CN102439460B - 多方向微流体装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多方向微流体装置及其使用方法。本发明的方面包括被配置为使样品经历两个或多个方向上不同的流动场并且包括分离介质和结合介质的微流体装置，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通。还提供使用所述装置以及包括所述装置的系统和试剂盒的方法。所述装置、系统和方法可用于各种不同的应用，包括诊断和验证分析。

Description

多方向微流体装置和方法
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2009年5月19日提交的申请号为61/179,649的美国临时专利申请和2009年11月2日提交的申请号为61/257,361的美国临时专利申请的申请日的优先权，这些申请经引用引用全部并入本文。
政府支持的引用
本发明是在国家卫生研究院的基金的部分政府支持下做出的，基金号为NIDCR5U01DE014961。政府对本发明享有一定权利。
背景技术
可以使用各种分析技术来检测给定样品中的特定分析物。例如，Western印迹法通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质然后通过用对目标蛋白特定的抗体探测可以用于检测样品中的蛋白质。Southern印迹法结合了电泳分离的DNA片段到滤膜的转移和通过探针杂交的后续片段检测。Northern印迹法涉及使用电泳根据尺寸分离RNA样品以及用与部分或全部目标序列互补的杂交探针检测。Eastern印迹法通过分析电泳分离的转移修饰后的蛋白质能够用于检测转移修饰后的蛋白质，所述转移修饰使用针对脂类、糖类、磷酸化或任何其他蛋白质修饰特定的探针。Far-Western印迹法与Western印迹法类似，但是使用非抗体蛋白质结合所关注的蛋白质，并因此能够用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。Southwest印迹法是能够用于检测DNA结合蛋白质的技术，其通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质然后用基因组DNA片段探测。
如上所述，传统印迹技术可能达不到需要高效样品分析或在资源匮乏的环境下操作的应用性能要求。印迹技术可能需要由受过培训的技师进行的劳动密集、耗时、多步骤程序，并因此可能不适用于在临床环境中使用。
发明内容
提供多方向微流体装置及其使用方法。本发明的方面包括被配置为使样品经历两个或多个在方向上不同的流动场并且包括分离介质和结合介质的微流体装置，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通。还提供使用所述装置的方法以及包括所述装置的系统和试剂盒。所述装置、系统和方法可用于各种不同的应用，包括诊断和验证分析。
附图说明
图1A示出了传统免疫印记程序的示意图。图1B示出了根据本说明书的实施方案检测样品中分析物存在的方法的示意图。图1C示出了根据本说明书的实施方案的微流体装置的示意图以及微流体装置中结合介质的明场和荧光图像。
图2示出了根据本说明书的实施方案的在将分离的样品转移至结合介质之前(图2A)和之后(图2B)的蛋白质的电泳图。
图3示出了根据本说明书的实施方案的使用阳性和阴性蛋白对照检测分析特异性的实验的荧光图像。图像示出了与通道内抗体功能化的膜结合的蛋白质的荧光。
图4A示出了根据本说明书的实施方案的与微流体装置中的抗体功能化的结合介质结合的蛋白质的剂量响应荧光图像。图4B示出了根据本说明书的实施方案的针对与结合介质结合的分析物的荧光信号对蛋白质浓度的图。
图5A示出了根据本说明书的实施方案的包括分离介质的微流体装置的示意图。图5B示出了使用根据本说明书的实施方案的微流体装置的宽分子范围蛋白梯的高分辨电泳分析。
图6示出了根据本说明书的实施方案的8％总丙烯酰胺凝胶(上图)和4％总丙烯酰胺凝胶(下图)的5个低分子量蛋白质的电泳图。
图7A示出了根据本说明书的实施方案的微流体装置的示意图。图7B示出了根据本说明书的实施方案的样品中分析物的分离、转移和检测。
图8示出了根据本说明书的实施方案的针对样品中多个分析物的多元分析配置的微流体装置的示意图。
图9A示出了根据本说明书的实施方案的包括分离介质上游的浓缩介质的微流体装置的示意图和图像(插图)。图9B示出了根据本说明书的实施方案的通过包括分离介质上游的浓缩介质的微流体装置的样品的电泳运动的图像。
图10示出了根据本说明书的实施方案的将所关注的分析物从第一微流体通道选择性转移至第二微流体通道的图像。
图11示出了根据本说明书的实施方案的结合介质的示意图和暴露于阴性和阳性对照的结合介质的图像。
图12A示出了根据本说明书的实施方案的包括容纳加载介质、分离介质和结合介质的腔室(插图)的微流体装置的明场图像。图12B示出了根据本说明书的实施方案的腔室的图像。图12C示出了根据本说明书的实施方案的包括腔室的微流体装置的示意图。图12D示出了根据本说明书的覆盖有样品中分析物的分离、转移和检测的示意图的图像。
图13示出了根据本说明书的实施方案的在微流体装置中分离蛋白梯的图像和曲线图。
图14A示出了根据本说明书的实施方案的使用微流体装置分离荧光标记的蛋白质的图像。图14B示出了根据本说明书的实施方案的在微流体装置中将荧光标记的蛋白质从分离介质转移到结合介质的图像。
图15A至图15D示出了根据本说明书的实施方案的针对微流体装置的模拟电场分布的图像。图15E至图15F示出了根据本说明书的实施方案的测试施加的电场的均匀性的微流体装置的图像。
图16示出了根据本说明书的实施方案的在具有和不具有电压整形的情况下通过微流体装置的样品的电动运动的CCD图像。
图17示出了根据本说明书的实施方案的覆盖有样品中多个分析物的分离、转移和检测的示意图的图像。
图18示出了根据本说明书的实施方案的样品中多个分析物的分离、转移和检测的图像。
图19示出了根据本说明书的实施方案的样品中分析物的分离、转移和检测对阴性对照的图像。
图20示出了根据本说明书的实施方案的样品中多个分析物的多元检测的图像。
图21示出了根据本说明书的实施方案的抗原捕获效率对结合介质宽度(μm)的曲线图。
具体实施方式
提供多方向微流体装置及其使用方法。本发明的方面包括被配置为使样品受两个或多个方向上的不同电场作用并且包括分离介质和结合介质的微流体装置，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通。还提供使用所述装置的方法以及包括所述装置的系统和试剂盒。所述装置、系统和方法可用于各种不同的应用，包括诊断和验证分析。
本说明书的方面包括用于检测液体样品中的分析物并且被配置成使样品经历在两个或多个方向上不同流动场的微流体装置，其中所述微流体装置包括：具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；以及具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通。
在某些实施方案中，所述分离介质包括聚合物凝胶。在某些情况下，所述结合介质包括稳定地与支撑体结合的结合构件。在某些情况下，所述支撑体包括膜。在某些情况下，所述支撑体包括聚合物凝胶。所述微流体装置的某些实施方案包括结合构件，所述结合构件包括蛋白质或其结合片段。例如，所述蛋白质可以是抗体。在某些情况下，所述分析物包括荧光标记。
在某些实施方案中，所述第二方向轴与所述第一方向轴正交。在某些情况下，所述微流体装置包括容纳所述分离介质和所述结合介质的腔室。
本说明书的方面还包括检测液体样品中的分析物的方法。所述方法包括：将液体样品引入微流体装置中，所述微流体装置被配置为使样品经历在两个或多个方向上不同的流动场；使样品通过分离介质以产生分离的样品；以及检测分离的样品中的分析物。如上所述，所述微流体装置包括：具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；以及具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体联通。
在某些实施方案中，所述方法包括将分离的样品转移到所述结合介质。在其他实施方案中，所述方法包括将结合构件转移到分离的样品。在某些情况下，所述方法还包括在使样品通过所述分离介质以制备分离的样品之前浓缩所述样品。
本方法的实施方案包括所述方法为诊断方法。另外，在某些情况下，所述方法为验证方法。
本说明书的方面还包括用于检测液体样品中分析物的系统。所述系统包括本文所述的微流体装置和检测器。如上所述，微流体装置被配置为使样品经历两个或多个在方向上不同的流动场，其中所述微流体装置包括：具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；和具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通。
在某些实施方案中，所述检测器为光电倍增管(PMT)、电荷耦合装置(CCD)、增强型电荷耦合装置(ICCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器、目视比色读出器(visual colorimetric readout)或光电二极管。在某些情况下，所述系统还包括被配置为引导液体通过微流体装置的微流体部件。
本说明书的方面还包括试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的微流体装置和缓冲液。如上所述，所述微流体装置包括：具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；和具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通。
下面，首先更详细地描述本发明的微流体装置。还公开了使用本发明的微流体装置的检测液体样品中分析物的方法。另外，还描述包括本发明的微流体装置的系统和试剂盒。
微流体装置
本说明书的实施方案包括多方向微流体装置。“多方向的”是指多于1个方向，例如两个或多个方向，三个或多个方向，四个或多个方向，等等。在某些实施方案中，在一个平面中包括两个或多个方向，以使所述两个或多个方向是共平面的。在某些情况下，所述两个或多个方向不是共平面的，以使两个方向包括在不同的、相交的平面中。在这些情况下，所述两个或多个方向可以是多方向的。“多维的”是指多于一维，例如二维的、三维的，等等。多维的方向可以占据三维空间的区域。例如，非共平面的两个方向可以各自包括在不同的、相交的平面中，以使包括所述两个方向的相交的平面占据三维空间的区域。
在某些实施方案中，所述微流体装置被配置为在多于一个方向(例如所述微流体装置为多方向的)上引导液体，如两个或多个方向，三个或多个方向，四个或多个方向，等等。例如，所述微流体装置可以被配置为在两个方向、三个方向、四个方向等上引导液体。在某些情况下，微流体装置为多维的。例如，微流体装置可以被配置为在两个或多个方向上引导液体，其中所述两个或多个方向不是共平面的，以使所述两个或多个方向包括在两个或多个不同的、相交的平面中。在这些情况下，包括两个或多个方向的相交平面可以占据三维空间的区域。例如，微流体装置可以包括在基板中，以使微流体装置为平面的。微流体装置可以被配置为在该平面内沿着多个方向引导液体。在某些实施方案中，微流体装置被配置为以多个维度引导液体，例如三维。例如，微流体装置可以被配置为沿着相同平面内的多个方向引导液体，以及沿着非共面的方向引导液体，以使微流体装置被配置为三维微流体装置。
在某些实施方案中，微流体装置包括分离介质。分离介质可以被配置为将样品中的分析物彼此分离。在某些情况下，分离介质被配置为根据分析物的物理性质分离样品中的分析物。例如，分离介质可以被配置为根据分析物的分子量、尺寸、电荷(例如荷质比)、等电点等分离分析物。在某些情况下，分离介质被配置为根据分析物的分子量分离样品中的分析物。在某些情况下，分离介质被配置为根据分析物的等电点(例如等电点聚焦)分离样品中的分析物。分离介质可以被配置为将样品中的分析物分离成分析物的不同的可检测带。“带”是指不同的可检测区域，在所述区域中分析物的浓度明显高于周围区域。分析物的每个带可以包括单一分析物或若干分析物，其中分析物的单一带中的每种分析物具有基本相似的上述物理性质。
在某些实施方案中，分离介质被配置为在样品穿过分离介质时分离样品中的分析物。在某些情况下，分离介质被配置为当样品流过分离介质时分离样品中的分析物。分离介质的方面包括分离介质具有流动路径，所述流动路径具有方向轴。“流动路径”是指液体样品在其运动时经过的方向。在某些情况下，流动路径为当样品穿过如分离介质、结合介质等介质时样品穿过的方向。如以上指出的，分离介质可以具有流动路径，所述流动路径具有方向轴。在某些实施方案中，分离流动路径的方向轴与分离介质的长度对准。在这些实施方案中，样品沿着分离介质的分离流动路径的方向穿过分离介质(例如，样品可以沿着分离介质的长度穿过分离介质)。在某些情况下，分离介质的长度大于分离介质的宽度，例如为分离介质宽度的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍等。在某些情况下，分离介质的分离流动路径通过通道如微流体通道限定。分离介质可以包括在微流体通道中，以使在样品流经微流体通道时样品穿过分离介质。
在某些实施方案中，分离介质包括聚合物，如聚合物凝胶。聚合物凝胶可以是适用于凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可以包括，但不限于，聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。分离介质的分离度可能取决于各种因素，例如，但不限于，孔径、总聚合物含量(例如总丙烯酰胺含量)、交联剂浓度、施加的电场、分析时间等。例如，分离介质的分离度可能取决于分离介质的孔径。在某些情况下，孔径取决于分离介质的总聚合物含量和/或分离介质中交联剂的浓度。在某些情况下，分离介质被配置为解析分子量差小于或等于10,000Da的分析物，例如小于或等于7,000Da，包括小于或等于5,000Da，或小于或等于2,000Da，或小于或等于1,000Da，例如小于或等于500Da，或小于或等于100Da。在某些情况下，分离介质可以包括聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶具有1％至20％的总丙烯酰胺含量，例如3％至15％，包括5％至10％。
在某些情况下，微流体装置包括位于分离介质上游的浓缩介质。“上游”是指靠近液体流的源。浓缩介质可以被配置为在样品接触分离介质之前浓缩样品。浓缩介质可以包括聚合物凝胶，如具有小孔径的聚合物凝胶。例如，浓缩介质可以包括聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶具有5％至10％的总丙烯酰胺含量，例如5％至9％，包括5％至8％，或5％至7％。在某些情况下，浓缩介质具有6％的总聚丙烯酰胺含量。在某些实施方案中，浓缩介质包括膜，如尺寸排阻膜。浓缩介质的小孔径可以减慢样品通过浓缩介质的电泳运动，从而在样品接触分离介质之前将其浓缩。在某些情况下，浓缩膜被配置为将样品浓度提高到2倍或更多，4倍或更多，10倍或更多，25倍或更多，50倍或更多，100倍或更多，500倍或更多，1000倍或更多，2500倍或更多，等等。
在某些实施方案中，本发明的微流体装置包括位于分离介质下游的结合介质。“下游”是指位于液体流的源的远端。结合介质可以具有标记流动路径，所述标记流动路径具有方向轴。在某些情况下，标记流动路径为样品或分析物穿过结合介质时样品经过的方向。样品或分析物可以沿着结合介质的标记流动路径的方向穿过结合介质(例如，样品可以沿着结合介质的方向轴穿过分离介质)。结合介质可以具有与分离介质的方向轴相同或不同的方向轴。例如分离介质可以具有第一方向轴，而结合介质可以具有第二方向轴。第一方向轴可以沿着与第二方向轴相同的方向排列。在某些情况下，第一方向轴沿着与第二方向轴不同的方向排列。在第一方向轴沿着与第二方向轴不同的方向排列的情况下，微流体装置为上述多维(例如多方向)微流体装置。例如，第二方向轴可以与第一方向轴呈小于或等于180度的角度，例如与第一方向轴呈小于或等于150度，小于或等于135度，包括小于或等于120度，小于或等于90度，小于或等于60度，小于或等于45度，或小于或等于30度的角度。在某些实施方案中，第二方向轴与第一方向轴正交。
在某些情况下，结合介质包括聚合物，例如聚合物凝胶或聚合物单块。单块是指单一连续结构。单块可以包括具有相同物理化学组成的单一区域，或者可以包括在其物理和化学组成方面不同的两个或多个区域。聚合物凝胶可以是适用于凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可以包括，但不限于，聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。在某些情况下，结合介质可以包括聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶具有1％至20％的总丙烯酰胺含量，例如3％至15％，包括5％至10％。聚合物单块可以是适用于色谱法的单块。聚合物单块可以包括，但不限于，丙烯酸酯聚合物、烷基丙烯酸酯聚合物、烷基丙烯酸烷基酯聚合物、其共聚物等。在某些情况下，结合介质包括膜。膜可以包括硝化纤维素膜、聚合物膜等。在某些情况下，结合介质包括珠粒。珠粒可以包括硝化纤维素珠粒、聚合物珠粒、其组合等。
在某些实施方案中，结合介质可以被配置为结合并固定所关注的分析物。在某些情况下，与结合介质结合的分析物有利于分析物的检测。例如，结合介质可以包括与支撑体稳定地缔合的结合膜。“稳定地缔合”是指在标准条件下一部分与另一部分或结构结合或以其他方式缔合。在某些情况下，支撑体为上述聚合物凝胶或膜。键可以包括共价键和非共价相互作用，例如，但不限于，离子键、疏水作用、氢键、范德华力(例如伦敦色散力)、偶极偶极相互作用等。在某些实施方案中，结合构件可以与支撑体共价地结合，如与支撑体交联或共聚。结合构件与支撑体之间的共价键包括涉及反应性基团的共价键，所述反应性基团例如但不限于以下基团：戊二醛，其利用双官能连接剂戊二醛与结合构件和支撑体的氨基/酰胺基形成共价键；甲基丙烯酸缩水甘油酯，其利用与结合构件共价结合的缩水甘油基官能团(即环氧官能团)和与支撑体结合的丙烯酸酯基团；4-硝基苯基甲基丙烯酸酯，其能够用于酰化结合构件的氨基从而与支撑体共价结合；N-羟基琥珀酰亚胺基丙烯酸酯(NHS-丙烯酸酯)，其利用N-羟基琥珀酰亚胺基与结合构件上的氨基相互作用从而合并到支撑体中。
结合构件可以是特定地结合目标的蛋白质或核酸序列或生物大分子(例如所关注的分析物)的任何分子。根据分析物的性质，结合构件可以为但不限于(a)用于检测核酸的与目标DNA或RNA序列的独特区域互补的DNA单链；(b)用于检测蛋白质和肽的针对肽分析物的表位的抗体；(c)任何识别分子，如特定的结合对的构件。例如，合适的特定结合对包括但不限于受体/配体对的构件；受体的配体-结合部分；抗体/抗原对的构件；抗体的抗原-结合片段；半抗原；凝集素/碳水化合物对的构件；酶/底物对的构件；生物素/抗生物素蛋白；生物素/链霉亲合素；异羟基洋地黄毒苷原/异羟基洋地黄毒苷抗体；DNA或RNA适配体结合对的构件；肽适配体结合对的构件；等等。
在某些实施方案中，结合构件包括抗体。结合构件抗体可以特定地与所关注的分析物结合。在某些情况下，如上所述，结合构件与支撑体稳定地缔合。支撑体-结合的结合构件可以被配置为特定地与所关注的分析物结合。这样，将所关注的分析物与支撑体-结合的结合构件特定地结合可以间接地将所关注的分析物与支撑体结合。将所关注的分析物与支撑体结合可以使分析物与支撑体稳定地缔合，并由此有利于检测所关注的分析物。
在某些实施方案中，两个或多个不同的结合构件与结合介质稳定地缔合。所述两个或多个不同的结合构件可以特定地与相同或不同的分析物结合。在某些情况下，所述两个或多个不同的结合构件可以特定地与相同的分析物结合。例如，所述两个或多个不同的结合构件可以包括对相同分析物上不同表位特异的不同的抗体。在其他情况下，所述两个或多个不同的结合构件可以特定地与不同分析物结合。例如，所述两个或多个结合构件可以包括对不同分析物上的表位特异的不同抗体。
微流体装置的方面包括分离介质与结合介质液体连通的实施方案。在某些实施方案中，结合介质被布置在分离介质的下游。微流体装置可以被配置为首先引导样品通过分离介质以制备分离的样品。在某些情况下，分离介质与结合介质彼此液体连通但是彼此不直接物理接触。例如，分离介质可以与通道或其他介质液体连通，所述通道或其他介质反过来与结合介质液体连通。在某些实施方案中，微流体装置被配置为使分离介质与结合介质互相直接液体连通。例如，分离介质可以与结合介质直接接触。在某些情况下，分离介质与结合介质彼此结合，例如共聚。分离介质与结合介质直接液体连通的实施方案可以有利于组成部分(moieties)从分离介质向结合介质的转移或组成部分从结合介质向分离介质的转移而具有最小的组成部分损失。在某些情况下，微流体装置被配置为使组成部分定量地从一种介质向另一种介质转移(例如从分离介质向结合介质，或从结合介质向分离介质)。
在某些实施方案中，微流体装置被配置为引导被分离的样品通过结合介质。在某些情况下，微流体装置被配置为使样品或分析物从分离介质穿过到达中间通道或介质，然后穿过结合介质。在其他情况下，微流体装置被配置为使分离介质和结合介质彼此直接液体连通，以使样品或分析物能够直接穿过分离介质到达结合介质。如上所述，结合介质可以包括结合构件，为了检测被分离的样品中所关注的分析物，所述结合构件被配置为与分析物结合。
在某些情况下，结合介质包括未与结合介质结合的结合构件。例如，结合介质可以包括混悬或溶解在液体如缓冲液中的结合构件。在这些情况下，装置被配置为从结合介质向分离介质引导结合构件。例如，装置可以被配置为从结合介质向分离介质的分离路径引导结合构件。如上所述，为了检测被分离的样品中所关注的分析物，结合构件可以被配置为与分析物结合。在某些情况下，微流体装置被配置为使结合构件穿过结合介质到达中间通道或介质然后穿过分离介质。在其他情况下，微流体期间被配置为使结合介质与分离介质彼此直接液体连通，以使结合构件能够直接穿过结合介质到达分离介质。
在某些情况下，微流体装置被配置为使样品经历两个或多个在方向上不同的流动场。“流动场”是指这样的区域，即在所述区域中组成部分沿着基本相同的方向穿过该区域。例如，流动场可以包括这样的区域，在所述区域中移动的组成部分沿着基本相同的方向运动通过介质。流动场可以包括介质，如分离介质、结合介质、加载介质等，其中，组成部分，如缓冲液、分析物、试剂等，沿着基本相同的方向运动通过介质。流动场可以通过施加的电场、压力差、电渗等来诱导。在某些实施方案中，两个或多个流动场可以是方向不同的。例如，第一流动场可以与分离介质的分离流动路径的方向轴一致。第一流动场可以被配置为引导样品或分析物沿着分离流动路径通过分离介质。第二流动场可以与结合介质的标记流动路径的方向轴一致。在某些情况下，第二流动场被配置为引导样品或分析物沿着标记流动路径通过结合介质。第二流动场可以被配置为引导样品或分析物通过结合介质，以使所关注的分析物与其特定的结合构件接触。在某些情况下，第二流动场被配置为引导结合构件沿着标记流动路径通过结合介质。第二流动场可以被配置为引导结合构件通过结合介质，以使结合构件与其特定的所关注的分析物接触。如上所述，在某些情况下，标记流动路径的方向轴与分离流动路径的方向轴正交。在这些情况下，第二流动场可以与第一流动场正交。
在某些实施方案中，微流体装置被配置为使样品经历两个或多个在方向上不同的电场。电场可以有利于样品通过微流体装置的运动(例如样品从微流体装置的一个区域电动移动至微流体装置的另一个区域)。如上所述，电场还可以促进用电泳(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE))分离样品中的分析物。例如，电场可以被配置为引导样品中的分析物通过微流体装置的分离介质。电场可以被配置为促进根据分析物的物理性质分离样品中的分析物。例如，电场可以被配置为促进根据分析物的分子量、尺寸、电荷(例如荷质比)、等电点等分离分析物。在某些情况下，电场被配置为促进根据分析物的分子量分离样品中的分析物。在某些情况下，电场被配置为促进根据分析物的等电点分离样品中的分析物。
在某些实施方案中，两个或多个电场可以是在方向上不同的。例如，第一电场可以与分离介质的分离流动路径的方向轴对准。第一电场可以被配置为引导样品或分析物沿着分离流动路径通过分离介质。第二电场可以与结合介质的标记流动路径对准。在某些情况下，第二电场被配置为引导样品或分析物沿着标记流动路径通过结合介质。第二电场可以被配置为引导样品或分析物通过结合介质，以使所关注的分析物与其特定的结合构件接触。在某些情况下，第二电场被配置为引导结合构件沿着标记流动路径通过结合介质。第二电场可以被配置为引导结合构件通过结合介质，以使结合构件接触其特定的所关注的分析物。如上所述，在某些情况下，标记流动路径的方向轴与分离流动路径的方向轴正交。在这些情况下，第二电场可以与第一电场正交。
在某些实施方案中，微流体装置包括被配置为产生电场的一个或多个电场发生器。电场发生器可以被配置为对微流体装置的不同区域施加电场，所述不同区域诸如分离介质、结合介质、加载介质等中的一个或多个。电场发生器可以被配置为通过微流体装置中的各种介质电动地传输样品中的分析物和组成部分。在某些情况下，电场发生器可以靠近微流体装置，如布置在微流体装置上。在某些情况下，电场发生器位于离微流体装置一段距离。例如，电场发生器可以包括在检测分析物的系统中，下面将更详细地描述所述系统。
微流体装置的方面包括转移流动路径。转移流动路径可以与结合介质的标记流动路径液体连通。例如，转移流动路径可以位于结合流动路径的下游。如上所述，结合介质可以包括特定地结合所关注的分析物的结合构件。不关注的组成部分不被结合构件结合并且可以穿过结合介质而不与结合构件结合。在某些实施方案中，转移流动路径被配置为引导不关注的组成部分离开结合介质。例如，转移流动路径可以被配置为将穿过结合介质而未与结合构件结合的不关注的组成部分引导出结合介质。在某些实施方案中，转移流动路径被配置为引导组成部分通过结合介质或在结合介质中进行化学或物理处理。例如，可以使解析的分析物通过化学变性剂、重折叠(refolding)化合物、洗涤剂等。
在某些情况下，转移流动路径的下游端与废物储存器液体连通，以使转移流动路径被配置为将不关注的组成部分引导至废物存储器。在某些情况下，转移流动路径的下游端与二级分析装置液体连通，以使转移流动路径被配置为将通过结合介质而未与结合构件结合的组成部分引导至二级分析装置用于所述组成部分的进一步表征。二级分析装置可以包括但不限于UV光谱仪和IR光谱仪、质谱仪、HPLC、亲和力分析装置等。在某些情况下，二级分析装置被包括在与微流体装置相同的基板上。在这些实施方案中，可以在单一基板上提供微流体装置和二级分析装置用于通过一个或多个不同分析技术分析样品。在某些实施方案中，作为系统的部分包括二级分析装置，其中系统包括微流体装置和一个或多个单独的二级分析装置。如上所述，微流体装置和二级分析装置可以彼此液体连通，以使通过微流体装置的组成部分可以被引导至二级分析装置用于这些组成部分的进一步表征。
在某些方面，如图1C和图7A中所示，按照独立通道的不同长度提供分离和结合介质。在这些实施方案中，微流体装置被配置为包括彼此液体连通的微流体通道。微流体通道可以是通道长度大于通道宽度的细长通道。例如，微流体通道的长度可以比微流体通道的宽度大，例如为微流体通道宽度的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍等。
微流体装置可以包括分离通道，所述分离通道包括分离介质，如上所述。微流体装置可以包括结合通道，所述结合通道包括结合介质，如上所述。在某些情况下，分离通道与结合通道液体连通，以使分离通道中的分离介质与结合通道中的结合介质液体连通。微流体装置的某些实施方案包括分离通道和结合通道，其中分离通道具有第一方向轴而结合通道具有第二方向轴。第一方向轴和第二方向轴可以沿着彼此相同的方向排列或者可以沿着彼此不同的方向排列。例如，分离通道的方向轴可以与结合通道呈小于或等于180度的角度，例如与结合通道呈小于或等于150度、小于或等于135度、包括小于或等于120度、小于或等于90度、小于或等于60度、小于或等于45度或小于或等于30度的角度。在某些实施方案中，结合通道的方向轴与分离通道的方向轴正交。
微流体通道的实施方案可以由任何合适的材料形成，所述合适的材料与微流体装置相容并且与微流体装置中使用的样品、缓冲液、试剂等相容。在某些情况下，微流体通道由相对于在本发明的微流体装置和方法中使用的样品、缓冲液、试剂等惰性(例如，不降解或反应)的材料形成。例如，微流体通道可以由以下材料形成：例如，但不限于，玻璃、石英、聚合物、弹性体、纸、其组合等。
在某些实施方案中，微流体通道具有1μm至500μm，例如5μm至300μm、包括10μm至200μm，例如50μm至150μm的宽度。在某些情况下，微流体通道具有100μm的宽度。在某些实施方案中，微流体通道具有1μm至200μm，例如5μm至100μm，包括10μm至50μm的深度。在某些情况下，微流体通道具有25μm的深度。
在某些情况下，微流体装置包括一个或多个样品输入口。样品输入口可以被配置为允许样品被引入到微流体装置中。样品输入口可以与分离介质液体连通。在某些情况下，样品输入口与分离介质的上游端液体连通。样品输入口还可以包括被配置为防止液体流出样品输入口的结构。例如，样品输入口可以包括盖、阀门、密封件等，所述盖、阀门、密封件等例如可以被刺穿或打开以允许将样品引入微流体装置然后被重新密封或关闭以基本上防止液体包括样品和/或缓冲液流出样品输入口。
图1C示出了微流体装置10的示意图。微流体装置10包括与结合介质12液体连通的分离介质11。微流体装置10还包括不同的入口和出口，例如液体入口13、废物出口14、样品入口15、液体出口16、液体入口17和液体出口18。液体出口16可以被配置为根据需要将被分离的分析物引导至废物储存器或下游的二级分析装置。类似地，液体出口18可以被配置为根据需要将未结合的分析物引导至废物储存器或下游的二级分析装置。图1C还示出了微流体装置内的结合介质的明场图像和荧光图像。
图7A还示出了微流体装置700的示意图，所述微流体装置700包括彼此液体连通的微流体通道，如上所述。微流体装置700包括分离通道701，所述分离通道701包括分离介质702。分离通道与包括结合介质704的结合通道703液体连通。微流体装置700还可以包括各种入口和出口，例如，但不限于以下入口和出口：液体入口705，其可以被配置为将液体引导至微流体装置700中；废物出口706，其可以被配置为将废液引导出微流体装置700；样品入口707，其可以被配置为将样品引导至分离介质上游的微流体装置700中；液体出口708，其可以被配置为根据需要将未转移至结合通道703的被分离的分析物引导至废物储存器或下游的二级分析装置；液体入口709，其可以被配置为将液体引导至转移通道711中；以及液体出口710，其可以被配置为根据需要将未结合的分析物引导至废物储存器或下游的二级分析装置。
在某些方面中，在单一的共同腔室中提供分离和结合介质，如图12至图16中所示。在这些实施方案中，微流体装置包括腔室。腔室可以包括分离介质和结合介质。如上所述，分离介质可以与结合介质液体连通，例如与结合介质直接物理接触。在某些情况下，分离介质与结合介质结合，例如与结合介质共聚或交联。这样，腔室可以被配置为包含彼此液体连通的分离介质和结合介质。腔室可以被配置为包含分离介质和结合介质，以使分离介质的分离流动路径在结合介质的标记流动路径的上游。
除了分离介质和结合介质之外，腔室还可以包括加载介质。加载介质可以与分离介质液体连通。在某些情况下，加载介质与分离介质直接物理接触。例如，加载介质可以与分离介质结合，例如与分离介质共聚或交联。加载介质可以位于分离介质的上游，以使样品在与分离介质接触之前与加载介质接触。在某些实施方案中，加载介质促进使样品与分离介质接触。例如，加载介质可以被配置为在样品接触分离介质之前浓缩样品。在某些实施方案中，加载介质可以包括具有不同物理和/或化学性质的两个或多个区域。加载介质可以包括负载区域和堆积区域。加载介质可以被配置为包括在堆积区域上游的加载区域。
在某些实施方案中，加载介质包括聚合物，例如聚合物凝胶。聚合物凝胶可以是适用于凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可以包括，但不限于，聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。在某些情况下，负载区域包括具有大孔径的聚合物凝胶。例如，负载区域可以包括具有小于或等于5％，例如小于或等于4％，包括小于或等于3％或者小于或等于2％的总丙烯酰胺含量的聚丙烯酰胺凝胶。在某些情况下，负载区域具有3％的总聚丙烯酰胺含量。在某些情况下，加载介质的堆积区域可以被配置为在样品接触分离介质之前浓缩样品。堆积区域可以包括具有小孔径的聚合物凝胶。例如，堆积区域可以包括具有5％至10％，例如5％至9％，包括5％至8％，或5％至7％的总丙烯酰胺含量的聚丙烯酰胺凝胶。在某些情况下，堆积区域具有6％的总聚丙烯酰胺含量。堆积区域的小孔径可以减慢样品通过堆积区域的电泳运动，由此在样品接触分离介质之前将其浓缩。
在某些情况下，腔室含有加载介质、分离介质和结合介质。如上所述，腔室可以被配置为含有加载介质、分离介质和结合介质，以使加载介质、分离介质和结合介质彼此液体连通。例如，腔室可以包括具有不同区域的连续的聚合物凝胶。连续的聚合物凝胶的每个区域可以具有不同的物理和/或化学性质。连续的聚合物凝胶可以包括具有加载介质的第一区域，具有分离介质的第二区域以及具有结合介质的第三区域。聚合物凝胶的每个区域的流动路径可以被配置为使样品首先接触加载介质，然后接触分离介质并且最后接触结合介质。
在某些实施方案中，聚合物凝胶具有0.1mm至5mm，例如0.2mm至2.5mm，包括0.5mm至1.5mm的宽度。在某些情况下，聚合物凝胶具有1.0mm的宽度。在某些情况下，聚合物凝胶具有0.5mm至5mm，例如0.5mm至3mm，包括1mm至2mm的长度。在某些情况下，聚合物凝胶具有1.5mm的长度。在某些情况下，包括加载介质的聚合物凝胶第一区域的宽度为0.1mm至5mm，例如0.2mm至2.5mm，包括0.5mm至1.5mm。在某些情况下，包括加载介质的聚合物凝胶第一区域具有0.9mm的宽度。在某些情况下，包括加载介质的聚合物凝胶第一区域的长度为0.1mm至2mm，例如0.1mm至1mm，包括0.1mm至0.5mm。在某些实施方案中，包括加载介质的聚合物凝胶第一区域具有0.2mm的长度。在某些情况下，包括分离介质的聚合物凝胶第二区域的宽度为0.1mm至5mm，例如0.2mm至2.5mm，包括0.5mm至1.5mm。在某些情况下，包括分离介质的聚合物凝胶第二区域具有0.9mm的宽度。在某些情况下，包括分离介质的聚合物凝胶第二区域的长度为0.5mm至5mm，例如0.5mm至3mm，包括1mm至2mm。在某些情况下，包括分离介质的聚合物凝胶第二区域具有1.3mm的长度。在某些情况下，包括结合介质的聚合物凝胶第三区域的宽度为0.01mm至2mm，例如0.01mm至1mm，包括0.05mm至0.5mm。在某些情况下，包括结合介质的聚合物凝胶第三区域具有0.1mm的宽度。在某些情况下，包括结合介质的聚合物凝胶第三区域的长度为0.5mm至5mm，例如0.5mm至3mm，包括1mm至2mm。在某些情况下，包括结合介质的聚合物凝胶第三区域具有1.5mm的长度。
在某些实施方案中，微流体装置的宽度为10cm至1mm，例如5cm至5mm，包括1cm至5mm。在某些情况下，微流体装置的长度为100cm至1mm的长度，例如50cm至1mm，包括10cm至5mm，或1cm至5mm。在某些方面，微流体装置具有小于或等于1000cm2的面积，例如小于或等于100cm2，包括小于或等于50cm2，例如小于或等于10cm2，或小于或等于5cm2，或小于或等于3cm2，或小于或等于1cm2，或小于或等于0.5cm2，或小于或等于0.25cm2，或小于或等于0.1cm2。
在某些实施方案中，微流体装置基本上是透明的。“透明”是指物质允许可见光通过该物质。在某些实施方案中，透明的微流体装置有利于检测与结合介质结合的分析物，例如包括可检测的标记如荧光标记的分析物。在某些情况下，微流体装置基本是不透明的。“不透明”是指物质不允许可见光通过该物质。在某些情况下，不透明的微流体装置可以有利于分析对光敏感的分析物，例如在光的存在下反应或降解的分析物。
方法
方法的实施方案针对检测在样品中是否存在分析物，例如，检测样品中一种或多种分析物的存在或不存在。在方法的某些实施方案中，样品中一种或多种分析物的存在可以被定性地或定量地检测。定性检测包括为使用者提供关于样品中分析物存在的是/非结果的检测。定量检测包括半定量检测和精细等级结果，其中半定量检测为使用者提供关于样品中分析物的量的粗略等级的结果(例如，低、中、高)，精细等级结果为使用者提供准确测量的分析物浓度。
在某些实施方案中，微流体装置被配置为检测样品中一种或多种分析物的存在。可以用分发明的微流体装置分析的样品可以变化，并包括简单的和复杂的样品。简单的样品为包括所关注的分析物并且可能包括或可能不包括不关注的一种或多种分子实体的样品，其中这些不关注的分子实体的数量可以是低的，例如小于或等于10个，小于或等于5个，等等。简单的样品可以包括已经以某些方式处理过的初始生物样品或其他样品，所述某些方式例如从样品中去除潜在干扰分子实体。“复杂的样品”是指可能具有或可能不具有所关注的分析物但是还包括不关注的许多不同蛋白质和其他分子的样品。在某些情况下，用本发明的方法分析的复杂的样品为包括大于或等于10个，例如大于或等于20个，包括大于或等于100个，例如大于或等于103个，大于或等于104个(例如15,000个；20,000个或25,000个或更多)有区别的(即不同的)分子实体，所述有区别的分子实体在分子结构或物理性质(例如分子量、尺寸、电荷、等电点等)方面彼此不同。
在某些实施方案中，所关注的样品为生物样品，例如，但不限于，尿液、血液、血清、血浆、唾液、精液、前列腺液、乳头抽吸液、泪液、汗液、粪便、颊拭子(cheek swabs)、脑脊髓液、细胞溶解样品、羊水、胃肠液、活体切割组织(例如由激光捕获显微切割(LCM)获得的样品)等。样品可以是生物样品或者可以使用成功提取DNA、RNA、蛋白质和肽的常规方法从源自人类、动物、植物、真菌、酵母、细菌、组织培养物、病毒培养物或其组合的生物样品中提取。在某些实施方案中，样品为液体样品，例如分析物在液体中的溶液。液体可以是水性液体，例如，但不限于，水、缓冲液等。
如上所述，可以用本发明方法分析的样品可以包括一种或多种所关注的分析物。可检测的分析物的实例包括，但不限于：核酸，例如双链或单链DNA、双链或单链RNA、DNA-RNA杂化物、DNA适配体、RNA适配体等；蛋白质和肽，具有或不具有修饰，例如，抗体、双抗体、Fab片段、DNA或RNA结合蛋白、磷酸化的蛋白质(磷酸化蛋白质组学)、肽适配体、表位等；小分子，如抑制剂、激活剂、配体等；寡糖或多糖；其混合物；等等。
在某些实施方案中，可以识别所关注的分析物，以便能够检测所关注的分析物的存在。可以通过本文所述方法中的任一种识别分析物。例如，分析物可以包括可检测的标记。可检测的标记包括，但不限于，荧光标记、比色标记、化学发光标记、酶连接的试剂、多色试剂、抗生物素蛋白-链霉抗生物素蛋白相关的检测试剂、不可见的可检测标记(例如放射性标记、金颗粒、磁性标记、电读出、密度信号等)等。在某些实施方案中，可检测的标记为荧光标记。荧光标记是可通过荧光检测器检测的标记部分。例如，将荧光标记与所关注的分析物结合可以允许通过荧光检测器检测所关注的分析物。荧光标记的实例包括，但不限于，当与试剂接触时发荧光的荧光分子、当用电磁辐射(例如，UV、可见光、x-射线等)照射时发荧光的荧光分子等。
合适的荧光分子(荧光团)包括，但不限于，荧光素、荧光素异硫氰酸酯、羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素二氯三嗪的5-异构体、笼蔽羧基荧光素-丙氨酸-羧基酰胺(caged carboxyfluorescein-alanine-carboxamide)、俄勒冈绿488(Oregon Green 488)、俄勒冈绿514(Oregon Green 514)；荧光黄、吖啶橙、罗丹明、四甲基罗丹明、德克萨斯红、碘化丙啶、JC-1(5，5’6，6’-四氯-1，1’，3，3’-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)、四溴罗丹明123、罗丹明6G、TMRM(四甲基罗丹明甲基酯)、TMRE(四甲基罗丹明乙基酯)、四甲基玫瑰胺(tetramethylrosamine)、罗丹明B和4-二甲基氨基四甲基玫瑰胺(4-dimethylaminotetramethylrosamine)、绿色荧光蛋白、蓝移的绿色荧光蛋白、蓝绿移的(cyan-shifted)绿色荧光蛋白、红移的(red-shifted)绿色荧光蛋白、黄移的(yellow-shifted)绿色荧光蛋白、4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸基均二苯代乙烯-2，2’二磺酸；吖啶及衍生物，如吖啶、吖啶异硫氰酸酯；5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘-二甲酰亚胺-3，5二磺酸盐；N-(4-苯胺-1-萘基)顺丁烯二酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-bora-3a，4a二氮杂-5-吲哒省(indacene)-3-丙酸BODIPY(4，4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a，4adiaza-5-indacene-3-propioni-c acid BODIPY)；颜料蓝(cascade blue)；亮黄(BrilliantYellow)；香豆素及衍生物：香豆素、7-氨基-4甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花菁染料；焰红染料(cyanosine)；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5’，5”-二溴连苯三酚-磺酞(溴连苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4，4’-二异硫氰酸基二氢-均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸；4，4’-二异硫氰酸基均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸；5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰氯(DNS，二甲氨基萘磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红及衍生物：伊红、伊红异硫氰酸酯、赤藓红及衍生物：赤藓红B、赤藓红、异硫氰酸酯；乙锭(ethidium)；荧光素及衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2基)氨基-荧光素(DTAF)、2’，7’二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、QFITC、(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮正甲酚酞(4-methylumbelliferoneortho cresolphthalein)；硝化酪氨酸；碱性副品红；苯酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘及衍生物：芘、芘丁酸酯、琥珀酰亚胺基1-芘；丁酸酯量子点；活性红4(Reactive Red 4)(CibacronTM亮红3B-A)罗丹明及衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-(4’-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、玫红酸；卡尔荧光橙560(Cal Fluor Orange 560)；铽螯合物衍生物；Cy3；Cy 5；Cy 5.5；Cy 7；IRD 700；IRD 800；拉荷亚蓝(La Jolla Blue)；酚酞菁；以及萘酚酞菁、香豆素及相关染料、氧杂蒽染料如对甲氨基酚染料、试卤灵染料、拜门染料(bimane dye)、吖啶染料、异吲哚染料、丹磺酰染料、氨基邻苯二甲酰肼类如鲁米诺，以及异鲁米诺衍生物，氨基邻苯二甲酰亚胺、氨基萘二甲酰亚胺、氨基苯并呋喃、氨基喹啉、二氰基氢醌、荧光铕和铽络合物；其组合等。合适的荧光蛋白和显色蛋白包括，但不限于，绿色荧光蛋白(GFP)，包括，但不限于，源自多管水母属(Aequoria victoria)的GFP或其衍生物，例如“人化的”衍生物，如增强的GFP(Enhanced GFP)；源自其他物种如海洋腔肠(Renilla reniformis)、瑞尼拉穆勒里(Renilla mulleri)或波利罗萨克斯戈恩依(Ptilosarcus guernyi)的GFP；“人化的”重组GFP(hrGFP)；任何源自珊瑚虫物种的各种荧光和着色蛋白；其组合；等等。
在某些实施方案中，所述方法包括将液体样品引入到微流体装置中。将液体样品引入到微流体装置中可以包括引导样品通过分离介质以制备被分离的样品。在某些情况下，当样品穿过分离介质时，通过凝胶电泳制备被分离的样品，如上所述。被分离的样品可以包括分析物的不同可检测带，其中每个带包括具有基本相似性质的一种或多种分析物，根据进行的凝胶电泳的类型，所述性质例如分子量、尺寸、电荷(例如荷质比)、等电点等。
所述方法的方面还可以包括将被分离的样品转移至结合介质。被分离的样品中分析物的特定的带可以被选择性地转移至结合介质。在某些情况下，所述方法包括使所关注的分析物与结合介质中的结合构件接触。结合构件可以特定地与所述分析物结合，从而将所述分析物保留在结合介质中。不关注的组成部分不被结合介质中的结合构件特定地结合。
在某些实施方案中，所述方法包括检测与结合介质结合的分析物。所关注的分析物与结合介质中的结合构件的可检测的结合表明样品中存在所关注的分析物。穿过结合介质并且未与结合介质中的结合构件结合的不关注的组成部分可以被洗掉或转移至二级分析装置，例如，但不限于，UV光谱仪和IR光谱仪、质谱仪、HPLC、亲合力分析装置等。
在某些实施方案中，所述方法包括将结合构件移出/移入被分离的样品。可以将结合构件从结合介质转移至被分离样品中的分析物的特定的带。在某些情况下，所述方法包括使结合构件与被分离样品中所关注的分析物接触。在某些情况下，所述方法包括使被分离的样品与分离介质稳定地缔合。例如，所述方法可以包括使被分离的样品与分离介质结合。被分离的样品可以与分离介质化学地或物理地结合，例如通过使被分离的样品与化学试剂接触、使被分离的样品与分离介质交联，等等。结合构件可以特定地与所关注的分析物结合，从而将结合构件保留在分离介质中，其中随后可以检测被结合的结合构件。未与被分离的样品中的分析物特定地结合的结合构件可以被转移通过分离介质。
在某些情况下，由于结合构件与不关注的组成部分的非特定的结合而产生的假阳性信号被最小化。例如，结合构件与不关注的其他组成部分的非特定结合可以被最小化并且不关注的组成部分不会被检测。不关注的组成部分可以穿过结合介质而不与结合构件结合。因此，结合构件可以仅与所关注的分析物特定地结合。结合构件仅与所关注的分析物的特定结合可以有利于复杂样品中所关注的分析物的特定检测。
在某些实施方案中，所述方法包括在引导样品通过分离介质之前对样品进行浓缩、稀释或缓冲液交换。浓缩样品可以包括在使样品与分离介质接触之前使样品与浓缩介质接触。如上所述，浓缩介质可以包括小孔径聚合物凝胶、膜(例如尺寸排除膜)、其组合等。在使样品与分离介质接触之前浓缩样品可以有利于提高被分离的样品中分析物的带之间的分辨率，因为当样品穿过分离介质时分析物的每个被分离的带可以分散得更少。稀释样品可以包括在使样品与分离介质接触之前使样品与额外的缓冲液接触。对样品进行缓冲液交换可以包括在使样品与分离介质接触之前使样品与缓冲液交换介质接触。缓冲液交换介质可以包括，但不限于，分子筛、多孔树脂等。
在某些实施方案中，所述方法包括将未被结合介质中的结合构件结合的组成部分转移出结合介质。未被结合的组成部分可以被引导至与结合介质的标记流动路径液体连通的转移流动路径。在某些情况下，所述方法包括将未被结合的组成部分引到废物储存器中。在其他情况下，所述方法包括引导来自结合介质下游的未被结合的组成部分以用于用二级分析装置进行二级分析，所述二级分析装置为例如，但不限于，UV光谱仪和IR光谱仪、质谱仪、HPLC、亲和力分析装置等。
所述方法的实施方案还可以包括释放与结合介质结合的分析物。释放可以包括使被结合的分析物与释放剂接触。释放剂可以被配置为中断分析物与结合构件之间的结合作用。在某些情况下，释放剂为中断分析物与结合构件之间的结合作用使结合构件释放分析物的试剂、缓冲液等。在从结合构件中释放分析物之后，所述方法可以包括将分析物转移出结合介质。例如，所述方法可以包括将来自结合介质下游的被释放的分析物引导用于用二级分析装置进行二级分析，所述二级分析装置为例如，但不限于，UV光谱仪和IR光谱仪、质谱仪、HPLC、亲和力分析装置等。
在某些实施方案中，所述方法包括样品中分析物的一元(uniplex)分析。“一元分析”是指分析样品以检测样品中一种分析物的存在。例如，样品可以包括所关注的分析物与不关注的其他分子实体的混合物。在某些情况下，所述方法包括样品的一元分析以测定样品混合物中所关注的分析物的存在。
某些实施方案包括样品中两个或多个分析物的多元(mutiplex)分析。“多元分析”是指检测两种或多种不同的分析物的存在，其中所述两种或多种分析物彼此不同。例如，分析物可以包括其分子量、尺寸、电荷(例如荷质比)、等电点等方面的可检测的区别。在某些情况下，分析物的数量大于2，例如大于或等于4，大于或等于6，大于或等于8等，直至大于或等于20，例如大于或等于50，包括大于或等于100种不同的分析物。在某些实施方案中，所述方法包括2至100种不同分析物的多元分析，例如4至50种不同分析物，包括4至20种不同分析物。
图8示出了被配置为用于样品中多种分析物的多元分析的微流体装置800的示意图。微流体装置800包括分离通道830中的分离介质810和在对应的单独结合通道840中的多个结合介质820。分离介质810与多个结合介质820液体连通。各个结合介质可以包括不同的结合构件。例如，各个结合介质可以包括不同的结合构件，所述结合构件特定地结合所关注的不同分析物。通过分离介质分离的分析物可以选择性地转移至结合介质820。分析物与结合介质820中的一个的可检测结合表明样品中存在特定分析物。每种都与不同的结合构件结合的多个结合介质820的内含物可以有利于在单一分析中检测多种不同的所关注的分析物。
图17示出了覆盖有微流体装置1700示意图的图像，微流体装置1700被配置为用于样品中多种样品的多元分析。“i”表示分离步骤(1)和转移步骤(2)的电流方向。微流体装置1700包括容纳分离介质1701、第一结合介质1702和第二结合介质1703的腔室。分离介质1701与第一结合介质1702液体连通，第一结合介质1702与第二结合介质1703液体连通。各个结合介质可以包括不同的结合构件。例如，第一结合介质1702可以包括特定地结合所关注的第一分析物1705的第一结合构件1704，而第二结合介质1703可以包括特定地结合所关注的第二分析物1707的第二结合构件1706。首先通过引导样品通过分离介质(图17，步骤(1))分离样品中的分析物。可以将被分离介质分离的分析物分别转移至第一结合介质1702和第二结合介质1703(图17，步骤(2))。所关注的第一分析物1705与第一结合介质1702中的第一结合构件1704的可检测结合表明在样品中存在所关注的第一分析物1705(图17，步骤(3))。所关注的第二分析物1707与第二结合介质1703中的第二结合构件1706的可检测结合表明在样品中存在所关注的第二分析物1707(图17，步骤(3))。每个都与不同结合构件结合的多个结合介质的内含物可以有利于在单次分析中检测多种不同的所关注的分析物。
在某些实施方案中，所述方法为自动化的方法。这样，在将样品引入微流体装置之后，所述方法可以包括最少的使用者与微流体装置和系统的相互作用。例如，引导样品通过分离介质以制备被分离的样品的步骤和将被分离的样品转移至结合介质的步骤可以通过微流体装置和系统进行，以使使用者无需手动进行这些步骤。在某些情况下，自动化的方法可以有利于缩短总分析时间。例如，所述方法的实施方案，包括样品中分析物的分离和检测，可以在小于或等于30分钟的时间内进行，例如小于或等于20分钟，包括小于或等于15分钟，或小于或等于10分钟，或小于或等于5分钟，或小于或等于2分钟，或小于或等于1分钟。
图1A示出了传统免疫印记程序的示意图。首先，通过电泳分离样品中的各种分析物。然后将被分离的分析物转移至膜。在印记和清洗之后，用特定地与某种目标分析物结合的抗体探测分析物。
图1B示出了检测样品中分析物的存在的方法的一个实施方案的示意图。所述方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，然后进行分离后样品的转移，以及最后基于膜的亲合力印记。分析物被从PAGE分离介质电动地转移至连续的结合介质(例如印记凝胶)并且通过特定的亲合力作用被原位识别。在步骤1中，通过分离介质5用电泳分离样品中的各种分析物。分离介质具有分离流动路径，所述分离流动路径具有第一方向轴。沿着第一方向轴施加电场以引导样品通过分离介质5。当被分离的分析物到达分离介质5中与结合介质4液体连通的区域时，通过沿着第二方向轴施加电场以将被分离的分析物引导至结合介质，可以将特定的分析物选择性地转移至结合介质(参见图1B，步骤2)。结合介质4包括与支撑体结合的结合构件7。例如，为了形成结合介质4，通过投影光刻(330-375nm，4分钟)将链酶抗生物素丙烯酰胺与生物素化的抗体共聚在聚丙烯酰胺凝胶中。在某些情况下，结合构件为特定针对某种目标分析物6的抗体。如果存在目标分析物6，则通过与结合构件7结合将目标分析物6保留在结合介质4中，产生可检测的信号(参见图1B，步骤3)。如果不存在目标分析物，则不会发生与结合构件的结合，并因此不会产生可检测的信号。如果存在不是目标分析物的分析物，则它们不会与结合构件结合并在不与结合构件结合的情况下通过结合介质。因此，不会产生可检测的信号。
针对包括彼此液体连通的微流体通道的微流体装置700的实施方案，图7B示出了分离、转移和检测样品中分析物的示意图。图7B中的方框(1)示出了与结合通道721液体连通的分离通道720的下游端。分离通道720包括分离介质722，而结合通道721包括结合介质723。结合介质723包括与结合介质723结合的结合构件724。在电泳分离之后(图7B，方框(1))，分析物725、726和727可以选择性地通过电泳转移至和输送通过结合介质723(图7B，方框(2))。结合构件724特定地与所关注的分析物727结合，从而将所关注的分析物727保留在结合介质723中(图7B，方框(3))。所关注的分析物可以包括可检测的标记，如荧光标记，并因此可以检测与结合介质723结合的所关注的分析物727。未结合的分析物726未被结合构件724特定地结合并通过结合介质723进入转移通道728，其中根据需要可以将未被结合的分析物726引导至废物储存器或下游的二级分析装置。未被转移至结合介质723的被分离的分析物725保留在分离通道720中，并且根据需要可以被引导至废物储存器或下游的二级分析装置。
系统
某些实施方案的方面包括检测样品中分析物的系统。在某些情况下，系统包括本文所述的微流体装置。系统还可以包括检测器。在某些情况下，检测器为被配置为检测可检测标记的检测器。如上所述，可检测标记可以是荧光标记。例如，可以使荧光标记与电磁辐射接触(例如可见光、UV、x-射线等)，电磁辐射激发荧光标签并使荧光标签发出可检测的电磁辐射(例如可见光等)。可以使用合适的检测器检测发射的电磁辐射以测定与结合构件结合的分析物的存在。
在某些情况下，检测器可以被配置为检测来自荧光标记的发射物，如上所述。在某些情况下，检测器包括光电倍增管(PMT)、电荷耦合装置(CCD)、增强的电荷耦合装置(ICCD)、互补金属-氧化物-半导体(SMOS)传感器、目视比色读出器、光电二极管等。
本说明书的系统根据需要可以包括各种其他部件。例如，系统可以包括流体处理部件，例如微流体流体处理部件。流体处理部件可以被配置为引导一种或多种流体通过微流体装置。在某些情况下，流体处理部件被配置为引导流体，例如，但不限于，样品溶液、缓冲液(例如释放缓冲液、清洗缓冲液、电泳缓冲液等)等。在某些实施方案中，微流体流体处理部件被配置为向微流体装置的分离介质递送流体，以使所述流体结合粗分离介质。流体处理部件可以包括微流体泵。在某些情况下，微流体泵被配置为用于压力驱动微流体处理以及按照路线使流体通过本文所述的微流体装置和系统。在某些情况下，微流体处理部件被配置为递送小体积的流体，例如小于或等于1mL，例如小于或等于500μL，包括小于或等于100μL，例如小于或等于50μL，或小于或等于25μL，或小于或等于10μL，或小于或等于5μL，或小于或等于1μL。
在某些实施方案中，系统包括一个或多个电场发生器。电场发生器可以被配置为对微流体装置的不同区域施加电场。系统可以被配置为施加电场以使样品电动地输送通过微流体装置。例如，电场发生器可以被配置为对分离介质施加电场。在某些情况下，施加的电场可以与分离介质的分离流动路径的方向轴对准。这样，施加的电场可以被配制为将样品中的分析物和组成部分电动地输送通过分离介质。在某些实施方案中，系统包括被配置为施加电场以使样品中的分析物和/或组成部分被电动地从分离介质输送至结合介质的电场发生器。例如，施加的电场可以与结合介质的标记流动路径的方向轴对准。在某些情况下，施加的电场被配置为电动地输送已经由分离介质分离的选定分析物。通过沿着结合介质的标记流动路径的方向轴施加合适的电场可以将已经由分离介质分离的选定分析物输送至结合介质。在某些情况下，电场发生器被配置为施加具有10V/cm至1000V/cm，例如100V/cm至800V/cm，包括200V/cm至600V/cm的强度的电场。
在某些实施方案中，电场发生器包括电压整形部件。在某些情况下，电压整形部件被配置为控制施加的电场的强度，以使施加的电场强度在分离介质和/或结合介质上是基本上均匀的。电压整形部件可以有利于提高样品中分析物的分辨率。例如，电压整形部件可以有利于减少样品通过分离介质的非均匀性运动。另外，电压整形部件可以有利于在分析物穿过分离介质时使分析物的带的离散度最小化。
在某些实施方案中，本发明的系统为生物芯片(例如生物传感器芯片)。“生物芯片”或“生物传感器芯片”是指包括基板表面的微流体系统，所述微流体系统在基板表面上设置有两个或多个不同的微流体装置。在某些实施方案中，微流体系统包括具有微流体装置阵列的基板表面。
“阵列”包括可寻址区域(例如空间上可寻址的区域)的任何二维或基本上二维(以及三维)的排列。当阵列具有位于阵列上的特定的预定位置上(例如“地址”)的多个装置时，其是“可寻址的”。阵列特征(例如装置)可以被中间间隔分开。任何规定基板可以携带设置在基板正面上的一个、两个、四个或更多个阵列。根据用途，所述阵列中的若干个或全部可以彼此相同或不同，并且每个都可以包含多个不同的微流体装置。阵列可以包含大于或等于1个，包括大于或等于2个，大于或等于4个，大于或等于8个，大于或等于10个，大于或等于50个，或大于或等于100个微流体装置。在某些实施方案中，微流体装置可以布置成面积小于10cm2，或小于5cm2，例如小于1cm2，包括小于50mm2，小于20mm2，例如小于10mm2，或甚至更小的阵列。例如，微流体装置的尺寸可以为10mm×10mm至200mm×200mm，包括小于或等于100mm×100mm的尺寸，例如小于或等于50mm×50mm，例如小于或等于25mm×25mm，或小于或等于10mm×10mm，或小于或等于5mm×5mm，例如小于或等于1mm×1mm。
微流体装置的阵列可以被布置为用于样品的多元分析。例如，可以串联地布置多个微流体装置，以便可以在串联的微流体装置中针对若干不同分析物分析样品。在某些实施方案中，可以平行地布置多个微流体装置，以便可以基本上同时分析两个或多个样品。
所述系统的方面包括微流体装置可以被配置为消耗最小量的样品同时仍然产生可检测的结果。例如，系统可以被配置为使用小于或等于100μL，例如小于或等于75μL，包括小于或等于50μL，或小于或等于25μL，或小于或等于10μL，例如，小于或等于5μL，小于或等于2μL，或小于或等于1μL的样品体积，同时仍然产生可检测的结果。在某些实施方案中，系统被配置为具有小于或等于1nM，例如小于或等于500pM，包括小于或等于100pM，例如小于或等于1pM，或小于或等于500fM，或小于或等于250fM，例如小于或等于100fM，包括小于或等于50fM，或小于或等于25fM，或小于或等于10fM的检测灵敏度。在某些情况下，系统被配置为能够检测浓度小于或等于1μg/mL，例如小于或等于500ng/mL，包括小于或等于100ng/mL，例如小于或等于10ng/mL，或小于或等于5ng/mL，如小于或等于1ng/mL，或小于或等于0.1ng/mL，或小于或等于0.01ng/mL，包括小于或等于1pg/mL的分析物。在某些实施方案中，系统具有10-18M至10M，例如10-15M至10-3M，包括10-12M至10-6M的动力学范围。
在某些实施方案中，在1℃至100℃，例如5℃至75℃，包括10℃至50℃，或20℃至40℃的温度下操作微流体装置。在某些情况下，在35℃至45℃的温度下操作微流体装置。
实用性
本发明的装置、系统和方法可以在需要检测样品中一种或多种分析物的存在或不存在和/或对样品中一种或多种分析物进行定量的各种不同的应用中使用。在某些实施方案中，所述方法针对样品中核酸、蛋白质或其他生物分子的检测。所述方法可以包括检测样品中一组生物标记，例如两个或多个不同蛋白质生物标记。例如，所述方法可以用于生物学样品中两种或多种疾病生物标记的快速临床检测，例如可以在受试者疾病病症的诊断中使用、在受试者疾病病症的进行中的控制或治疗中使用，等等。另外，本发明的装置、系统和方法可以在检测样品中分析物的方案中使用，例如，但不限于，Western印迹法、Northern印迹法、Eastern印迹法、Far-Western印迹法、Southwestern印迹法等。
在某些实施方案中，本发明的装置、系统和方法可以在检测生物标记中使用。在某些情况下，本发明的装置、系统和方法可以用于检测特定生物标记的存在或不存在，以及在血液、血浆、血清或其他体液或分泌物，例如，但不限于，尿液、血液、血清、血浆、唾液、精液、前列腺液、乳头抽吸液、泪液、汗液、粪便、颊拭子(cheek swabs)、脑脊髓液、细胞溶解样品、羊水、胃肠液、活体切割组织(例如由激光捕获显微切割(LCM)获得的样品)等中的特定生物标记浓度的升高或降低。
生物标记的存在或不存在或生物标记的浓度的明显变化可以用于诊断个体中的疾病风险、疾病存在，或者个体中疾病的设计治疗。例如，特定生物标记或生物标记组的存在可以影响提供给个体的药物治疗或给药方案的选择。在潜在药物疗法的评估中，可以使用生物标记作为自然指标(如存活或不可逆发病)的替代物。如果治疗改变与改善的健康有直接联系的生物标记，则生物标记能够用作评价特定治疗或给药方案的临床受益的替代性指标。因此，本发明的装置、系统和方法有利于基于在个体中检测的特定生物标记或生物标记组的个性化诊断和治疗。此外，上述本发明的装置和系统的高灵敏度有利于与疾病相关的生物标记的早期检测。由于在单个芯片上检测多种生物标记的能力以及灵敏度、扩展性和易于使用的原因，本文公开的微流体装置、系统和方法可以在便携式和床边或患者附近的分子诊断学中使用。
在某些实施方案中，本发明的装置、系统和方法可以用于检测针对疾病或疾病状态的生物标记。在某些情况下，所述疾病为细胞增殖性疾病，例如但不限于，癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤、或癌瘤等。在某些情况下，本发明的装置、系统和方法可以针对药物开发和疫苗开发用于检测表征细胞信号路径和细胞内通讯的生物标记。例如，本发明的装置、系统和方法可以用于检测疾病的存在，例如细胞增殖性疾病，例如癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤、癌瘤等。在某些情况下，用于检测癌症的所关注的特定生物标记或细胞增殖性疾病的指标包括，但不限于以下物质：前列腺特异性抗原(PSA)，其是前列腺癌生物标记；C-活性蛋白质，其是炎症指标；转录因子，例如p53，其促进细胞周期和凋亡控制；多胺浓度，其是光化性角化病和鳞状细胞癌的指标；增殖细胞核抗原(PCNA)，其是在处于增殖生长阶段的细胞的细胞核中表达的与细胞周期有关的蛋白质；生长因子，例如IGF-I；生长因子结合蛋白，例如IGFBP-3；微RNA，其是调节基因表达的长度为约21-23个核苷酸的单链RNA分子；糖类抗原CA19.9，其是胰腺癌和结肠癌生物标记；细胞周期蛋白依赖性激酶；上皮生长因子(EGF)；血管内皮生长因子(VEGF)；蛋白质酪氨酸激酶；雌激素受体(ER)和孕激素受体的过表达；等等。例如，本发明的装置、系统和方法可以用于检测和/或定量患病的、健康的和良性样品中内源性前列腺特异性抗原的量。
在某些实施方案中，本发明的装置、系统和方法可用于检测针对传染性疾病或疾病状态的生物标记。在某些情况下，所述生物标记可以是分子生物标记，例如但不限于蛋白质、核酸、糖类、小分子等。例如，本发明的装置、系统和方法可以用于监测HIV病毒量和患者CD4计数，通过用IHV衣壳蛋白p24、糖蛋白120和41、CD4+细胞等的抗体使传感器表面功能化用于HIV/AIDS诊断和/或治疗监测，。可以通过本发明的装置、系统和方法检测的特定的疾病或疾病状态包括，但不限于，细菌感染、病毒感染、升高或降低的基因表达、染色体异常(例如缺失或着生)等。例如，本发明的装置、系统和方法可以用于检测胃肠感染，例如但不限于，无菌性脑膜炎、肉毒中毒、霍乱、大肠杆菌感染、手足口病、螺杆菌感染、出血性结膜炎、疱疹性咽峡炎、心肌炎(myocaditis)、副伤寒、脊髓灰质炎、志贺氏菌病、伤寒病、弧菌性败血病、病毒性腹泻等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测呼吸道感染，例如但不限于，腺病毒感染、非典型性肺炎、禽流感、猪流感、黑死病、白喉、流感、麻疹、流行性脑脊髓膜炎、流行性腮腺炎、副流感病毒、百日咳(即，百日咳)、肺炎、肺鼠疫、呼吸道合胞体病毒感染、风疹、猩红热、败血型鼠疫、严重急性呼吸系统综合症(SARS)、肺结核等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测神经性疾病，例如但不限于，克罗伊茨费尔特-雅各布病、牛海绵样脑病(即，疯牛病)、帕金森氏病、阿尔茨海默病、狂犬病等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测泌尿生殖疾病，例如但不限于，AIDS、软性下疳、衣原体、尖锐湿疣、生殖器疱疹、淋病、性病性淋巴肉芽肿、非淋菌性尿道炎、梅毒等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测病毒性肝炎疾病，例如但不限于，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测出血热疾病，例如但不限于，埃博拉出血热、肾综合征出血热(HFRS)、拉沙热出血热(Lassa hemorrhagic fever)、马尔堡出血热等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测人畜共患疾病，例如但不限于，炭疽、禽流感、布鲁氏杆菌病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、牛海绵样脑病(即，疯牛病)、致泻性大肠杆菌感染、日本脑炎、西螺旋体病、Q热、狂犬病、严重急性呼吸系统综合症(SARS)等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测虫媒病毒感染，例如但不限于，登革出血热、日本脑炎、蜱传脑炎、西尼罗热、黄热等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测抗生素抗性感染，例如但不限于，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，白色念珠菌(Candida albicans)，肠球菌种(Enterococci sp.)，肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，金黄色酿脓葡萄杆菌(Staphylococcus aureus)等。另外，本发明的装置、系统和方法可以用于检测虫传感染，例如但不限于，猫抓病、地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒、人埃里希体病、日本红斑热、虱传回归热、莱姆病、疟疾、战壕热、恙虫病等。类似地，本发明的装置、系统和方法可以用于检测心血管疾病、中枢神经疾病、肾衰竭、糖尿病、自身免疫性疾病以及许多其他疾病。
本发明的装置、系统和方法可用于诊断分析，例如但不限于，以下方面：上述检测和/或定量生物标记；筛查分析，其中针对无症状受试者以一定间隔检测样品；预后分析，其中使用生物标记的存在或量预测可能的疾病过程；分层分析，其中可以预测受试者对不同药物治疗的响应；功效分析，其中监测药物治疗的功效；等等。
本发明的装置、系统和方法还可以用于验证分析。例如，可以使用验证分析验证或证实潜在的疾病生物标记是疾病在各种个体中存在或不存在的可靠指标。本发明的装置、系统和方法的短分析时间有利于在最短的时间里提高筛查多个样品的处理能力。
在某些情况下，本发明的装置、系统和方法可以在不需要针对实施的实验室环境的情况下使用。与同等的分析研究实验室设备相比，本发明的装置和系统在便携式手持系统中提供相当的分析灵敏度。在某些情况下，重量和操作成本比典型的固定实验室设备更低。本发明的系统和装置可以被集成到单一设备中，以使分析的所有步骤，包括所关注的分析物的分离、转移、标记和检测，可以由单一的设备进行。例如，在某些情况下，不存在用于所关注的分析物的分离、转移、标记和检测的独立设备。另外，本发明的系统和装置可以由不具有检测样品中一种或多种分析物的医疗培训的人员在非处方家庭检测的家庭环境中使用。本发明的系统和装置还可以在临床环境(例如床边)用于快速诊断，或者在由于成本或其他原因而未提供固定研究实验室设备的环境中使用。
试剂盒
本说明书的方面还包括具有本文详细描述的微流体装置的试剂盒。试剂盒可以还包括缓冲液。例如，试剂盒可以包括例如电泳缓冲液、样品缓冲液等的缓冲液。试剂盒可以还包括其他试剂，例如但不限于，释放剂、变性剂、重折叠剂、洗涤剂、可检测的标记(例如荧光标记、比色标记、化学发光标记、多色试剂、酶连接试剂、抗生物素蛋白-链霉抗生物素蛋白相关的检测试剂、放射性标记、金颗粒、磁性标记等)等。
除了以上成分之外，本发明的试剂盒可以还包括实施本发明方法的说明。这些说明可以以各种形式存在于本发明的试剂盒中，在试剂盒中可以存在一种或多种所述形式。这些说明可以存在的一种形式为在合适的介质或基板上的印刷信息，例如印有所述信息的一种或多张纸，在试剂盒的包装中，在药品说明书中等。另一种方式可以是计算机可读介质，例如其中记录或存储有所述信息的磁盘、CD、DVD、蓝光光碟、计算机可读存储器等。可以存在的又一种方式为可以经由互联网用以在移动的位置获取信息的网址。在试剂盒中可以存在任何方便的方式。
从以上提供的说明书中可以理解，本发明的实施方案具有广泛的应用。因此，提供本文中的实施例是为了说明的目的，并不应解释为对本发明的任何形式的限定。本领域普通技术人员会容易地想到能够改变或修改以产生基本上相似结果的各种非重要参数。因此，提出以下实施例是为了为本领域普通技术人员提供完整的说明书和描述如何制造和使用本发明，并不是为了限定发明人所认为的他们的发明的范围，也不是为了表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力保证了所使用的数值(例如，数量、温度等)的准确性，但是应当考虑某些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，以及压力为大气压或接近大气压。
实施例
材料和方法
除非下文另有说明，使用以下方案制备微流体装置并进行实验。
试剂
水溶性光引发剂2，2-偶氮二[2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺](VA-086)购自WakoChemicals(Richmond，VA)。3-(三甲氧基甲硅烷基)-丙基甲基丙烯酸酯(98％)，冰醋酸(ACS级)、甲醇(ACS级)和30％的(29∶1)丙烯酰胺/双丙烯酰胺购自Sigma(St.Louis，MO)。链霉抗生物素-丙烯酰胺(SA)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。预混合的10×三甲醇氨基甲烷-甘氨酸非变性电泳缓冲液(25mM三甲醇氨基甲烷，pH8.3，192mM甘氨酸)购自Bio-Rad(Hercules，CA)。分别使用Alexa Fluor 488共轭牛血清蛋白(BSA)和FITC-生物素作为阴性和阳性对照(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。α-辅肌动蛋白和生物素共轭抗辅肌动蛋白购自Cytoskeleton公司(Denver，CO)。游离PSA(前列腺特异性抗原)和生物素化的单克隆抗PSA购自EXBIO(Praha，CzechRepublic)。按照供应商的说明(Invitrogen，Carlsbad，CA)使用Alexa Fluor 488蛋白质标记试剂盒在内部将蛋白质荧光标记。在使用前，标记的蛋白质在4℃下避光存储。
微流体芯片制造
在内部设计玻璃微流体芯片，并使用Caliper Life Sciences(Hopkinton，MA)的标准湿法刻蚀方法制造。使用3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯、冰醋酸、去离子水和甲醇的2∶3∶2∶3的混合物先将表面功能化用于与聚丙烯酰胺(PA)凝胶共价连接。在20分钟静态培养之后，使甲醇冲洗通过微流体装置30分钟，然后氮气吹干。
功能化的结合介质光致图案化
经由UV物镜(UPLANS-APO 4×，Olympus)的基于掩模的光刻结合薄膜掩模和显微镜系统(IX-70，Olympus，Melville，NY)提供导致交联的激发和结合介质(8％T，包括链霉抗生物素-丙烯酰胺)的形成。使用凝胶基体中共价结合的链霉抗生物素固定用于免疫印迹的生物素化的抗体。使用汞灯作为激发源(330-375nm)，并使用显微镜(Olympus，Melville，NY)上的手工调节x-y移动台进行对芯片的掩模对准。用含有0.2％(w/v)VA-086光引发剂的三甲醇氨基甲烷-甘氨酸非变性运行缓冲液调整包括丙烯酰胺和BIS的最终前驱体体积。在装填进微流体装置之前使凝胶前驱体溶液脱气(在真空下5分钟，同时超声震荡)以保证基本上无气泡的最终凝胶。为了开始制造，将PA凝胶前驱体溶液通过毛细管引入或压力填充(经由注射器)到微流体装置中。在装载微流体装置之后，用移液管将高粘度5％的2-羟乙基纤维素溶液(Sigma，平均MW～720000)温和地引入到储存器中。使用对位于15cm远的具有冷却风扇的过滤的汞灯(300-380nm)(100W，UVP B100-AP，Upland，CA)的芯片整片曝光形成大孔径样品负载凝胶。
设备和图像
分析操作是可编程的，并经由具有铂电极的高压电源(Labsmith HVS448，Livermore，CA)控制。通过在废物储存器上施加+800V电势并将样品储存器接地～2分钟来装载样品。使用具有10×目镜(N.A.0.3)、为GFP检测优化的过滤立方体和x-y移动台的倒置落射荧光显微镜(IX-70，Olympus，Melville，NY)采集图像。使用1392×1040Peltier冷却的隔行CCD相机(CoolSNAPTM HQ2，Roper Scientific，Trenton NJ)以10MHz的频率监测蛋白质迁移和结合。除非另有说明，CCD曝光时间为300ms。使用ImageJ(国家卫生研究院，Bethesda，MD)完成图像分析。
结果
图2示出了在将被分离的样品转移到结合介质之前(图2A)和之后(图2B)的蛋白质电泳图。进行目标蛋白质(α-辅肌动蛋白和前列腺特异性抗原，PSA)和阴性对照(BSA)的非变性PAGE，随后进行到结合介质的电泳转移。在小于或等于30秒的时间里将分离的蛋白质带转移至结合介质，捕获效率为85％。特定的目标蛋白质(最弱的峰，α-辅肌动蛋白)与结合介质结合并产生可检测的荧光信号(图2B，插图，转换的灰度)。
图3示出了使用阳性和阴性蛋白质对照的检测分析特异性的实验的荧光图像。微流体装置的结合介质30的荧光图像在图3中示出。分析物BSA(例如阴性对照)、生物素、α-辅肌动蛋白和PSA分别独立地与具有结合到结合介质支撑体的链霉抗生物素、抗辅肌动蛋白和抗PSA的三种不同的结合介质接触。图3显示没有可检测的非对角线信号，表明没有可检测的交叉反应性并且没有可检测的非特定吸附。
图4A示出了微流体装置中与抗体功能化的结合介质结合的蛋白质的剂量响应的荧光图像。微流体装置的结合介质40的荧光图像在图4中示出。使升高浓度的BSA(例如阴性对照)与用链霉抗生物素功能化的结合介质接触。BSA显示没有或最小的可检测信号。使升高浓度的α-辅肌动蛋白与用抗辅肌动蛋白功能化的结合介质接触。α-辅肌动蛋白显示荧光信号随着α-辅肌动蛋白浓度的升高而升高。使升高浓度的PSA与用抗PSA功能化的结合介质接触。PSA显示荧光信号随着PSA浓度升高而升高。剂量响应曲线的建立可以有利于蛋白质的定量。另外，观察到结合介质上的内在蛋白质富集(参见图4B)。与没有结合介质的信号相比，蛋白质富集可以有利于提高结合介质上的检测灵敏度。
图5A示出了包括分离介质50的微流体装置的示意图。可以通过样品入口51将样品引入微流体装置。可以通过施加电场将样品从样品入口51引导至分离介质50来将样品加载到分离介质50上(参见图5A，插图1)。在使样品与分离介质50接触之后，可以沿着分离介质50的方向轴施加电场引导样品通过分离介质50(参见图5A，插图2)。样品中的分析物在流过分离介质50时可以被分离并被位于分离介质50末端的检测器52检测。图5B示出了使用具有分离介质的微流体装置的宽分子范围蛋白质梯的高分辨电泳分析，所述分离介质通过将交联聚丙烯酰胺凝胶光致图案化制备。分离介质能够使用10×10-6L的样品体积在15秒之后实现样品中不同蛋白质之间的可检测的分辨。
图6示出了在5种低分子量蛋白质的电泳分离中聚丙烯酰胺凝胶的分辨率差别的实例。在图6中，具有8％总丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶(例如小孔径凝胶)能够在20秒的时间里可检测地分辨样品中的所有5种蛋白质(参见图6，上图)，而具有4％总丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶(例如大孔径凝胶)不能分辨样品中的蛋白质，并且在5秒时仅给出单峰(参见图6，下图)。
图9A示出了包括分离介质920上游的浓缩介质910的微流体装置900的示意图和图像(插图)。分离介质920的上游区域包括具有3.5％总丙烯酰胺(T)和2.2％交联剂(C)的大孔径凝胶。分离介质的大孔径区域的下游为具有8％T和2.2％C的小孔径区域。图9B示出了样品930通过包括分离介质950上游的浓缩介质940的微流体装置的时间里的电泳运动的图像。分离介质在分离通道960中包括6％聚丙烯酰胺凝胶。以5秒的时间间隔t0、t5和t10采集反相荧光微图像。荧光微图像示出了在浓缩介质940附近的样品富集和蛋白质样品的洗脱。在图9B中，3分钟之后，浓缩的初始浓度100nM的报告蛋白(例如荧光标记的抗C-RP)在浓缩介质(例如膜)处被浓缩了170倍。在10s的时间里，浓缩的抗C-RP被洗脱至分离通道中。施加的电场为400V/cm。
图10示出了在电泳分析之后所关注的分析物1000从第一微流体通道1010选择性转移至第二微流体通道1020的图像。所关注的特定分析物的选择性转移能够收集蛋白质用于与结合介质接触或用于随后的分析。在图10中，所关注的分析物1000被从第一微流体通道1010中的电泳分离引导至第二微流体通道1020用于进一步分析。不关注的分析物1030保留在第一微流体通道1010中未作处理。所关注的分析物从一个微流体通道选择性转移至另一个可以有利于小体积(例如小于1pL)的定量操作。另外，特定的分辨的分析物的物理操作可以有利于所关注的选定分析物的电泳后表征。在图10中，蛋白质在第一微流体通道1010通过电泳被分离(例如等电聚焦)。为了使加载在第一微流体通道1010与第二微流体通道1020之间交点处的所关注的分析物1000转移，在交点上施加与用于分离分析物的初始电场垂直的电场(E＝395V/cm)，从而将所关注的分析物1000推至第二微流体通道1020。
图11A示出了位于微流体装置1100中的结合介质1110的示意图。另外，指出了电场(E)，其示出通过结合介质的电泳方向。图11B和图11C示出了暴露于阴性和阳性对照的结合介质的荧光图像。将200nM lgG共聚在聚丙烯酰胺结合介质(10％总丙烯酰胺/2.5％交联剂)中。通过在由100W 365-nm YAG激光器发出的细(75μm宽)激光片束下曝光20秒在玻璃微通道中形成结合介质。在600V以5分钟的时间使1∶100lgG-FITC和1∶100蛋白质G-FITC溶液经电泳通过结合介质，然后以15分钟的时间通过缓冲液冲洗未结合的蛋白质G*。通过CCD/落射荧光显微镜进行荧光成像。图11B和图11C中示出的荧光图像图示了共聚的蛋白质G(lgG)抗体与荧光标记的蛋白质G(蛋白质G*)的特定相互作用。图11B是阴性对照(例如在结合介质中没有共聚的lgG)并且示出来自经过电泳的荧光标记蛋白质G的可忽略的可检测信号。在图11C中，与lgG共聚的结合介质结合了蛋白质G*。结果表明，在电泳分析物输送期间，与结合介质结合的抗体的特异性被保留。
图12A示出了包括容纳分离介质1203和结合介质1204的腔室1202(插图)的微流体装置1201的明场图像。结合介质1204被设置为与分离介质1203液体连通并且沿着标记流动路径排列(参见图12C，步骤3)。在这种情况下，分离流动路径(参见图12C，步骤2)与标记流动路径(参见图12C，步骤3)彼此正交。标记介质包括孔径与分离介质相似的凝胶。另外，标记介质包括链霉抗生物素以允许用生物素化的结合构件(例如抗体)功能化。腔室1202还包括与分离介质1203液体连通的加载介质1205。加载介质1205被沿着分离流动路径设置在分离介质1203的上游(参见图12，步骤2)。加载介质1205包括大孔径凝胶(3％总丙烯酰胺)，其在较小孔径的分离介质1203(6％总丙烯酰胺)上游。图12A中的腔室1202还与沿着腔室1202侧部设置的多个通道1206液体连通。通道1206可以被配置为将电场引导至腔室1202中的加载介质1205、分离介质1203和结合介质1204。
图12B示出了腔室1202和被配置为将电场引导至腔室1202的通道1206的明场图像。图12C示出了包括上述腔室1202的微流体装置的示意图。可以将样品引入微流体装置(参见图12C，步骤1)。可以沿着分离流动路径的方向轴施加电场以引导样品通过加载介质和分离介质(参见图12C，步骤2)。可以使用电场发生器V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7和V8施加电场。在样品的电泳分离之后，通过沿着标记流动路径的方向轴施加电场，可以将样品中被分离的分析物选择性地转移至结合介质(参见图12C，步骤3)。
图12D示出了覆盖有样品中分析物的分离、转移和检测的示意图的图像。首先将蛋白质样品电动地加载到微流体装置的大孔径加载介质中(参见图12D，步骤1)。当蛋白质样品到达大孔径的加载介质与较小孔径的分离介质之间的界面时被浓缩。“i”表示电流的方向。当蛋白质沿着分离流动路径的方向轴向分离介质底部迁移时被分离(参见图12D，步骤2)。然后转换施加的电场以引导被分离的样品进入结合介质，结合介质包括固定的(例如交联的或共聚的)结合构件(参见图12D，步骤3)。结合构件被配置为特定地结合并保留所关注的分析物1207，并且如果所关注的分析物1207与功能化的结合介质结合则产生阳性“印迹”(例如可检测的信号)。测定分子量和结合信息以识别所关注的分析物1207。
图13示出了在微流体装置中分离蛋白质梯的图像和曲线图。图13A至图13D示出了在微流体装置中使用12％SDS-PAGE电泳分离蛋白质梯的反相CCD图像。图13A至图13D中的图像取自不同的时间点(例如电泳分离开始后11.6秒、13.2秒、22.0秒和26.8秒)。在图13E中，通过使用SDS-PAGE(3％-8％T)的微流体装置，蛋白质梯的迁移度与蛋白质的尺寸线性相关。结果与梯度板凝胶(4％-12％T)SDS-PAGE比较(参见图13E)。图13E中曲线图中的插图示出了用微流体装置和板凝胶分离的蛋白质带。图13F示出了使用微流体装置的SDS-PAGE分离的电泳图。测量图13D中CCD图像的迁移距离。
图14A示出了使用微流体装置分离荧光标记蛋白质的图像。在微流体装置中使用SDS-PAGE将荧光标记的生物素化的肌动蛋白1401与样品中的其他蛋白质分离。与较小的蛋白质种类1402相比，较大的蛋白质种类(例如荧光标记的生物素化的肌动蛋白1401)通过分离介质迁移较短的距离。图14B示出了荧光标记的蛋白质从微流体装置中的分离介质转移至结合介质的图像。结合介质包括与结合介质结合的链霉抗生物素。当荧光标记的生物素化的肌动蛋白1401穿过结合介质时，结合介质特定地结合并保留荧光标记的生物素化的肌动蛋白1401(参见图14B)。较小的蛋白质种类1402穿过结合介质而不与结合介质结合并排出微流体装置。
图15A至图15D示出了用于微流体装置的模拟电场分布的图像。图15A和图15B分别示出了微流体腔室中的COMSOL模拟的1维电场分布以及具有主通道和一个交叉通道的微流体装置的图像。图15C和图15D分别示出了微流体腔室中的垂直和水平的COMSOL模拟的2维电场分布的图像。COMSOL模拟表明微流体腔室中的垂直和水平的电场分布在微流体腔室上是均匀的。图15E至图15F示出了检测2维微流体腔室中施加的电场的均匀性的微流体装置的CCD图像。“i”表示施加的电场方向。采集加载到微流体腔室中的0.1μM游离染料溶液的实验CCD图像。图15E表明染料通过微流体腔室的电动运动在垂直方向上是基本上均匀的。图15F表明染料通过微流体腔室的电动运动在水平方向上是基本上均匀的。COMSOL模拟和实验数据都显示在微流体腔室内沿垂直和水平方向的良好可控的、均匀的电场分布。均匀的电场分布可以有利于准确地多维引导样品和/或所关注的选定分析物通过微流体装置。
图16示出了在具有或不具有电压整形的情况下样品1601通过微流体装置的电动运动的图像。将荧光标记的0.1μM BSA注射到微流体装置中，并使用CCD成像观察。CCD图像示出了在从垂直方向至水平方向的转移步骤期间荧光标记的样品1601的带形状。在通过使用整形的电压转移之后，样品带形状被保留，而没有明显的变形。“i”表示施加的电场的方向。在图16(左)中，样品1601保持其原始形状，在进入分离腔室之后基本上没有变形(参见图16A)，并且在被转移至第二水平维度之后基本上没有变形(参见图16B)。图16C和图16D表明在没有电压整形的情况下，在进入分离腔室之后(参见图16C)和转移至第二水平维度之后(参见图16D)，样品带形状明显变形。多个侧通道1602允许不同样品、试剂、缓冲液等被引入微流体腔室中。例如，在分离样品中的分析物之后可以将其他样品、试剂、缓冲液等引入微流体腔室，用于随后的夹心抗体检测、酶反应等。
图18示出了样品中多种分析物的分离、转移和检测的图像。微流体装置1800包括容纳分离介质(6％总丙烯酰胺)1801和两种不同结合介质的微流体腔室(1mm×1mm)；第一结合介质(6％总丙烯酰胺)1802，其包括对PG特定的结合构件，和第二结合介质(6％总丙烯酰胺)1803，其包括对CRP特定的结合构件。使用聚丙烯酰胺凝胶的基于掩模的UV光刻，通过选择性光致图案化来形成分离介质和结合介质。选择性光致图案化能够在微流体腔室中形成集成的介质，其中所述介质包括不同物理和功能性质的不同区域，用于分析物分离(例如分离介质)和基于抗体的检测(例如结合介质)。
在图18中，通过使用150V/cm的电场强度引导样品通过分离介质1801将包括目标蛋白质G(PG)和C-活性蛋白质(CRP)的样品电动地分离(图18，步骤(1))。PG和CRP的基线分离在大约20秒的时间里完成。使用横向电场(50V/cm)将被分离的目标蛋白质PG和CRP转移至结合介质(图18，步骤(2))。包括PG的被分离的样品带选择性地与包括对PG特定的结合构件的结合介质结合(～80％捕获效率)，而包括CRP的被分离的样品带选择性地与包括对CRP特定的结合构件的结合介质结合(～80％捕获效率)(图18，步骤(3))。分离、转移和检测步骤在90秒的时间里进行。由于低交叉反应性，每种分析物与固定在其相应印迹区域的抗体结合。
图19示出了样品中分析物相对阴性对照的分离、转移和检测的图像。微流体装置1900包括容纳分离介质(6％总聚丙烯酰胺)1901和两种不同结合介质的微流体腔室(1mm×1mm)；第一结合介质(6％总丙烯酰胺)1902，其包括对PG特定的结合构件，和第二结合介质(6％总丙烯酰胺)1903，其包括对CRP特定的结合构件。通过使用150V/cm的电场强度引导样品通过分离介质1901将包括C-活性蛋白质(CRP)和阴性对照(胎牛血清蛋白(BSA))的样品电动地分离(图19，步骤(1))。CRP和BSA的基线分离在30秒的时间里完成。使用横向电场(50V/cm)将CRP和BSA阴性对照的分离带转移至结合介质(图19，步骤(2))。包括CRP的被分离的样品带选择性地与包括对CRP特定的结合构件的结合介质结合(图19，步骤(2))。包括BSA阴性对照的被分离的样品带未与结合介质结合并显示没有可检测的交叉反应性或非特定性吸附(图18，步骤(3))。分离、转移和检测步骤在110秒内进行。
图20示出了样品中多种分析物的多元检测的图像。在电泳分离之后，在抗体功能化的结合介质处选择性捕获并检测目标蛋白质G(PG)和C-活性蛋白质(CRP)(参见图18)。在暴露于横向电场(＞110s，以50V/cm)之后，目标蛋白质保留在它们各自的结合介质中。结果表明，在暴露于施加的电场大于或等于110秒之后，分析物被保持与结合介质特定地结合。
图21示出了抗原捕获效率对结合介质宽度(μm)的曲线图。抗原捕获效率被模型化为设计和操作参数的函数，假设郎缪结合动力学。模型化可以有利于针对用于样品中多种分析物的多元分析配置的微流体装置优化结合介质(例如结合介质宽度、结合构件密度等)。
虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述实施方案，但是在本说明书的教导下对于本领域普通技术人员明显的是，在不脱离所附权利要求书的精神和范围的情况下，可以对其进行某些变化和修改。还应当理解，本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不是为了限定，因为本发明的范围仅通过所附权利要求书限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非在上下文中另有说明外，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及任何其他指出的数值或该范围中的中间值包括在本发明中，其中下限精确到十分位。这些更小范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围中，并且也包括在本发明中，属于指出的范围中任何特别排除的限定。在指出的范围包括一个或两个界限的情况下，排除了这些界限的一个或两个的范围也包括在本发明中。
本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用被并入本文，犹如每个独立地出版物或专利具体且单独地被表明通过引用被并入本文，并且通过引用并入本文是为了结合所引用的出版物公开和描述方法和/或材料。任何出版物的引用是针对在其申请日之前的公开，并不应被解释为承认本发明由于之前的发明而不早于这些出版物。另外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，其可能需要独立地证实。
应当注意，当在本文中以及在所附权利要求中使用时，除非在上下文中另有说明，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。还应当注意，权利要求可能被撰写为排除任何任选元素。就这一点而言，这一声明是为了用作例如“仅”、“只有”等排他性术语与叙述权利要求元素结合使用或“否定”限定的使用的前提基础。
当阅读本说明书时，对于本领域技术人员明显的是，在本文中描述和说明的独立的实施方案具有分立的部分和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，其可以容易地被分离或者与其他若干实施方案的任一个的特征结合。任何叙述的方法可以以叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序实施。
因此，前文仅描述了本发明的原理。显而易见的是，本领域技术人员能够想到虽然未在本文中明确地描述或示出但是实施本发明的原理并且包括在其精神和范围内的各种布置。此外，本文叙述的所有实施例和条件性语言原则上是为了帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进现有技术做出贡献的概念，并应当解释为不对这些特定叙述的实施例和条件进行限定。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有声明是为了包括其结构和功能等同物。因此，其用意是，这些等同物包括目前已知的等同物和未来开发的等同物，即，开发的执行相同功能的任何元件，而不论结构如何。因此，本发明的范围不被限定为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神通过所附权利要求书体现。

Claims (24)

1.一种用于检测液体样品中分析物的微流体装置，其中所述微流体装置包括：
具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；和
具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通，
其中所述微流体装置被配置为使样品经历两个或更多个方向上不同的流动场。
2.如权利要求1所述的微流体装置，其中所述两个或更多个方向上不同的流动场包括两个或更多个方向上不同的电场。
3.如权利要求1所述的微流体装置，其中所述分离介质包括聚合物凝胶。
4.如权利要求1所述的微流体装置，其中所述结合介质包括稳定地与支撑体缔合的结合构件。
5.如权利要求4所述的微流体装置，其中所述支撑体包括膜。
6.如权利要求4所述的微流体装置，其中所述支撑体包括聚合物凝胶。
7.如权利要求4所述的微流体装置，其中所述结合构件包括蛋白质或其结合片段。
8.如权利要求7所述的微流体装置，其中所述蛋白质为抗体。
9.如权利要求1所述的微流体装置，其中所述分析物包括荧光标记。
10.如权利要求1所述的微流体装置，其中所述第二方向轴与所述第一方向轴正交。
11.如权利要求1所述的微流体装置，其中所述微流体装置包括容纳所述分离介质和所述结合介质的腔室。
12.一种检测液体样品中分析物的方法，所述方法包括：
（a）将所述液体样品引入被配置为使样品经历两个或更多个方向上不同的流动场的微流体装置，其中所述微流体装置包括：
（i）具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；和
（ii）具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通；
（b）引导所述样品通过所述分离介质以制备被分离的样品；以及
（c）检测所述被分离的样品中的分析物。
13.如权利要求12所述方法，其中所述两个或更多个方向上不同的流动场包括两个或更多个方向上不同的电场。
14.如权利要求12所述方法，其中所述方法包括将所述被分离的样品转移至所述结合介质。
15.如权利要求12所述方法，其中所述方法包括将所述结合构件转移至所述被分离的样品。
16.如权利要求12所述方法，在引导所述样品之前还包括浓缩所述样品。
17.如权利要求12所述方法，其中所述方法为验证方法。
18.一种用于检测液体样品中分析物的系统，所述系统包括：
（a）被配置为使样品经历两个或更多个方向上不同的流动场的微流体装置，其中所述微流体装置包括：
（i）具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；和
（ii）具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通；以及
（b）检测器。
19.如权利要求18所述的系统，其中所述两个或更多个方向上不同的流动场包括两个或更多个方向上不同的电场。
20.如权利要求18所述的系统，所述检测器为光电倍增管、电荷耦合装置、互补金属-氧化物-半导体传感器、目视比色读出器或光电二极管。
21.如权利要求18所述的系统，还包括被配置为引导液体通过所述微流体装置的微流体部件。
22.如权利要求18所述的系统，所述检测器为增强的电荷耦合装置。
23.一种试剂盒，包括：
（a）被配置为使样品经历两个或更多个方向上不同的流动场的微流体装置，其中所述微流体装置包括：
（i）具有分离流动路径的分离介质，所述分离流动路径具有第一方向轴；和
（ii）具有标记流动路径的结合介质，所述标记流动路径具有第二方向轴，其中所述结合介质与所述分离介质液体连通；以及
（b）缓冲液。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述两个或更多个方向上不同的流动场包括两个或更多个方向上不同的电场。
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