TW201843450A - 從液體活檢中準確診斷疾病生物標記物的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種使用雙液相系統(ATPS) 來提高針對靶標生物標記物的檢測和診斷的方法。在一個實施例中，本發明提供了一種提高診斷步驟的方法，涉及在液體活檢中檢測或定量一個或多個生物標記物，該方法包含嵌入了 ATPS 組分的多孔材料與含有生物標記物的液體活檢接觸，純化和濃縮靶標生物標記物，並提供對包含靶標生物標記物執行診斷過程的產品。

Description

從液體活檢中準確診斷疾病生物標記物的方法
相關申請 本申請主張 2017年3月28日提交的美國臨時專利申請號 62/478,021的優先權及2017年9月18日提交的美國臨時專利申請號 62/560,180，該專利申請之全部內容以引用之方式併入本申請案中。本申請案亦引用多個公開出版物，該等公開出版物的全部內容以引用之方式併入本申請案中。
本發明涉及一種通過使用雙液相系統(ATPS)提高對生物標記物的檢測和診斷的方法。本發明特別提供了一種從液體活檢中提高對已知生物標記物的檢測和診斷的方法。
生物標記物是生物特性的分子指標，是一種生化方面的特徵，可用於檢測疾病的出現、嚴重性、進展或治療效果。例如，源自於腫瘤的DNA會游離在癌症患者的血漿或血清中，其可作為評估患者的腫瘤或癌症類型的生物標記物。通常，患者血漿或血清中的不同生物標記物與不同類型和形式的疾病有特殊關係。
在診斷測試中使用生物標記物作為分子指標，不僅可以檢測標記物的存在與否，而且經常可以定量分析出標記物的確切濃度，以確定異常情況是否存在。由於準確性的要求，樣品的採集、製備和分析過程往往是複雜而費時的。目前，對基於血液的生物標記物的標記或活性檢測被認為是生物標記物測試的“黃金標準”。
準確檢測和定量分析癌症生物標記物對於能否準確和敏銳地診斷出癌症以及治療的監測，對癌症的發病期和晚期都尤其重要。微量的癌症生物標記物可能存在於癌症早期中，而當癌症進展到晚期，特別是出現擴散時，癌症生物標記的分佈可能變得更加複雜和混亂。當治療有明顯的副作用時，對癌症生物標記物進行準確而有效的藥物反應分析也是至關重要的。必須對每項臨床治療的有效性和安全性進行評估，以便為患者制定出最佳治療策略。
檢測濃度極微的分析物是否存在是一個巨大的挑戰。分析物可以是癌症的生物標記，如游離DNA(cfDNA)，肝癌的甲胎蛋白(AFP)，癌症抗原，如乳腺癌的 CA15-3等可能存在於患者的血液，唾液，尿液或其他體液中。如果濃度過低，許多現有的診斷或檢測方法可能會錯誤地報告分析物不存在。如果分析物濃度極低，PCR和 ELISA 等診斷黃金標準也可能產生假陰性結果。此外，血液、血清和血漿中存在著各種生物分子，它們會干擾和影響診斷的準確性，如肽、寡糖、配體、小分子和天然產物。因此有效的純化和濃縮方法是非常有需要的。
文獻報道了很多可以濃縮游離DNA(cfDNA)和其他癌症生物標記物的純化產品。然而，這些昂貴的試劑盒往往受制於可以處理的最大樣品量，以及在血液樣品堵塞之前可以純化的DNA量。專利 WO2017041030 中公開了一種使用嵌入雙液相系統的多孔材料來濃縮分析物的方法。不幸的是，濃縮的倍數只有大約10倍，這很難滿足癌症對診斷準確度和靈敏度的要求。能夠達到更高濃度的靶標生物標記物的優化方法和設備是非常需要的。
為了克服以上這些限制，本發明提供了一種可以純化和濃縮液體活檢中的靶標分析物 (生物標記物)的優化方法，以便在不需要複雜設備的情況下，可以迅速和快速地進行分析。液體活檢包含血液、血清和血漿。本方法使用嵌入雙液相系統 (ATPS)的多孔材料，可以從液體活檢中純化生物標記物，並將生物標記的濃度濃縮至100倍或以上。總而言之，本文所描述的方法可以提高檢測和定量生物標記物的準確性、靈敏度和效率，從而能夠提高各種依賴生物標記物來檢測和/或定量的分析或診斷技術。如果盡早發現疾病，許多危及生命的疾病就會得到痊癒。
本發明涉及一種使用雙液相系統(ATPS)來提高對生物標記物的檢測和診斷方法。
在一個實施例中，本發明提供了一種提高診斷步驟的方法，涉及在液體活檢中檢測或定量分析一個或多個生物標記物，該方法包含嵌入了ATPS 組分的多孔材料與含有生物標記物的液體活檢接觸，純化和濃縮靶標生物標記物，並提供對包含靶標生物標記物執行診斷過程的產品。
在下面的描述中，描述了本發明的幾個實施例。為解釋起見，提出了具體的配置和細節，以便對實施例提供透徹的理解。此外，對於一個詞的複數或單數形式，以及說明實施例的方向程度被描述為“頂部”，“底部”，“前面”，“後面”，“左”，“右” 之類的，這些字眼是幫助讀者理解實施例，並不意味著要限制本發明。對於本領域的技術人員來說，本發明可以在沒有具體細節的情況下被實踐。以下的實施例讓本發明更容易理解，那些本領域的技術人員將很容易明白，具體的例子只是為了說明目的，而不應被隨後的申請專利範圍所限制。應當指出的是，過渡性術語“包含”或“包括”與“含有”或“特點是”是同義詞，是包容性的或開放式的，並且不排除額外的、未列舉的元素或方法步驟。
在本發明的一個實施例中，雙液相系統(ATPS)完全被嵌入在多孔材料中，允許相自發分離。因此，含靶標生物標記物的樣品從純化到濃縮只需一步。本發明可應用於基於生物標記物檢測或定量分析的各種診斷或檢測技術，包含但不限於酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)、聚合酶鏈反應 (PCR)、放射免疫 (RIA)，蛋白質生物学的方法等。
在一個實施例中，本發明提供一種提高診斷的方法，其中包含使用嵌入雙液相系統(ATPS)組分的多孔材料來檢測或定量液體活檢中的靶標生物標記物。在一個實施例中，本發明包含有效果且高效率地對腫瘤患者的血液、血清和血漿中的靶標生物標記物進行純化和濃縮的步驟。在一個實施例中，本發明所獲得的純化和濃縮的靶標生物標記物，可以在下游技術中檢測或診斷出的特定類型的疾病或健康指標。樣品和生物標記物的種類
在一個實施例中，本方法用於提高診斷，其中包含檢測或定量樣品中的靶標生物標記物。
在一個實施例中，本方法適用于任何包含可以顯示疾病或健康情況 (即生物標記物) 的生物分子的樣品類型。在一個實施例中，樣品包含但不限於血液、血漿、血清、組織、細菌、病毒、RNA 病毒、塗片、細菌培養、細胞培養 (如細胞懸浮物和黏附細胞)，尿液、唾液、糞便和身體分泌物 (如淚水、痰、鼻咽粘液、陰道分泌物和精液)、聚合酶鏈反應 (PCR) 混合物和體外核酸修飾反應混合物。
在一個實施例中，樣品是從液體活檢中抽取的，包含但不限於血液、血漿、血清、尿液、唾液和各種類型的身體分泌物 (如淚、痰、鼻咽粘液、陰道分泌物和精液) 。
在一個實施例中，本發明的方法可以將靶標分析物或生物標記物從非靶標分子中分離出來 (例如，天然来源的小分子和大分子可能幹擾靶標生物標記物的檢測或定量)，從而得到更準確的檢測和診斷。
在一個實施例中，本發明的生物標記物存在於主體的任何生物分子，作為疾病或健康情況的指標。
在一個實施例中，生物標記物是核酸、蛋白質或小分子。
在一個實施例中，生物標記物是一種游離分子，包含指標但不限於游離DNA(cfDNA)、游離蛋白、外泌體和在主體體液中循環的游離分子。在一個實施例中，生物標記物是依附在細胞表面或包含在細胞中的分子。
在一個實施例中，生物標記物是各種類型的核酸 (例如，DNA 包含 cDNA； RNA 包含 mRNA 和 rRNA)、形式 (如單鏈的，雙股的，盤繞的，作為一個質粒，非編碼或編碼) 和長度 (如寡核苷酸、基因、染色體和基因組DNA)，起源于主體或外源體或兩者。
在一個實施例中，生物標記物是一種蛋白質，它是一種肽或多肽，包含完整的蛋白質分子、降解的蛋白質分子和蛋白質分子的消化片段。在一個實施例中，生物標記物包含但不限於抗原、受體和抗體，起源於主體或外源體或兩者。
在一個實施例中，生物標記物是一個小分子，如代謝物。在一個實施例中，代謝產物是與疾病相關的代謝物，它標明疾病的存在或程度或健康情況。在一個實施例中，代謝產物是與藥物有關的代謝物，如一種藥物副產品，其水平隨藥物的主體體內消耗而發生變化。
在一個實施例中，靶標生物標記來源於主體自己 (例如從任何器官、組織或細胞中衍生或釋放的分子)、外源體 (病原體如與某種疾病有關的病毒或與細菌)。或來源於由該主體所攝取的食物或藥物。
在一個實施例中，靶標生物標記物是由腫瘤或癌症產生的分子，或由主體的身體對腫瘤或癌症作出的反應。
在一個實施例中，靶標生物標記物通常不能在健康的主體中發現。在一個實施例中，靶標生物標記物是一種通常能在健康的主體中發現的分子，它的水平顯示出某種疾病或健康情況。
在一個實施例中，靶標生物標記物是與腫瘤或癌症相關的分子，包含但不限於游離DNA，甲胎蛋白(AFP)，腫瘤抗原(CA15-3)，腫瘤抗原(CA125)，前列腺特異抗原 (BRCA1)，癌胚抗原，c-erbB-2、P16、p53 、醛糖還原酶、血管生成素，膜聯蛋白A1、B細胞活化因子（BAFF），B細胞淋巴瘤2型 (BCL2)，人絨毛膜促性腺激素β型、鈣週期素、膽嚢癌細胞、蛋白酶 D、窖蛋白-1、嗜鉻粒蛋白A，αB-晶狀體蛋白 (CRYAB)，內皮抑素，嗜酸細胞活化趨化因子-2，上皮細胞黏附分子(EpCAM)，埃茲蛋白，脂肪酸結合蛋白 4(FABP4)，β-半乳糖凝集素-3，γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶調節鏈，凝溶膠蛋白，葡萄糖 6-磷酸(G6P)，糖蛋白 130 (gp130)，穀胱甘肽S-轉移酶畝1(GSTM1)，Hepsin，高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)，胰島素樣生長因子結合蛋白 1 (IGFBP-1)，胰島素樣生長因子結合蛋白 4 (IGFBP-4)，胰島素樣生長因數結合蛋白 5 (IGFBP-5)，胰島素樣生長因結合蛋白 6 (IGFBP-6)，LGL，潛伏相關肽 LAP，巨噬細胞刺激蛋白 (MSP)，MICA，核苷二磷酸激酶 B (NME2)，神經元特異性烯醇化酶 (NSE)，骨橋蛋白，骨保護素，胃蛋白酶，過氧化物還原酶，磷酸絲氨酸轉氨酶(PSAT1)，前列腺特異抗原，受體酪氨酸蛋白激酶，ErbB3，Serpin B3，血管平滑肌細胞生長因子 R2 (VSGF R2/KDR)，血管內皮生長因子 R3 (VEGF R3/Flt-4)，甲狀腺球蛋白，酪氨酸激酶與免疫球蛋白樣和表皮生長因子樣結構域2 (TIE-2)，組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)，轉化生長因子β (TGF-β1)，腫瘤壞死因子受體 1 (TNF-R1)，尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活質 (uPA)，尿激酶受體 (uPAR)，BRCA I，BRCA II，激肽釋放酶，e-鈣黏蛋白，Hox的基因肽，Engrailed-2。雙液相 系統 (ATPS)
在一個實施例中，提供了一個完全被嵌入在多孔材料中的雙液相系統 (ATPS)，用於從樣品中純化和濃縮靶標生物標記物。ATPS 在多孔材料 (如紙張) 上被使用時，當ATPS的兩相溶液流經多孔材料時，ATPS 的兩個相會分離。因為兩個相具有不同的物理化學性質，所以它們在多孔材料流動的速度不同。混合物中的不同分子會因為其不同的性質而在兩個相之間分佈開來，因此，只需要最簡單的設備和人力，便可以利用雙液相系統 (ATPS) 來分離和濃縮靶標生物標記物。相可以分離是因為依賴等溫動力學原理和毛細管作用使液體流動，過程完全不需要電源或設備。
本發明的優點是可以輕易地獲得高純度和濃度的靶標生物標記物，無需進一步純化或濃縮便可以直接應用在下游分析上。
本發明提供的方法和設備是穩定性強、價格低廉、簡單、易於處理、安全、方便使用、快捷的。本發明的方法能夠純化和濃縮靶標生物標記物，而且可以確保應用在下游的分析結果不會受到原樣品中雜質的影響。由於本發明不需要任何額外的電源、複雜的儀器或電子硬件來操作，因此它可以提供快速和可以承擔的快速核酸分離和純化方法。
由於本發明的獨特功能，本發明可以方便快捷地純化和濃縮靶標生物標記物，而無需使用額外電源或複雜儀器，並且適用于含靶標生物標記物量非常低或體積小的樣品。此外，本方法易用於自動化上，包含高通量篩選體系。
在一個實施例中，本發明的方法可以從血液中純化和濃縮靶標生物標記物。本發明的方法能夠破解血細胞使其釋放細胞中的東西，將靶標生物標記物與非靶標分子包含細胞碎片分離，同時將靶標生物標記物濃縮在一起。
在另一個實施例中，本發明的方法可以從血清或血漿中純化和濃縮靶標生物標記物。
在一個實施例中，靶標生物標記物會保存在ATPS上，而非靶標材料會留在液相中 (例如，原始樣品加上任何非ATPS的組分)。
在一個實施例中，通過改變嵌入在多孔材料上的ATPS組分的量，即兩個相的體積比，靶標生物標記物可以優先在一個相中被濃縮。在一個實施例中，靶標生物標記物被保存在ATPS的前沿位置，然後收集這些標記物，並可選擇使用適當的技術作進一步分析。在本中所提供的一個實施例中，靶標生物標記物分子在嵌入了雙液相系統ATPS的多孔材料的頂部被純化，與沒有嵌入ATPS的多孔材料相比，濃縮倍數增加了多達50-100倍。設計嵌入 ATPS 的多孔材料
在一個實施例中，本發明提供了一種嵌入ATPS組分的多孔材料。在本發明中可以使用各種ATPS，包含但不限於聚合物-聚合物 (如 PEG-右旋糖酐)、聚合物-鹽 (如 PEG-鹽)和膠束 (Triton X-114)。多孔材料可以使用任何可以吸收和轉移液體的合適的多孔材料。本發明適用的多孔材料包含但不限於玻纖紙、棉基紙、其他類型的紙張、聚合物泡沫塑膠、纖維素泡沫塑膠、其他類型的泡沫塑膠、人造絲織物、棉織物、其他類型的織物、木材、石材和任何其他能吸收和轉移液體的材料。
在一個實施例中，多孔材料是商用或由內部製造的。
圖 1 說明了三家供應商的幾種類型的多孔材料在嵌入了ATPS後的分離能力(玻纖紙、棉基紙、單層基質紙和聚烯烴泡沫墊)。靶標分析物是用紫色表示的。如圖1所示，來自供應商1的玻纖紙 FG1、來自供應商2 的玻纖紙 FG1 和 玻纖紙 FG2，和來自供應商3 的聚烯烴泡沫墊，在前沿位置有深紫色，它們的濃縮能力最好。調整濃縮倍數
在一個實施例中，多孔材料中的ATPS 組分的相對量可以調整。對ATPS的兩個組分的體積比進行了調控，使靶標生物標記物在一個組分中優先濃縮。
為了更好地量化與本發明相關的發明，本發明開發了一種分析方法，以評估嵌入在多孔材料上的ATPS 組分的相對量與所能達到的濃縮倍數之間關係。通過調整ATPS 兩個組分的相對量，可以選擇和微調濃縮倍數。
在一個實施例中，將 ATPS 組分整合到多孔材料中，ATPS 組分在水中(或適當的緩衝液)是可溶性的，用一定比例被應用在多孔材料上。然後將多孔材料放置在凍幹機中除去水，從而使ATPS 組分直接被嵌入在多孔材料上。當樣品被引入到多孔材料後，ATPS 組分立即進行補液，從而將樣品中的分子分離，並將靶標分析物濃縮在流體流動的前沿位置，而無需任何外部動力或設備來提供推動力。
如圖2所示，測試了兩種ATPS 的組合(膠束和聚合物/鹽ATPS)，靶標分析物的濃度可達到100倍或更多。同樣數量的紫色分析物被加入到嵌入了不同量的 ATPS 組分的多孔材料上，以及不加ATPS 的多孔材料作為一個對照。在對照中，淺紫色的分析物被均勻分佈在多孔材料上。另一方面，在嵌入了ATPS的多孔材料中，分析物可以在流體流動的前沿位置被濃縮，如深紫色所示。本文的資料表明，濃縮倍數可達到30倍至100倍之間。更重要的是，這裡的資料表明，通過調整嵌入在多孔材料上的 ATPS 組分的比率，本發明可以根據需要調整濃縮倍數。此外，資料表明，嵌入多種 ATPS 組分 (聚合物/鹽體系和膠束體系) 的多孔材料可以實現純化和濃縮分析物。其他聚合物/鹽，膠束，聚合物/聚合物體系可以同樣實施與進一步優化。
在一個實施例中，多孔玻纖紙嵌入聚合物-聚合物 (如 PEG-右旋糖酐)ATPS。當含有多個分析物的樣品加入到多孔玻纖紙上的ATPS 時，多孔玻纖紙使含分析物的組分優先流動，跑在其他 ATPS 組分前面。因此，含靶標分析物的ATPS 組分在流體流動的前沿沿位置被濃縮。
在一個實施例中，多孔玻纖紙嵌入聚合物-鹽基（如PEG-鹽）ATPS。當含有多個分析物的樣品加入到多孔玻纖紙上的ATPS 時，多孔玻纖紙使含分析物的組分優先流動，跑在其他ATPS 組分前面。因此，含靶標分析物的ATPS 組分在流體流動的前沿位置被濃縮。
在一個實施例中，多孔玻纖紙嵌入膠束基（如表面活性劑溶液）ATPS。當含有多個分析物的樣品加入到多孔玻纖紙上的ATPS 時，多孔玻纖紙使含分析物的組分優先流動，跑在其他 ATPS 組分前面。因此，含靶標分析物的ATPS 組分在流體流動的前沿位置被濃縮。
在一個實施例中，多個 ATPS 組分被合併到多孔材料中，以控制靶標分析物 (即生物標記物) 的濃縮倍數。
在一個實施例中，優化聚合物/鹽 ATPS 組分的比率來控制濃縮倍數。
在一個實施例中，優化聚合物/聚合物 ATPS 組分的比率來控制濃縮倍數。
在一個實施例中，優化膠束 ATPS 組分的比率來控制濃縮倍數。
在一個實施例中，嵌入在多孔材料上的 ATPS允許生物分子在流體流動的前沿位置被濃縮。調整ATPS 組分的比率以達到濃縮倍數在10至和100倍之間。
在一個實施例中，嵌入在多孔材料中的 ATPS用於血液樣品，濃縮倍數介於10倍和100倍之間。
在一個實施例中，有各種不同 ATPS 體系，包含但不限於聚合物 (如 PEG-右旋糖酐)、聚合物-鹽 (如 PEG-鹽) 和膠束 (如TritonX-114)。第一個和/或第二個組分包含聚合物。聚合物包含但不限於聚乙二醇，如疏水改性聚亞烷基二醇，聚（氧化烯）聚合物，聚（氧化烯）共聚物，如疏水改性的聚（氧化烯）共聚物，聚乙烯醇吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇己內醯胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化澱粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機矽改性聚醚、聚N-異丙基丙烯酰胺。在另一個實施例中，第一個聚合物包含聚乙二醇、聚丙烯乙二醇或右旋糖酐。
在一個實施例中，第一個組分或第二個組分的聚合物濃度在大約0.01% 到大約90% 的範圍內(w/w) (按水溶液的總重量)。在各實施例中，聚合物溶液的濃度是約0.01% w/w，約0.05% w/w，約0.1% w/w，約0.15% w/w，約0.2% w/w，約0.25% w/w，約0.3% w/w，約0.35% w/w，約0.4% w/w，約0.45% w/w，約0.5% w/w，約0.55% w/w，約0.6% w/w，約0.65% w/w，約0.7% w/w，約0.75% w/w，約0.8% w/w，約0.85% w/w，約 0.9%) w/w，約0.95% w/w，或約1% w/w。在某些實施例中，聚合物溶液的濃度是約為1% w/w，約2% w/w，約3% w/w，約4% w/w，約5% w/w，約6% w/w，約7% w/w，約8% w/w，約9% w/w，約10% w/w，約 1 1% w/w，約12% w/w，約13% w/w，約14% w/w，約15% w/w，約16% w/w，約17% w/w，約18% w/w，約19% w/w，約20% w/w，約21% w/w，約22% w/w，約23% w/w，約24% w/w，約25% w/w，約26% w/w，約27% w/w，約28% w/w，約29% w/w，約30% w/w，約31% w/w，約32% w/w，約33% w/w，約34% w/w，約35% w/w，約36% w/w，約37% w/w，約38% w/w，約39% w/w，約40% w/w，約41% w/w，約42% w/w，約43% w/w，約44% w/w，約45% w/w，約46% w/w，約47% w/w，約48% w/w，約49% w/w，約50% w/w。
在一個實施例中，第一個和/或第二個組分包含鹽，鹽包含但不限於氫鍵鹽、離液鹽、含有陽離子如直鏈或支鏈三甲基銨、三乙基銨、磷酸銨，三丁基銨，四甲基銨，四乙基銨，四丙基銨和四丁基膦銨，和陰離子如磷酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，氯化物和碳酸氫的無機鹽。在另一實施例中，鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和其組合組成。其他鹽，例如醋酸銨，也可以使用。
在一個實施例中，鹽總濃度在0.001至100mM 的範圍內。本領域的技術人員會明白，在 ATPS中所需的鹽的量會受到聚合物分子量、濃度和物理狀態的影響。
在各種實施例中，鹽相選自鹽溶液，濃度約為0.001% 到90% w/w.在各種實施例中，鹽溶液濃度約0.01% w/w，約0.05% w/w，約0.1% w/w，約0.15% w/w，約0.2% w/w，約0.25% w/w，約0.3% w/w，約0.35% w/w，約0.4% w/w，約0.45% w/w，約0.5% w/w，約0.55% w/w，約0.6% w/w，約0.65% w/w，約0.7% w/w，約0.75% w/w，約0.8% w/w，約0.85% w/w，約 0.9%) w/w，約0.95% w/w，或約1% w/w。在某些實施例中，鹽溶液濃度約為1% w/w，約2% w/w，約3% w/w，約4% w/w，約5% w/w，約6% w/w，約7% w/w，約8% w/w，約9% w/w，約10% w/w，約 11% w/w，約12% w/w，約13% w/w，約14% w/w，約15% w/w，約16% w/w，約17% w/w，約18% w/w，約19% w/w，約20% w/w，約21% w/w，約22% w/w，約23% w/w，約24% w/w，約25% w/w，約26% w/w，約27% w/w，約28% w/w，約29% w/w，約30% w/w，約31% w/w，約32% w/w，約33% w/w，約34% w/w，約35% w/w，約36% w/w，約37% w/w，約38% w/w，約39% w/w，約40% w/w，約41% w/w，約42% w/w，約43% w/w，約44% w/w，約45% w/w，約46% w/w，約47% w/w，約48% w/w，約49% w/w，約50% w/w。
在一個實施例中，ATPS 中的第一個組分和/或第二個組分包含與水不相容的溶劑。在某些實施例中，溶劑包含非極性有機溶劑。在某些實施例中，溶劑包含油。在某些實施例中，溶劑選自戊烷、環戊烷、苯、1，4二惡烷、乙醚、三氯甲烷、氯仿、甲苯和己烷。
在一個實施例中，ATPS 中的第一個組分和/或第二個組分包含膠束溶液。在某些實施例中，膠束溶液包含非離子表面活性劑。在某些實施例中，膠束溶液包含洗滌劑。在某些實施例中，膠束溶液包含Triton-X。在某些實施例中，膠束溶液包含類似於Triton-X的聚合物，如 Igepal CA-630 和 Nonidet P-40。在某些實施例中，膠束溶液主要由Triton-X組成。
在一個實施例中，ATPS 中的第一個組分包含膠束溶液，液相中的第個二組分包含聚合物。在一個實施例中，液相中的第二個組分包含膠束溶液，液相中的第一個組分包含聚合物。在一個實施例中，液相中的第一個組分包含膠束溶液，液相中的第二個組分包含鹽。在一個實施例中，液相中的第二個組分包含膠束溶液，第一個組分包含鹽。在一個實施例中，膠束溶液為Triton-X 溶液。在一個實施例中，第一個組分包含第一聚合物，第二個組分包含第二聚合物。在一個實施例中，第一/第二聚合物從聚乙二醇和右旋糖酐中選擇。在一個實施例中，第一個組分包含聚合物，第二個組分包含鹽。在一個實施例中，第二個組分包含聚合物，第一個組分包含鹽。在某些實施例中，第一個組分包含聚乙二醇，第二個組分包含磷酸鉀。在某些實施例中，第二個組分包含聚乙二醇，第一個組分為磷酸鉀。在一個實施例中，第一個組分包含鹽，第二個組分包含鹽。在一個實施例中，第一個組分包含氫鍵鹽，第二個組分包含離液鹽 。在某些實施例中，第二個組分包含氫鍵鹽和第一個組分包含離液鹽。
在一個實施例中，第一個組分與第二個組分的比率在1:1 到1:1000 之間。在某些實施例中，第一個組分與第二個組分的比率選自大約 1:1，約 1:2，約 1:3，約 1:4，約 1:5，約 1:6，約 1:7，約 1:8，約 1:9，約1:10。在某些實施例中，第一個組分與第二個組分的比率選自大約1:20，約1:30，約1:40，約1:50，約 1:60，約1:70，約 1:80，約 1:90，約 1:100。在某些實施例中，第一個組分與第二個組分的比率選自大約 1:200，約 1:300，約 1:400，約 1:500，約 1:600，約 1:700，約 1:800，約 1:900，約1:1000。
在一個實施例中，第二個組分與第一個組分的比率選自大約 1:1，約 1:2，約 1:3，約 1:4，約 1:5，約 1:6，約 1:7，約 1:8，約 1:9，約1:10。在某些實施例中，第二個組分與第一個組分的比率選自大約 1:20，約1:30，約 1:40，約 1:50，約 1:60，約 1:70，約 1:80，約 1:90，約1:100。在某些實施例中，第二個組分與第一個組分的比率選自大約 1:200，約 1:300，約 1:400，約 1:500，約 1:600，約 1:700，約 1:800，約 1:900，約 1:1000。已分離的生物標記物的下游處理
在各種實施例中，本發明可與一個或多個加工或試劑結合使用，用於洗滌和洗脫保留在多孔基質中生物標記物，或保存生物標記物作後處理。
在一個實施例中，生物標記物與 ATPS接觸以後，一次或多次用洗滌緩衝液洗ATPS，以除去非靶標生物標記物或留在多孔基質中的雜質。洗滌緩衝液可包含不同離子強度、pH 值或含有添加劑的洗滌溶液。洗滌緩衝液包含但不限於 20% - 50% 乙醇和 20%-50% 異丙醇； 約 0.1 - 4.0 M胍鹽酸鹽的溶液，洗滌劑和達到約80%的乙醇； 或約80% 乙醇。
在一個實施例中，靶標生物標記物被加到ATPS 的多孔基質上並流向多孔基質的一端。在一個實施例中，本發明所分離的靶標生物標記物使用適當的洗脫緩衝液或去離子水洗脫多孔基質。在一個實施例中分離的靶標生物標記物不洗脫，但保存在多孔基質中以便將來使用。例如，在使用本發明分離生物標記物之後，含有靶標生物標記物 (如 DNA 生物標記)在多孔材料 (紙)上被烘乾和保存。在一個實施例中，在多孔基質上保存的生物標記物可以洗脫作進一步分析或處理。洗脫緩衝液的選擇可能取決於對純化生物標記物的預期用途。核酸類生物標記物的適合洗脫緩衝液的例子包含，但不限於，TE緩衝液，重/雙蒸餾水和 PCR 緩衝液。在一個實施例中，在多孔紙上的純化分析物被洗脫在含有TE 緩衝液的試管中 (10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA溶液，pH 7.5 )，純化的分析物在相對較小的體積內回收，例如，低於 10ul。使用本發明提高診斷步驟
通過本發明的方法獲得的生物標記物可以廣泛地在下游被應用，如法醫對生物標記物的檢測或分析、診斷或治療應用，以及實驗室處理，如測序，擴增，反轉錄，標記，消化，免疫印跡法等。預計本發明能夠提高生物標記物在下游的鑒定或處理步驟。
在一個實施例中，本發明可以在樣品中純化和濃縮顯示疾病的靶標生物標記物，所獲得的產物經過下游診斷，可以檢測或定量靶標生物標記物。本發明尤其可以在一個單一的步驟中進行細胞裂解，純化和濃縮靶標生物標記物，設備簡單和快速，不受樣品量大小或靶標生物標記物在樣品中量的影響。本發明提供了含有靶標生物標記物的高質量樣品，從而大大提高了診斷的準確性、靈敏度和效率。同時，由於大部分雜質已被除去，本發明還可以降低信號噪音比，提高下游工序的陽性信號。假陽性率和假陰性率也可以降低。
在一個實施例中，已純化的生物標記物在下游應用包含但不限於任何檢測、分析或診斷，以及已純化的生物標記物的檢測或定量。在一個實施例中，與本發明結合的檢測、分析或診斷包含但不限於在商業臨床實驗室執行，以及實驗室執行測序，擴增 (如 PCR，逆轉錄PCR (RT-PCR)，實時PCR (real-time PCR)，實時逆轉錄 (real-time RT-PCR) ，反轉錄，標記，消化，免疫印跡法，ELISA，放射免疫 (RIA) ，免疫，酶分析法，GC/MS，蛋白質生物學等方法。在一個實施例中，本發明與酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 和特定抗體抗原結合，其中有兩大好處。首先，縮短需長時間通過培養基質評估共軛酶的活性以產生可檢測的產物的時間。原因是本發明僅基於熱動力原理，在常溫下處理靶標分析物。與需幾個小時甚至幾天的常規 ELISA 過程不同，整個樣品處理過程只需要10分鐘到大約一個小時。其次，本發明可以顯著提高低濃度的靶標生物分子，如肽、蛋白質、抗體和激素，濃度可提高10倍至100倍，因此，可以檢測到一些原本因為低濃度或受雜質干擾，而無法從樣品中被檢測到的分子。
在一個實施例中，本發明與聚合酶鏈反應 (PCR) 結合。在一個實施例中，本發明可以大大濃縮原本非常微量或濃度很低的DNA分子 (可能是由於樣品量太大或 DNA 的量太小或兩者都是)。原本濃度很低的 DNA可能在現有工藝中不能被檢測和處理到，因為現有的樣品處理的試劑盒對樣品的大小有嚴格的要求和限制。經本發明處理後，靶標 DNA 生物標記物可濃縮10倍至1000倍。因此，樣品體積大小大大降低，PCR 檢測的擴增和靈敏度也大大提高。
在一個實施例中，本發明提到的生物標記物可以通過任何已知的檢測方法 (如高壓液相色譜、免疫和通過化學或酶方法的指示劑)。在本發明公開的一個實施例中，指示劑可以再包含一個或多個額外組分。這些額外組分可以包含穩定劑，以及一般公認為安全 (GRAS) 的組分。
在一個實施例中，這裏使用的緩衝液包含，但不限於，磷酸鹽緩衝液(PBS)，TE 緩衝液。在本發明中，優選緩衝液為 9.57 mM PBS 緩衝液(8 mM 氯化鈉，0.2 mM 氯化鉀，1.15 mM磷酸磷酸鈉，0.2 mM磷酸二氫鉀，溶液 pH 值為 7.35-7.65)。本發明中，優選緩衝液為 TE 緩衝液，含有2% 牛血清白蛋白 (BSA)、0.1% Tween-20、0.1%PEG 和20mM Tris，pH 值為 7.5。
在一個實施例中，本發明提到的一種準確診斷疾病的方法，包含以下步驟： (a) 提供包含所述疾病的靶標生物標記物的樣品溶液; (b) 提供嵌入了一個雙液相系統(ATPS)組分的多孔材料，其中，當水溶液流經所說的多孔材料時, 組分形成兩個相的溶液，，使一個相溶液比另一個相溶液流動得更快； (c) 允許所說的多孔材料在毛細管作用下汲取樣品溶液，其中，樣品溶液中的靶標生物標記會分配到流動較快的相溶液中，並在流動較快的相溶液的前沿位置被濃縮； (d) 從流動較快的相溶液的前沿位置收集靶標生物標記物，最終溶液所包含的靶標生物標記物的濃度比在樣品溶液中高至少50倍以上；和 (e) 對所說的最終溶液進行診斷化驗以檢測和定量靶標生物標記物；其中，診斷所述疾病的準確性顯著提高。
在這裡所描述的一個實施例中，多孔材料選自玻纖紙，棉基紙，單層基質紙和聚烯烴泡沫墊。
在這裡所描述的一個實施例中，ATPS 組分選自聚合物，鹽和表面活性劑。
在這裡所描述的一個實施例中，聚合物選自聚乙二醇，聚（氧化烯）聚合物，聚（氧化烯）共聚物，聚乙烯醇吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇己內醯胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化澱粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機矽改性聚醚、聚N-異丙基丙烯酰胺。聚乙二醇、聚丙烯乙二醇和右旋糖酐。
在這裡所描述的一個實施例中，鹽選自氫鍵鹽、離液鹽、含有陽離子的無機鹽，如直鏈或支鏈三甲基銨、三乙基銨、磷酸銨，三丁基銨，四甲基銨，四乙基銨，四丙基銨和四丁基膦銨，和陰離子，如磷酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，氯化物和碳酸氫。在另一實施例中，鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和其組合組成。
在這裡所描述的一個實施例中，表面活性劑選自非離子表面活性劑，洗滌劑，Triton-X，Igepal CA-630 和 Nonidet P-40。
在這裡所描述的一個實施例中，樣品溶液包含一個或多個血液、血漿、血清、 尿液、唾液、糞便和身體分泌物。
在這裡所描述的一個實施例中，靶標生物標記物選自核酸，蛋白質，碳水化合物，脂質，金屬離子，維生素和代謝產物。
在這裡所描述的一個實施例中，核酸是游離 DNA 或游離循環腫瘤 DNA。
在這裡所描述的一個實施例中，靶標生物標記物選自：甲胎蛋白(AFP)，腫瘤抗原(CA15-3)，腫瘤抗原(CA125)，前列腺特異抗原 (BRCA1)，癌胚抗原，c-erbB-2、P16、p53 、醛糖還原酶、血管生成素，膜聯蛋白A1、B細胞活化因子 (BAFF) ，B細胞淋巴瘤2型 (BCL2)，人絨毛膜促性腺激素β型、鈣週期素、膽嚢癌細胞、蛋白酶 D、窖蛋白-1、嗜鉻粒蛋白甲， αB-晶狀體蛋白(CRYAB)，內皮抑素，嗜酸細胞活化趨化因子-2，上皮細胞黏附分子(EpCAM)，埃茲蛋白，脂肪酸結合蛋白 4(FABP4)，β-半乳糖凝集素-3，γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶調節鏈，凝溶膠蛋白，葡萄糖 6-磷酸(G6P)，糖蛋白 130 (gp130)，穀胱甘肽S-轉移酶畝1(GSTM1)，Hepsin，高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)，胰島素樣生長因子結合蛋白 1 (IGFBP-1)，胰島素樣生長因子結合蛋白 4 (IGFBP-4)，胰島素樣生長因數結合蛋白 5 (IGFBP-5)，胰島素樣生長因結合蛋白 6 (IGFBP-6)，LGL，潛伏相關肽 LAP，巨噬細胞刺激蛋白 (MSP)，MICA，核苷二磷酸激酶 B (NME2)，神經元特異性烯醇化酶 (NSE)，骨橋蛋白，骨保護素，胃蛋白酶，過氧化物還原酶，磷酸絲氨酸轉氨酶(PSAT1)，前列腺特異抗原，受體酪氨酸蛋白激酶，ErbB3，Serpin B3，血管平滑肌細胞生長因子 R2 (VSGF R2/KDR)，血管內皮生長因子 R3 (VEGF R3/Flt-4)，甲狀腺球蛋白，酪氨酸激酶與免疫球蛋白樣和表皮生長因子樣結構域2 (TIE-2)，組織纖維蛋白溶酶原激活劑 (tPA)，轉化生長因子β (TGF-β1)，腫瘤壞死因子受體 1 (TNF-R1)，尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活質 (uPA)，尿激酶受體 (uPAR)，BrcaI，BrcaII，激肽釋放酶，e-鈣黏蛋白，Hox的基因肽，Engrailed-2。
在這裡所描述的一個實施例中，靶標生物標記物可以被濃縮至100倍。
在這裡所描述的一個實施例中，疾病是癌症。
在這裡所描述的一個實施例中，診斷化驗是選自酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)，聚合酶鏈反應 (PCR)，放射免疫 (RIA)，蛋白質生物學方法，免疫印跡程法、免疫分析、酶法和 GC/MS。
通過參考下面的實施例可以更好地理解本發明。本領域的技術人員將很容易理解，所提供的例子僅僅是為了說明目的，而不意味著限制本發明的範圍。本發明由隨後的申請專利範圍作界定。具體實施例 實施例 1- 嵌入 ATPS 的多孔材料
配制好的ATPS 組分在多孔紙上脫水，ATPS 組分是20% (w/w) PEG 4600，2% (w/w) SDS，16% (w/w) Triton-X114 和 18.5%(w/w) 硫酸鈉Na2 SO4 。多孔紙包含玻纖紙，棉基紙，專用單層基質紙和聚烯烴泡沫墊，寬度為2.2 cm和長度是可調的。PEG 溶液 (在DI水中) 被加到多孔材料的每個窄孔中。50uL TE緩衝液 (包含2% 牛血清白蛋白 (BSA)、0.1% Tween-20 和0.1% PEG、20 mM TE，pH 值 7.5) 立即隨第一個溶液也被加入。
上述嵌入 ATPS 的多孔材料在凍幹機中乾燥1小時，切割成長度為0.5 cm的紙片 (新尺寸： 4 cm x 0.5 cm)。然後把紙片疊起 (四張紙片成一疊)，從角落到離末端0.5cm 處的點切開 (形成一個三角形，看見圖 1)。嵌入ATPS的多孔材料然後被浸泡在包含指示劑 (膠體金) 的PBS緩衝液中 (pH 值 7.4)，其包含鹽 (在這裡是磷酸鉀)。ATPS溶解於緩衝液并在毛細管作用下產生流動。實施例 2- 使用本發明在血漿中濃縮游離循環 DNA (ccfDNA)
從患者和健康者各收集血漿樣品。分別用本發明或 QIAamp 循環核酸試劑盒 (QIAGEN) 從血漿樣品中純化ccfDNA。如前面的例子所述，ATPS 紙疊和對照紙疊分別浸泡在血漿樣品中，在毛細管作用下汲取大約2分鐘，直到溶液流到頂端。頂部被提取，並用乙醇沉澱再以Nanodrop 分光光度計分析。本發明的結果與 QIAamp 循環核酸試劑盒 (QIAGEN) 的結果進行比較。表1顯示本發明可以將 ccfDNA 從患者或健康者的血漿樣品中分離出比商業試劑盒更高的產量。 表1。利用本發明的方法或 QIAamp 循環核酸試劑盒從患者和健康者的血漿中分離和濃縮 ccfDNA。 實施例 3- 使用本發明 濃縮 血清中的甲胎蛋白 (AFP)
從患者和健康者收集血清樣品。用本發明和 甲胎蛋白 (AFP) ELISA 試劑盒（由 BioSupply 有限公司提供的，11 The Grove，Shipley，BD18 4LD）從血清樣品中純化和濃縮甲胎蛋白。甲胎蛋白(AFP)標準品被加入到一組血清樣品中進行比較。
如實施例1中所述，ATPS 紙疊和對照紙疊被浸泡在血清樣品中，並且在毛細管作用下汲取大約2分鐘，直到溶液流到頂端。提取並分析頂部。表2顯示本發明可以從患者或健康者的血清樣品中濃縮甲胎蛋白 (AFP)。
AFP 標準品是通過把AFP (Sigma Aldrich，產品號8452) 溶解在去離子水中，得到50ng/L。 表 2： 從患者或健康者的血清樣品中分離和濃縮甲胎蛋白(AFP)。 實施例 4- 使用本發明和癌症抗原 (CA15-3) ELISA 試劑盒濃縮血清中的癌症抗原 (CA15-3)
從患者和健康者收集血清樣品。分別用本發明和癌症抗原(CA15-3) ELISA 試劑盒(由 BioSupply 有限公司提供的，11 The Grove，Shipley，BD18 4LD) 從血清樣品中純化並濃縮癌症抗原(CA15-3)。癌症抗原 (CA15-3) 標準品被加入到一組血清樣品進行比較。
如實施例1中所述，ATPS 紙疊和對照紙疊被浸泡在血清樣品中，並且在毛細管作用下汲取大約2分鐘，直到溶液流到頂端。提取並分析頂部。表3顯示本發明可以從患者或健康者的血清樣品中濃縮癌症抗原(CA15-3)。
癌症抗原(CA15-3) 標準品是通過把癌症抗原(CA15-3) (商業產品，Fitzgerald Industries International，Inc。(CA15-3 MAb M8071022) 溶解在去離子水中，得到 25 kU/L。 表 3：從患者或健康者的血清樣品中的分離和濃縮癌症抗原(CA 15-3)。
圖 1 顯示嵌入ATPS組分的不同多孔材料中的分離相。
圖 2 顯示了本發明的一個實施例，生物分子在嵌入ATPS的多孔材料上的前沿位置被濃縮成不同倍數。

Claims (13)

  1. 一種準確診斷疾病的方法，包含以下步驟： (a) 提供包含所述疾病的靶標生物標記物的樣品溶液; (b) 提供嵌入了一個雙液相系統(ATPS)組分的多孔材料，其中，當水溶液流經所述多孔材料時, 其中一個相溶液比另一個相溶液流動更快，從而形成兩個相溶液； (c) 允許所述多孔材料在毛細管作用下吸取所述樣品溶液，其中，樣品溶液中的靶標生物標記會分配到流動較快的相溶液中，並在所述流動較快的相溶液的前沿位置被濃縮； (d) 從所述流動較快的相溶液的前沿位置收集所述靶標生物標記物，獲得最終溶液，所述最終溶液包含的靶標生物標記物的濃度比在樣品溶液中高至少50倍以上；和 (e) 對所述最終溶液進行診斷化驗以檢測和定量靶標生物標記物； 其中，本方法顯著地提高診斷所述疾病的準確性。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述多孔材料選自玻纖紙、棉基紙、單層基質紙和聚烯烴泡沫墊。
  3. 如請求項1所述的方法，其中所述ATPS 組分選自聚合物、鹽和表面活性劑。
  4. 如請求項3所述的方法，其中所述聚合物選自聚乙二醇、聚（氧化烯）聚合物、聚（氧化烯）共聚物、聚乙烯醇吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇己內醯胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化澱粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機矽改性聚醚、聚N-異丙基丙烯酰胺。聚乙二醇、聚丙烯乙二醇和右旋糖酐。
  5. 如請求項3所述的方法，其中鹽選自氫鍵鹽、離液鹽、含有三甲基銨、、三乙基銨、三丁基銨、四甲基銨、四乙基銨、四丙基銨或四丁基膦銨陽離子和陰離子、含有磷酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物或碳酸氫陰離子的無機鹽、氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和其組合。
  6. 如請求項3所述的方法，其中所述表面活性劑選自非離子表面活性劑、洗滌劑、Triton-X、Igepal CA-630 和 Nonidet P-40。
  7. 如請求項1所述的方法，其中所述樣品溶液包含一個或多個血液、血漿、血清、 尿液、唾液、糞便和身體分泌物。
  8. 如請求項1所述的方法，其中所述靶標生物標記物選自核酸、蛋白質、碳水化合物、脂質、金屬離子、維生素和代謝產物。
  9. 如請求項8所述的方法，其中所述核酸是游離 DNA 或游離循環腫瘤 DNA。
  10. 如請求項1所述的方法，其中靶標生物標記物選自：甲胎蛋白(AFP) 、腫瘤抗原(CA15-3) 、腫瘤抗原(CA125) 、前列腺特異抗原 (BRCA1) 、癌胚抗原、c-erbB-2、P16、p53 、醛糖還原酶、血管生成素，膜聯蛋白A1、B細胞活化因子 (BAFF) 、B細胞淋巴瘤2型 (BCL2) 、人絨毛膜促性腺激素β型、鈣週期素、膽嚢癌細胞、蛋白酶 D、窖蛋白-1、嗜鉻粒蛋白甲、 αB-晶狀體蛋白(CRYAB) 、內皮抑素、嗜酸細胞活化趨化因子-2、上皮細胞黏附分子(EpCAM) 、埃茲蛋白、脂肪酸結合蛋白 4(FABP4) 、β-半乳糖凝集素-3、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶調節鏈、凝溶膠蛋白、葡萄糖 6-磷酸(G6P) 、糖蛋白 130 (gp130) 、穀胱甘肽S-轉移酶畝1(GSTM1) 、Hepsin、高遷移率族蛋白B1(HMGB-1) 、胰島素樣生長因子結合蛋白 1 (IGFBP-1) 、胰島素樣生長因子結合蛋白 4 (IGFBP-4) 、胰島素樣生長因數結合蛋白 5 (IGFBP-5) 、胰島素樣生長因結合蛋白 6 (IGFBP-6) 、LGL、潛伏相關肽 LAP、巨噬細胞刺激蛋白 (MSP) 、MICA、核苷二磷酸激酶 B (NME2) 、神經元特異性烯醇化酶 (NSE) 、骨橋蛋白、骨保護素、胃蛋白酶、過氧化物還原酶、磷酸絲氨酸轉氨酶(PSAT1) 、前列腺特異抗原、受體酪氨酸蛋白激酶、ErbB3、Serpin B3、血管平滑肌細胞生長因子 R2 (VSGF R2/KDR) 、血管內皮生長因子 R3 (VEGF R3/Flt-4) 、甲狀腺球蛋白、酪氨酸激酶與免疫球蛋白樣和表皮生長因子樣結構域2 (TIE-2) 、組織纖維蛋白溶酶原激活劑 (tPA) 、轉化生長因子β (TGF-β1) 、腫瘤壞死因子受體 1 (TNF-R1)，尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活質 (uPA)，尿激酶受體 (uPAR)，BrcaI，BrcaII，激肽釋放酶、e-鈣黏蛋白、Hox的基因肽、Engrailed-2。
  11. 如請求項1所述的方法，其中所述靶標生物標記物可以被濃縮至100倍。
  12. 如請求項1所述的方法，其中所述疾病是癌症。
  13. 如請求項1所述的方法，其中所述診斷化驗選自酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 、聚合酶鏈反應 (PCR) 、放射免疫 (RIA) 、蛋白質生物學方法、免疫印跡程法、免疫分析、酶法和 GC/MS。
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