JP2004069387A - 二次元電気泳動方法、装置及びそのゲル保持器具 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来の二次元電気泳動法では、一次元目電気泳動を行うゲルは細長いチューブ等の内部に形成して電気泳動を行うため、その後に二次元目電気泳動に供するためには、細長いゲルをチューブの内部から取り出してスラブ状ゲルに隣接させなければならず、取り扱いに十分な注意が必要であり、非常に時間がかかってしまう。また、このような操作を機械化、自動化するのは非常に困難である。
【解決手段】そこで本発明では、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間にゲルを形成して一次元目電気泳動を行うと共に、その終了後にゲル保持器具を、そのまま又は制限酵素処理等の他の過程を経た後、二次元目電気泳動槽に移動し、帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【選択図】 図１７
【解決手段】そこで本発明では、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間にゲルを形成して一次元目電気泳動を行うと共に、その終了後にゲル保持器具を、そのまま又は制限酵素処理等の他の過程を経た後、二次元目電気泳動槽に移動し、帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【選択図】 図１７
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は二次元電気泳動方法、装置及びそのゲル保持器具に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
二次元電気泳動方法は、細長いチューブ等の細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うものであり、タンパク質や核酸等の多種多様な成分を分離するのに広く使用されている。
【０００３】
一方、近来、二次元電気泳動法を適用したゲノムＤＮＡのスキャニング方法として、ＲＬＧＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｌａｎｄｍａｒｋ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ）法と称されるゲノム解析手法が提案されている。（Ｈａｔａｄａ，ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８， ９５２３−９５２７ （１９９１），特許第２７９４０４７号特許公報）
【０００４】
このゲノムＤＮＡのスキャニング方法は、
（ａ） ゲノムＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｂ） ゲノムＤＮＡの切断末端を標識する工程
（ｃ） ゲノムＤＮＡ断片を一次元電気泳動により分画する工程
（ｄ） （ａ）の工程で使用する制限酵素より切断頻度の高い制限酵素によりゲノムＤＮＡ断片を切断する工程
（ｅ） ゲノムＤＮＡ断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
から成るものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の二次元電気泳動法を適用するに際しての課題は、細長いチューブ等の内部での一次元目電気泳動の点と一次元目電気泳動を行った細長いゲルの取り扱いの点にある。
即ち、従来の二次元電気泳動法では、一次元目電気泳動を行うゲルは細長いチューブ等の内部に形成し、そこに保持して電気泳動を行うのでコームを利用することができず、サンプルＤＮＡをアプライすると、ゲルとチューブの内壁間をＤＮＡが流れて、ゲル中に流れるＤＮＡの量にばらつきが生じ、このことからデータの再現性に問題があった。
【０００６】
また、細長いチューブ等の内部で一次元目電気泳動を行った後に、ゲルを二次元目電気泳動に供するためには、細長いゲルをチューブの内部から取り出して、これをスラブ状ゲルの端縁に隣接させなければならない。
【０００７】
この操作に際しては、ゲルを損傷しないようにするために、取り扱いに十分な注意が必要であり、非常に時間がかかってしまう。また、このような操作を機械化、自動化するのは非常に困難である。
【０００８】
一方、上記ＲＬＧＳ法において二次元電気泳動法を実施する場合には、一次元電気泳動を行った細長いゲルを制限酵素で処理する工程が必要であるため、やはり、チューブ内部の細長いゲルを、例えば太いチューブ等による制限酵素処理容器に移し換える必要があり、その前後の取り扱いにも十分な注意が必要であり、非常に時間がかかる。また、このような操作も機械化、自動化は非常に困難である。
【０００９】
このような二次元電気泳動法の課題を解決することを目的として、例えば特開平１１−３０６０５号公報に記載の発明では、一次元電気泳動用のストリップ状ゲルと二次元電気泳動用のスラブ状ゲルとを、共通容器上で組み合わせる構成とし、これらのゲル間は、流体不浸透性で、電気絶縁性の破壊容易式隔壁により仕切った構成を提案している。このような構成において、一次元電気泳動は、上記隔壁を破壊する前に、この隔壁によってスラブ状ゲルと隔離されたリザーバ内で行い、このような一次元電気泳動が終了した後に隔壁を破壊して、ストリップ状ゲルをスラブ状ゲルの端縁に移動させ、こうしてストリップ状ゲルをスラブ状ゲルの端縁に隣接させて、二次元電気泳動を行うものである。
【００１０】
しかしながら、このような提案の方法では、やはり機械化、自動化が困難であると共に、制限酵素で処理する工程が必要な上記ＲＬＧＳ方法に適用することはできない。
本発明はこのような課題を解決することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上述した課題を解決するために、請求項１の発明では、細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法において、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成して、この状態において一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動終了後に一次元目電気泳動槽から取り出したゲル保持器具を二次元目電気泳動槽に移動し、一次元目電気泳動を行った帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１２】
また請求項２の発明では、細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法において、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成して、この状態において一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動終了後に一次元目電気泳動槽から取り出したゲル保持器具を制限酵素処理槽内に移動して、一次元目電気泳動を行った帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行うと共に、制限酵素処理終了後に制限酵素処理槽から取り出したゲル保持器具を二次元目電気泳動槽に移動し、一次元目電気泳動、制限酵素処理を行った帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１３】
また請求項３の発明では、上記請求項１又は２に記載の発明において、一次元目電気泳動槽の緩衝液溜部間に位置する載置部上にゲル保持器具を載置した後、両端を閉止体により塞ぎ、この状態において、上方から溶解したゲルを注入して帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成し、固化した後に閉止体を外して電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１４】
また請求項４の発明では、上記請求項２に記載の発明において、制限酵素処理槽内の載置部にゲル保持器具を載置した後、ゲル保持器具の帯状板体間の上部に制限酵素を注入し、次いで乾燥防止用の蓋をした状態で帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１５】
また請求項５の発明では、上記請求項２又は４に記載の発明において、制限酵素処理槽内には、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した細長い溝を形成し、この細長い溝に制限酵素を注入して、載置されるゲル保持器具の帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１６】
また請求項６の発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽を要素として、これらを平面上に配置して構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００１７】
また請求項７の発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽と、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した制限酵素注入用の細長い溝を形成した制限酵素処理槽を要素として、これらを平面上に配置して構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００１８】
また請求項８の発明では、前記請求項６又は７に記載の発明において、要素を配置した空間の上方に搬送手段を移動可能に設置し、搬送手段には、ゲル保持器具を支持するハンドリング手段と、液の注入、排出手段を構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００１９】
また請求項９の発明では、前記請求項６〜８までのいずれか１項に記載の発明において、二次元目電気泳動槽はスラブ状ゲルを水平に支持する構成とし、そのスラブ状ゲルの端縁に対応してゲル保持器具の横支持部を設けた二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２０】
また請求項１０の発明では、前記請求項９に記載の発明において、二次元電気泳動槽には、スラブ状ゲルを挟持するプレートの両側に対応する絶縁板の装着溝を形成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２１】
また請求項１１の発明では、請求項９又は１０に記載の発明において、ハンドリング手段によりゲル保持器具を横方向に支持するためのゲル保持器具の回転手段を適所に構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２２】
また請求項１２の発明では、請求項１１に記載の発明において、回転手段は、適所に設置したゲル保持器具の９０度回転台と、ゲル保持器具に構成した垂直及び水平支持用のハンドリング部とから構成し、ゲル保持器具を９０度回転台により回転させてハンドリング手段により支持するハンドリング部を垂直支持用から水平支持用に変更する構成とした二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２３】
また請求項１３の発明では、請求項１１に記載の発明において、回転手段は、ハンドリング手段自体に構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２４】
また請求項１４の発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成とした二次元電気泳動用ゲル保持器具を提案するものである。
【００２５】
また請求項１５の発明では、前記請求項１４に記載の発明において、対を成す細長い帯状板体はスぺーサーにより所定間隔に保持して一体に構成し、スペーサーは上側を帯状板体内から外部に突出させてハンドリング部に構成した二次元電気泳動用ゲル保持器具を提案するものである。
【００２６】
本発明によれば、一次元電気泳動を行うための細長いゲルは、細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成のゲル保持器具の、帯状板体間の隙間に形成するので、コームを利用することができ、このコームにより形成したウェル内にサンプルＤＮＡを注入することにより、一次元目電気泳動において確実にゲルの中にサンプルＤＮＡを流すことができる。従って細長いチューブ内にゲルを形成する方法のように、ＤＮＡがゲルとチューブの内壁間を流れてしまって、ゲル中に流れるＤＮＡの量がばらつき、データの再現性に問題が生じるということがない。
【００２７】
また、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に形成された細長いゲルは帯状板体間の隙間を介して外部と接するので、一次元電気泳動を行った細長いゲルをゲル保持器具から取り出さずに、そのまま二次元電気泳動槽に移動して、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うことができる。
【００２８】
またＲＬＧＳ法を適用する場合のように、一次元目電気泳動過程と二次元目電気泳動過程との間に制限酵素処理過程を設ける場合においても、これらの過程の全てに渡って細長いゲルをゲル保持器具から取り出す必要がない。
【００２９】
従って、ゲルの取り扱いが容易となり、ゲルの損傷を防止できると共に、ゲル保持器具をハンドリング手段でハンドリングする機構を構成することにより、機械化、自動化も容易である。
【００３０】
本発明のゲル保持器具におけるゲルの形成は、例えば、一次元目電気泳動槽の緩衝液溜部間に位置する載置部上にゲル保持器具を載置した後、両端を閉止体により塞ぎ、この状態において、上方から溶解したゲルを注入するという操作を行うことにより、容易に帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成することができ、そして固化した後に閉止体を外すことにより電気泳動を行うことができる。
【００３１】
一次元電気泳動と二次元電気泳動との間において、制限酵素処理を行う場合には、制限酵素処理槽内の載置部にゲル保持器具を載置した後、ゲル保持器具の帯状板体間の上部に制限酵素を注入し、次いで乾燥防止用の蓋をした状態で帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行うことができる。この方法では、必要最小限の量の制限酵素で経済的に所定の処理を行うことができる。
【００３２】
また制限酵素処理槽内には、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した細長い溝を形成し、この細長い溝に制限酵素を注入して、載置されるゲル保持器具の帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う構成とすることができる。この方法の場合にも少量の制限酵素で経済的に所定の処理を行うことができ、上記方法と併用することにより、より確実な制限酵素処理を行うことができる。
【００３３】
本発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽を要素として、これらを平面上に配置することにより二次元電気泳動装置を構成することができる。
【００３４】
また、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽と、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した制限酵素注入用の細長い溝を形成した制限酵素処理槽を要素として、これらを平面上に配置することにより、上記ＲＬＧＳ法が適用可能な二次元電気泳動装置を構成することができる。
【００３５】
そしてこのような構成の二次元電気泳動装置では、上記要素を配置した空間の上方に搬送手段を移動可能に設置し、搬送手段に、ゲル保持器具を支持するハンドリング手段と、液の注入、排出手段を構成して、機械化、自動化した二次元電気泳動装置を構成することができる。
【００３６】
本発明において、二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動槽は、スラブ状ゲルを垂直に支持する方式であっても、水平に支持する方式であっても良く、後者の場合のように、スラブ状ゲルを水平に支持する二次元目電気泳動槽の場合には、そのスラブ状ゲルの端縁に対応してゲル保持器具の横支持部を設けた構成とすれば良い。
【００３７】
また後者の場合には、二次元電気泳動槽に、スラブ状ゲルを挟持するプレートの両側に対応する絶縁板の装着溝を形成し、アクリルアミドゲルを用いる場合に絶縁板を装着すれば、上記プレート上に多量の緩衝液が流入して覆って、電気泳動に際して電流の大部分が緩衝液の方に流れてしまうのを防止することができる。
【００３８】
さらに、スラブ状ゲルを水平に支持する二次元目電気泳動槽の場合には、そのスラブ状ゲルの端縁に対応してゲル保持器具の横支持部を設けて、ゲル保持器具を一次元電気泳動槽、制限酵素処理槽における装着姿勢、即ち縦方向から９０度回転した姿勢としなければならないが、その回転手段を適所に構成することができる。
【００３９】
例えば、回転手段は、適所に設置したゲル保持器具の９０度回転台と、ゲル保持器具に構成した垂直及び水平支持用のハンドリング部とから構成し、ゲル保持器具を９０度回転台により回転させてハンドリング手段により支持するハンドリング部を垂直支持用から水平支持用に変更する構成とすることができる。
【００４０】
またこのような構成の他の例として、回転手段は、ハンドリング手段自体に構成することもできる。
【００４１】
ハンドリング手段によりゲル保持器具をハンドリングする場合の、ハンドリング部は、対を成す細長い帯状板体を所定間隔に保持して一体化するためのスぺーサーの一部を突出させて構成することができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態を図を参照して説明する。
図１は本発明を適用して構成した二次元電気泳動装置の平面上の構成を概念的に示すもので、この二次元電気泳動装置は上記ＲＬＧＳ法が適用可能なものとしている。
符号１は一次元目電気泳動槽、２は二次元目電気泳動槽、３は制限酵素処理槽であり、これらは装置本体４の台上に載置されている。また符号５は一次元目電気泳動のゲルであるアガロースゲルを溶解状態に維持するためのホットスターラー、６は一次元目ゲルを形成するために後記ゲル保持器具の端部を塞ぐための閉止体置き場、７はゲルにウェルを形成するためのコーム置き場、８は制限酵素処理槽３の蓋置き場、９はリンスポートエアーブロー、１０は試薬ラック、１１はろ紙ホルダー置き場、１２はゲル保持器具の９０度回転装置である。一方、図中に２点鎖線で表した符号１３は搬送手段であり、この搬送手段１３には、後述するようなゲル保持器具のハンドリング手段や液の注入、排出手段を設けており、これらの手段は、以上の各要素が配置された装置本体４の台上を縦横及び上下方向に移動可能に構成されている。また、符号１４は針補正ピンであり、この針補正ピンは、後述するように液を注入するためのシリンジ（注射器）の位置を初期化するためのものである。
【００４３】
図２、図３はゲル保持器具の一例を示すもので、図２において、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。また図３はゲル保持器具の斜視図である。
これらの図に示すように、本発明において、ゲル保持器具１５は、対を成す細長い帯状板体１６，１６を左右のスぺーサー１７，１７により所定間隔に保持して一体に構成しており、そしてスペーサー１７，１７は上側を帯状板体１６内から外部に突出させてハンドリング部１８に構成している。即ち、上記ハンドリング手段によりこれらのハンドリング部１８を挟んで支持し、この状態で上述した一次元目電気泳動槽１、二次元目電気泳動槽２、及び制限酵素処理槽３の上方に搬送して、これらの槽に装着したり、外したりすることができる。
【００４４】
以上の構成において、本発明のゲル保持器具１５では、後述するように、対を成す細長い帯状板体１６，１６間の隙間２０に一次元目電気泳動用ゲルを形成するのである。
【００４５】
次に、図４、図５は一次元電気泳動槽の一例を示すもので、図４において、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ断面図、（ｃ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。また図５は一次元目電気泳動槽の斜視図である。
これらの図に示すように、一次元目電気泳動槽１は、上記ゲル保持器具１５に対応して細長い容器として構成され、中央側にゲル保持器具１５の載置部２１を設け、その両側に緩衝液溜部２２，２２を設けている。そして載置部２１の上側には、ゲル保持器具１５の案内支持部２３を構成しており、案内支持部２３の上端は案内用の傾斜部を設けている。更に緩衝液溜部２２において、載置部２１の端部と対向した個所には支持凸部２４を設けている。この他に、一次元目電気泳動槽１には、当然のこととして電気泳動用の電極と、その他の必要な要素を設けるのであるが、これらは図示を省略している。
【００４６】
次にゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素を図６〜図８を参照して説明する。
図６は要素を説明する拡散斜視図であり、また図７は要素を装着した状態の平面図、図８は図７のＣ−Ｃ断面図である。
これらの図に示すように、一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素としては、ゲル保持器具１５と一次元目電気泳動槽１に加えて、一次元目電気泳動槽１の緩衝液溜部２２の上側に嵌合して、支持凸部２４と載置部２１の端縁上に支持される閉止体２５を設ける。閉止体２５は上側にハンドリング部２６を突設すると共に横側にゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に嵌合する突出部２７を設けた構成である。
【００４７】
以上の構成において、図に示すようにゲル保持器具１５を一次元目電気泳動槽１に案内用傾斜部を経て挿入し、載置部２１上に載置して支持した後、閉止体２５を、その突出部２７をゲル保持器具１５側に向けた状態で下降させて緩衝液溜部２２の上側に嵌合し、この際、突出部２７は帯状板体１６間の隙間２０に嵌合させる。
【００４８】
この状態では、図８に示すように、帯状板体１６間の隙間２０の両端側は閉止体２５により閉止された状態となるため、この状態において上方から溶解したゲルを注入することにより、容易に帯状板体１６間の隙間２０に一次元目電気泳動用ゲルを形成することができ、そして固化した後に閉止体２５を外すことによりゲルの両端部が緩衝液溜部２２と連通状態となって電気泳動を行うことができる。
【００４９】
次に、制限酵素処理槽３の一例を図９、図１０を参照して説明する。
図９の（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＤ−Ｄ断面図、（ｃ）は（ｂ）のＥ−Ｅ断面図であり、図１０は制限酵素処理槽３とゲル保持器具１５と制限酵素の乾燥防止用の蓋１９との対応関係を示す拡散斜視図である。
図に示すように、制限酵素処理槽３は、ゲル保持器具１５に対応した細長い容器として構成しており、ゲル保持器具１５を載置する載置部２８の左右側と下側に中空部２９ａ，２９ｂ，２９ｃを構成しており、左右側の中空部２９ａ，２９ｂ間の隙間がゲル保持器具１５の案内空間３０として構成されている。そして載置部２８の上面には、ゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に対応した細長い溝３１が形成されている。上記中空部２９ａ，２９ｂ，２９ｃには温水等の熱媒体を流す構成としており、夫々の中空部２９ａ，２９ｂ，２９ｃにはホース接続部３２ａ，３２ｂ，３２ｃを構成している。例えば、温水等の熱媒体は、下側のホース接続部３２ｃから中空部２９ｃの一端側に流入して他端側方向に流れ、他端側において連通部により中空部２９ａ，２９ｂに流入し、そこを一端側方向に流れて、夫々のホース接続部３２ａ，３２ｂから流出するように供給される。
そして図１０に示すように蓋１９は、ゲル保持器具１５のスペーサー１７，１７間の帯状板体１６，１６上に載置して、帯状板体１６，１６間の隙間２０を塞ぐ構成としている。この蓋１９には上方にハンドリング部５２を突設している。
【００５０】
次に、二次元目電気泳動槽２の一例を図１１〜図１７を参照して説明する。
図１１は平面図、図１２は図１１のＦ−Ｆ断面図、図１３は斜視図、図１４は二次元目電気泳動用のスラブ状ゲルとゲル保持器具を所定位置に装着した状態の平面図、図１５は図１４のＧ−Ｇ断面図、図１６は要部拡大図、図１７は緩衝液を入れた状態の図１４のＧ−Ｇ断面図である。
これらの図に示すように、二次元目電気泳動槽２は、スラブ状ゲルを載置する広い載置部３３と、その両側に緩衝液溜部３４ａ，３４ｂを形成した容器として構成され、一方側の緩衝液溜部３４ａは、ゲル保持器具１５に対応して、載置部３３よりも長く構成されている。そして緩衝液溜部３４ａには、載置部３３の端縁側に、ゲル保持器具１５を横方向で支持する横支持部３５を設けており、この横支持部３５と載置部３３間には高さ調整用の段部３６が形成されている。一方、載置部３３に対応する二次元目電気泳動槽２の側壁３７には絶縁板３８の装着溝３９が形成されている。一次元目電気泳動槽１と同様に、この二次元目電気泳動槽２には、この他に、当然のこととして電気泳動用の電極と、その他の必要な要素を設けるのであるが、これらは図示を省略している。
【００５１】
図１４〜図１７を参照して、二次元目電気泳動槽２における各要素の装着状態を説明する。まず、図において符号４０ａ，４０ｂはスラブ状ゲル形成用のプレートであり、それらの間の隙間に二次元目電気泳動用のスラブ状ゲル４１が形成される。スラブ状ゲルの形成方法は、プレート４０ａ，４０ｂをスぺーサーにより所定間隔に維持した状態で内部に溶解したゲル、例えばこの場合、アクリルアミドゲルを流し込むことによって行うことができ、この方法は従来の適宜の方法を適用することができる。
【００５２】
図に示すように、下側のプレート４０ｂは、上側のプレート４０ａよりも長く形成されており、その部分は傾斜している。この傾斜部４２は後述するように、ゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に形成されたゲル４３と、スラブ状ゲル４１とを円滑に隣接させて連結状態とするために設けられるものである。
【００５３】
図１４〜図１７に示すように、二次元目電気泳動槽２においては、まずスラブ状ゲル４１を形成したプレート４０ａ，４０ｂを載置部３３に載置した後、装着溝３９に絶縁板３８を装着して、それらの下端を上側のプレート４０ａに当接させた状態としておく。
【００５４】
次いで後述するような所定の処理が行われたゲル４３を保持したままのゲル保持器具１５を上記ハンドリング手段により二次元目電気泳動槽２に搬送し、ゲル保持器具１５が横方向の状態で、ゲル４３の形成側をスラブ状ゲル４１側に向けて横支持部３５上に載置して支持する。この状態においてゲル保持器具１５内のゲル４３とスラブ状ゲル４１間に接続用のアガロースゲル４４を注入することにより、ゲル４３とスラブ状ゲル４１とを連結状態として電気泳動が可能な状態とする。
【００５５】
二次元目電気泳動槽２における電気泳動においては、絶縁板３８により、多量の緩衝液５５がプレート４０ａ上を覆ってしまうのを防ぐことができ、こうしてアクリルアミドゲルを用いる場合にも、電流の大部分が緩衝液の方を流れてしまうことを防止することができる。
【００５６】
以上に説明した二次元目電気泳動槽２はスラブ状ゲルを水平方向に支持する形式であるが、このような水平式の二次元目電気泳動槽２の場合には、一次元目電気泳動槽１及び制限酵素処理槽３においては縦方向に支持してハンドリングしているゲル保持器具１５を横方向に方向転換する必要があるが、このような方向転換を行うハンドリング手段は適宜に構成することができ、その例は後述する。
【００５７】
次に以上のような要素からなる二次元電気泳動装置の動作を、上記ＲＬＧＳ方法の実施に適用した例を次に図１８〜図３８に基づいて説明する。
まず本発明では、針補正ピン１４を用いて液を注入するためのシリンジ（注射器）の位置を初期化する。次いで、準備としてゲルを溶解し、ホットスターラー５に載せて溶解状態を維持しておく。更にシリンジを搬送手段１３の所定位置にセットする。そして、上述したとおり、ゲル保持器具１５を一次元目電気泳動槽１に案内用傾斜部を経て挿入し、載置部２１上に載置して支持した後、閉止体２５を、その突出部２７をゲル保持器具１５側に向けた状態で下降させて緩衝液溜部２２の上側に嵌合して図８に示すように、帯状板体１６間の隙間２０の両端側を閉止体２５により閉止された状態としておく。一方、二次元目電気泳動槽３においては、スラブ状ゲル４１を形成したプレート４０ａ，４０ｂを載置部３３に載置した後、装着溝３９に絶縁板３８を装着して、それらの下端を上側のプレート４０ａに当接させた状態としておく。また、上述した夫々の置き場に、制限酵素処理槽３の蓋、ろ紙ホルダー、コーム等をセットしておく。
【００５８】
次いでシリンジによる注入器具４６をホットスターラー５上に搬送して、溶解しているゲルを吸引し、これを一次元目電気泳動槽１に装着されているゲル保持器具１５上に搬送して、図１８に示すように横方向に移動しながらアガロースゲルをゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０内に注入する。この注入により、溶解したゲルは図２以降に示すように、閉止体２５によって区画される隙間２０の下部空間に満たされる。
【００５９】
次いでハンドリング手段は搬送手段１３によりコーム４７を取ってきて、それを図１９に示すようにゲル保持器具１５の一方側のハンドリング部１８（スぺーサー１７）と閉止体２５の間において、帯状板体１６間の隙間２０に嵌合する。
【００６０】
こうしてゲルが固まるまで、例えばタイマーにより設定した所定時間待機し、ゲルが固まったら、図２０に示すように閉止体２５とコーム４７を取り外して所定の置き場まで搬送する。コーム４７の個所には電気泳動を行うサンプルを注入するウェル４８が形成されている。
【００６１】
次いで図２１に示すように、搬送手段１３に設置している注入手段のニードル４９により、電気泳動用緩衝液４５を緩衝液溜部２２に所定量注入する。
【００６２】
次いで図２２に示すように、微量ニードル５０により試薬ラック１０のサンプルを吸引して、これをウェル４８に注入し、この状態で図２３に示すように電気泳動を行う。ウェル４８内のサンプルを符号５１で示す。
【００６３】
次いで図２４に示すように搬送手段１３の適所に装置したニードル４９により緩衝液溜部２２内の緩衝液４５を吸い出して、図２５に示すように緩衝液溜部２２内を空にする。
【００６４】
次いで図２６に示すようにニードル４９により、今度は制限酵素処理用の緩衝液５３を緩衝液溜部２２に注入する。
【００６５】
次いで搬送手段１３のハンドリング手段５４により、図２７に示すようにゲル保持器具１５のハンドリング部１７を挟持して、ゲル保持器具１５を僅かに（例えば２ｍｍ程度）持ち上げて所定時間維持し、一次元目電気泳動槽１の載置部２１に接触していたゲル保持器具１５内のゲル４３を制限酵素処理用緩衝液５３に接触させ、そして所定時間経過後にゲル保持器具１５を下降させて載置部２１に載置しておく。
【００６６】
一方、搬送手段１３は、ニードル４９を試薬ラック１０に移動させ、試薬ラック１０から制限酵素溶液を所定量吸引した後、図２８、図２９に示すように制限酵素処理槽３において、ニードル４９を細長い溝３１に対応させて、横方向に移動させながら制限酵素溶液５６を細長い溝３１に注入する。
【００６７】
次いで搬送手段１３のハンドリング手段５４は、上述したように一次元目電気泳動槽１の載置部２１に載置されているゲル保持器具１５を制限酵素処理槽３に搬送し、それを下降して図３０に示すように載置部２８に載置する。
【００６８】
次いで、搬送手段１３のハンドリング手段５４によりろ紙ホルダー置き場１１からろ紙ホルダー５７を運び、図３１に示すようにろ紙５８をゲル保持器具１５の帯状板体１６間に位置させて、そこの緩衝液を吸い取る。
【００６９】
次いで図３２に示すようにろ紙ホルダー５７をろ紙ホルダー置き場１１に戻して、制限酵素処理槽３における処理が完了する。
【００７０】
次いでゲル保持器具１５の上部の細い隙間２０に制限酵素を注入し、この後、必要に応じて、即ち次の工程までに時間がある場合には、蓋置き場８から運んだ蓋を制限酵素処理槽３の上部に装着する。以上の状態で設定した時間維持することにより、細長い溝３１内の制限酵素溶液５６によりゲル保持器具１５の帯状板体１６間のゲル４３の制限酵素処理が行われる。
【００７１】
このようにこの実施の形態では、制限酵素処理槽３の載置部２８に構成した細長い溝３１内とゲル保持器具１５の上部の細い隙間２０に注入した必要最小限の制限酵素溶液５６により処理を行うので、高価な制限酵素の量を節約してコストの低減を図ることができる。
【００７２】
次いで、これまでの工程において一次元目電気泳動槽１に満たされている制限酵素処理用緩衝液５３を、図３３に示すようにニードル４９により吸い出して、図３４に示すように一次元目電気泳動槽１内を空にする。
【００７３】
次いで今度は、図３５に示すように、再びニードル４９により電気泳動用緩衝液４５を一次元目電気泳動槽１内に注入する。
【００７４】
一次元目電気泳動槽１内に所定量の緩衝液４５が注入されたら、制限酵素処理槽３に載置されているゲル保持器具１５を搬送手段１３のハンドリング手段５４により一次元目電気泳動槽１の上方に運び、図３６に示すように載置部２１に載置せずに、上方、例えば２ｍｍ程度上方に設定時間保持して、ゲル保持器具１５内のゲル４３を電気泳動用緩衝液４５に接触させ、設定時間経過後にゲル保持器具１５を下降させて載置部２１に載置して待機する。
【００７５】
次いで搬送手段１３のハンドリング手段は、ゲル保持器具１５を二次元目電気泳動槽２に運び、ここでゲル保持器具１５を横方向に方向転換させた後に、下降させて、ゲル４３の形成側をスラブ状ゲル４１側に向けて横支持部３５上に載置して支持し、この状態においてゲル保持器具１５内のゲル４３とスラブ状ゲル４１間に接続用のアガロースゲル４４を注入することにより、ゲル４３とスラブ状ゲル４１とを連結状態として電気泳動が可能な状態とする。こうして、上述したように二次元目の電気泳動が行われる。
【００７６】
本実施の形態では、二次元目電気泳動槽２はスラブ状ゲルを水平方向に支持する形式であるので、上述したとおり一次元目電気泳動槽１及び制限酵素処理槽３においては縦方向に支持してハンドリングしているゲル保持器具１５を横方向に回転する必要があり、上述した実施の形態では、このような回転をハンドリング手段に構成しているが、次に他の例を説明する。
【００７７】
即ち、図３７、図３８は回転手段の他の例を示すものであり、この回転手段はゲル保持器具１５の９０度回転装置１２と、図３７に示すようにゲル保持器具１５に構成した垂直及び水平支持用のハンドリング部１８，１８’とから構成している。
９０度回転装置１２は図３８に示すように直交する一対の支持板５９ａ，５９ｂを設けて９０度回転可能に装置したものであり、図３８の（ａ）〜（ｅ）の操作を経て９０度回転させるものである。
まず（ｂ）では一次元目電気泳動槽１内のゲル保持器具１５の垂直支持用のハンドリング部１８をハンドリング手段５４の把持部６０で挟んで支持し、この状態で９０度回転装置１２まで運んで、水平状態の支持板５９ａ上に載置する。次いで、（ｃ）に示すように把持部６０を外した後、支持板５９ａ，５９ｂを（ｄ）に示すように図中反時計回りに９０度回転させて、ゲル保持器具１５を横方向として支持板５９ｂにより支持し、この状態で（ｅ）に示すようにハンドリング手段５４の把持部６０で、今度は水平支持用のハンドリング部１８’を挟んで支持し、この状態で（ｆ）に示すように二次元目電気泳動槽２に運んで、上述したとおり横支持部３５に載置支持することができる。
【００７８】
以上に説明した実施の形態は、本発明の二次元電気泳動法を、機械化、自動化した二次元電気泳動装置により行う例であるが、本発明における二次元電気泳動法の実施は、人手により行うこともできるものである。
【００７９】
一方、以上の実施の形態では、一次元目電気泳動槽１及び二次元目電気泳動槽２の両方を水平式に構成しているが、これらはいずれも垂直式とすることもできるものである。
【００８０】
更に以上の実施の形態は、ＲＬＧＳ法を適用する場合のように、一次元目電気泳動過程と二次元目電気泳動過程との間に制限酵素処理過程を設ける場合について述べているが、本発明は、制限酵素処理過程を設けない二次元電気泳動法にも適用できるものである。
【００８１】
【発明の効果】
本発明は以上のとおりであるので、次のような効果がある。
ａ．一次元電気泳動を行うための細長いゲルは、細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成のゲル保持器具の、帯状板体間の隙間に形成するので、コームを利用することができ、このコームにより形成したウェル内にサンプルＤＮＡを注入することにより、一次元目電気泳動において確実にゲルの中にサンプルＤＮＡを流すことができる。従って細長いチューブ内にゲルを形成する方法のように、ＤＮＡがゲルとチューブの内壁間を流れてしまって、ゲル中に流れるＤＮＡの量がばらつき、データの再現性に問題が生じるということがない。
ｂ．ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に形成された細長いゲルは帯状板体間の隙間を介して外部と接するので、一次元電気泳動を行った細長いゲルをゲル保持器具から取り出さずに、そのまま二次元電気泳動槽に移動して、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うことができる。
ｃ．またＲＬＧＳ法を適用する場合のように、一次元目電気泳動過程と二次元目電気泳動過程との間に制限酵素処理過程を設ける場合においても、これらの過程の全てに渡って細長いゲルをゲル保持器具から取り出す必要がない。
ｄ．従って、ゲルの取り扱いが容易となり、ゲルの損傷を防止できると共に、ゲル保持器具をハンドリング手段でハンドリングする機構を構成することにより、機械化、自動化も容易である。
ｅ．本発明のゲル保持器具におけるゲルの形成は、例えば、一次元目電気泳動槽の緩衝液溜部間に位置する載置部上にゲル保持器具を載置した後、両端を閉止体により塞ぎ、この状態において、上方から溶解したゲルを注入するという操作を行うことにより、容易に帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成することができ、そして固化した後に閉止体を外すことにより電気泳動を行うことができる。
ｆ．一次元電気泳動と二次元電気泳動との間において、制限酵素処理を行う場合、制限酵素処理槽内には、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した細長い溝を形成し、この細長い溝に制限酵素を注入して、載置されるゲル保持器具の帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う構成とすれば、必要最小限の量の制限酵素で経済的に所定の処理を行うことができる。
ｇ．本発明では、ゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽、及び制限酵素処理槽等を要素として、これらを平面上に配置することにより二次元電気泳動装置を容易に構成することができる。
ｈ．このような構成の二次元電気泳動装置では、上記要素を配置した空間の上方に搬送手段を移動可能に設置し、搬送手段に、ゲル保持器具を支持するハンドリング手段と、液の注入、排出手段を構成して、機械化、自動化した二次元電気泳動装置を構成することができる。
ｉ．水平支持式の二次元電気泳動槽に、スラブ状ゲルを挟持するプレートの両側に対応する絶縁板の装着溝を形成し、アクリルアミドゲルを用いる場合に絶縁板を装着すれば、電気泳動に際して電流が緩衝液の方に流れてしまうのを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用して構成した二次元電気泳動装置の平面上の構成を概念的に示す説明図である。
【図２】ゲル保持器具を示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【図３】ゲル保持器具を示す斜視図である。
【図４】一次元目電気泳動槽を示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ断面図、（ｃ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。
【図５】一次元目電気泳動槽を示す斜視図である。
【図６】一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素を示す拡散斜視図である。
【図７】一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素を装着した状態の平面図である。
【図８】図７のＣ−Ｃ断面図である。
【図９】制限酵素処理槽を示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＤ−Ｄ断面図、（ｃ）は（ｂ）のＥ−Ｅ断面図である。
【図１０】制限酵素処理槽とゲル保持器具との対応関係を示す拡散斜視図である。
【図１１】二次元目電気泳動槽を示す平面図である。
【図１２】図１１のＦ−Ｆ断面図である。
【図１３】二次元目電気泳動槽を示す斜視図である。
【図１４】二次元目電気泳動用のスラブ状ゲルとゲル保持器具を所定位置に装着した状態の平面図である。
【図１５】図１４のＧ−Ｇ断面図である。
【図１６】図１５の要部拡大図である。
【図１７】緩衝液を入れた状態の図１４のＧ−Ｇ断面図である。
【図１８】本発明の二次元電気泳動装置の動作を示す断面図である。
【図１９】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図１８の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２０】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図１９の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２１】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２０の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２２】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２１の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２３】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２２の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２４】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２３の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２５】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２４の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２６】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２５の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２７】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２６の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２８】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２７の状態から進行した時点で示す平面図である。
【図２９】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２８の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３０】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２９の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３１】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３０の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３２】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３１の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３３】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３２の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３４】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３３の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３５】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３４の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３６】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３５の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３７】本発明におけるゲル保持器具の回転機構の他の例を構成するゲル保持器具の斜視図である。
【図３８】本発明におけるゲル保持器具の回転機構の動作を示す説明図である。
【符号の説明】
１ 一次元目電気泳動槽
２ 二次元目電気泳動槽
３ 制限酵素処理槽
４ 装置本体
５ ホットスターラー
６ 閉止体置き場
７ コーム置き場
８ 蓋置き場
９ リンスポートエアーブロー
１０ 試薬ラック
１１ ろ紙ホルダー置き場
１２ ９０度回転装置
１３ 搬送手段
１４ 針補正ピン
１５ ゲル保持器具
１６ 帯状板体
１７ スペーサー
１８，１８’ ハンドリング部
１９ 蓋
２０ 隙間
２１ 載置部
２２ 緩衝液溜部
２３ 案内支持部
２４ 支持凸部
２５ 閉止体
２６ ハンドリング部
２７ 突出部
２８ 載置部
２９ａ，２９ｂ，２９ｃ 中空部
３０ 案内空間
３１ 細長い溝
３２ａ，３２ｂ，３２ｃ ホース接続部
３３ 載置部
３４ａ，３４ｂ 緩衝液溜部
３５ 横支持部
３６ 段部
３７ 側壁
３８ 絶縁板
３９ 装着溝
４０ａ，４０ｂ プレート
４１ スラブ状ゲル
４２ 傾斜部
４３ ゲル（一次元目）
４４ 接続用アガロースゲル
４５ 緩衝液（一次元目）
４６ 分注器具
４７ コーム
４８ ウェル
４９ ニードル
５０ 微量ニードル
５１ サンプル
５２ ハンドリング部
５３ 制限酵素用緩衝液
５４ ハンドリング手段
５５ 緩衝液（ニ次元目）
５６ 制限酵素溶液
５７ ろ紙ホルダー
５８ ろ紙
５９ａ，５９ｂ 支持板
６０ 把持部
【発明の属する技術分野】
本発明は二次元電気泳動方法、装置及びそのゲル保持器具に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
二次元電気泳動方法は、細長いチューブ等の細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うものであり、タンパク質や核酸等の多種多様な成分を分離するのに広く使用されている。
【０００３】
一方、近来、二次元電気泳動法を適用したゲノムＤＮＡのスキャニング方法として、ＲＬＧＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｌａｎｄｍａｒｋ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ）法と称されるゲノム解析手法が提案されている。（Ｈａｔａｄａ，ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８， ９５２３−９５２７ （１９９１），特許第２７９４０４７号特許公報）
【０００４】
このゲノムＤＮＡのスキャニング方法は、
（ａ） ゲノムＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｂ） ゲノムＤＮＡの切断末端を標識する工程
（ｃ） ゲノムＤＮＡ断片を一次元電気泳動により分画する工程
（ｄ） （ａ）の工程で使用する制限酵素より切断頻度の高い制限酵素によりゲノムＤＮＡ断片を切断する工程
（ｅ） ゲノムＤＮＡ断片のバンド群を二次元電気泳動により分画する工程
から成るものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の二次元電気泳動法を適用するに際しての課題は、細長いチューブ等の内部での一次元目電気泳動の点と一次元目電気泳動を行った細長いゲルの取り扱いの点にある。
即ち、従来の二次元電気泳動法では、一次元目電気泳動を行うゲルは細長いチューブ等の内部に形成し、そこに保持して電気泳動を行うのでコームを利用することができず、サンプルＤＮＡをアプライすると、ゲルとチューブの内壁間をＤＮＡが流れて、ゲル中に流れるＤＮＡの量にばらつきが生じ、このことからデータの再現性に問題があった。
【０００６】
また、細長いチューブ等の内部で一次元目電気泳動を行った後に、ゲルを二次元目電気泳動に供するためには、細長いゲルをチューブの内部から取り出して、これをスラブ状ゲルの端縁に隣接させなければならない。
【０００７】
この操作に際しては、ゲルを損傷しないようにするために、取り扱いに十分な注意が必要であり、非常に時間がかかってしまう。また、このような操作を機械化、自動化するのは非常に困難である。
【０００８】
一方、上記ＲＬＧＳ法において二次元電気泳動法を実施する場合には、一次元電気泳動を行った細長いゲルを制限酵素で処理する工程が必要であるため、やはり、チューブ内部の細長いゲルを、例えば太いチューブ等による制限酵素処理容器に移し換える必要があり、その前後の取り扱いにも十分な注意が必要であり、非常に時間がかかる。また、このような操作も機械化、自動化は非常に困難である。
【０００９】
このような二次元電気泳動法の課題を解決することを目的として、例えば特開平１１−３０６０５号公報に記載の発明では、一次元電気泳動用のストリップ状ゲルと二次元電気泳動用のスラブ状ゲルとを、共通容器上で組み合わせる構成とし、これらのゲル間は、流体不浸透性で、電気絶縁性の破壊容易式隔壁により仕切った構成を提案している。このような構成において、一次元電気泳動は、上記隔壁を破壊する前に、この隔壁によってスラブ状ゲルと隔離されたリザーバ内で行い、このような一次元電気泳動が終了した後に隔壁を破壊して、ストリップ状ゲルをスラブ状ゲルの端縁に移動させ、こうしてストリップ状ゲルをスラブ状ゲルの端縁に隣接させて、二次元電気泳動を行うものである。
【００１０】
しかしながら、このような提案の方法では、やはり機械化、自動化が困難であると共に、制限酵素で処理する工程が必要な上記ＲＬＧＳ方法に適用することはできない。
本発明はこのような課題を解決することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上述した課題を解決するために、請求項１の発明では、細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法において、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成して、この状態において一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動終了後に一次元目電気泳動槽から取り出したゲル保持器具を二次元目電気泳動槽に移動し、一次元目電気泳動を行った帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１２】
また請求項２の発明では、細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法において、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成して、この状態において一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動終了後に一次元目電気泳動槽から取り出したゲル保持器具を制限酵素処理槽内に移動して、一次元目電気泳動を行った帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行うと共に、制限酵素処理終了後に制限酵素処理槽から取り出したゲル保持器具を二次元目電気泳動槽に移動し、一次元目電気泳動、制限酵素処理を行った帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１３】
また請求項３の発明では、上記請求項１又は２に記載の発明において、一次元目電気泳動槽の緩衝液溜部間に位置する載置部上にゲル保持器具を載置した後、両端を閉止体により塞ぎ、この状態において、上方から溶解したゲルを注入して帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成し、固化した後に閉止体を外して電気泳動を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１４】
また請求項４の発明では、上記請求項２に記載の発明において、制限酵素処理槽内の載置部にゲル保持器具を載置した後、ゲル保持器具の帯状板体間の上部に制限酵素を注入し、次いで乾燥防止用の蓋をした状態で帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１５】
また請求項５の発明では、上記請求項２又は４に記載の発明において、制限酵素処理槽内には、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した細長い溝を形成し、この細長い溝に制限酵素を注入して、載置されるゲル保持器具の帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う二次元電気泳動方法を提案するものである。
【００１６】
また請求項６の発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽を要素として、これらを平面上に配置して構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００１７】
また請求項７の発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽と、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した制限酵素注入用の細長い溝を形成した制限酵素処理槽を要素として、これらを平面上に配置して構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００１８】
また請求項８の発明では、前記請求項６又は７に記載の発明において、要素を配置した空間の上方に搬送手段を移動可能に設置し、搬送手段には、ゲル保持器具を支持するハンドリング手段と、液の注入、排出手段を構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００１９】
また請求項９の発明では、前記請求項６〜８までのいずれか１項に記載の発明において、二次元目電気泳動槽はスラブ状ゲルを水平に支持する構成とし、そのスラブ状ゲルの端縁に対応してゲル保持器具の横支持部を設けた二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２０】
また請求項１０の発明では、前記請求項９に記載の発明において、二次元電気泳動槽には、スラブ状ゲルを挟持するプレートの両側に対応する絶縁板の装着溝を形成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２１】
また請求項１１の発明では、請求項９又は１０に記載の発明において、ハンドリング手段によりゲル保持器具を横方向に支持するためのゲル保持器具の回転手段を適所に構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２２】
また請求項１２の発明では、請求項１１に記載の発明において、回転手段は、適所に設置したゲル保持器具の９０度回転台と、ゲル保持器具に構成した垂直及び水平支持用のハンドリング部とから構成し、ゲル保持器具を９０度回転台により回転させてハンドリング手段により支持するハンドリング部を垂直支持用から水平支持用に変更する構成とした二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２３】
また請求項１３の発明では、請求項１１に記載の発明において、回転手段は、ハンドリング手段自体に構成した二次元電気泳動装置を提案するものである。
【００２４】
また請求項１４の発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成とした二次元電気泳動用ゲル保持器具を提案するものである。
【００２５】
また請求項１５の発明では、前記請求項１４に記載の発明において、対を成す細長い帯状板体はスぺーサーにより所定間隔に保持して一体に構成し、スペーサーは上側を帯状板体内から外部に突出させてハンドリング部に構成した二次元電気泳動用ゲル保持器具を提案するものである。
【００２６】
本発明によれば、一次元電気泳動を行うための細長いゲルは、細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成のゲル保持器具の、帯状板体間の隙間に形成するので、コームを利用することができ、このコームにより形成したウェル内にサンプルＤＮＡを注入することにより、一次元目電気泳動において確実にゲルの中にサンプルＤＮＡを流すことができる。従って細長いチューブ内にゲルを形成する方法のように、ＤＮＡがゲルとチューブの内壁間を流れてしまって、ゲル中に流れるＤＮＡの量がばらつき、データの再現性に問題が生じるということがない。
【００２７】
また、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に形成された細長いゲルは帯状板体間の隙間を介して外部と接するので、一次元電気泳動を行った細長いゲルをゲル保持器具から取り出さずに、そのまま二次元電気泳動槽に移動して、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うことができる。
【００２８】
またＲＬＧＳ法を適用する場合のように、一次元目電気泳動過程と二次元目電気泳動過程との間に制限酵素処理過程を設ける場合においても、これらの過程の全てに渡って細長いゲルをゲル保持器具から取り出す必要がない。
【００２９】
従って、ゲルの取り扱いが容易となり、ゲルの損傷を防止できると共に、ゲル保持器具をハンドリング手段でハンドリングする機構を構成することにより、機械化、自動化も容易である。
【００３０】
本発明のゲル保持器具におけるゲルの形成は、例えば、一次元目電気泳動槽の緩衝液溜部間に位置する載置部上にゲル保持器具を載置した後、両端を閉止体により塞ぎ、この状態において、上方から溶解したゲルを注入するという操作を行うことにより、容易に帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成することができ、そして固化した後に閉止体を外すことにより電気泳動を行うことができる。
【００３１】
一次元電気泳動と二次元電気泳動との間において、制限酵素処理を行う場合には、制限酵素処理槽内の載置部にゲル保持器具を載置した後、ゲル保持器具の帯状板体間の上部に制限酵素を注入し、次いで乾燥防止用の蓋をした状態で帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行うことができる。この方法では、必要最小限の量の制限酵素で経済的に所定の処理を行うことができる。
【００３２】
また制限酵素処理槽内には、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した細長い溝を形成し、この細長い溝に制限酵素を注入して、載置されるゲル保持器具の帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う構成とすることができる。この方法の場合にも少量の制限酵素で経済的に所定の処理を行うことができ、上記方法と併用することにより、より確実な制限酵素処理を行うことができる。
【００３３】
本発明では、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽を要素として、これらを平面上に配置することにより二次元電気泳動装置を構成することができる。
【００３４】
また、対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽と、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した制限酵素注入用の細長い溝を形成した制限酵素処理槽を要素として、これらを平面上に配置することにより、上記ＲＬＧＳ法が適用可能な二次元電気泳動装置を構成することができる。
【００３５】
そしてこのような構成の二次元電気泳動装置では、上記要素を配置した空間の上方に搬送手段を移動可能に設置し、搬送手段に、ゲル保持器具を支持するハンドリング手段と、液の注入、排出手段を構成して、機械化、自動化した二次元電気泳動装置を構成することができる。
【００３６】
本発明において、二次元目電気泳動を行う二次元目電気泳動槽は、スラブ状ゲルを垂直に支持する方式であっても、水平に支持する方式であっても良く、後者の場合のように、スラブ状ゲルを水平に支持する二次元目電気泳動槽の場合には、そのスラブ状ゲルの端縁に対応してゲル保持器具の横支持部を設けた構成とすれば良い。
【００３７】
また後者の場合には、二次元電気泳動槽に、スラブ状ゲルを挟持するプレートの両側に対応する絶縁板の装着溝を形成し、アクリルアミドゲルを用いる場合に絶縁板を装着すれば、上記プレート上に多量の緩衝液が流入して覆って、電気泳動に際して電流の大部分が緩衝液の方に流れてしまうのを防止することができる。
【００３８】
さらに、スラブ状ゲルを水平に支持する二次元目電気泳動槽の場合には、そのスラブ状ゲルの端縁に対応してゲル保持器具の横支持部を設けて、ゲル保持器具を一次元電気泳動槽、制限酵素処理槽における装着姿勢、即ち縦方向から９０度回転した姿勢としなければならないが、その回転手段を適所に構成することができる。
【００３９】
例えば、回転手段は、適所に設置したゲル保持器具の９０度回転台と、ゲル保持器具に構成した垂直及び水平支持用のハンドリング部とから構成し、ゲル保持器具を９０度回転台により回転させてハンドリング手段により支持するハンドリング部を垂直支持用から水平支持用に変更する構成とすることができる。
【００４０】
またこのような構成の他の例として、回転手段は、ハンドリング手段自体に構成することもできる。
【００４１】
ハンドリング手段によりゲル保持器具をハンドリングする場合の、ハンドリング部は、対を成す細長い帯状板体を所定間隔に保持して一体化するためのスぺーサーの一部を突出させて構成することができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態を図を参照して説明する。
図１は本発明を適用して構成した二次元電気泳動装置の平面上の構成を概念的に示すもので、この二次元電気泳動装置は上記ＲＬＧＳ法が適用可能なものとしている。
符号１は一次元目電気泳動槽、２は二次元目電気泳動槽、３は制限酵素処理槽であり、これらは装置本体４の台上に載置されている。また符号５は一次元目電気泳動のゲルであるアガロースゲルを溶解状態に維持するためのホットスターラー、６は一次元目ゲルを形成するために後記ゲル保持器具の端部を塞ぐための閉止体置き場、７はゲルにウェルを形成するためのコーム置き場、８は制限酵素処理槽３の蓋置き場、９はリンスポートエアーブロー、１０は試薬ラック、１１はろ紙ホルダー置き場、１２はゲル保持器具の９０度回転装置である。一方、図中に２点鎖線で表した符号１３は搬送手段であり、この搬送手段１３には、後述するようなゲル保持器具のハンドリング手段や液の注入、排出手段を設けており、これらの手段は、以上の各要素が配置された装置本体４の台上を縦横及び上下方向に移動可能に構成されている。また、符号１４は針補正ピンであり、この針補正ピンは、後述するように液を注入するためのシリンジ（注射器）の位置を初期化するためのものである。
【００４３】
図２、図３はゲル保持器具の一例を示すもので、図２において、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。また図３はゲル保持器具の斜視図である。
これらの図に示すように、本発明において、ゲル保持器具１５は、対を成す細長い帯状板体１６，１６を左右のスぺーサー１７，１７により所定間隔に保持して一体に構成しており、そしてスペーサー１７，１７は上側を帯状板体１６内から外部に突出させてハンドリング部１８に構成している。即ち、上記ハンドリング手段によりこれらのハンドリング部１８を挟んで支持し、この状態で上述した一次元目電気泳動槽１、二次元目電気泳動槽２、及び制限酵素処理槽３の上方に搬送して、これらの槽に装着したり、外したりすることができる。
【００４４】
以上の構成において、本発明のゲル保持器具１５では、後述するように、対を成す細長い帯状板体１６，１６間の隙間２０に一次元目電気泳動用ゲルを形成するのである。
【００４５】
次に、図４、図５は一次元電気泳動槽の一例を示すもので、図４において、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ断面図、（ｃ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。また図５は一次元目電気泳動槽の斜視図である。
これらの図に示すように、一次元目電気泳動槽１は、上記ゲル保持器具１５に対応して細長い容器として構成され、中央側にゲル保持器具１５の載置部２１を設け、その両側に緩衝液溜部２２，２２を設けている。そして載置部２１の上側には、ゲル保持器具１５の案内支持部２３を構成しており、案内支持部２３の上端は案内用の傾斜部を設けている。更に緩衝液溜部２２において、載置部２１の端部と対向した個所には支持凸部２４を設けている。この他に、一次元目電気泳動槽１には、当然のこととして電気泳動用の電極と、その他の必要な要素を設けるのであるが、これらは図示を省略している。
【００４６】
次にゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素を図６〜図８を参照して説明する。
図６は要素を説明する拡散斜視図であり、また図７は要素を装着した状態の平面図、図８は図７のＣ−Ｃ断面図である。
これらの図に示すように、一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素としては、ゲル保持器具１５と一次元目電気泳動槽１に加えて、一次元目電気泳動槽１の緩衝液溜部２２の上側に嵌合して、支持凸部２４と載置部２１の端縁上に支持される閉止体２５を設ける。閉止体２５は上側にハンドリング部２６を突設すると共に横側にゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に嵌合する突出部２７を設けた構成である。
【００４７】
以上の構成において、図に示すようにゲル保持器具１５を一次元目電気泳動槽１に案内用傾斜部を経て挿入し、載置部２１上に載置して支持した後、閉止体２５を、その突出部２７をゲル保持器具１５側に向けた状態で下降させて緩衝液溜部２２の上側に嵌合し、この際、突出部２７は帯状板体１６間の隙間２０に嵌合させる。
【００４８】
この状態では、図８に示すように、帯状板体１６間の隙間２０の両端側は閉止体２５により閉止された状態となるため、この状態において上方から溶解したゲルを注入することにより、容易に帯状板体１６間の隙間２０に一次元目電気泳動用ゲルを形成することができ、そして固化した後に閉止体２５を外すことによりゲルの両端部が緩衝液溜部２２と連通状態となって電気泳動を行うことができる。
【００４９】
次に、制限酵素処理槽３の一例を図９、図１０を参照して説明する。
図９の（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＤ−Ｄ断面図、（ｃ）は（ｂ）のＥ−Ｅ断面図であり、図１０は制限酵素処理槽３とゲル保持器具１５と制限酵素の乾燥防止用の蓋１９との対応関係を示す拡散斜視図である。
図に示すように、制限酵素処理槽３は、ゲル保持器具１５に対応した細長い容器として構成しており、ゲル保持器具１５を載置する載置部２８の左右側と下側に中空部２９ａ，２９ｂ，２９ｃを構成しており、左右側の中空部２９ａ，２９ｂ間の隙間がゲル保持器具１５の案内空間３０として構成されている。そして載置部２８の上面には、ゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に対応した細長い溝３１が形成されている。上記中空部２９ａ，２９ｂ，２９ｃには温水等の熱媒体を流す構成としており、夫々の中空部２９ａ，２９ｂ，２９ｃにはホース接続部３２ａ，３２ｂ，３２ｃを構成している。例えば、温水等の熱媒体は、下側のホース接続部３２ｃから中空部２９ｃの一端側に流入して他端側方向に流れ、他端側において連通部により中空部２９ａ，２９ｂに流入し、そこを一端側方向に流れて、夫々のホース接続部３２ａ，３２ｂから流出するように供給される。
そして図１０に示すように蓋１９は、ゲル保持器具１５のスペーサー１７，１７間の帯状板体１６，１６上に載置して、帯状板体１６，１６間の隙間２０を塞ぐ構成としている。この蓋１９には上方にハンドリング部５２を突設している。
【００５０】
次に、二次元目電気泳動槽２の一例を図１１〜図１７を参照して説明する。
図１１は平面図、図１２は図１１のＦ−Ｆ断面図、図１３は斜視図、図１４は二次元目電気泳動用のスラブ状ゲルとゲル保持器具を所定位置に装着した状態の平面図、図１５は図１４のＧ−Ｇ断面図、図１６は要部拡大図、図１７は緩衝液を入れた状態の図１４のＧ−Ｇ断面図である。
これらの図に示すように、二次元目電気泳動槽２は、スラブ状ゲルを載置する広い載置部３３と、その両側に緩衝液溜部３４ａ，３４ｂを形成した容器として構成され、一方側の緩衝液溜部３４ａは、ゲル保持器具１５に対応して、載置部３３よりも長く構成されている。そして緩衝液溜部３４ａには、載置部３３の端縁側に、ゲル保持器具１５を横方向で支持する横支持部３５を設けており、この横支持部３５と載置部３３間には高さ調整用の段部３６が形成されている。一方、載置部３３に対応する二次元目電気泳動槽２の側壁３７には絶縁板３８の装着溝３９が形成されている。一次元目電気泳動槽１と同様に、この二次元目電気泳動槽２には、この他に、当然のこととして電気泳動用の電極と、その他の必要な要素を設けるのであるが、これらは図示を省略している。
【００５１】
図１４〜図１７を参照して、二次元目電気泳動槽２における各要素の装着状態を説明する。まず、図において符号４０ａ，４０ｂはスラブ状ゲル形成用のプレートであり、それらの間の隙間に二次元目電気泳動用のスラブ状ゲル４１が形成される。スラブ状ゲルの形成方法は、プレート４０ａ，４０ｂをスぺーサーにより所定間隔に維持した状態で内部に溶解したゲル、例えばこの場合、アクリルアミドゲルを流し込むことによって行うことができ、この方法は従来の適宜の方法を適用することができる。
【００５２】
図に示すように、下側のプレート４０ｂは、上側のプレート４０ａよりも長く形成されており、その部分は傾斜している。この傾斜部４２は後述するように、ゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０に形成されたゲル４３と、スラブ状ゲル４１とを円滑に隣接させて連結状態とするために設けられるものである。
【００５３】
図１４〜図１７に示すように、二次元目電気泳動槽２においては、まずスラブ状ゲル４１を形成したプレート４０ａ，４０ｂを載置部３３に載置した後、装着溝３９に絶縁板３８を装着して、それらの下端を上側のプレート４０ａに当接させた状態としておく。
【００５４】
次いで後述するような所定の処理が行われたゲル４３を保持したままのゲル保持器具１５を上記ハンドリング手段により二次元目電気泳動槽２に搬送し、ゲル保持器具１５が横方向の状態で、ゲル４３の形成側をスラブ状ゲル４１側に向けて横支持部３５上に載置して支持する。この状態においてゲル保持器具１５内のゲル４３とスラブ状ゲル４１間に接続用のアガロースゲル４４を注入することにより、ゲル４３とスラブ状ゲル４１とを連結状態として電気泳動が可能な状態とする。
【００５５】
二次元目電気泳動槽２における電気泳動においては、絶縁板３８により、多量の緩衝液５５がプレート４０ａ上を覆ってしまうのを防ぐことができ、こうしてアクリルアミドゲルを用いる場合にも、電流の大部分が緩衝液の方を流れてしまうことを防止することができる。
【００５６】
以上に説明した二次元目電気泳動槽２はスラブ状ゲルを水平方向に支持する形式であるが、このような水平式の二次元目電気泳動槽２の場合には、一次元目電気泳動槽１及び制限酵素処理槽３においては縦方向に支持してハンドリングしているゲル保持器具１５を横方向に方向転換する必要があるが、このような方向転換を行うハンドリング手段は適宜に構成することができ、その例は後述する。
【００５７】
次に以上のような要素からなる二次元電気泳動装置の動作を、上記ＲＬＧＳ方法の実施に適用した例を次に図１８〜図３８に基づいて説明する。
まず本発明では、針補正ピン１４を用いて液を注入するためのシリンジ（注射器）の位置を初期化する。次いで、準備としてゲルを溶解し、ホットスターラー５に載せて溶解状態を維持しておく。更にシリンジを搬送手段１３の所定位置にセットする。そして、上述したとおり、ゲル保持器具１５を一次元目電気泳動槽１に案内用傾斜部を経て挿入し、載置部２１上に載置して支持した後、閉止体２５を、その突出部２７をゲル保持器具１５側に向けた状態で下降させて緩衝液溜部２２の上側に嵌合して図８に示すように、帯状板体１６間の隙間２０の両端側を閉止体２５により閉止された状態としておく。一方、二次元目電気泳動槽３においては、スラブ状ゲル４１を形成したプレート４０ａ，４０ｂを載置部３３に載置した後、装着溝３９に絶縁板３８を装着して、それらの下端を上側のプレート４０ａに当接させた状態としておく。また、上述した夫々の置き場に、制限酵素処理槽３の蓋、ろ紙ホルダー、コーム等をセットしておく。
【００５８】
次いでシリンジによる注入器具４６をホットスターラー５上に搬送して、溶解しているゲルを吸引し、これを一次元目電気泳動槽１に装着されているゲル保持器具１５上に搬送して、図１８に示すように横方向に移動しながらアガロースゲルをゲル保持器具１５の帯状板体１６間の隙間２０内に注入する。この注入により、溶解したゲルは図２以降に示すように、閉止体２５によって区画される隙間２０の下部空間に満たされる。
【００５９】
次いでハンドリング手段は搬送手段１３によりコーム４７を取ってきて、それを図１９に示すようにゲル保持器具１５の一方側のハンドリング部１８（スぺーサー１７）と閉止体２５の間において、帯状板体１６間の隙間２０に嵌合する。
【００６０】
こうしてゲルが固まるまで、例えばタイマーにより設定した所定時間待機し、ゲルが固まったら、図２０に示すように閉止体２５とコーム４７を取り外して所定の置き場まで搬送する。コーム４７の個所には電気泳動を行うサンプルを注入するウェル４８が形成されている。
【００６１】
次いで図２１に示すように、搬送手段１３に設置している注入手段のニードル４９により、電気泳動用緩衝液４５を緩衝液溜部２２に所定量注入する。
【００６２】
次いで図２２に示すように、微量ニードル５０により試薬ラック１０のサンプルを吸引して、これをウェル４８に注入し、この状態で図２３に示すように電気泳動を行う。ウェル４８内のサンプルを符号５１で示す。
【００６３】
次いで図２４に示すように搬送手段１３の適所に装置したニードル４９により緩衝液溜部２２内の緩衝液４５を吸い出して、図２５に示すように緩衝液溜部２２内を空にする。
【００６４】
次いで図２６に示すようにニードル４９により、今度は制限酵素処理用の緩衝液５３を緩衝液溜部２２に注入する。
【００６５】
次いで搬送手段１３のハンドリング手段５４により、図２７に示すようにゲル保持器具１５のハンドリング部１７を挟持して、ゲル保持器具１５を僅かに（例えば２ｍｍ程度）持ち上げて所定時間維持し、一次元目電気泳動槽１の載置部２１に接触していたゲル保持器具１５内のゲル４３を制限酵素処理用緩衝液５３に接触させ、そして所定時間経過後にゲル保持器具１５を下降させて載置部２１に載置しておく。
【００６６】
一方、搬送手段１３は、ニードル４９を試薬ラック１０に移動させ、試薬ラック１０から制限酵素溶液を所定量吸引した後、図２８、図２９に示すように制限酵素処理槽３において、ニードル４９を細長い溝３１に対応させて、横方向に移動させながら制限酵素溶液５６を細長い溝３１に注入する。
【００６７】
次いで搬送手段１３のハンドリング手段５４は、上述したように一次元目電気泳動槽１の載置部２１に載置されているゲル保持器具１５を制限酵素処理槽３に搬送し、それを下降して図３０に示すように載置部２８に載置する。
【００６８】
次いで、搬送手段１３のハンドリング手段５４によりろ紙ホルダー置き場１１からろ紙ホルダー５７を運び、図３１に示すようにろ紙５８をゲル保持器具１５の帯状板体１６間に位置させて、そこの緩衝液を吸い取る。
【００６９】
次いで図３２に示すようにろ紙ホルダー５７をろ紙ホルダー置き場１１に戻して、制限酵素処理槽３における処理が完了する。
【００７０】
次いでゲル保持器具１５の上部の細い隙間２０に制限酵素を注入し、この後、必要に応じて、即ち次の工程までに時間がある場合には、蓋置き場８から運んだ蓋を制限酵素処理槽３の上部に装着する。以上の状態で設定した時間維持することにより、細長い溝３１内の制限酵素溶液５６によりゲル保持器具１５の帯状板体１６間のゲル４３の制限酵素処理が行われる。
【００７１】
このようにこの実施の形態では、制限酵素処理槽３の載置部２８に構成した細長い溝３１内とゲル保持器具１５の上部の細い隙間２０に注入した必要最小限の制限酵素溶液５６により処理を行うので、高価な制限酵素の量を節約してコストの低減を図ることができる。
【００７２】
次いで、これまでの工程において一次元目電気泳動槽１に満たされている制限酵素処理用緩衝液５３を、図３３に示すようにニードル４９により吸い出して、図３４に示すように一次元目電気泳動槽１内を空にする。
【００７３】
次いで今度は、図３５に示すように、再びニードル４９により電気泳動用緩衝液４５を一次元目電気泳動槽１内に注入する。
【００７４】
一次元目電気泳動槽１内に所定量の緩衝液４５が注入されたら、制限酵素処理槽３に載置されているゲル保持器具１５を搬送手段１３のハンドリング手段５４により一次元目電気泳動槽１の上方に運び、図３６に示すように載置部２１に載置せずに、上方、例えば２ｍｍ程度上方に設定時間保持して、ゲル保持器具１５内のゲル４３を電気泳動用緩衝液４５に接触させ、設定時間経過後にゲル保持器具１５を下降させて載置部２１に載置して待機する。
【００７５】
次いで搬送手段１３のハンドリング手段は、ゲル保持器具１５を二次元目電気泳動槽２に運び、ここでゲル保持器具１５を横方向に方向転換させた後に、下降させて、ゲル４３の形成側をスラブ状ゲル４１側に向けて横支持部３５上に載置して支持し、この状態においてゲル保持器具１５内のゲル４３とスラブ状ゲル４１間に接続用のアガロースゲル４４を注入することにより、ゲル４３とスラブ状ゲル４１とを連結状態として電気泳動が可能な状態とする。こうして、上述したように二次元目の電気泳動が行われる。
【００７６】
本実施の形態では、二次元目電気泳動槽２はスラブ状ゲルを水平方向に支持する形式であるので、上述したとおり一次元目電気泳動槽１及び制限酵素処理槽３においては縦方向に支持してハンドリングしているゲル保持器具１５を横方向に回転する必要があり、上述した実施の形態では、このような回転をハンドリング手段に構成しているが、次に他の例を説明する。
【００７７】
即ち、図３７、図３８は回転手段の他の例を示すものであり、この回転手段はゲル保持器具１５の９０度回転装置１２と、図３７に示すようにゲル保持器具１５に構成した垂直及び水平支持用のハンドリング部１８，１８’とから構成している。
９０度回転装置１２は図３８に示すように直交する一対の支持板５９ａ，５９ｂを設けて９０度回転可能に装置したものであり、図３８の（ａ）〜（ｅ）の操作を経て９０度回転させるものである。
まず（ｂ）では一次元目電気泳動槽１内のゲル保持器具１５の垂直支持用のハンドリング部１８をハンドリング手段５４の把持部６０で挟んで支持し、この状態で９０度回転装置１２まで運んで、水平状態の支持板５９ａ上に載置する。次いで、（ｃ）に示すように把持部６０を外した後、支持板５９ａ，５９ｂを（ｄ）に示すように図中反時計回りに９０度回転させて、ゲル保持器具１５を横方向として支持板５９ｂにより支持し、この状態で（ｅ）に示すようにハンドリング手段５４の把持部６０で、今度は水平支持用のハンドリング部１８’を挟んで支持し、この状態で（ｆ）に示すように二次元目電気泳動槽２に運んで、上述したとおり横支持部３５に載置支持することができる。
【００７８】
以上に説明した実施の形態は、本発明の二次元電気泳動法を、機械化、自動化した二次元電気泳動装置により行う例であるが、本発明における二次元電気泳動法の実施は、人手により行うこともできるものである。
【００７９】
一方、以上の実施の形態では、一次元目電気泳動槽１及び二次元目電気泳動槽２の両方を水平式に構成しているが、これらはいずれも垂直式とすることもできるものである。
【００８０】
更に以上の実施の形態は、ＲＬＧＳ法を適用する場合のように、一次元目電気泳動過程と二次元目電気泳動過程との間に制限酵素処理過程を設ける場合について述べているが、本発明は、制限酵素処理過程を設けない二次元電気泳動法にも適用できるものである。
【００８１】
【発明の効果】
本発明は以上のとおりであるので、次のような効果がある。
ａ．一次元電気泳動を行うための細長いゲルは、細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成のゲル保持器具の、帯状板体間の隙間に形成するので、コームを利用することができ、このコームにより形成したウェル内にサンプルＤＮＡを注入することにより、一次元目電気泳動において確実にゲルの中にサンプルＤＮＡを流すことができる。従って細長いチューブ内にゲルを形成する方法のように、ＤＮＡがゲルとチューブの内壁間を流れてしまって、ゲル中に流れるＤＮＡの量がばらつき、データの再現性に問題が生じるということがない。
ｂ．ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に形成された細長いゲルは帯状板体間の隙間を介して外部と接するので、一次元電気泳動を行った細長いゲルをゲル保持器具から取り出さずに、そのまま二次元電気泳動槽に移動して、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うことができる。
ｃ．またＲＬＧＳ法を適用する場合のように、一次元目電気泳動過程と二次元目電気泳動過程との間に制限酵素処理過程を設ける場合においても、これらの過程の全てに渡って細長いゲルをゲル保持器具から取り出す必要がない。
ｄ．従って、ゲルの取り扱いが容易となり、ゲルの損傷を防止できると共に、ゲル保持器具をハンドリング手段でハンドリングする機構を構成することにより、機械化、自動化も容易である。
ｅ．本発明のゲル保持器具におけるゲルの形成は、例えば、一次元目電気泳動槽の緩衝液溜部間に位置する載置部上にゲル保持器具を載置した後、両端を閉止体により塞ぎ、この状態において、上方から溶解したゲルを注入するという操作を行うことにより、容易に帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成することができ、そして固化した後に閉止体を外すことにより電気泳動を行うことができる。
ｆ．一次元電気泳動と二次元電気泳動との間において、制限酵素処理を行う場合、制限酵素処理槽内には、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した細長い溝を形成し、この細長い溝に制限酵素を注入して、載置されるゲル保持器具の帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行う構成とすれば、必要最小限の量の制限酵素で経済的に所定の処理を行うことができる。
ｇ．本発明では、ゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽、及び制限酵素処理槽等を要素として、これらを平面上に配置することにより二次元電気泳動装置を容易に構成することができる。
ｈ．このような構成の二次元電気泳動装置では、上記要素を配置した空間の上方に搬送手段を移動可能に設置し、搬送手段に、ゲル保持器具を支持するハンドリング手段と、液の注入、排出手段を構成して、機械化、自動化した二次元電気泳動装置を構成することができる。
ｉ．水平支持式の二次元電気泳動槽に、スラブ状ゲルを挟持するプレートの両側に対応する絶縁板の装着溝を形成し、アクリルアミドゲルを用いる場合に絶縁板を装着すれば、電気泳動に際して電流が緩衝液の方に流れてしまうのを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用して構成した二次元電気泳動装置の平面上の構成を概念的に示す説明図である。
【図２】ゲル保持器具を示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【図３】ゲル保持器具を示す斜視図である。
【図４】一次元目電気泳動槽を示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ断面図、（ｃ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。
【図５】一次元目電気泳動槽を示す斜視図である。
【図６】一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素を示す拡散斜視図である。
【図７】一次元目電気泳動用ゲルを形成するための要素を装着した状態の平面図である。
【図８】図７のＣ−Ｃ断面図である。
【図９】制限酵素処理槽を示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＤ−Ｄ断面図、（ｃ）は（ｂ）のＥ−Ｅ断面図である。
【図１０】制限酵素処理槽とゲル保持器具との対応関係を示す拡散斜視図である。
【図１１】二次元目電気泳動槽を示す平面図である。
【図１２】図１１のＦ−Ｆ断面図である。
【図１３】二次元目電気泳動槽を示す斜視図である。
【図１４】二次元目電気泳動用のスラブ状ゲルとゲル保持器具を所定位置に装着した状態の平面図である。
【図１５】図１４のＧ−Ｇ断面図である。
【図１６】図１５の要部拡大図である。
【図１７】緩衝液を入れた状態の図１４のＧ−Ｇ断面図である。
【図１８】本発明の二次元電気泳動装置の動作を示す断面図である。
【図１９】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図１８の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２０】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図１９の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２１】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２０の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２２】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２１の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２３】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２２の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２４】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２３の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２５】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２４の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２６】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２５の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２７】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２６の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図２８】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２７の状態から進行した時点で示す平面図である。
【図２９】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２８の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３０】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図２９の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３１】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３０の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３２】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３１の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３３】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３２の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３４】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３３の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３５】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３４の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３６】本発明の二次元電気泳動装置の動作を図３５の状態から進行した時点で示す断面図である。
【図３７】本発明におけるゲル保持器具の回転機構の他の例を構成するゲル保持器具の斜視図である。
【図３８】本発明におけるゲル保持器具の回転機構の動作を示す説明図である。
【符号の説明】
１ 一次元目電気泳動槽
２ 二次元目電気泳動槽
３ 制限酵素処理槽
４ 装置本体
５ ホットスターラー
６ 閉止体置き場
７ コーム置き場
８ 蓋置き場
９ リンスポートエアーブロー
１０ 試薬ラック
１１ ろ紙ホルダー置き場
１２ ９０度回転装置
１３ 搬送手段
１４ 針補正ピン
１５ ゲル保持器具
１６ 帯状板体
１７ スペーサー
１８，１８’ ハンドリング部
１９ 蓋
２０ 隙間
２１ 載置部
２２ 緩衝液溜部
２３ 案内支持部
２４ 支持凸部
２５ 閉止体
２６ ハンドリング部
２７ 突出部
２８ 載置部
２９ａ，２９ｂ，２９ｃ 中空部
３０ 案内空間
３１ 細長い溝
３２ａ，３２ｂ，３２ｃ ホース接続部
３３ 載置部
３４ａ，３４ｂ 緩衝液溜部
３５ 横支持部
３６ 段部
３７ 側壁
３８ 絶縁板
３９ 装着溝
４０ａ，４０ｂ プレート
４１ スラブ状ゲル
４２ 傾斜部
４３ ゲル（一次元目）
４４ 接続用アガロースゲル
４５ 緩衝液（一次元目）
４６ 分注器具
４７ コーム
４８ ウェル
４９ ニードル
５０ 微量ニードル
５１ サンプル
５２ ハンドリング部
５３ 制限酵素用緩衝液
５４ ハンドリング手段
５５ 緩衝液（ニ次元目）
５６ 制限酵素溶液
５７ ろ紙ホルダー
５８ ろ紙
５９ａ，５９ｂ 支持板
６０ 把持部
Claims (15)
- 細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法において、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成して、この状態において一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動終了後に一次元目電気泳動槽から取り出したゲル保持器具を二次元目電気泳動槽に移動し、一次元目電気泳動を行った帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うことを特徴とする二次元電気泳動方法
- 細長いゲル保持器具により保持した細長いゲルにより一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動を行った細長いゲルを、スラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行う二次元電気泳動方法において、ゲル保持器具は対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持した構成とし、一次元目電気泳動槽内において帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成して、この状態において一次元目電気泳動を行うと共に、一次元目電気泳動終了後に一次元目電気泳動槽から取り出したゲル保持器具を制限酵素処理槽内に移動して、一次元目電気泳動を行った帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行うと共に、制限酵素処理終了後に制限酵素処理槽から取り出したゲル保持器具を二次元目電気泳動槽に移動し、一次元目電気泳動、制限酵素処理を行った帯状板体間のゲルを、二次元目電気泳動槽内のスラブ状ゲルの端縁に隣接させて二次元目電気泳動を行うことを特徴とする二次元電気泳動方法
- 一次元目電気泳動槽の緩衝液溜部間に位置する載置部上にゲル保持器具を載置した後、両端を閉止体により塞ぎ、この状態において、上方から溶解したゲルを注入して帯状板体間の隙間に一次元目電気泳動用ゲルを形成し、固化した後に閉止体を外して電気泳動を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の二次元電気泳動方法
- 制限酵素処理槽内の載置部にゲル保持器具を載置した後、ゲル保持器具の帯状板体間の上部に制限酵素を注入し、次いで乾燥防止用の蓋をした状態で帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行うことを特徴とする請求項２に記載の二次元電気泳動方法
- 制限酵素処理槽内には、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した細長い溝を形成し、この細長い溝に制限酵素を注入して、載置されるゲル保持器具の帯状板体間のゲルの制限酵素処理を行うことを特徴とする請求項２又は４に記載の二次元電気泳動方法
- 対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽を要素として、これらを平面上に配置して構成したことを特徴とする二次元電気泳動装置
- 対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成としたゲル保持器具と、このゲル保持器具を載置する載置部の両側に緩衝液溜部を構成した一次元目電気泳動槽と、スラブ状ゲルを支持し、その端縁側にゲル保持器具の支持部を形成した二次元目電気泳動槽と、ゲル保持器具の載置部に、ゲル保持器具の帯状板体間の隙間に対応した制限酵素注入用の細長い溝を形成した制限酵素処理槽を要素として、これらを平面上に配置して構成したことを特徴とする二次元電気泳動装置
- 要素を配置した空間の上方に搬送手段を移動可能に設置し、搬送手段には、ゲル保持器具を支持するハンドリング手段と、液の注入、排出手段を構成したことを特徴とする請求項６又は７に記載の二次元電気泳動装置
- 二次元目電気泳動槽はスラブ状ゲルを水平に支持する構成とし、そのスラブ状ゲルの端縁に対応してゲル保持器具の横支持部を設けたことを特徴とする請求項６〜８までのいずれか１項に記載の二次元電気泳動装置
- 二次元電気泳動槽には、スラブ状ゲルを挟持するプレートの両側に対応する絶縁板の装着溝を形成したことを特徴とする請求項９に記載の二次元電気泳動装置
- ハンドリング手段によりゲル保持器具を横方向に支持するためのゲル保持器具の回転手段を適所に構成したことを特徴とする請求項９又は１０に記載の二次元電気泳動装置
- 回転手段は、適所に設置したゲル保持器具の９０度回転台と、ゲル保持器具に構成した垂直及び水平支持用のハンドリング部とから構成し、ゲル保持器具を９０度回転台により回転させてハンドリング手段により支持するハンドリング部を垂直支持用から水平支持用に変更する構成としたことを特徴とする請求項１１に記載の二次元電気泳動装置
- 回転手段は、ハンドリング手段自体に構成したことを特徴とする請求項１１に記載の二次元電気泳動装置
- 対を成す細長い帯状板体を間隔を置いて平行に支持し、帯状板体間の隙間にゲルを形成して保持する構成とした二次元電気泳動用ゲル保持器具
- 対を成す細長い帯状板体はスぺーサーにより所定間隔に保持して一体に構成し、スペーサーは上側を帯状板体内から外部に突出させてハンドリング部に構成したことを特徴とする請求項１４に記載の二次元電気泳動用ゲル保持器具
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