微流体装置。所述系统还可以包括检测器。在一些情况下，检测器是配置成检测可检测标记的检测器。如上所述，可检测标记可以是荧光标记。例如，荧光标记可以接触电磁辐射(例如，可见光,UV,x-射线等)，其激发荧光标记并且引起荧光标记发射可检测电磁辐射(例如，可见光等)。发射的电磁辐射可以利用适当检测器检测以确定结合至结合成员的分析物的存在。
在一些情况下，检测器可以被配置成检测来自如上所述的荧光标记的发射。在某些情况下，检测器包括光电倍增管(PMT)、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器、视觉色度读出器、光电二极管等。
本发明的系统可以包括所需的各种其他部件。例如，所述系统可以包括流体处理部件，如微流体流体处理部件。流体处理部件可以被配置成引导一种或多种流体通过微流体装置。在一些情况下，流体处理部件被配置成引导流体，如，但不限于样品溶液、缓冲液(例如，释放缓冲液，洗涤缓冲液、电泳缓冲液等)等。在某些实施方式中，微流体流体处理部件被配置成将流体递送至微流体装置的分离介质，使得流体接触分离介质。流体处理部件可以包括微流体泵。在一些情况下，微流体泵被配置用于压力驱动微流体处理并且给定流体通过本文中公开的微流体装置和系统的路线。在某些情况下，微流体流体处理部件被配置成递送小体积的流体，如1mL以下,如500μL以下,包括100μL以下,例如50μL以下,或25μL以下,或10μL以下,或5μL以下,或1μL以下。
在某些实施方式中，所述系统包括一种或多种电场发生器。电场发生器可以被配置成将电场施加至微流体装置的不同区域。所述系统可以被配置成施加电场以使样品电动地传输通过微流体装置。例如，电场发生器可以被配置成将电场施加至分离介质。在一些情况下，施加的电场可以与分离介质的分离流路的取向轴成直线。同样，施加的电场可以被配置成将样品中的分析物和部分电动地传输通过分离介质。在某些实施方式中，所述系统包括配制成施加电场以使样品中的分析物和/或部分从分离介质电动地传输至结合介质的电场发生器。例如，施加的电场可以与结合介质的标记流路的取向轴成直线。在一些情况下，施加的电场被配置成电动地传输已通过分离介质分离的所选分析物。已通过分离介质分离的所选分析物可以通过沿着结合介质的标记流路的取向轴施加适当电场传输至结合介质。在一些情况下，电场发生器被配置成施加强度范围为10V/cm至1000V/cm,如100V/cm至800V/cm,包括200V/cm至600V/cm的电场。
在某些实施方式中，电场发生器包括电压成形部件。在一些情况下，电压成形部件被配置成控制施加的电场的强度，以使施加的电场强度横过分离介质和/或结合介质基本上是均匀的。电压成形部件可以有利于增加样品中的分析物的分辨率。例如，电压成形部件可以有利于样品通过分离介质的非均匀移动的减少。另外，电压成形部件可以有利于当分析物经过分离介质时最小化分析物的带的分散。
在某些实施方式中，主题系统是生物芯片(例如，生物传感芯片)。“生物芯片”或“生物传感芯片”是指包括基底表面的微流体系统，该微流体系统在基底表面上显示两种以上不同微流体装置。在某些实施方式中，微流体系统包括具有微流体装置阵列的基底表面。
“阵列”包括可寻址区域，例如空间可寻址区域的任何二维或基本上二维(以及三维)布置。当阵列具有位于在阵列上的特定预定位置(例如“地址”)的多个装置时是“可寻址的”。阵列特征(例如，装置)可以通过介入空间分开。任何给定的基底可以带有设置在基底正面上的一个、两个、四个以上阵列。取决于用途，任何或所有阵列可以彼此相同或不同，并且各自可以含有多个不同的微流体装置。阵列可以含有一个或多个，包括两个以上，四个以上，8个以上，10个以上，50个以上，或100个以上的微流体装置。在某些实施方式中，微流体装置可以布置成这样的阵列，其具有的面积小于10cm2以下，小于5cm2,例如，小于1cm2,包括小于50mm2,小于20mm2,如小于10mm2,或甚至更小。例如，微流体装置可以具有的尺寸范围为10mm x10mm至200mm x200mm,包括尺寸为100mm x100mm以下,如50mm x50mm以下,例如25mm x25mm以下,或10mm x10mm以下,或5mm x5mm以下,例如，1mm x1mm以下。
微流体装置的阵列可以布置用于样品的多任务分析。例如，多微流体装置可以串联布置，以使样品可以在一系列微流体装置中被分析若干不同分析物的存在。在某些实施方式中，多个微流体装置可以并列布置，以使两个以上样品可以基本上同时被分析。
系统的方面包括，微流体装置可以被配置成消耗最小量的样品同时仍产生可检测结果。例如，系统可以被配置成使用的样品体积为100μL以下,如75μL以下,包括50μL以下,或25μL以下,或10μL以下,例如，5μL以下,2μL以下,或1μL以下，同时仍然产生可检测结果。在某些实施方式中，系统被配置成具有的检测灵敏度为10nM以下,或5nM以下,或1nM以下,如500pM以下,包括100pM以下,或50pM以下,例如，或10pM以下,或1pM以下,或500fM以下,或250fM以下,如100fM以下,包括50fM以下,或25fM以下,或10fM以下。在一些情况下，系统被配置成能够检测浓度为1μg/mL以下,如500ng/mL以下,包括100ng/mL以下,例如，10mg/mL以下,或5ng/mL以下,如1ng/mL以下,或0.1ng/mL以下,或0.01ng/mL以下,包括1pg/mL以下的分析物。在某些实施方式中，系统具有的动态范围为10-18M至10M,如10-15M至10-3M,包括10-12M至10-6M。
在某些实施方式中，微流体装置在以下温度范围运行，1℃至100℃,如5℃至75℃,包括10℃至50℃,或20℃至40℃。在一些情况下，微流体装置在温度范围为35℃至40℃运行。
应用
主题装置、系统和方法可用于各种各样的不同应用，其中样品中一种或多种分析物的存在与否的确定和/或定量是所需的。在某些实施方式中，所述方法涉及检测样品中的核酸、蛋白质或其他生物分子。所述方法可以包括检测样品中的一组生物标记，例如，两种以上不同蛋白生物标记。例如，所述方法可以用于生物样品中的两种以上疾病生物标记物的快速、临床检测，例如如可以用于受试者的疾病病症的诊断，用于受试者的疾病病症的正在进行的管理或治疗等。另外，主题装置、系统和方法可以用于用于检测样品中的分析物的检测的方案，如但不限于Western印迹,SOUTHERN印迹,NORTHERN印迹,Eastern,Far-Western印迹,SouthWestern印迹等。
在某些实施方式中，主题装置、系统和方法可用于检测生物标记物。在一些情况下，主题装置、系统和方法可以用来检测是否存在特定的生物标记物，以及特定生物标记物在血液、血浆、血清或其他体液或分泌物，如但不限于尿液、血液、血清、血浆、唾液、精液、前列腺液、乳头抽出液、泪液、粪便、面颊擦洗液、脑脊髓液、细胞溶解产物样品、羊膜液、胃肠液、生物活检组织(例如，获自激光捕获显微解剖(LCM))等中的浓度的增加或降低。
是否存在生物标记物或生物标记物的浓度的显著变化可以用来诊断疾病风险，个体中疾病的存在，或调整个体疾病的治疗。例如，特定生物标记物或生物标记物组的存在可以影响向个体提供的药物治疗或施用方案的选择。在评价潜在的药物疗法中，生物标记物可以用作非变性终点如存活或不可逆发病的替代。如果一种治疗改变生物标记物，其具有改善健康的直接关联，则该生物标记物可以用作用于评价特定治疗或施用方案的临床益处的替代终点。因此，基于在个体中检测的特定标记物或标记物组的个性化诊断和治疗由主题装置、系统和方法促进。此外，与疾病相关的生物标记物的早期检测由如上所述的主题装置和系统的高灵敏度促进。由于在单个芯片上检测多个生物标记物的能力，连同灵敏度、可规模化和易于使用，本发明公开的微流体装置、系统和方法可用于便携式和医疗点或接近患者的分子诊断。
在某些实施方式中，主题装置、系统和方法可用于检测疾病或疾病状态的生物标记物。在一些情况下，疾病是细胞增殖性疾病，如但不限于癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤或癌瘤等。在某些情况下，主题装置、系统和方法可用于检测用于表征细胞转导路径的生物标记物和用于药物发现和疫苗开发的胞内通信。例如，主题装置、系统和方法可用于检测疾病的存在，如细胞增殖性疾病，如但不限于癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤或癌瘤等。在某些情况下，关注的用于检测癌症或细胞增殖性疾病指示的特定生物标记物包括但不限于以下：前列腺特异性抗原(PSA)，其是前列腺癌生物标记物；C-反应性蛋白，其是炎症的指示；转录因子，如p53，其有利于细胞周期,和凋亡控制；多胺浓度，其是光线性角化病和鳞状细胞癌的指示；增殖性细胞核抗原(PCNA)，其是在增殖生长期的细胞的细胞核中表达的细胞周期相关蛋白；生长因子，如IGF-I;生长因子结合蛋白，如IGFBP-3;微小RNA，其是调节基因表达的长度为约21-23该核苷酸的单链RNA分子；糖类抗原CA19.9，其是胰腺和结肠癌生物标记物；细胞周期蛋白依赖性激酶；表皮生长因子(EGF)；血管内皮生长因子(VEGF)；蛋白质酪氨酸激酶；雌激素受体(ER)和雄激素受体(PR)的过表达等。例如，主题装置、系统和方法可以用来检测和/或定量患病、健康和良性样品中的内源性前列腺特异性抗原(PSA)的量。
在某些实施方式中，主题装置、系统和方法可用于检测传染病或疾病状态的生物标记物。在一些情况下，生物标记物可以是分子生物标记物，如但不限于蛋白质、核酸、糖类、小分子等。例如，主题装置、系统和方法可以用来监测HIV病毒载量和患者CD4计数，以通过用对HIV衣壳蛋白p24、糖蛋白(glycoprotiens)120和41、CD4+细胞等的抗体功能化传感器表面进行HIV/AIDS诊断和/或疗法监测。Particular diseases或disease states that可以通过主题装置、系统和方法监测的特定疾病或疾病状态包括但不限于细菌感染、病毒感染、增加或减少的基因表达、染色体异常(例如，缺失或插入)等。例如，主题装置、系统和方法可以用来检测胃肠感染，如但不限于，无菌性脑膜炎、食物中毒、霍乱、大肠杆菌感染、手足口病、螺杆菌感染、出血性结膜炎、副伤寒、小儿麻痹、细菌性痢疾、伤寒、弧菌性败血病、病毒性腹泻等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测呼吸道感染，如但不限于，腺病毒感染、非典型肺炎、禽流感、猪流感、腹股沟鼠疫、白喉、流感、麻疹、脑膜炎球菌性脑膜炎、流行性腮腺炎、副流行性感冒、百日咳(即，哮咳)、肺炎、肺炎型鼠疫、呼吸道合胞体病毒感染、风疹、猩红热、败血性鼠疫、严重急性呼吸器官综合征(SARS)、肺结核等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测神经性疾病，如但不限于，克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、牛海绵状脑病（bovine spongiformencephalopathy）(即，疯牛病),帕金森病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、狂犬病等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测泌尿生殖系统疾病，如但不限于，AIDS,软下疳,衣原体,尖锐湿疣（condyloma accuminata）,生殖器疱疹,淋病,性病淋巴肉芽肿,非淋菌性尿道炎,梅毒等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测病毒性肝炎病,如但不限于，甲型肝炎,乙型肝炎,丙型肝炎,丁型肝炎,戊型肝炎等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测出血热疾病，如但不限于，博拉出血热,肾综合征出血热(HFRS),Lassa出血热,马尔堡出血热等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测动物源性寄生虫病，如但不限于，炭疽,禽流感,普鲁斯病(brucellosis),克雅氏病,牛海绵状脑病(即，疯牛病),致泻性大肠杆菌感染,日本脑炎,钩端螺旋体病,Q热,狂犬病,严重急性呼吸器官综合征(SARS)等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测虫媒病毒感染，如但不限于，登革出血热,日本脑炎,蜱传脑炎,西尼罗热,黄热病等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测抗生素抗性感染，如但不限于，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii),白色念珠菌(Candida albicans),肠球菌(Enterococci sp.),肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。另外，主题装置、系统和方法可以用来检测媒介传播的感染，如但不限于，猫抓病,地方性斑疹伤寒,流行性斑疹伤寒,人艾利希体症(human ehrlichosis),日本斑疹伤寒,虱传回归热,莱姆病,疟疾,战壕热,恙虫病等。类似地，主题装置、系统和方法可以用来检测心血管疾病、中枢神经疾病、肾衰竭、糖尿病、自身免疫病和许多其他疾病。
主题装置、系统和方法可用于诊断测定，如但限于以下：检测和/或定量生物标记物，如上所述；筛选测定，其中样品以规律间隔测试无症状受试者；预后测定，其中生物标记的存在和/或量用来预测可能的疾病过程；层化测定(stratification assay)，其中受试者对药物治疗的响应可以被预测；效力测定，其中药物治疗的效力被监测等。
主题装置、系统和方法还可用于验证测定。例如，验证测定可以用来验证或确认有效的疾病生物标记物是各种各样个体范围是否存在疾病的可靠指示。主题装置、系统和方法的短测定时间可以有利于用于在最少时间量中筛选多个样品的生产能力增加。
在一些情况下，主题装置、系统和方法可以在不要求用于实现的实验室环境下使用。相比于等效的分析研究实验室设备，主题装置和系统提供在便携式、手持式系统中的相当分析灵敏度。在一些情况下，重量和操作成本低于典型静止实验室设备。主题系统和装置可以集成到单个设备中，使得所有的测定步骤，包括关注的分析物的分离、转移、标记和检测，可以通过单个设备进行。例如，在一些情况下，没有单独的用于关注的分析物的分离、转移、标记和检测的设备。另外，主题系统和装置可以由无医学培训的人员在家庭环境用于非处方药家庭测试(over-the-counter home testing)，以检测样品中的一种或多种分析物。主题系统和装置也可以用于临床环境，例如在床侧，用于快速诊断，或用于其中由于成本或其他原因而没有提供静止的研究实验室设备的环境。
试剂盒
本发明的方法另外包括具有如本文中详述的微流体装置的试剂盒。所述试剂盒进一步包括缓冲液。例如，所述试剂盒可以包括缓冲液，如电泳缓冲液、样品缓冲液等。试剂盒可以进一步包括另外的试剂，如但不限于，释放剂、变性剂、重折叠剂、去污剂、可检测标记(例如，荧光标记，比色标记，化学发光标记，多色试剂，酶联试剂，抗生物素蛋白-抗生蛋白链菌素相关检测试剂、放射标记、金粒子、磁性标记等)等。
除了以上组分外，主题试剂盒可以进一步包括用于实施主题方法的说明书。这些说明书可以以各种形式存在于主题试剂盒中，其一种或多种可以存在于试剂盒中。其中这些说明书可以存在的一种形式为在合适介质或基底上的印刷信息，例如，在试剂盒包装中、在包装插件中的一张或多张其上印刷了信息的纸等。另一种方式是计算机可读介质，例如光盘、CD,DVD,蓝光碟(Blu-Ray),计算机可读存储器等，其上已记录或存储信息。可以存在的另一种方式是网址，其可以经由互联网访问在远方位置的信息而使用。任何方便的方式可以存在于试剂盒中。
如可以从以上提供的公开内容理解的，本发明的实施方式具有广泛的各种应用。因此，本文中提供的实施例提供用于举例说明的目的而不意图被以任何方式解释为对本发明的限制。本领域技术人员将易于认识到可以被改变或锈蚀的各种非关键参数以产生基本上类似的结果。因此，提供一下实施例以向本领域技术人员提供如何形成和利用本发明的完整公开内容和描述，而不意图显示本发明发明人视为其发明的范围它们也不意图表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已努力确保关于所使用的数值(例如，量，温度等)的准确性，但是一些实验误差和偏差应被考虑。除非另有指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度为摄氏度，并且压力在或接近大气压。
实施例
I.概述
进行实验以证实以快速、自动化且统一的微流体形式的多任务非变性Western印迹。测定和微装置设计利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳集成针对多个抗体结合区域的蛋白结合(例如，印迹)。这种微流体集成策略克服了对于常规再印迹技术典型地需要的抗体脱离步骤所固有的非特异性材料损失，其可限制分析物定量。为了通知多任务微流体装置的合理设计，开发了分析模型用于在结合区域上的分析物捕获。相比于经验，报告了观察结果，经验85%以上的捕获效率。无标记检测室的同时和定量的多任务测量在不需要样品的预先标记下成为可能。测定线性动力学范围的范围为8nM至800nM，测定在5min内完成。
II.实验
A.芯片上多分析物免疫印迹。多任务免疫印迹测定封装在单个1mm×1.5mm微室和微流体通道网络(图1(a))。为了制造多任务装置，微室用聚丙烯酰胺(PA)凝胶图案化，具有用于PAGE(加载和分离凝胶)的特定区域和与PAGE分离轴平行的离散抗体图案化PA凝胶结合区域。为了将蛋白质加载到中央室中，～2μL体积首先移液到样品储罐(图1(a),储罐2)。横跨储罐2和4保持的电势导致在交叉通道交叉点处形成的～0.5nL大小的蛋白塞。如图1(b)所示，蛋白质然后在所述室的非变性PAGE区域中注射和分离。分离区域由叠加界面(大至小孔径不连续性，3%T-至-6%T,w/v)和分离凝胶(6%T)构成。随着电泳进行，蛋白质由于荷质比差异而溶解(图1(b),步骤1)。在电极1和5处的电压控制最小化样品扩散并且保持高分辨率分析物分离(参见电压程序，表1)。
表1.用于高电压电源的芯片上免疫印迹电压控制程序
高电压电源连接至8个可编程电极。8个可编程电极的每一个能够电流.电压反馈控制，其中动力范围为约4000V并且估计+/-0.01μA电流和1V电压分辨率。
在分离完成时，移除分离电场并且横跨所述室施加横向场，由此将分离的蛋白质峰引向抗体官能化结合区域(图1(b),步骤2)。每个结合区域包括通过抗生蛋白链菌素-缀合的丙烯酰胺连接至PA凝胶的生物素化捕获抗体(蛋白质靶标是特异的)。这种适应性键化学的使用允许印迹区域可与在测定开始之前利用生物素化抗体定制。例如在图1中，示出了用不同抗体(Ab1,Ab2)图案化的两个不同结合区域。
界定中央室边界的微通道阵列分别在PAGE分离和转移期间沿着分离和电转移轴保持电池均匀性。转移步骤保持从分离轴至结合区域的分离分辨率(SR)。需要在分离轴上的蛋白质位置对结合区域上的区域的1:1空间描图以保持荷质信息。因此，在电转移期间的峰扩散被最小化。在图1(b)中，步骤3，具有对固定化抗体的亲和性的蛋白质作为免疫复合物被固定在相关结合区域中。这种凝胶中结合过程在分钟时间范围上进行。具有对固定化抗体的低至无亲和性的蛋白质在没有被保持下移动通过结合区域的通道并移出。
B.试剂和样品。稀释至1×的Tris-甘氨酸(25mM Tris,192mM甘氨酸，在pH8.3)用作样品和运行缓冲液(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。PA凝胶制备自30%丙烯酰胺(29:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺比)储液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。抗体功能化印迹凝胶制备自也含有抗生蛋白链菌素丙烯酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA)的前体溶液。所有凝胶前体溶液含有来自WakoChemicals(Richmond,VA)的0.2%(w/v)2,2’-偶氮二-[2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺](VA-086)作为光引发剂。
由在770nM的C-反应性蛋白(EMD Chemicals Inc.,Darmstadt,Germany)、在550nM的蛋白G(PG)和在133nM的胰蛋白酶抑制剂(TI)(Invitrogen)组成的荧光标记蛋白梯用于装置和测定表征。CRP在室内根据制造商说明用AlexaFluor488(Invitrogen)标记同时购买PG和TI，以由售主标记。生物素化抗-蛋白G(α-PG)抗体获自Abcam(Cambridge,MA)，并且生物素化抗-CRP(α-CRP)购自R&D Systems(Minneapolis,MN)。替代地，抗体可以使用商购获得的生物化试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,IL)缀合。
C.多分析物印迹芯片制造。玻璃微流体芯片利用由Caliper Life Sciences(Hopkinton,MA)进行的玻璃初始湿法蚀刻在室内设计。钻出流体接入孔口(Crystalite,Lewis Center,OH/Cameron Microdrill Presses,Sonora,CA)并且在室内热粘合芯片(Vulcan3-550,Neytech,York,PA)。在引入凝胶前体溶液之前，玻璃芯片首先用硅烷(甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯，Sigma-Aldrich)、乙酸、甲醇和水的2:2:3:3混合物温育30分钟。这个表面硅烷化布置硅消除凝胶边界的移动是关键的，该凝胶边界的移动有时在没有进行硅烷化时在延长施加电场(即，>20分钟)下观察到。在玻璃芯片制造后，三种类型的凝胶在2D室中制造：大孔径加载凝胶(3%T,3.3%C)、小孔径分离凝胶(6%T,3.3%C)和抗体功能化凝胶(4%T,3.3%C，含有3.8μM抗生蛋白链菌素-丙烯酰胺)凝胶。生物素化抗体以1.6μM包括在印迹凝胶前体溶液中并在PA凝胶光聚合之前在室温(25℃)温育1小时。
单个装置内的离散凝胶区的集成通过多步骤光刻法实现(图6)。图6示出了多步骤光刻凝胶制造的示意图。具有可变强度控制的HamamatsuLightningCure LC5UV光源(Hamamatsu City,Japan)用于凝胶的光图案化。来自LC5的UV光束沿着Nikon Diaphot200(Tokyo,Japan)倒置显微镜的光路引导并向上通过UV-透射物镜(UPLANS-APO4x,Olympus,Melville,NY)。掩盖的芯片然后暴露于在3.5mW/cm2的UV达5min和30s，如利用UV513AB数字照度计(Digital Light Meter)(General Tools,New York NY)。抽空未聚合的材料并将用于下一结合凝胶区域的前体通过在相邻储罐处施加真空引入至中央室。在每个光聚合步骤之前进行芯片通道和室的肉眼检查以避免引入气泡。如果观察到，通道或室内的气泡用缓冲液经由施加真空压力冲出并用新鲜PA凝胶前体冲入。当所有必需的结合区域被聚合时，未聚合的结合凝胶前体溶液冲中央室抽空并用6%T PA分离凝胶溶液替代。
分离凝胶区域然后掩盖以在中央室的顶部附近产生界面并使用UV物镜以3.5mW/cm2曝光。最后，较低密度加载凝胶前体涌过最上方的加载通道并且整个芯片暴露于具有冷却风扇的过滤水银灯(UVP B100-AP,Upland,CA)。最后的聚合步骤需要在9mW/cm2整片曝光5分钟。
如上所述，使用UV光来聚合依次引入到中央室中的凝胶前体溶液。高空间分辨率(～20μm)光刻技术用来在室中产生更多的复制凝胶结构，其能够实现多任务测定。多步骤制造方法获得具有离散加载和分离凝胶区的装置，以及使用n+2UV曝光步骤制造的n个结合凝胶区域(其中n对应于所需的蛋白质靶标的数量)。取决于装置复杂性，总制造时间为2至4小时。完成的芯片在4℃储存几周并充分浸没在缓冲水溶液中。尽管结合区域设计用于单次使用，但是内部凝胶可以通过将芯片在高氯酸(66%):过氧化氢(33%)浴中浸泡过夜被溶解，使得玻璃芯片可以被再使用。
D.流体接入和电压控制。为了进行结合测定，将光图样化芯片固定在落射荧光显微镜阶段(epi-fluorescence microscope stage)并将～2μL样品直接等分到样品加载储罐中。所有其他储罐加载Tris-甘氨酸缓冲液，并且各自插入铂电极。每个电极处电压和电流水平的连续控制和监测使用具有电流/电压反馈控制的8通道高电压电源实现(参见表1)。装置内的电场强度通过用所施加的电势中的差除以电极之间的距离估算。
E.数据收集和分析。图像收集利用CCD相机(CoolSNAPTM HQ2,RoperScientific,Trenton,NJ)和10×物镜(UPlanFL,N.A.=0.3,Olympus,Center Valley,PA)使用倒置落射荧光显微镜(IX-70,Olympus)进行。相机曝光时间为300ms并且采用2×2像素装仓，导致得到代表～1mm×1.34mm视野的全视野图像。全视野成像的使用允许所有分析物在蛋白质分离期间被同时观察并且在水平转移后在抗体功能化印迹区域上被检测。来自水银弧灯的光通过XF100-3或XF111-2滤光片组(Omega Optical,Brattleboro,VT)过滤以分别照明AlexaFluor488和568个标记蛋白。两种颜色图像复合汇编自在同一装置上的两次不同运行期间取得的个别红色和绿色波长图像序列。保持相同的条件和计时并且来自每个颜色通道的图像同步至在开始每个实验时观察到的电信号，然后经由ImageJ(NIH,Bethesda,MD)汇合成后处理中的单个序列。
使用ImageJ进行图像分析并且选择并一致地施加对应于分离和印迹区域的关注区域(ROI)。横跨ROI的线路段平均化以计算荧光信号的空间分布。蛋白质带之间的SR定义为SR=ΔL/4σ，其中ΔL是相邻带中心之间的距离并且σ表示平均特征带宽度(假定为Gaussian分布)。当SR>1时溶解两个分析物带。通过使用OriginPro(OriginLab,Northampton MA)采用Gaussian峰拟合算法计算σ。
F.印迹区中分析物捕获的模拟。使用Matlab(MathWorks,Natick MA)写入和进行模拟。
III.结果和讨论
A.芯片上多任务非变性Western印迹。为了评估芯片上多任务再印迹性能并建立强大的测定方案，测定荧光标记的三种分析物梯(ladder)。该梯由两种靶蛋白(CRP,PG)和高电泳迁移率阴性对照(TI)构成。来自蛋白质印迹测定的结果显示在图2中，其中三个不要步骤(非变性PAGE分离、转移和多分析物印迹)的性能标识在以下描述。
非变性PAGE。为了评估堆积凝胶的注射扩散最小化作用，注射样品嗲的标准偏差在通过该微室内的堆积界面之前(σinj)和之后(σstack)理解进行比较。对于这里使用的结构，堆积界面的存在将注射扩散减少75%,从σinj=117μm至σstack=29μm。伴随地，当带横跨堆积界面时，观察到荧光信号最大值的41%±19%(n=6)增加。在通过堆积界面(分离时间为t=17s)后，注射塞溶解到PG(σPG=122μm)、TI(σTI=96μm)和CRP(σCRP=96μm)中。在t=17s，所有三种物质基线溶解，其中SR为TI/PG之间的1.10和PG/CRP之间的1.78。分离占据1290μm分离轴的630μm(从堆积凝胶至TI峰中心)。
电泳转移至结合区域。在t=28s，开始电泳样品从非变性PAGE分离轴转移至结合区域。切断分离电场并垂直于分离轴施加电场以驱动物质越过分离室并到达结合区域。采用在控制管1、5、6、7和8处(图1(a))的电流流动的调节以最小化转移期间(图2(b))和在前分离期间室中的弥散场(细节参见电压控制程序，表1)。
全部带转移至印迹区域对于PG峰(高迁移率阳性对照)在25s内完成并且对于较低迁移率CRP峰在210s内完成。高迁移率阴性对照移动通过两个结合区域并在50s内移出该2D室。水平电转移在最慢物质经过分离轴和最后结合区域之间的水平跨度时完成。在样品转移和结合之前和之后蛋白质带宽度、峰位置和SR中的变化显示在表2中。相比于PAGE期间的带的宽度，在结合后，平均带宽平均降低16%(沿着水平尺寸)。
为了评估在印迹凝胶界面(即，分离至印迹区域，结合区域1至2)处和每个印迹区域内的非特异性排阻(例如，物理尺寸排阻)或保留，监测对抗体功能化凝胶不是特异性的阴性对照蛋白质。图7示出了用来评估在印迹凝胶界面处的尺寸排阻作用的阳性和阴性对照实验的基质图示。为了研究在凝胶区域界面出的尺寸排阻作用，包括BSA(66kDa)、α-辅肌动蛋白(100kDa)和IgG(150kDa)的大分析物针对抗-CRP和抗-蛋白质G抗体功能化的印迹区域进行评估。在样品转移期间，监测在印迹界面处和印迹区域内的荧光。大的阴性对照蛋白通过印迹区域同时没有表现出电泳迁移率的降低，因为它们从分离凝胶横过进入印迹区域并从其出来。BSA和α-辅肌动蛋白样品，在300nM测定，在各个峰迁移越过印迹区域之后在分离凝胶至抗-PG和抗CRP界面处显示5%和4%残余信号。
图7示出了能够通过结合区域的大阴性对照蛋白(范围为66-150kDa)的传输。在双分析物测定中，观察懂啊阴性对照蛋白(TI)的电泳迁移率的可忽略变化(沿着分离轴的μTI：4.93×10-5cm2/Vs,在α-CRP区域中的μTI：4.93×10-5cm2/Vs;在α-PG区域中的μTI：4.95×10-5cm2/Vs)。在水平转移方向(至印迹凝胶或两个印迹区域之间的分离)上在任何凝胶界面处观察到可忽略的堆积和可忽略的去堆积，这是由于区域内和每个水平转移界面处的密切配合孔径所致。
表2.带宽、峰中心位置和分离分辨率在整个水平转移中被保持。
之前：在30s成像。之后：在250s成像。峰中心位移定义为在水平运输至印迹区域后峰中心沿着分离轴的净位移，并且也以与分离轴的长度的相对比例表示。
印迹和荧光读数。双重分析物非变性印迹产生从8至800nM的线性剂量响应(y=0.042x–0.187;R2=0.988,n=5)，如经由用于蛋白质G样品的荧光成像测得的。横跨蛋白质带的长度对荧光强度绘图导致产生于蛋白质捕获总质量相关联的曲线下方的面积。印迹前和印迹后PG和CRP带测量的比较证实，每个蛋白质带的85至95%在匹配抗体功能化结合区域上被捕获。基于当前的落射荧光类全视野成像系统的～3的SNR建立2.5nM的检测下限。全视野成像能力选择用于此处，因为它允许同时定量测量多个分析物，使得一个相同样品中的这些靶标的相对表达水平可以在单次测定中进行比较。纳摩尔以下的灵敏度水平利用更灵敏的检测方法，如扫描激光/光电倍增管系统是可能的。
B.建立用于分析物印迹的条件。为了建立用于印迹的最佳操作条件，进行免疫印迹过程的模型化。假定迁移蛋白和固定化抗体之间的相互作用由一阶Langmuir结合模型充分表示，结合(Cbound)和游离的靶蛋白(C)的浓度分布可以表示为结合反应和微分方程：
C + b m ← k off → k on C bound
dC bound dt = k on C ( b m - C bound ) - k off C bound
这里，bm表示在固定化抗体群组上的可用结合位点。在结合位点处的游离分析物结合通过正向结合速率常数kon(M-1s-1)和反向离解速率常数koff(s-1)控制。对于此系统，非维度数(Da)表示反应性通量(由kon和结合部位的可用度确定)与质量传输通量（电迁移）的比值。具体地，Da=(Lkonbm)/Uo，其中L是印迹区域的宽度并且Uo表示通过印迹区域的分析物电迁移速度。这里，Uo=μoE，其中E是所施加的水平电场强度并且μo表示分析物的电泳迁移率，使得:Da=(Lkonbm)/μoE。因此，Da描述了两种时间量程电迁移时间(L/μoE)和结合反应时间(1/konbm)之间的关系。为了提供背景，当Da的值高(>10)时，结合凝胶中的蛋白质靶标共区域化的持续时间显著超过对于结合反应所需的特征性时间量程。因此，所述系统受质量传输限制。在低Da(<1)下，靶标移动通过结合区域对于结合太快而不能发生并且所述系统受反应限制。在质量传输限制方式(Da>10)下操作，同时保持如由应用限定的合理总测定时间是期望的。
靶标带(ΔCbound)的缺乏和结合靶标在结合凝胶内的空间分布(Cbound)二者被模型化用于单个靶标带、单个印迹区域系统。这里，x对应于微室的水平（转移）轴。迁移性蛋白质带在一维中模型化我具有-2σ至+2σ的宽度的Gaussian分布。浓度分布划分成一系列等宽度ΔX的n个微分元。每个带元分配初始浓度值C(x,to)。结合区域类似地通过等宽度ΔX的p个凝胶元表示，使得p=L/ΔX，其中L表示印迹区域的总长度(图8)。
电泳迁移速度决定保留时间步(Δt)，其中每个靶标带元用匹配的结合凝胶元共区域化或“温育”。通过结合凝胶的平均峰迁移速度在所有结合区域上被认为是恒定的和均匀的。对于每个时间步，结合的蛋白浓度通过以下表示：
ΔCbound＝(konC(bm-Cbound)-koffCbound)Δt
表3.模拟参数，经验和推理确定。
变量[单位] 范围 实验的 模拟
bm[μM] 0-22 1.6* 1.6
E[V/cm] 10-150 50-75 50
L[μm] 20-500 100-300 100-200
kon[M-1s-1] 104-108 – 5.75×105
koff[s-1] 10-1-10-5 – 1×10-3
μo[cm2/Vs] 1-7×10-5 6.6×10-5 6.6×10-5
σ[μm] 10-100 80 80
C[nM] 1-500 8-1250 800
*假设全部结合位点可用
在每个时间步之后，计算的ΔCbound从相应的带和凝胶元减去。注意用于koff的时间量程典型地比kon的时间量程大107-1010。在模拟中，允许带相对于凝胶推进，并且计算下一组带/凝胶温育步骤。使用经验确定的电泳迁移率值和已知的样品/抗体浓度(表3)。
选择适当的kon在拟合所述模型中是关键的，因为kon是唯一不能从经验观察和系统设计中提取出的参数。kon的值可以通过多阶量程变化，这取决于抗原/抗体对和局部微环境。尽管本模型不是捕获带的对流-扩散行为，但是当相比于转移和分离期，通过结合区域的带迁移相对较短，因此证实在结合相互作用期间可忽视印迹凝胶中的扩散作用。图3比较了来自模拟获得的结果与实验结果，其中800nM PG样品在规定的水平场强度下被转移至α-PG印迹凝胶。这里，固定化带的长度定义为，当结合的抗原浓度作为空间的函数描图时，距含有曲线下方总面积的90%的分离/印迹凝胶界面的距离。在模拟和实验工作中，对于完全抗原捕获所需的印迹区域的长度作为所施加场强度的函数线性地增加。500μm水平距离对于这种抗原的完全捕获是足够的，甚至对于在大于100V/cm的水平场的高浓度靶标(图3(a))。
图3(b)示出了结合效率的变化是如何受参数如场强度和样品性质影响的。假定印迹区域宽度为100μm并且结合位点密度为1.6μM，对于E的值从14-140V cm-1变化，μo从2-40cm2V-1s-1变化并且kon从0.5-20M-1s-1变化。结合效率用作靶标捕获的度量。如果印迹区域的宽度小于完全固定化带的必需尺寸，则蛋白质捕获的效率可能不是最佳的。这里详述的模型可用于优化性能和通知装置设计。
对于具体组的操作(即，E,L)和分析物特性(即，抗原/抗体结合亲和性，分析物迁移率)的最小印迹凝胶宽度的知识有助于最大化分析物印迹测定的能力。基于当前条件下的水平转移区域的必需长度，据估计，针对8-10个抗体的印迹在进一步扩展中央室下是可能的。具体地，所述模型有助于用于生物应用的装置设计，其中电泳迁移率和结合亲和性常数对于一种多分析物样品中的物种来说可以的宽范围的。当实验结果与模拟进行比较时，固定化带的空间分布也可以用作用于估算之前未知的结合亲和性的基础。
在一些情况下，可以有利的是降低水平电场的强度，由此延长其中抗原靶标在样品转移期间共区域化至捕获抗体的时间。增加的“温育时间”导致更高的捕获效率和增强的局部化结合信号，其决定检测限。然而，较慢的转移速度也可能导致更大的带扩散。替代地，也可以增大局部捕获抗体浓度以最小化必需的水平俘获长度避过增大测量灵敏度。各种抗体功能化区域的芯片上布置可以定制，这取决于分析物的转移行为。例如，单个样品内的多个物种的抗体之间的交叉反应性可以经常提供对所有形式的免疫测定的障碍。在其中已知的交叉反应性存在于结合抗原/抗体对之间的情况下，可以规定2D芯片内的抗体功能化印迹区域的序列以最小化模糊或假性测量。注意印迹区域宽度对于所有靶标物种不需要是相同的。
C.作为与蛋白质亚型分析相关的共迁移物种的印迹。在常规印迹测定中，当两种抗原表现出密切匹配的电泳速度时，印迹膜(即，PVDF或硝基纤维素板)的剥离和再印迹可以是唯一选项。例如，这可以出现在蛋白的亚型或翻译后修饰的研究中，其导致分子量的相对较小差异。芯片上印迹被评估作为选择性地印迹和鉴别来自非变性PAGE的两种共迁移性物种之一的方式。图4中提供的两种颜色成像数据显示由英国标记的PG靶标构成的样品(红色荧光标记)和由BSA和TI构成的样品梯（绿色荧光标记）的非变性PAGE分析。PG带显示与BSA10%不同的电泳速度，因此物种在非变性PAGE测定中早期共迁移。
在过去的t=27s的PAGE分离时间，电场切换至水平方向并且所有物质迁移至位于室右边的结合区域。以50V/cm的转移需要38s。在针对结合区域中固定化的α-PG抗体结合后，红色标记的PG被特异性地保留在α-PG结合区域中。结合效率，定义为：#结合的分子/总的#分子(基于荧光强度测量)，对于PG估算为95%。所有迁移通过印迹区域(t=30至65s)的非靶标带没有可检测的荧光信号，后面留下被捕获的关注抗原。免疫印迹在样品注射后65s完成。
D.印迹区域上的无标记检测。为了获得无标记的芯片上非变性Western印迹，所得测定步骤如前面所述进行，不同之处是：1)蛋白质样品在PAGE之前不再进行荧光标记和2)荧光标记的检测抗体在印迹区域上的分析物捕获之后引入。这里，所述测定对于PG在500nM下显示。为了更清楚地显示测定构思，PG用绿色荧光团标记(检测抗体用红色标记)。实践中，样品蛋白不被标记但可以包括染料标记的蛋白质梯，其中该样品作为相对迁移率参照。在样品捕获后，与结合的靶标匹配的荧光标记的检测抗体(6μM)从在装置右边的控制通道阵列被引入到结合区域(E=150V/cm)。检测抗体然后在20min温育期后冲洗出结合/分离室。如图5中看到的，检测抗体报告了在印迹区域上的固定化靶蛋白质带（如以绿色显示的）的位置处的荧光信号(红色,SNR～39)。该方式也与酶联扩增相容而进一步增强在印迹区域上的检测信号。
IV.概括和结论
上述实验证实这样的集成测定，其报告1)经由非变性PAGE获得的分析物电泳迁移率与2)随后的多种物种的基于抗体的印迹。微流体装置用于适用于分析物定量的再印迹测定的自动化操作。还开发了分析模型，其捕获在凝胶结合区域中分析物电迁移和基于亲和性的分析物捕获之间的竞争。所述模型用于通知装置设计(例如，结合区域的水平尺寸和此处描述的几何结构的可能结合区域的最大数量)以及用于最佳蛋白质结合效率的测定操作条件(例如，电转移场强度)的选择。还进行了实验，其中多阶段样品和试剂递送方案用于这样的无标记测定，其使用夹心抗体检测方法。多光谱检测和酶扩增可以采用，用于多任务刺耳的那个和增加分析灵敏度。此处描述的用于非变性蛋白质分析的多任务免疫印迹技术证实用于良好溶解和不溶解的蛋白质(自PAGE)二者并获得在约几分钟的总的自动化测定完成。
尽管为了清楚理解的目的，前述实施方式以通过例示和实施例的方式在某些细节上进行了描述，但是对于本领域技术人员来说，依照本公开内容的教导，显而易见的是，可以对其进行某些改变和变更而不背离所附权利要求的精神或范围。还要理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不用于限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应理解，在该范围的上下限以及在该所述范围内的任何陈述或插入的值之间的各个插入值，除非上下文另有清楚指明，至下限单位的十分之一，被涵盖在本发明中。这些较小范围的上下限可以独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本发明的范围内，服从在所述范围内任何具体地不包括极限。在其中所述范围包括极限之一或二者的情况下，不包括这些包括的极限之一或二者的范围也包括在本发明中。
本说明书中引述的所有出版物和专利通过引用并入本文中，如同每个个别出版物或专利具体且个别地指明通过引用并入一样并且通过引用并入本文以公开或描述与所引述出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引述是其在申请日之前的公开内容而不应解释为承认本发明无权借助于在前发明在这样的出版物前面。而且，提供的公开日期可能不同于实际公开日期，这可能需要独立地确认。
注意的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另有清楚指明。还注意的是，权利要求可以撰写为不包括任何可选的要素。同样，这种陈述意图用作关于所述权项要素使用这样的排他性术语如“单独的”、“唯一”等或使用“负面”限制的引用基础。
如对本领域技术人员在阅读本公开内容后将明显的，本文描述和例示的单个实施方式的每一个具有具体地组分和特征，其可以容易地与任何其他实施方式的特征分开或组合，而不背离本发明的范围和精神。任何所述方法可以以所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
因此，前述内容仅说明本发明的原理。将理解的是本领域的技术人员将能够设计不同的安排，这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示，但实施本发明的原理并且被包括在其精神和范围之内。此外，在此引用的所有实例和有条件的语言原则上旨在帮助读者理解本发明的原理而不受此类确切引用的实例和条件的限制。并且，引用本发明的原理、方面、以及实施例的所有在此的陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物以及未来发展的等效物，即不论结构而执行相同功能的发展的任何要素。本发明的范围不是旨在限制于在此显示和描述的示例性实施例。而本发明的范围和精神是通过所附权利要求书来实施。

Claims (20)

1.一种用于检测流体样品中的两种以上分析物的微流体装置，其中所述微流体装置包括：
室，其包含：
分离介质;
第一结合介质;和
第二结合介质;以及
流场元件，其被配置成使所述室经过两种以上方向不同的流场。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述两种以上方向不同的流场包括两种以上方向不同的电场。
3.根据权利要求2所述的微流体装置，其中所述两种以上方向不同的电场是正交电场。
4.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述分离介质包括聚合物凝胶。
5.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述室还包括与所述分离介质接触的堆叠介质。
6.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述第一结合介质位于所述分离介质和所述第二结合介质之间。
7.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述第一和第二结合介质各自包括与聚合物凝胶稳定联合的结合成员。
8.根据权利要求7所述的微流体装置,其中所述结合成员包含蛋白质或其结合片段。
9.根据权利要求8所述的微流体装置,其中所述蛋白质是抗体。
10.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述两种以上分析物未被标记。
11.一种测定流体样品的两种以上分析物的方法，所述方法包括：
(a)将所述流体样品引入到微流体装置中，所述微流体装置包括：
(i)室，其包含：
分离介质;
第一结合介质;和
第二结合介质;及
(ii)流场元件，其被配置成使所述室经过两种以上方向不同的流场；
(b)将所述样品引导通过所述分离介质以产生分离的样品；
(c)将所述分离的样品引导通过所述第一和第二结合介质；以及
(d)对所述第一和第二结合介质评价所述两种以上分析物的存在。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述两种以上方向不同的流场包括两种以上方向不同的电场。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述室还包含堆叠介质并且所述方法还包括在将所述样品引导通过所述分离介质之前浓缩所述样品。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述方法还包括在对所述第一和第二结合介质评价所述两种以上分析物的存在之前，使第一和第二标记试剂流过所述第一和第二结合介质。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述方法是诊断方法。
16.一种用于测定流体样品的两种以上分析物的存在的系统，所述系统包括：
(a)微流体装置，所述微流体装置包括：
(i)室，其包含：
分离介质;
第一结合介质;和
第二结合介质;及
(ii)流场元件，其配置成使所述室经过两种以上方向不同的流场;以及
(b)检测器。
17.根据权利要求16所述的系统,其中所述检测器是光电倍增管、电荷耦合器件、增强型电荷耦合器件、互补式金属氧化物半导体传感器、视觉色度读出器或光电二极管。
18.根据权利要求16所述的系统，还包括配置成引导流体通过所述微流体装置的微流体部件。
19.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)微流体装置，所述微流体装置包括：
(i)室，其包含：
分离介质;
第一结合介质;
第二结合介质;和
(ii)流场元件，其配置成使所述室经过两种以上方向不同的流场；以及
(b)缓冲液。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括第一和第二标记试剂，其分别特异性地结合第一和第二分析物。
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