JP2665992B2 - 分離されたタンパク質類またはｄｎａ／ｒｎａなどの荷電巨大分子類を含有するゲルの電気溶出法およびこれに用いる装置と手段 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、分離されたタンパク質類またはDNA/RNAな
どの荷電巨大分子類を含有するゲルの新規な電気溶出
法、及びこの方法に用いる装置と手段に関する。

背景技術 大きさおよび／または荷電量が異なるタンパク質類ま
たはDNA/RNAの分離には、ゲル電気泳動が広く用いられ
ている。これらの化合物は、泳動距離が異なっているの
で、ゲルを染色させたり、あるいは抗原−抗体実験用の
膜に移行させたり、または他の親和力の相互作用によっ
て研究されている。しかしながら、従来から一般に、個
々のタンパク質バンドを回収するには、ゲルを、単一の
バンドを含有するセグメントに分割し、電気溶出または
単純分散のいずれかでこのセグメントを均質化して溶出
するという、困難で時間がかかる方法を取っていた。し
かも、この方法は、非能率的であり、ごく希薄な生成物
しか得ることができないことが多い。EP公開公報第0,36
1,062号公報には、荷電され極性化された巨大分子を電
気泳動で分離し、精製し、濃縮する方法が開示されてい
る。この方法は、支持媒体として皿状または棒状のゲル
を含む分離カラム中で巨大分子を分離する工程と、支持
媒体から分離された巨大分子を電気泳動電流を用いて移
動させる工程と、分離された巨大分子を分子検出器に供
給する工程と、分離された巨大分子を分子検出器から分
配器に供給する工程と、分離された巨大分子を多電極補
集器中に補集する工程とからなり、該補集器の電極の各
々は、分子検出器からの信号によって個々に活性化され
る。この方法は、分子検出器と、分離された巨大分子を
逐次補集する多電極補集器とからなる複雑なシステムを
必要とする。

アメリカ合衆国特許第3,956,099号明細書には、電気
泳動操作中に成分を個々の部屋に分離する、連続作業に
好適な複合システムが開示されている。しかしながら、
この方法は、従来のゲル中で読め巨大分子を分離してか
ら溶出するのではなく、タンパク質類の大規模な精製用
の分離装置を用いている。

アメリカ合衆国特許第4,049,534号、第4,725,348号お
よび第4,747,918号明細書では、単一の成分を含有する
小さなゲルフラグメントの電気溶出に適している方法と
成分とが開示されている。この方法では、所望の分子を
局在化して切除するという、時間がかかり、正確度にも
問題がある操作を行わなくてはならない。したがって、
ゲル中で分離された全ての成分を同時に検討するには適
当な方法ではない。

ヨーロッパ公開特許第0 380 313号明細書には、特に
高分子量化合物の移動に適している電界反転電気吸収転
移（field inversion electroblotiing）と溶出装置が
開示されている。この方法でも、予め所望のバンドを同
定しておかなければならないので、上記アメリカ合衆国
特許第4,049,534号、第4,725,348号および第4,747,918
号明細書で開示されている方法と同じ様な限界がある。

アメリカ合衆国特許第4,181,594号明細書には、スラ
ブゲルに含まれている化合物が上方の複数のウェルに直
接に電気溶出されるマトリックス回収装置が開示されて
いる。各化合物は、かなりの厚さを持つ壁体で隔てられ
ている数個のウェルに溶出する。壁体の厚さのために移
動にむらが出たり、非効率的となる可能性がある。ウェ
ルには異なるタンパク質指示薬が充填されている。この
装置には透析膜がないので、得られる生成物にはゲルか
らの塩と界面活性剤（detergents）が含まれている。

ブロットエルーター（登録商標）装置（Blotelutor a
pparatus manufactured by Biometra,Gottinget,German
y）は、二次元ゲルからタンパク質類を溶出する専用装
置である。タンパク質類はかなりの厚さを持つ壁体で隔
てられているウェルに溶出する。この場合も壁体の厚さ
のために移動にむらが出る可能性がある。さらに、この
装置の方法では、生理緩衝液を使わないし、また前処置
として平衡化を行って、溶出中にゲルの位置を確実に固
定する工程がない。

これら従来のシステム何れを取ってみても一つとし
て、一次元ゲル中で全ての化合物を分離して同時に溶出
する従来の要求を満たしているものはない。これらの特
色を持つシステムがあれば、タンパク質/DNAの複合混合
物を生物学的化学的にスクリーニングする方法を大きく
発展させることであろう。

発明の要旨 本発明の目的は、一次元ゲル中に含まれるDNA/RNAの
ような分離された荷電巨大分子の同時溶出法、及び該溶
出法の実施に際し用いられる装置と手段を提供すること
にある。

本発明の方法では、請求項１に記載されたように、分
離されたタンパク質類などの荷電巨大分子を、ポリアク
リルアミドまたはアガロースゲルなどのゲル全体中で同
時に溶出することができる。このようにすることによ
り、分離さた荷電巨大分子は単一の化合物、あるいは位
置が近い複数の化合物を含む狭い範囲のフラグメントに
分割され、同時に共在しているドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）の大部分が取り除かれる。

本発明において、ゲル全体をひとまとめにして溶出す
ることは新規である。前述してきたところからみると、
従来法では一般に、電気泳動完了時にゲルマトリックス
を直接切断することが基本となっている。均質化の後、
材料を電気溶出装置に移動させる。前述のように、特に
ゲルの全タンパク質分をひとまとめにして（代表的に
は、フラクション20−30個）同時にスクリーニングする
ことが望ましい場合には、このような方法は非常に困難
であり、時間が掛かりすぎる。

本発明はさらに、本発明の方法を用いてゲル全体中で
全ての化合物を分離して同時に溶出するのに用いられ
る、請求項９に記載されたような装置を提供する。この
装置は、非常に効率よく通常のゲル（厚さ0.5−1mm）を
溶出するが、たいへん厚い（３−4mm）ゲルの溶出にも
適している。

以下、図面により本発明の方法と装置を説明する。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の複数の室を持つ電気溶出装置の概略
図である。

図２は、本発明の方法により図１に示す装置から溶出
されたゲルの写真である。

図３は、図１に示す電気溶出装置によるタンパク質類
複合混合物の分画を示す写真である。

図４は、複数の室を持つ電気溶出装置から溶出された
フラクションに対する細胞の反応を示すグラフである。

図５は、複数の室を持つ電気溶出装置から溶出したフ
ラクションは毒性がないことを示すグラフである。

実施形態の詳細な説明 図１は装置の断面を示している。この電気溶出装置全
体は、黒鉛電極とその端子を除いて、界面活性剤に対す
る抵抗性を持つプラスチックで出来ている。

装置は黒鉛陽極（４）を含む支持体（１）と、緩衝液
を充填しているスポンジ（５）とからなっている。支持
体（１）には溜めがあって、フレーム（２）搭載時にス
ポンジが押されて出てくる過剰の緩衝液を受け取ってい
る。スポンジの上には透析膜などの半透過膜があり、フ
レームは指で回すネジにより支持体に強く接続されてい
る。透析膜は任意により、例えば糊付けなどによりスポ
ンジに固定しても良く。黒鉛陰極（３）は安全カバー
（８）に埋め込む。

フレームには台形の複数の室（７）が平行に並んでお
り、室の表面が下方の透析膜（６）の表面と密接に接触
することにより室が密閉されている。台形の複数の室
（７）は、第一の開かれた側（71）と、該第一の開かれ
た側（71）に対向し、かつ、それよれも短い第二の開か
れた側（72）と、互いに対向する二つの閉じられた側
（73,74）とからなる。

室各々の容量は15ml以下、好ましくは約3mlである。

フレームには窪みがあって、ここにゲル（９）を入れ
る。緩衝液で濡らした濾紙（10）を、ゲル（９）と黒鉛
陰極（３）との間に挟むのが好ましい。

装置の部品の一つに、窪みの大きさに合わせてゲルを
正確に削り落とす鋳型がある。

鋳型は、透明なアクリル系プラスチック製であり、各
々のウェルの位置が明示されている。鋳型にはさらに、
切除する前に鋳型の位置を正確に決めるための調整線が
書き込まれている。

ボルト電位は約40ボルトを印加する。電源もこのボル
トを印加できるような調整機能をもっていなくてはなら
ない。電源は電線（各々11および12）によって陰極
（３）と陽極（４）に接続する。電源は、安全カバー
（８）に埋め込んでも良い。

溶出完了までに要する時間は一般に、0.75mmのゲルに
対しては８分から15分である。溶出が終わったら10秒間
電流の方向を反転させて、膜に付いている物質をはがれ
易くする。得られた生成物は、装置側面の採取口からプ
ラスチックピペットで採取する。

電気溶出法は、先ず前処置として、分離されている分
子を含有するゲルを緩衝液中で、好ましくは約30−40分
間、平衡化することにより開始する。例えば、生成物を
細胞分析に使用する場合に好ましい緩衝液は、低いイオ
ン強度の生理緩衝液、さらに好ましくは2mMリン酸塩緩
衝液（pH＝6.5）である。平衡化させている間に、ゲル
は膨張して最大限にまで大きくなり、したがって溶出の
間中、ゲルの位置を確実に固定することが出来る。緩衝
液は三回取り替えて、ゲルから余剰の塩とイオン性界面
活性剤（ionic detergents）を確実に取り除く。ゲルを
緩衝液から取り去り、清潔なガラス板上に載せ、溶出す
る部分を鋳型により切除する。好ましい使用法として
は、予め染色した分子量マーカーでゲルの周辺部に線を
画く。鋳型の調整線をマーカーに合わせることによっ
て、ゲルの正確な位置を決めることができるし、また再
現性よく切除することもできる。ゲルのバンドと溶出室
とを平行させることが重要であるが、この方法によりこ
れを確実に行うことができる。

装置支持体のスポンジには緩衝液を充填する。緩衝液
に浸した透析膜をスポンジの上に置き、フレームを指回
しネジで搭載する。スポンジは膜の支持体として機能
し、スポンジを押圧すると各室が密閉される。室には緩
衝液を充填し、鋳型を用いてゲルをフレームの窪みに移
動させる。ゲルの大きさに合わせた厚い濾紙二枚を緩衝
液に浸して、ゲルの上におく。黒鉛陰極を搭載し、好ま
しくは約40ボルトのボルト電位を印加する。溶出中に荷
電分子は、ゲルから室に充填してある緩衝液に移動す
る。台形の室を隔てている壁の上部は鋭角に尖ってい
て、至適の移動を妨げる表面をできる限り少なくしてい
る。イオン性界面活性剤（SDS）は、透析膜を通過して
陽極の方向に移動した後、緩衝液中で効果的に除去され
る。溶出完了に要する時間は、実験対象化合物と使用さ
れているマトリックスによって異なるが、好ましくは８
分から16分である。溶出が終わったら短時間、好ましく
は約10秒間電流の方向を反転させて、膜に付いている分
子をはがれ易くする。溶出後フレーム側面の開口部にピ
ペットを当てて、生成物を吸い取って回収する。生成物
を採取した後、装置を解体し、ゲルにタンパク質/DNA用
の染色を施して、移動の完了を確認する。全てのフラク
ションに充分な量のPBS×10を添加して等張としてか
ら、生成物を細胞分析に使用する。

本発明の第二の実施態様は、この装置を使用して、電
気溶出と電気吸収転移を同時に実施することである。こ
の実施態様では、適当な膜一枚を装置の片側に挿入し、
全ての室の変化する部分を覆う。こうすることにより、
分子は溶液中に移動し、膜に同時に吸収転移する。好ま
しい形態では、分離されているタンパク質混合物に対す
るＴ細胞の反応性と抗体反応は、同時に、簡単でしかも
正確に分析することができる。

本発明の第三の実施態様は、単一の化合物を精製する
簡単にして迅速な方法である。この方法は、ゲル細片ま
たは分離されている物質を含む電気吸収転移された膜を
除去する工程、および染色、または特定のプローブを用
いて反応させることにより、所望の化合物を局在化する
工程からなっている。好ましい一実施例においては、前
記のプローブはモノクローナル抗体である。各溶出室
は、鋭角的に尖らせた室壁からの影響によって、膜上に
示される。ゲル片を染色する場合、溶出する室の局在化
を示す多数の２−3mmの穴が開く。溶出する室の各々を
正確にマークする鋳型により、正確な穴明けを容易に実
施することができる。これらの試料により対象化合物を
含む室を正確に同定することができる。

図２に見られる通り、本発明の方法と装置によりゲル
の全ての部分を効果的に溶出することができる。ゲルは
ＡとＢの二つの部分には分割されている。

ゲルのＡ部分は、溶出前に取り出されて、タンパク質
用に染色されたものである。

溶出ゲル（Ｂ部分）は、溶出工程終了後、移動の完了
を確認するためにタンパク質用染色を行ったものであ
る。

ゲル中に、室壁端の位置を示す細く淡い線と、ゲル底
部にぼんやりとした二つの部分が見える。これら二つの
所見により、次の二つの重要事項が強調されている。

1:室壁を鋭角的に尖らせると、至適移動を妨げる表面が
可能な限り少なくなる。

2:ゲル底部の空気泡は、タンパク質の移動に干渉する。

図３の写真は、タンパク質類の複合混合物の分画を示
している。

ヒト結核菌培養物の濾液を10−20％SDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（10−20％SDS−PAGE）により分離
し、本発明の複数の室を持つ電気溶出装置で分画したも
のである。濾液と得られたフラクションを、SDS−PAGE
と銀染色（silver staining）により分析した。

レーンＦはヒト結核菌の濾液である。

レーン１〜18はフラクション１〜18である。

図４は、ヒト結核菌を感染させたマウスから採取した
脾臓リンパ細胞の増殖反応を示している。ヒト結核菌培
養物濾液のフラクションを1:5で希釈したもので刺激し
た培養基で細胞を増殖した。元のままの濾液に対する増
殖反応は18600cpmであり、刺激しない細胞の反応は500c
pmであった。増殖の測定は、増殖細胞のDNAに³Hチミジ
ンを組み入れたものを液体シンチレーション計数によっ
て測定した。

図５から、本発明の複数の室を持つ電気溶出装置によ
り得たフラクションは毒性がないことが窺える。

複数の室を持つ電気溶出装置のフラクションに低度の
刺激を加えたもの、中等度の刺激を加えたもの、高度の
刺激を加えたものを、1:5から1:500までの範囲で希釈し
て検討した。全てのフラクションに明白な用量依存の関
係、すなわち用量を大きくすればするほど、増殖反応が
大きくなることが認められた。これらの結果から、電気
溶出装置の生成物に毒性がないことが強調されている。

前記から明らかなように、本発明の方法と装置とは次
の大きな利点があることが分かる。

先ず、日常的に常用されている、一個の一次元ゲル中
の全ての成分を分離しておいて同時に溶出する作業を、
迅速かつ簡単に実施することが可能である。さらに、各
種の厚さを持つ一次元ゲルを使用することが可能とな
り、したがって本発明は最大限の適応性を持っている。
このため、電気溶出装置を、通常のタンパク質精製方法
の一部とすることができるし、生成物を定量的、定性的
に分析することもできる。

台形のウェルによって、全てのタンパク質のバンドを
むらなく移動させることができる。

分離フレームをスポンジの方向に伸ばして、取扱の容
易な効率的な容器とすることができる。

緩衝液には毒性がなく、また溶出中に問題となる可能
性がある塩化物イオンもない。電気溶出装置の全ての部
分に同じ緩衝液が使用されていて、省力的である。

溶出が完了したら、生成物を吸い出すので、機械を分
解する必要がない。これによって高い純度が維持でき
る。生成物は完全に毒性がなく、数多くの各種目的に使
用することができる。

最後に、鋳型を使用して正確な、しかも再現性の良い
分画を行なうことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｚ

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分離されているタンパク質またはDNA/RNA
   などの荷電巨大分子を含有するゲルの電気溶出方法であ
   って、 （ａ）複数の隣接する並列の室（７）の第一の開かれた
   側の上にゲルを載置する工程と、 （ｂ）室（７）の第二の開かれた側（72）の上に半透膜
   を載置する工程と、 （ｃ）閉鎖された室（７）を溶出緩衝液で満たす工程
   と、 （ｄ）ゲル中の分離された荷電巨大分子が室（７）中の
   溶出緩衝液に移動するように、室（７）に電圧差を加え
   る工程 とからなり、 室（７）の各々が、台形の断面を有し、かつ、第一の開
   かれた側（71）と、該第一の開かれた側（71）に対向
   し、かつ、それよりも短い第二の開かれた側（72）と、
   互いに対向する二つの閉じられた側（73,74）とからな
   る溶出方法。
2. 【請求項２】上記室（７）の二つの閉じられた側（73,7
   4）が、該室と隣接する室の二つの閉じられた側と三角
   形を形成することを特徴とする請求項１に記載の溶出方
   法。
3. 【請求項３】上記ゲル（９）のバンドと上記室が並列す
   るように、上記ゲル（９）が載置されることを特徴とす
   る請求項１に記載の溶出方法。
4. 【請求項４】半透膜（６）を通して溶出緩衝液からイオ
   ン性界面活性剤を除去するのに充分な時間、好ましくは
   ８〜16分間、ボルト電圧差が加えられることを特徴とす
   る請求項１に記載の溶出方法。
5. 【請求項５】上記溶出後に、ボルト電位が短時間、好ま
   しくは約10秒間、反転することを特徴とする請求項１に
   記載の溶出方法。
6. 【請求項６】上記溶出緩衝液が低いイオン強度をもつこ
   とを特徴とする請求項１に記載の溶出方法。
7. 【請求項７】上記溶出緩衝液が、約2mMのリン酸緩衝液
   であることを特徴とする請求項６に記載の溶出方法。
8. 【請求項８】全ての室の可変部分が分子のブロッティン
   グに適した膜で覆われることを特徴とする、分離された
   荷電巨大分子の同時電気溶出及び電気ブロッティングの
   ための請求項１に記載の溶出方法。
9. 【請求項９】請求項１に記載の溶出方法を実施するのに
   用いられる装置であって、 ａ）ｉ）黒鉛陽極（４）と ii）緩衝液で満たされたスポンジ（５）と iii）スポンジ（５）上に載置された半透膜（６）と iv）スポンジ（５）からの余剰緩衝液を受けとめる貯め とからなる支持体（１）と、 ｂ）ｉ）各々が、台形の断面を有し、かつ、第一の開か
   れた側（71）と、該第一の開かれた側（71）に対向し、
   かつ、それよりも短い第二の開かれた側（72）と、互い
   に対向する二つの閉じられた側（73,74）とからなり、 該第二の開かれた側（72）が、フレーム（２）が支持体
   （１）に連結されたときに、半透膜（６）によって閉鎖
   される、 複数の並列に隣接した室（７）と、 ii）ゲル（９）を受けるための切り欠き とからなるフレーム（２）と、 ｃ）黒鉛陰極（３）からなる安全カバー（８）とからな
   り、かつ、 ゲル（９）が、安全カバー（８）とフレーム（２）と支
   持体（１）が連結されたときに、室（７）の第一の開か
   れた側を閉鎖することを特徴とする装置。
10. 【請求項１０】室の上記二つの閉じられた側（73,74）
    が、該室と隣接する室の二つの閉じられた側と三角形を
    形成することを特徴とする請求項９に記載の装置。
11. 【請求項１１】上記フレーム（２）が、回収された生成
    物を吸い出すための側方開口部を含むことを特徴とする
    請求項９に記載の装置。
12. 【請求項１２】上記安全カバー（８）が、自動的に電流
    を反転させることのできる電源を含むことを特徴とする
    請求項９に記載の装置。
13. 【請求項１３】同時溶出及びブロッティングのための膜
    を含むことを特徴とする請求項９に記載の装置。
14. 【請求項１４】請求項９に記載の装置のフレーム（２）
    の切り欠きの大きさに応じたゲルの正確な切り取りに用
    いられる鋳型であって、切除前の鋳型の位置決めのため
    の調整線と、所望の複数の種類の分子が各々の室中に含
    まれるような室のアイデンティフィケーションとを含む
    鋳型。