JPS58193446A - 簡易２次元電気泳動法 - Google Patents
簡易２次元電気泳動法Info
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- JPS58193446A JPS58193446A JP57075270A JP7527082A JPS58193446A JP S58193446 A JPS58193446 A JP S58193446A JP 57075270 A JP57075270 A JP 57075270A JP 7527082 A JP7527082 A JP 7527082A JP S58193446 A JPS58193446 A JP S58193446A
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- Japan
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- dimensional
- gel
- dimensional electrophoresis
- electrophoresis
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、臨床検査を目的とした血液などの体液の分析
法にかかわり、特に、体液中に含まれる諸種蛋白質の多
成分同時分析に好適な２次元電気泳動分析法に関するも
のである。
法にかかわり、特に、体液中に含まれる諸種蛋白質の多
成分同時分析に好適な２次元電気泳動分析法に関するも
のである。
従来、血液蛋白質の多成分同時分析法として用いられて
いるポリアクリルアミ゛ドゲルを支持体とする２次元電
気泳動法（詳Ｉｗｌｌは例えば「蛋白質・核酸・酵素」
、共立出版、１９７８年９月号２１１頁参照）において
は、まず、１次元目の泳動はガラス管内に充填さｎ＋ポ
リアクリルアミドを、また２次元目はガラス板あるいは
アクリル板とスペーサから構成される容器内にアクリル
アミドの濃度勾配を形成させたのち重合させた平板ゲル
を支持体として用いている。１次元目のゲルにはあらか
じめ多種類のポリアミノカルボン酸あるいはポリアミノ
スルフォン酸等から成る両性担体（たとえばＬＫＢ社製
アンフオライン、Ｂｉｏ Ｒａｄ ｌｌｉバイオライト
等）が含まれており、陽極（酸性液）、陰極（アルカリ
液）両極間に電圧をかけ泳動が進むにしたがってゲル内
にｐＨ勾配が形成される。
いるポリアクリルアミ゛ドゲルを支持体とする２次元電
気泳動法（詳Ｉｗｌｌは例えば「蛋白質・核酸・酵素」
、共立出版、１９７８年９月号２１１頁参照）において
は、まず、１次元目の泳動はガラス管内に充填さｎ＋ポ
リアクリルアミドを、また２次元目はガラス板あるいは
アクリル板とスペーサから構成される容器内にアクリル
アミドの濃度勾配を形成させたのち重合させた平板ゲル
を支持体として用いている。１次元目のゲルにはあらか
じめ多種類のポリアミノカルボン酸あるいはポリアミノ
スルフォン酸等から成る両性担体（たとえばＬＫＢ社製
アンフオライン、Ｂｉｏ Ｒａｄ ｌｌｉバイオライト
等）が含まれており、陽極（酸性液）、陰極（アルカリ
液）両極間に電圧をかけ泳動が進むにしたがってゲル内
にｐＨ勾配が形成される。
ゲル上に充填し几試料蛋白は泳動過程で個有の等電点位
置に分離濃縮嘔れてくる。定常状態になった時点でこの
ゲルをガラス管から押し出し２次元用平板ゲルの上部に
水平にのせ、緩衝液（たとえばトリス−グリシンｐＨ１
３，６）を満した両極間に電場をかけ、１次元目で分離
した成分をさらに分子量差により分離を行なう。泳動終
了後容器を解体して平板ゲルを取り出し、蛋白染色液に
浸漬、放置後バックグラウンドの脱染を行ない、残存し
ている染色蛋白質スポットの吸光度を測定する。
置に分離濃縮嘔れてくる。定常状態になった時点でこの
ゲルをガラス管から押し出し２次元用平板ゲルの上部に
水平にのせ、緩衝液（たとえばトリス−グリシンｐＨ１
３，６）を満した両極間に電場をかけ、１次元目で分離
した成分をさらに分子量差により分離を行なう。泳動終
了後容器を解体して平板ゲルを取り出し、蛋白染色液に
浸漬、放置後バックグラウンドの脱染を行ない、残存し
ている染色蛋白質スポットの吸光度を測定する。
しかしながら、１次元目に用いる細長いゲルは柔らかく
、ガラス管から押し出し平板ゲルの一端にすきまなく密
着させる操作を機械的方法で行なうことは困難である。
、ガラス管から押し出し平板ゲルの一端にすきまなく密
着させる操作を機械的方法で行なうことは困難である。
また、２次元泳動後の柔らかい平板ゲルを容器から取り
出し、染色、脱染。
出し、染色、脱染。
吸光度測定など一連の操作をすると、ゲルの破損などの
問題が生ずる。
問題が生ずる。
本発明の目的は、上記従来法の欠点を改良し次操作性の
良い簡易な２次元電気泳動法を提供することにある。
良い簡易な２次元電気泳動法を提供することにある。
本発明は１次元目と２次元目の泳動分離に用いる支持体
を機械的強度の高い基板の上に隣接して結合させ、この
基板１枚で２次元泳動分ＩＩＭを行なうものでめる。支
持体を固定する基板（たとえばガラス、ポリエステルな
ど）は表面を清浄に保ったのちアルカリ処理（７’（と
えば６ＮＮａＯＨ１＃液中に浸漬、水洗、乾燥）で表面
を活性化してお龜、これにシランカプリング剤で表面処
理を施こす。
を機械的強度の高い基板の上に隣接して結合させ、この
基板１枚で２次元泳動分ＩＩＭを行なうものでめる。支
持体を固定する基板（たとえばガラス、ポリエステルな
ど）は表面を清浄に保ったのちアルカリ処理（７’（と
えば６ＮＮａＯＨ１＃液中に浸漬、水洗、乾燥）で表面
を活性化してお龜、これにシランカプリング剤で表面処
理を施こす。
ここで用いるシラ／カプリング剤（Ｒ８ｉＸ、）、Ｒは
たとえばビニル基、メルカプトグロビル基、メタクリル
オキシグロビル基、グリシドオキシプロピル基などの有
機残基、Ｘはエトキシ、メトキシ、アセトキシなどに代
表さｎる有機残基から成る化合物で、基板上の水酸基と
Ｘ基の間で脱水縮合が起り、他方Ｒとアクリルアミド不
飽和二重結合との間で結合が起ることによりアクリルア
ミドを基板に固定化させるものである。
たとえばビニル基、メルカプトグロビル基、メタクリル
オキシグロビル基、グリシドオキシプロピル基などの有
機残基、Ｘはエトキシ、メトキシ、アセトキシなどに代
表さｎる有機残基から成る化合物で、基板上の水酸基と
Ｘ基の間で脱水縮合が起り、他方Ｒとアクリルアミド不
飽和二重結合との間で結合が起ることによりアクリルア
ミドを基板に固定化させるものである。
本発明は、この基板上に濃度勾配アクリルアミドゲルを
結合固定させ、さらにこの低濃度端に一定の間隔を置い
て１次元泳動用の均一濃度のゲルを同じく結合固定させ
ておき、１次元目の電気泳動分離が終了した時点で上記
２種類のゲル間の溝にアガロース（寒天）を主体とし、
こｎに緩衝液等の電解質を含浸させたバインダーを充填
することにより両者を一体化し、２次元展開を可能にし
たものでるる。
結合固定させ、さらにこの低濃度端に一定の間隔を置い
て１次元泳動用の均一濃度のゲルを同じく結合固定させ
ておき、１次元目の電気泳動分離が終了した時点で上記
２種類のゲル間の溝にアガロース（寒天）を主体とし、
こｎに緩衝液等の電解質を含浸させたバインダーを充填
することにより両者を一体化し、２次元展開を可能にし
たものでるる。
上記バインダー材料に要求さｎる条件は、（１）蛋白質
等の試料を吸着捕獲しないもの、０）目づまり
□などして蛋白質の移動を妨げないもの、（３）アクリ
ルアミドゲルとの密着性がよいもの、（４）帯電して電
気泳動効果に影響を及はさないものなどである。
等の試料を吸着捕獲しないもの、０）目づまり
□などして蛋白質の移動を妨げないもの、（３）アクリ
ルアミドゲルとの密着性がよいもの、（４）帯電して電
気泳動効果に影響を及はさないものなどである。
例えば、アガロース、Ｆ紙などを用いることかできる。
以下、本発明を実施例を用いて説明する。
実施例１
第１図を用いて実施例を説明する。ガラス板１の片面を
メタアクリルオキシプロピルトリメトキシシランで処理
し、ガラス板上１０ｃ１１１四方にアクリルアミドの濃
度勾配４〜２０％を有し、かつ、キ ０、０５ Ｍ （ｍｏｔ／ｌ ） Ｏトリスヒドロメジ
メチルアミノメタンおよび０．３８ Ｍのグリシン水溶
液（以下Ａ液と云う）を含むポリアクリルアミドゲル３
（５０ｘ５０Ｘ２ｍｇ）を結合する。次に、このガラ
ス板上にさらにポリアクリルアミド濃度４％を含みかつ
２％の両性電解質、アンフオライン（スウェーデン、Ｌ
ＫＢ社製、 ｐＨ３，５〜９．５）を含むゲル２ （５
０Ｘ８Ｘ２■）を２ｍの間［４を隔てて濃度勾配ゲルの
低濃度（４％）端に作成する。（以上第１図（ａ） ）
、次に試料でるる血清８μｔを５の試料孔に注入し、ゲ
ルの両端はそれぞれ０．０４ＭＮ！ＩＯＨ水溶液（陽極
槽７）、０．０１ＭＨ，ＰＯ，水溶液（陽極槽９）にＰ
紙６．８を介して液絡したのち、通電し、血清蛋白質を
その等電点差により分離する。（以上、第１図（ｂ））
。
メタアクリルオキシプロピルトリメトキシシランで処理
し、ガラス板上１０ｃ１１１四方にアクリルアミドの濃
度勾配４〜２０％を有し、かつ、キ ０、０５ Ｍ （ｍｏｔ／ｌ ） Ｏトリスヒドロメジ
メチルアミノメタンおよび０．３８ Ｍのグリシン水溶
液（以下Ａ液と云う）を含むポリアクリルアミドゲル３
（５０ｘ５０Ｘ２ｍｇ）を結合する。次に、このガラ
ス板上にさらにポリアクリルアミド濃度４％を含みかつ
２％の両性電解質、アンフオライン（スウェーデン、Ｌ
ＫＢ社製、 ｐＨ３，５〜９．５）を含むゲル２ （５
０Ｘ８Ｘ２■）を２ｍの間［４を隔てて濃度勾配ゲルの
低濃度（４％）端に作成する。（以上第１図（ａ） ）
、次に試料でるる血清８μｔを５の試料孔に注入し、ゲ
ルの両端はそれぞれ０．０４ＭＮ！ＩＯＨ水溶液（陽極
槽７）、０．０１ＭＨ，ＰＯ，水溶液（陽極槽９）にＰ
紙６．８を介して液絡したのち、通電し、血清蛋白質を
その等電点差により分離する。（以上、第１図（ｂ））
。
１次元電気泳動終了後直ちにこの液絡用戸紙を取り除き
、そｎと同時に２種類のゲルの間隙に泳動用アガロース
粉末の加圧成型体１４（たとえば０゜１ｇのアガロース
をｉ、 ｓ ｘ ｓ ｏ■のダイスにつめ、２ｔ／ｃｍ
”で加圧成型した本の）を挿入し、Ａ液を含浸させる。
、そｎと同時に２種類のゲルの間隙に泳動用アガロース
粉末の加圧成型体１４（たとえば０゜１ｇのアガロース
をｉ、 ｓ ｘ ｓ ｏ■のダイスにつめ、２ｔ／ｃｍ
”で加圧成型した本の）を挿入し、Ａ液を含浸させる。
次にＡ液を含浸した液絡用Ｆ紙１０をゲル２に接触させ
て直き、これを負電極槽１１に接続する。同様にＡ液を
含浸させた液絡用ｐ紙１２を濃度勾配用ゲル３の高濃度
端に置き、これを正電極槽１３に接続し、両電極間に通
電して成分蛋白質をその分子量差に基づいてゲル３の内
部に分離する。（以上、第１図（Ｃ））。なお泳動分離
の過程でガラス基板１は水平位置に保持しておく。
て直き、これを負電極槽１１に接続する。同様にＡ液を
含浸させた液絡用ｐ紙１２を濃度勾配用ゲル３の高濃度
端に置き、これを正電極槽１３に接続し、両電極間に通
電して成分蛋白質をその分子量差に基づいてゲル３の内
部に分離する。（以上、第１図（Ｃ））。なお泳動分離
の過程でガラス基板１は水平位置に保持しておく。
実施例２
構成は実施例１と同様であるが、１次元泳動用支持体と
してアガロースゲルを用い、２種類のゲルの間隙の充愼
剤としてもアガロースゲルを用いるものである。１次元
泳動用支持体はアガロース粉末（例えばマリンコロイド
社、 ５ｅａｐｌａｑｕａ ）１％を含みかつ２％の両
性電解質アンフオラインを含む溶液をゲル化したものを
用いる。作成に当っては表面処理を施したガラスま念は
ポリエステルからなる基板（６０Ｘ７０Ｘ１．５■）上
にまずアクリルアミド４〜２０％の濃度勾配平板ゲル（
５０Ｘ５０Ｘ１ｍｍ）を結合させ、この低濃度側に１．
５■の間隔を置いて帯状に等電点泳動用アガロースゲル
（１０Ｘ５０Ｘ１■）を結合させる。
してアガロースゲルを用い、２種類のゲルの間隙の充愼
剤としてもアガロースゲルを用いるものである。１次元
泳動用支持体はアガロース粉末（例えばマリンコロイド
社、 ５ｅａｐｌａｑｕａ ）１％を含みかつ２％の両
性電解質アンフオラインを含む溶液をゲル化したものを
用いる。作成に当っては表面処理を施したガラスま念は
ポリエステルからなる基板（６０Ｘ７０Ｘ１．５■）上
にまずアクリルアミド４〜２０％の濃度勾配平板ゲル（
５０Ｘ５０Ｘ１ｍｍ）を結合させ、この低濃度側に１．
５■の間隔を置いて帯状に等電点泳動用アガロースゲル
（１０Ｘ５０Ｘ１■）を結合させる。
実施例１と同様の方法で１次元泳動終了後直ちに２遣類
のゲルの間隙４にアガロース溶解液（１％低融点アガロ
ースー念とえばマリンコロイド社製５ｅａｐｌａｑｕｅ
、 ０．０５ Ｍ トリスヒドロキシメチルアミノ
メタンおよび０．３８Ｍグリシン水溶液）を流し込み、
充分ゲル化するのを待って冷却を充分に行ないながら２
次元目の泳動分離に切りかえる。
のゲルの間隙４にアガロース溶解液（１％低融点アガロ
ースー念とえばマリンコロイド社製５ｅａｐｌａｑｕｅ
、 ０．０５ Ｍ トリスヒドロキシメチルアミノ
メタンおよび０．３８Ｍグリシン水溶液）を流し込み、
充分ゲル化するのを待って冷却を充分に行ないながら２
次元目の泳動分離に切りかえる。
以上本発明によｎば、１次元目と２次元目の２つの機械
的強度の低いゲル状支持体を直接取扱う必要がなくなり
、固い基板ごとゲルを取扱えるため泳動分離操作は大巾
に簡略化され、得られる２次元電気泳動ず象は分離能、
再現性基従来法に比し同等あるいはそれ以上である。
的強度の低いゲル状支持体を直接取扱う必要がなくなり
、固い基板ごとゲルを取扱えるため泳動分離操作は大巾
に簡略化され、得られる２次元電気泳動ず象は分離能、
再現性基従来法に比し同等あるいはそれ以上である。
第１図ａ、ｂ、ｃは本発明の方法を実施するための泳動
装置の平面図である。 １・・・基板、２・・・１次元目の泳動用支持体ｚ３・
・・２次元目の泳動用支持体、４・・・隙間、５・・・
分析試料添加用スペース、６・・・液絡、７・・・負電
極槽、８・・・液絡、９・・・正電極槽、１０・・・液
絡、１１・・・負電極槽、１２・・・液絡、１３・・・
正電極槽、１４・・・間隙充葛 （Ｌ （Ｃ −一〒律 −〕１４
装置の平面図である。 １・・・基板、２・・・１次元目の泳動用支持体ｚ３・
・・２次元目の泳動用支持体、４・・・隙間、５・・・
分析試料添加用スペース、６・・・液絡、７・・・負電
極槽、８・・・液絡、９・・・正電極槽、１０・・・液
絡、１１・・・負電極槽、１２・・・液絡、１３・・・
正電極槽、１４・・・間隙充葛 （Ｌ （Ｃ −一〒律 −〕１４
Claims (1)
- １、同一基板上に２種類の電気泳動用支持体を一定間隔
を置いて固定化し、１次元電気泳動終了後、両者の間隙
に電解液を含有するバインダーを充填することによって
２種の支持体を一体化し、２次元目の泳動を行なうこと
を特徴とする２次元電気泳動法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57075270A JPS58193446A (ja) | 1982-05-07 | 1982-05-07 | 簡易２次元電気泳動法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57075270A JPS58193446A (ja) | 1982-05-07 | 1982-05-07 | 簡易２次元電気泳動法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58193446A true JPS58193446A (ja) | 1983-11-11 |
Family
ID=13571363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57075270A Pending JPS58193446A (ja) | 1982-05-07 | 1982-05-07 | 簡易２次元電気泳動法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58193446A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61288148A (ja) * | 1985-06-14 | 1986-12-18 | Shimadzu Corp | 二次元電気泳動方法 |
| US4874490A (en) * | 1988-11-04 | 1989-10-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pre-cast gel systems for two-dimensional electrophoresis |
| US4966667A (en) * | 1989-04-18 | 1990-10-30 | Millipore Corporation | Gel transfer process and composite |
| JP2006162405A (ja) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 二次元電気泳動方法 |
| JP2006242802A (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 二次元電気泳動方法 |
| WO2007114632A1 (en) * | 2006-04-03 | 2007-10-11 | Jong Tae Park | Electrophorsis device having collecting well for dna purification |
| EP2159573A1 (en) * | 2008-08-28 | 2010-03-03 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | 2D electrophoresis device and method of manufacturing |
| US8221604B2 (en) | 2002-10-28 | 2012-07-17 | Katayanagi Institute | Method for controlling substance transfer |
-
1982
- 1982-05-07 JP JP57075270A patent/JPS58193446A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61288148A (ja) * | 1985-06-14 | 1986-12-18 | Shimadzu Corp | 二次元電気泳動方法 |
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| EP0366897A2 (en) * | 1988-11-04 | 1990-05-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pre-cast gel systems for two-dimensional electrophoresis |
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