JP4599577B2 - 二次元電気泳動方法 - Google Patents
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このため、従来は、一次元目の電気泳動を行う際の一次元ゲルの乾燥を防止し、併せて一次元ゲルと二次元ゲルとを非導電状態とするため、一次元ゲルを非導電性の固体或いは液体で包含する方法が採られていた。そして一次元目の電気泳動終了後、該乾燥防止等のための物質を除去していた。
より詳しくは、乾燥した一次元ゲルの膨潤を短時間で実施し、トータルの一次元目の電気泳動を短時間でしかも簡便に実施することができる、二次元電気泳動方法および二次元電気泳動用キットを提供することを課題とする。
さらに、本発明では、前記第1の電気泳動分離媒体を冷却しながら、該第1の電気泳動分離媒体に電場を与えて、前記サンプル中の成分を一次元目の分離を実施することにより、該第1の電気泳動分離媒体へ任意の電流量を供給することができる。これにより、電場供給開始直後から大電力を供給することが可能となるが、特定の電場を供給することにより、一次元目の分離(一次分離)時間をより短縮できることを見出した。
すなわち、本発明は下記を含む。
(1)ストリップ状の乾燥した第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて、一つの支持基板上に担持された二次元電気泳動基板を提供する工程、
(2)前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体に、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する膨潤用溶液を添加して、前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体を飽和状態まで膨潤させるとともに、前記第1の電気泳動分離媒体にサンプルを含浸させる工程、
(3)前記第1の電気泳動分離媒体を冷却しながら、該第1の電気泳動分離媒体に電場を与えて、前記サンプル中の成分を一次分離する工程、
(4)一次分離を実施した後、液状緩衝剤を前記間隔に流し、さらに該液状緩衝剤をゲル化する工程、および
(5)前記第1の電気泳動分離媒体および第2の電気泳動分離媒体の双方に、前記第1の電気泳動分離媒体の長手方向に対して実質的に垂直方向に電場を与え、前記第2の電気泳動分離媒体において、前記一次分離された成分を二次分離する工程。
〔2〕 前記工程(2)において、水よりも極性が高い有機溶媒が、水よりも極性が高い有機酸である、〔1〕に記載の方法。
〔3〕 前記工程(2)において、膨潤用溶液中の水よりも極性が高い有機溶媒の含有量が、5体積%(有機溶媒の体積/水溶液全体の体積×100(%))以上である、〔1〕に記載の方法。
〔4〕 前記工程(3)において、第1の電気泳動分離媒体の温度が、電場が供給されている間0〜20℃である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕 前記工程(3)において、電場の供給開始直後から、単位体積あたりの電力量を1〜120mW/mm3の範囲にして電場の供給を行う、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕 前記工程(4)で用いる液状緩衝剤が、アガロースを含有する、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕 前記液状緩衝剤が、pH6.8であり、さらにマイナスイオンを含有する、〔6〕に記載の方法。
〔8〕 前記工程(1)において、前記第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体との間の間隔が、気体により隔てられている、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕 ストリップ状の乾燥した第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔を置いて、一つの支持手段上に備えられ、
前記支持手段には、乾燥した第1の電気泳動分離媒体の膨潤用に、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する膨潤用溶液の供給手段が備えられている、二次元電気泳動用キット。
〔10〕 前記支持手段に、さらに冷却手段が前記第1の電気泳動分離媒体の冷却を可能とするように備えられている、〔9〕に記載のキット。
〔11〕 前記支持手段が、さらに、サンプルの一次分離後に前記間隔に流し込むための、液状緩衝剤の供給手段を有している、〔9〕または〔10〕に記載のキット。
〔12〕 前記冷却手段が、ペルチェ素子である、〔10〕に記載のキット。
〔13〕 前記液状緩衝剤が、アガロースおよびマイナスイオンを含有し、pHが6.8である、〔11〕に記載のキット。
また、前記第1の電気泳動分離媒体を冷却しながら、該第1の電気泳動分離媒体に電場を与えて、前記サンプル中の成分を一次分離するので、該第1の電気泳動分離媒体へ任意の電流量を供給することができる。第1の電気泳動分離媒体への電場を特定の条件で供給することにより、これまで2〜13時間要していた一次分離時間を、たとえば10〜20分程度に著しく短縮できる。これにより、一次元目の電気泳動に際し、一次元ゲルの乾燥防止のため液体または固体で一次元ゲルを保護する必要がなくなり、極めて簡便な操作で二次元電気泳動を行うことができる。
本発明に係る二次元電気泳動方法は、下記工程を含む。
(1)ストリップ状の乾燥した第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて、一つの支持手段上に担持された二次元電気泳動基板を提供する工程、
(2)前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体に、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する膨潤用溶液を添加して、前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体を飽和状態まで膨潤させるとともに、前記第1の電気泳動分離媒体にサンプルを含浸させる工程、
(3)前記第1の電気泳動分離媒体を冷却しながら、該第1の電気泳動分離媒体に電場を与えて、前記サンプル中の成分を一次分離する工程、
(4)一次分離を実施した後、液状緩衝剤を前記間隔に流し、さらに該液状緩衝剤をゲル化する工程、および
(5)前記第1の電気泳動分離媒体および第2の電気泳動分離媒体の双方に、前記第1の電気泳動分離媒体の長手方向に対して実質的に垂直方向に電場を与え、前記第2の電気泳動分離媒体において、前記一次分離された成分を二次分離する工程。
以下、各工程ごとに説明する。
前記工程(1)で供給される二次元電気泳動基板において、前記第1の電気泳動分離媒体は、水又は水溶性溶液の吸収により膨張する乾燥ゲルであり、通常、使用する直前に水あるいは水溶性溶液で膨潤させる。
このようなゲルとしては、ポリアクリルアミドゲルが挙げられる。このようなゲルは、等電点電気泳動を行うIPGゲル(固定化pH勾配ゲル)である。
第1の電気泳動分離媒体の寸法に限定はないが、本発明では、膨潤後においても、極めて細く薄い形状のものを採用できる。たとえば、飽和状態の膨潤後において、厚さ0.1〜1.0mm、短手方向の長さ0.5〜5.0mmであるようなものを用いることもできる。長手方向の長さは、基板の大きさにより異なり限定されない。
電気泳動に先立って、タンパク質等のサンプルは蛍光標識しておくことができる。またこのとき、同じ条件で等電点マーカーも泳動しておくことができる。
本発明では、前記第1の電気泳動分離媒体の膨潤に、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する膨潤用溶液を用いる。すなわち膨潤用溶液は、水および水よりも極性が高い有機溶媒を含有する。
溶媒の極性は、誘電率測定などの方法により、測定することができる。
前記水よりも極性が高い有機溶媒の含有割合が上記の量以上であると、前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体の膨潤用溶液の膨潤時間を著しく短縮化できる。特に、ポリアクリルアミドゲルのIPGゲルの迅速な膨潤に好適である。
前記第1の電気泳動分離媒体を膨潤用溶液で膨潤させた後、該膨張した第1の電気泳動分離媒体の長手方向の両端から電流を流し、一次元目の分離を実施する。膨潤用溶液は、そのまま一次元目の泳動媒体として機能する。
温度制御方法は特に限定されないが、たとえば、ペルチェ素子を第1の電気泳動分離媒体の裏側、あるいは、第1の電気泳動分離媒体の結合する支持手段の裏側に設けることができる。
一次分離を実施した後、液状緩衝液を前記間隔に流し込み、該液状緩衝剤をゲル化することにより、第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とを該ゲルを介して接触させる。
液状緩衝剤に含まれるゲル化成分としては、たとえば、好ましくはアガロース、N−イソプロピルアクリルアミド、アクリルアミドなどが挙げられ、さらに好ましくはアガロースである。液状緩衝剤中のアガロースの含有割合は、好ましくは0.2〜0.4質量%、さらに好ましくは0.25〜0.35質量%である。
アガロースの含有量が上記範囲にあると、液状緩衝剤の流し込みを効率的に実施できるとともに、二次元目の電気泳動が精度よく実施できる範囲で、一次元目のゲルと二次元目のゲルとを接続させることができる。
また、アガロースの濃度が上記範囲にあると、サンプルの濃縮の程度を向上させることができる。
一次元目のゲルに展開された個々の成分は、上記のゲル化した液状緩衝剤を通って、1次元目のゲルから最も近い二次元目のゲルに移動し、分子量にしたがって展開される。このとき、通常、分子量マーカーを同じ条件で電気泳動しておく。
二次元目の電気泳動は、公知の方法と同様に実施すればよく、特に限定はない。二次元目の電気泳動は、たとえば、トリス−グリシン緩衝液、トリス−ホウ酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、トリス−トリシン緩衝液、トリス−リン酸二水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等のような一般にタンパク質などの電気泳動用緩衝液として使用される緩衝液を用いて行うことができる。前記緩衝液は、一般にタンパク質の緩衝液として使用される濃度で使用できる。
本発明に係る二次元電気泳動用キットは、ストリップ状の乾燥した第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔を置いて、一つの支持手段上に備えられ、前記支持手段には、乾燥した第1の電気泳動分離媒体の膨潤用に、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する膨潤用溶液の供給手段が備えられている。
このような二次元電気泳動用キットは、試料の汚染などの防止のため使い捨て可能なよう、低コストで簡便な構造となっている。
膨潤用溶液の供給手段は、前記支持手段に備えられており、これにより、簡便に膨潤用溶液を乾燥した第1の電気泳動分離媒体に添加することができる。
前記冷却手段としては、たとえば、ペルチェ素子などを用いることができる。この場合、冷却手段は、特に、前記第1の電気泳動分離媒体の冷却に用いるものであるため、前述のとおり、たとえばペルチェ素子を第1の電気泳動分離媒体の裏側、あるいは、第1の電気泳動分離媒体の結合する支持手段の裏側に設ければよく、支持手段全体に設ける必要はない。
該液状緩衝剤は、上述のとおり、たとえば、アガロースおよびマイナスイオンを含有していてもよく、またpHは好ましくは6〜8、さらに好ましくは6.8である。
液状緩衝剤の供給手段は、前記支持手段に備えられており、これにより、簡便に液状緩衝剤を前記間隔に流し込むことができる。
図1、2は、本発明に係る二次元電気泳動用キットの模式図およびその断面図の一例である。第1の電気泳動分離媒体1、および第2の電気泳動分離媒体2は、支持基板8上に隙間(ジャンクション部)9を有して備えられる。第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とは互いに平行な面で対面して配置されている。また、二次元目の電気泳動用バッファー槽3、4が設けられている。
これにより、一次元目の電気泳動に際し、通電に伴って、簡便に第1の電気泳動分離媒体1の冷却を簡便かつ効率よく実施できる。
また、支持手段8には、間隔9に注入する液状緩衝剤の供給手段が備えられていてもよい(図示せず)。該液状緩衝剤の供給手段は、緩衝剤を放出する液だめなどである。
このような膨潤用溶液の供給手段5、液状緩衝剤の供給手段が備えられていると、操作の自動化を図ることができ、迅速で正確な電気泳動を実施できる。特に、たとえば、前記前記第1の電気泳動分離媒体1の幅が数ミリ単位、あるいは前記間隔9も数ミリ単位となっても、正確にこれらの緩衝液の供給が可能となるという利点がある。
一次元目ゲルの膨潤時間の溶媒組成依存性
一次元目の乾燥ゲルとして、ポリアクリルアミド乾燥pH勾配固定化ゲル(インビトロジェン社製、厚さ0.02mm×短手方向の幅0.8mm×長手方向の長さ52mm)を用いた。添加する溶媒として蒸留水とギ酸の2液の混合溶媒で、ギ酸の割合を0%、5%、10%、20%、40%、100%(ギ酸の体積/水溶液全体の体積×100(体積%))に変えた溶液を用いた。ギ酸の極性は比誘電率として58であり、水の比誘電率である40よりも大きい。
上記混合溶媒を添加してゲルの膨潤に要する時間を測定した。
測定は、測長顕微鏡(総合倍率500倍)を用い、目視にてゲルの高さが0.5mmになるまでの時間を計測した。
一次元目ゲルの膨潤時間の溶媒組成依存性
実施例1においてギ酸の代わりにメタノールを用い、実施例1と同様にしてゲルの膨潤時間を測定した。メタノールの極性は比誘電率として32であり、水の極性よりも小さい。
〔実施例2〕
ゲル1の長手方向の横は、支持基板の壁と接することが無いよう空間でさえぎられ、ゲル1とゲル2とは互いに接触しない用に配置され、ゲル1とゲル2とは互いに電気的に絶縁されている。
〔実施例3〕
サンプルとして、ウシ血清アルブミン(シグマ社製)と馬心臓由来ミオグロビン(シグマ社製)の混合物を用いた。図2に示すようなゲル1として実施例1と同様のポリアクリルアミドゲルを用い、上記のサンプルを実施例2と同様の方法でゲル内に注入した(図6A)。
ゲル2として実施例2と同様のポリアクリルアミドゲルを用い、これらのゲルの溝9に、95℃で加温し液状化した125mMトリス塩酸緩衝溶液(pH 6.8)、0.25%アガロース混合液を基板に備え付けの液だめから注入した。5分以内でアガロースはゲル化した。つぎに緩衝溶液槽3、4に二次元目の電気泳動用の緩衝溶液(0.19Mグリシン、SDS、25mMトリスアミノメタンを含む)を注入し、陰極として一次元目のゲルに近い緩衝溶液槽3に、陽極として二次元目のゲルに近い緩衝溶液槽4に電極7を接触させ、二次元目の電気泳動を行った(定電圧200V、約15分間)。
図6Cは、二次元目電気泳動においてサンプルが一次元目のポリアクリルアミドゲルから二次元目のポリアクリルアミドゲルに移動したゲルの像である。
〔実施例4〕
実施例2で示したのと同様の方法で一次元目ゲルへのサンプル注入と等電点電気泳動を行った。さらに、その後、実施例3と同様の方法で一次元目ゲルと二次元目ゲルを接続し、二次元目の電気泳動を行った。図7に一次元目の電気泳動に続いて行った二次元目の電気泳動後にサンプルが分離された二次元目ポリアクリルアミドゲルの像を示す。
2 第2の電気泳動分離媒体
3 緩衝溶液槽
4 緩衝溶液槽
5 膨潤用溶液の供給手段
6 電極
7 電極
8 支持基板
9 間隔(ジャンクション部)
Claims (12)
- (1)ストリップ状の乾燥した第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて、一つの支持基板上に担持された二次元電気泳動基板を提供する工程、
(2)前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体に、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する膨潤用溶液を添加して、前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体を飽和状態まで膨潤させるとともに、前記第1の電気泳動分離媒体にサンプルを含浸させる工程、
(3)前記第1の電気泳動分離媒体を冷却しながら、該第1の電気泳動分離媒体に電場を与えて、前記サンプル中の成分を一次分離する工程、
(4)一次分離を実施した後、液状緩衝剤を前記間隔に流し、さらに該液状緩衝剤をゲル化する工程、および
(5)前記第1の電気泳動分離媒体および第2の電気泳動分離媒体の双方に、前記第1の電気泳動分離媒体の長手方向に対して実質的に垂直方向に電場を与え、前記第2の電気泳動分離媒体において、前記一次分離された成分を二次分離する工程
を含み、前記第1の電気泳動分離媒体がポリアクリルアミドゲルであり、前記第2の電気泳動分離媒体がポリアクリルアミドゲルであり、前記水よりも極性が高い有機溶媒がギ酸である、二次元電気泳動方法。 - 前記工程(2)において、膨潤用溶液中の水よりも極性が高い有機溶媒の含有量が、5体積%(有機溶媒の体積/水溶液全体の体積×100(%))以上である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(3)において、第1の電気泳動分離媒体の温度が、電場が供給されている間0〜20℃である、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(3)において、電場の供給開始直後から、単位体積あたりの電力量を1〜120mW/mm3の範囲にして電場の供給を行う、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(4)で用いる液状緩衝剤が、アガロースを含有する、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記液状緩衝剤が、pH6.8であり、さらにマイナスイオンを含有する、請求項5に記載の方法。
- 前記工程(1)において、前記第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体との間の間隔が、気体により隔てられている、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- ストリップ状の乾燥した第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔を置いて、一つの支持手段上に備えられ、
前記支持手段には、乾燥した第1の電気泳動分離媒体の膨潤用に、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する膨潤用溶液の供給手段が備えられ、
前記第1の電気泳動分離媒体がポリアクリルアミドゲルであり、前記第2の電気泳動分離媒体がポリアクリルアミドゲルであり、前記水よりも極性が高い有機溶媒がギ酸である、二次元電気泳動用キット。 - 前記支持手段に、さらに冷却手段が前記第1の電気泳動分離媒体の冷却を可能とするように備えられている、請求項8に記載のキット。
- 前記支持手段が、さらに、サンプルの一次分離後に前記間隔に流し込むための、液状緩衝剤の供給手段を有している、請求項8または9に記載のキット。
- 前記冷却手段が、ペルチェ素子である、請求項9に記載のキット。
- 前記液状緩衝剤が、アガロースおよびマイナスイオンを含有し、pHが6.8である、請求項10に記載のキット。
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